一种空间环境下的蜡状芽孢杆菌lct-bc235菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及空间环境下的蜡状芽孢杆菌及其基因组序列。既往研究发现空间环境能够影响微生物的许多特征，例如生长速率、细胞形态、细胞代谢水平、生物被膜的产生、毒力和耐药性的增加或者降低。本发明利用太空特殊环境，通过搭载神舟八号飞船将蜡状芽孢杆菌送入太空，历经398小时、1100万公里的飞行返回地面后进行了表型相关实验，证明了空间环境下的菌株存在明显的变化。随后对其进行了基因组测序、转录组测序、和蛋白质组学分析，旨在发现发生这些变化的潜在机制及其应用。随着对这些问题的深入研究，有利于我们发现和了解空间环境对细菌的影响致病性和耐药性改变的机制，为保障航天员安全提供了理论基础。
【专利说明】一种空间环境下的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235菌株
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种空间环境下的蜡状芽孢杆菌生物特性、全基因组测序、转录组测序和差异蛋白组学分析。
【背景技术】
[0002]随着人类空间探索活动的日益频繁，宇宙空间成为了人类活动的一个重要领域。 微生物是自然环境中的一部分，其存在于空气、水、土壤等生物圈的各个部分。因此，人类的空间活动不可避免的将微生物也带上了宇宙空间。尽管外层空间具有极端和复杂的环境， 这些微生物都能够适应这些诸如微重力、宇宙射线、温度、压力等的改变并表现出相应的形态和生理学的变化。尤其是有研究发现在模拟微重力条件下培养的鼠伤寒沙门氏菌对小鼠感染的毒力会增强；肺炎链球菌等机会致病菌在模拟微重力条件下毒力增强。目前，在空间站中已检测出包括肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙雷氏菌、 蜡状芽孢杆菌和肠球菌等多种细菌。对这些细菌进行深入研究有助于了解这些细菌的致病力和耐药性的改变机制，为载人航天提供医学保障基础。
[0003]蜡样芽胞杆菌是革兰氏阳性杆菌，好氧或兼性厌氧并能够形成孢子。蜡状芽孢杆菌是一种条件致病菌，其能够产生相关导致呕吐的毒素和三种不同的肠毒素，引起呕吐综合征和腹泻病造成食物中毒，是一种潜在的会导致宇航员急性胃肠道疾病的重要致病菌。 尤其是空间飞行时，航天员所携带的食物大多是由从地球出发前制作的罐头食品，极容易受蜡状芽孢杆菌污染。一旦宇航员感染此种疾病我们尚未有很好的认识。因此，通过表型研究空间环境下的突变株，并利用基因组、转录组、蛋白质组三大组学研究方法，全面研究该菌株对空间环境的适应性变化，关注其致病性、耐药性的变化，为预防感染性疾病的发生奠定基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种太空环境中的蜡状芽孢杆菌菌株LCT-BC235。通过表型研究，全基因组测序，并结合转录组学和蛋白组学阐明该细菌对空间的变化机制。
[0005]本发明提供的菌株LCT-B`C25，其保藏号为CGMCC N0.6516。
[0006]所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，其表型特征为:革兰氏阳性杆菌，具有芽孢，菌体单个或者成双排列；与地面对照株相比较，其耐药性没有发生明显变化；其生长速率减慢；生化特征为硫酸四癸钠反应、四氮唑紫反应阴性。
[0007]所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235进行全基因组测序，得到其全基因组序列及注释内容。LCT-BC235的全基因组鸟枪法测得序列总长度为5，514，728bp，平均GC含量为35.32*%。其序列包含34个contigs,能够组装成为5个scaffolds。用Glimmer version3.02软件预测出5，263个编码基因。对该菌株的序列进行SNP分析发现，蜡状芽孢杆菌 LCT-BC235 有三个 SNP。分别是 UW1GL000001，UW1GL002432, UW1GL005263。然而，其中两个为基因间区SNP，一个为同义SNP。此同义SNP是一个保守的假定蛋白。[0008]所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，通过转录组测序鉴定获得差异表达基因。结果有624个上调基因和813个下调基因。对这些基因进行GO功能富集分析显示，具有明显差异表达的基因的生物学功能主要与跨膜转运和离子跨膜转运有关(P = 0.04239)。对这些基因进行通路富集分析发现其差异表达基因主要与与磷酸转移酶系统、氧化磷酸化过程的 pathway 有关。
[0009]所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，利用蛋白组学鉴定获得差异表达蛋白分子。结果得到8个上调表达的蛋白和73个下调表达的蛋白。对这些差异表达的基因进行GO功能富集分析和pathway富集分析发现这些差异蛋白主要是与糖类代谢脂类代谢和氨基酸代谢相关。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1蜡状芽孢杆菌LCT-BC235革兰氏染色
[0011]图2蜡状芽孢杆菌LCT-BC235进化分析
[0012]图3蜡状芽孢杆菌空间菌株LCT-BC235的biolog生化特征
[0013]图4蜡状芽孢杆菌空间诱变株LCT-BC235与地面对照株LCT-BC244的生长曲线比较
[0014]图5蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的转录组基因覆盖度
[0015]图6蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的转录组差异表达基因
[0016]图7蜡状芽孢杆菌空间诱变菌株LCT-BC235的蛋白组差异表达蛋白
【具体实施方式】
[0017]下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0018]下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0019]本项目研究人员采用自制的样本管搭载细菌，依据:HYK_GF15《航天员系统载人运输飞船/目标飞行器舱载产品环境试验技术条件》，该样本管通过了冲击、快速减压、震动实验。褪色沙雷菌接种至样本管中，培养基为LB琼脂半固体培养基。然后封装入代号为 20111001的样品包(材料为蓝色美塔斯阻燃布料)。经过神舟八号搭载，获得太空环境下的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235菌株。
[0020]具体实施实例一、LCT-BC235的表型研究:
[0021](I).菌种选择:蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，保藏号为CGMCCN0.6528
[0022](2).形态学:原样品进行稀释涂布，进行革兰氏染色。LCT-BC235为革兰氏阳性杆菌，具有芽孢，菌体单个或者成双排列，如图1。
[0023](3) ? LCT-BC235菌株16s rDNA鉴定及进化分析
[0024]16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约1.5kb。将已分纯的单菌直接经菌液PCR 扩增16S rDNA，部分通过菌液PCR较难 扩增的单菌经扩大培养后提取基因组后扩增，扩增所用引物序列如下:
[0025]SgF:AGAGTTTGATCATGGCTCAG
[0026]SgR: TAGGGTTACCTTGTTACGACTT
[0027]16S rDNA PCR产物用96孔mi I Ipore纯化系统纯化后准确定量，经AB13730xl全自动序列分析仪测序，测序结果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测序结果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1350bp(双向测序)即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxonserver2.1数据库中进行比对,确定菌株大致的分类地位。所有单菌16S序列全部导入seqman,输出single file (fasta)后，经Mega5.0软件clusterW 多重比对，输出meg文件重新导入构建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method为bootstrap参数设置为1000。16s rDNA鉴定结果显示LCT-BC235属于蜡状芽孢菌。对其进行进化分析如图2所示。
[0028](4).耐药性检测:配制菌悬液后稀释涂布，粘贴药敏片，选择的抗生素为青霉素 G、氨苄青霉素、头孢唑林、复达欣(头孢他啶)(头孢噻甲羧肟)、菌必治(头孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、环丙沙星(奔克)(悉复欢)(丙氟哌酸)、洁霉素(林可霉素)、万古霉素、 复方新诺明、氯霉素、舒普深(先锋必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、链霉素、美满霉素 (二甲胺四环素)(米诺环素)、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。培养24h后观察抑菌圈大小。结果发现与地面对照株相比较，蜡状芽孢杆菌LCT-BC235的耐药性没有发生明显变化。
[0029](5).溶血试验:采用点种法，将太空株和地面株点种于同一血琼脂培养基上，培养温度37°C，培养24小时后观察结果显示LCT-BC235无溶血圈出现。
[0030](6).生化代谢(Biolog)实验:制备菌悬液，接种至Biolog96孔板，37°C培养 24-48h观察结果(见图3)。该菌株生化代谢较地面株差别较大如表1。
[0031]表1蜡状芽孢杆菌LCT-BC235的biolog生化特征
[0032]
【权利要求】
1.一种空间环境下的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，其保藏号为:CGMCCN0.6516。
2.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，其表型特征为:革兰氏阳性杆菌， 具有芽孢，菌体单个或者成双排列；与地面对照株相比较，其耐药性没有发生明显变化；该菌的生长速率减慢；生化特征为硫酸四癸钠反应、四氮唑紫反应阴性。
3.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235进行全基因组测序，得到其全基因组序列及注释内容。
4.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌LCT-BC235，通过转录组测序鉴定获得差异表达基因。
5.根据权利要求1所述的蜡状芽孢`杆菌LCT-BC235，利用蛋白组学鉴定获得差异表达蛋白分子。
【文档编号】C12N1/20GK103555602SQ201210380072
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年9月26日 优先权日:2012年9月26日
【发明者】刘长庭, 苏龙翔, 方向群, 王俊峰, 李天志, 郭英华, 常德, 王雅娟, 陈振鸿, 姜学革 申请人:中国人民解放军总医院