高效降解敌草胺的蜡状芽孢杆菌lgy06及其应用及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其是一种高效降解敌草胺的蜡状芽孢杆菌LGY06 及其应用及使用方法。
【背景技术】
[0002] 敌草胺（Napropamide)化学名称为N，N-二乙基-2-(α-萘氧基）丙酰胺，又名草 萘胺、大惠利，基本理化性质如式1所示。敌草胺属于酰芳胺类除草剂，可被杂草根系或芽 鞘吸收，抑制体内某些酶的合成，使根芽不能生长而死亡。敌草胺是选择性芽前土壤处理 剂，杀草谱广，可防除一年生禾本科杂草和某些阔叶杂草及莎草科杂草，适用于多种作物， 是许多作物有选择性的旱田除草剂。
[0003] 敌草胺进入田间土层之后，其半衰期长达两个月左右，施药一次可解决整季杂草 的危害问题，有着较广阔的应用前景。但是由于敌草胺在土壤中持效期长，使用不当会对后 茬作物产生药害，如果残留超过最大限量，则会对人畜产生不良影响或通过食物链对生态 系统中的生物造成毒害。此外，敌草胺具有较大的水溶性（73 mg/L，25°C)残留在土壤中的 敌草胺有可能在环境中扩散，进入地表水或地下水，对水体质量构成威胁。因此，消除环境 中敌草胺的残留污染引起科研工作者的高度重视，已成为一个重要的研究课题。
[0004] 生物修复（Bioremediation)技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点，已 成为处理环境中有机污染物的有效措施。国际上已有利用生物修复技术成功治理石油污染 的先例。近年来，研究利用生物修复技术治理农药残留污染已成为研究热点。目前许多发达 国家和大公司都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国BCI公司、 美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展 有限公司已成功生产"比亚"生物降解制剂可用于去除有机磷类农药残留。但是，由于农药 结构多样性，而微生物降解农药往往具有很强的针对性，导致现有降解菌资源库远不能满 足农药残留污染生物修复的实际需求。目前还没有专门针对敌草胺的降解微生物及其相关 降解制剂产品。因此，有针对性地筛选高效降解菌株，研制微生物修复剂，通过人工接种加 速环境中除草剂的降解，消除残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是：提供一种高效降解敌草胺的蜡状芽孢杆菌LGY06。
[0006] 本发明的另一目的是提供该菌株在降解敌草胺残留中的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供所述菌株在制备降解敌草胺制剂中的应用。
[0008] 本发明是这样实现的：高效降解敌草胺的蜡状芽孢杆菌LGY06,其保藏号为CCTCC NO :M 2015398。
[0009] 该菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 高效降解敌草胺的蜡状芽孢杆菌LGY06在降解敌草胺残留中的应用。
[0011] 采用高效降解敌草胺的蜡状芽孢杆菌LGY06生产降解敌草胺制剂的方法，将蜡状 芽孢杆菌LGY06的菌株作为活性成分，制备获得降解敌草胺的菌剂。
[0012] 本发明所提供的细菌是錯状芽孢杆菌cereiA?) LGY06,所述菌株已于 2015年6月19日保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保 藏号为 CCTCCNO: M 2015398。
[0013] 所述菌株经形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌 cereus )，该菌株在在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长很快，呈圆形或近似圆形、 质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状，成短或长链，芽孢中生，无荚膜。电 子显微镜下观察杆状细胞长直径>1 μ m。通过生理生化特性测定，显示该菌株革兰氏阳性， 接触酶阳性，氧化酶阴性，VP试验阳性，甲基红试验阳性。该菌可利用葡萄糖、柠檬酸盐；不 利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇。
[0014] 本发明筛选获得一株蜡状芽孢杆菌CereuS)LGY06,该菌株可在短时间 内有效降解敌草胺残留，保护生态环境和人类健康，且使用方便，成本低，去除率达到75% 以上，可用于修复敌草胺污染的水体、土壤等自然环境，解决农业生产中除草剂残留超标问 题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。使用蜡状蜡状芽孢杆菌LGY06生产制备得 到的菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点，适合治理水体和土壤等环境中 敌草胺造成的污染，具有非常重要的理论和应用价值。
【附图说明】
[0015] 附图1为敌草胺准品色谱图； 附图2为菌株LGY06对敌草胺（50 mg/L)的降解率。
【具体实施方式】
[0016] 本发明的实施例1 :降解菌LGY06的分离与鉴定 1)降解菌LGY06的分离与筛选 称取长期受敌草胺污染土壤10. 〇 g于250 mL三角锥形瓶中，加入100 mL无机盐培养 基，添加敌草胺至浓度为100 mg/L，三角锥形瓶置于摇床（28°C，150 rpm的上培养7 d，取 5 mL培养液接种至新鲜基础培养基(除草剂100 mg/L)中，然后在28°C摇瓶培养7 d，依次 类推5次接种，按敌草胺100 mg/L的浓度梯度增长，使最终富集培养液敌草胺的浓度达到 500 mg/L，得到富集降解菌株。
[0017] 降解菌富集分离过程中，每2次转接后，将菌悬液制备成10 2~10 6系列稀释液， 用涂布法分别在固体分离纯化培养基上进行分离，28°C培养两天，根据其不同的外观形态 和特征挑取单菌落，反复划线纯化，并根据菌落外观形态特征和显微形态观察的菌体形态 特征合并相同的菌株，并将所得的菌株接种于固体分离纯化培养基斜面，保存、备用。
[0018] 经过大量的富集培养，分离到能够在含敌草胺500 mg/L的分离培养基上生长的菌 株20余株，并使用高效液相色谱法（HPLC)验证其降解效果。进一步筛选后，获得一个编号 为LGY06的菌株，命名为降解菌LGY06,该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度50. 0 mg/L 的敌草胺在7 d内降解75%以上。
[0019] HPLC测定条件：Waters 600E高效液相色谱仪（美国Waters);检测器： Waters2487 紫外检测器（美国 Waters);色谱柱：C18反相柱（SunFire ?, 150 nmX4. 60 mm，5 μπι);流动相为乙腈：水（80 : 20, V/V)，流速I. 2 mL/min ;柱温30°C ;检测波长： 220 nm;进样量：5 yL。在上述条件下，敌草胺的峰形由一个峰组成，且峰尖锐、稳定，保留 时间约为6. 6 min (见图1)。
[0020] 降解率计算方法如下：
2)降解菌LGY06的鉴定 (1)降解菌LGY06的形态学鉴定将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分 离并纯化得到的降解菌LGY06进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、 湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。对于处于对数生长期的所述降解菌LGY06,经涂片染 色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
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