一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白及其制备和应用
【专利摘要】一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白及其制备和应用，属于基因工程和生物医药领域，所述蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，该序列能编码上述海洋芽孢杆菌蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。海洋芽孢杆菌蛋白可以抑制多种肿瘤细胞的生长，具有开发成抗肿瘤药物和/或保健品的潜力。
【专利说明】
一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白及其制备和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程和生物医药领域，特别是涉及一种具有抗肿瘤活性的海洋芽 孢杆菌蛋白及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病，是我国人口死亡的主要原因之一， 2005年全球共有约750万人死于恶性肿瘤，我国每年约有130万人死于癌症，而且发病率呈 逐年上升趋势。药物治疗是恶性肿瘤综合疗法中的重要组成部分，经典的细胞毒类抗肿瘤 药物是目前化学治疗的主要手段，并在未来的相当长时期内仍将占据主导地位。因此从天 然生物中寻找新的结构类型或新的作用机制的抗肿瘤活性成分是当前抗肿瘤药物研究的 新趋势。但是绝大多数的抗肿瘤先导化合物在生物体内含量低，规模化制备困难，所以目前 天然来源的抗肿瘤先导化合物的药物来源是一大难题。由于海洋独特的地理、气候及环境 特点，海洋微生物也具有新颖性与多样性，这在科学研究、应用开发等方面都具有重要价 值。海洋因此被认为是个潜在、重要的微生物资源库，可能是产生具有新型生物活性物质的 菌株的潜在种源地，将会给新型天然药物的筛选与发现带来新的机遇与突破。
[0003] 目前对海洋微生物的研究已经不仅仅局限于其基础研究，抗冻、抗辐射、抗肿瘤及 抗菌等菌株也被不断发现，且其产生的活性物质将极可能成为新的药用活性物质，有良好 的研究及开发前景。美国专利检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微生物已授权相关专利5项， 2004年Fenical等发现了一种新型的海洋放线菌CNQ140,从中获得了环多烯类的天然产物， 具有显著的抗肿瘤活性(PatentNo .yS7521414B2)。国内检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微 生物已授权相关专利2项，2007年东南大学的杨瑞丽等发现了一种产生抗肿瘤活性物质的 海洋链霉菌，该菌的发酵液对多种肿瘤细胞均具有显著的细胞毒作用，并且能诱导肿瘤细 胞凋亡，是一株具有预防和治疗肿瘤潜力的菌株资源(授权公告号：100554404) ;2003年中 国科学院海洋所的秦松等将海洋链霉菌Streptomycessp.经发酵积累粗提物，利用硅胶层 析等多种层析方法分离得到两种化合物，命名为chinikomycinA和B，其对多种人体肿瘤细 胞有抑制作用(授权公告号：1296347)，国内在评审中的相关专利有7项。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题在于提供一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白及 其制备方法，以用于抗肿瘤药物的研究与应用，为肿瘤的治疗和预防提供新药物。
[0005] 本发明是通过如下技术方案来实现的：
[0006] 一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白，其核苷酸序列见SEQIDN0.1，该序列能 编码上述海洋芽孢杆菌蛋白。对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，其中SEQIDN0.1中 16-105位核苷酸序列编码的是信号肽，106-303位核苷酸序列编码的是连接肽，304-825位 核苷酸序列编码的是活性蛋白。
[0007] 本发明还提供了 一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白的氨基酸序列，见 SEQIDNO. 2。通过氨基酸序列对比发现，该海洋芽孢杆菌蛋白第一次被发现具有抗肿瘤活 性。
[0008] 本发明还提供一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白的制备方法，具体的方法 包括构建原核表达载体，利用超滤和离子交换方法纯化重组蛋白。所述的表达载体为 PET22b，所用的酶为NcoI和HindllI，其中特异性引物5' -CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3'为PCR扩增反应的正向引物，5'-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3'为相应的反向引物， 以编码该蛋白的DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得带有酶切位点的目的片段，将目的基因 与载体双酶切后连接，连接产物转化到感受态细胞E. col iBL21 (DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂 固态培养基上培养，将长出的阳性克隆重组菌培养发酵，发酵液经离心通过超滤、硫酸铵沉 淀和离子交换方法分离纯化得到重组蛋白。该方法所得的重组菌表达量较高，抗肿瘤活性 好。
[0009] -种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白的制备方法，具体步骤如下：
[0010] 1)采用特异的引物对编码蛋白的基因进行扩增，扩增的同时在引物上设计Ncol和 HindllI的酶切位点，引物为：
[0011] Forward:5 '-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3 '
[0012] Reverse:5 '-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3 '
[0013] PCR扩增体系为：2 X ESTaqMasterMix25yL，上游引物2yL，下游引物2yL，DNA模板2μ L，加 FreeWater至50yL; PCR扩增条件为：90~96 °C预变性4~7min，90~96 °C变性30s，54~ 60°C退火3〇8,71~76°(：延伸0.9~1.2111丨11，循环25~35次，最后71~76°(：延伸8~1211^11 ; [0014] 2)用Ncol和Hindlll分别双酶切PET22b质粒和扩增产物，电泳后回收目的产物，然 后用T4DNA连接酶16°C过夜连接，将目的基因与载体连接，最后将连接产物转化到感受态细 胞E. col iBL21 (DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上，37 °C过夜培养，获得重组菌株，其 中氨苄浓度为90~12〇11^/1，琼脂浓度为1.8~2.2%;
[0015] 3)将重组菌株接种于灭菌后的初始发酵液中，在37°C，100~300r/min下，发酵培 养，待培养至0D600 = 0 · 7~1 · 0时，加入终浓度为0 · 8~1 · 2mM的IPTG，30°C，100~300r/min 诱导8~10h，得到发酵菌液，所述的初始发酵液，以质量分数计，包括0.8~1.5%的胰蛋白 胨，0.7~1.3 %的氯化钠，0.4~0.6 %的酵母提取物，余量为水；
[0016] 将发酵液离心，取上清，然后使用3kd、50kd的超滤膜截留；接着使用30%~60 %的 硫酸铵沉淀，将得到的沉淀重溶后透析、除盐;然后使用阳离子交换色谱，经过挂柱、洗脱， 得到纯化的活性蛋白。
[0017] 本发明还涉及一种海洋芽孢杆菌活性蛋白在作为制备治疗多种肿瘤疾病药物和/ 或保健品中得应用。它可以抑制多种肿瘤细胞的生长，具有开发成抗肿瘤药物和/或保健品 的潜力，所述的肿瘤细胞包括人肝癌细胞BEL-7402、人肝癌细胞HepG2、人卵巢癌细胞NIH-0VCAR、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人胶质瘤细胞U251和人肾透明细胞腺癌细胞786-0细 胞。
[0018] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0019]该方法能成功的构建出重组菌并能表达出具有活性的蛋白，目的蛋白产量高且该 蛋白具有较好的抗肿瘤活性，为该海洋芽孢杆菌活性蛋白在药物研发和医药保健中提供更 好的技术支持和物质基础，具有较好的研究和应用价值。
【附图说明】
[0020] 图1重组蛋白在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)的诱导表达及分离纯化。图示中Μ为 蛋白Marker，1为纯化的重组蛋白（方框内），2为未诱导重组菌，3为诱导的重组菌(方框内为 重组蛋白）。
[0021] 图2重组蛋白对人肝癌细胞BEL-7402细胞毒性图。
【具体实施方式】：
[0022]实施例一、重组菌的构建
[0023] 1)采用特异的引物对编码蛋白的基因进行扩增。扩增的同时在引物上设计Ncol和 HindllI的酶切位点，引物为：
[0024] Forward:5 '-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3 '
[0025] Reverse:5 '-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3 '
[0026] PCR扩增体系为：2 X ESTaqMasterMix25yL，上游引物2yL，下游引物2yL，DNA模板2μ L，加 FreeWater至 50yL。PCR 扩增条件为：90 °C 预变性 5min，94 °C 变性 30s，58 °C 退火 30s，73 °C 延伸1. Omin，循环30次，最后73°C延伸lOmin。
[0027] 2)用Ncol和Hindlll分别双酶切PET22b质粒和扩增产物，1%电泳后回收目的产 物。然后用T4DNA连接酶16°C过夜连接，将目的基因与载体连接。最后将连接产物转化到感 受态细胞E. coliBL21 (DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上，37°C过夜培养。其中氨苄 浓度为120mg/L，琼脂浓度为2.0 %。
[0028] 3)将长出的阳性克隆用菌液PCR、双酶切质粒和测序进行鉴定实施例二、重组菌的 发酵培养及重组蛋白的分离纯化
[0029]将重组菌株接种于灭菌后的初始发酵液中，在37°C，150r/min下，发酵培养，待培 养至0D600 = 0.70时，加入终浓度为1.02mM的IPTG，30°C，1500r/min诱导9h。得到发酵菌液。 所述的初始发酵液，以质量分数计，包括1.2 %的胰蛋白胨，1.0 %的氯化钠，0.5 %的酵母提 取物，余Μ为水。
[0030] 将发酵液于10000rmp、10min、4°C离心，取上清，然后使用3kd、50kd的超滤膜截留； 接着使用30 %~60 %的硫酸铵沉淀，将得到的沉淀重溶后透析、除盐;然后使用QFastFlow 阳离子交换色谱，经过挂柱、洗脱，得到纯化的活性蛋白。活性蛋白的纯度用SDS-PAGE方法 检测，检测结果见图1。
[0031] 实施例三：
[0032]活性蛋白对肿瘤细胞的抑制作用:本实施例中活性蛋白抑制检测的7种肿瘤细胞 株，证实活性蛋白具有广谱抗肿瘤作用。
[0033] 1.细胞培养及活性蛋白配制：
[0034] 将肿瘤细胞接种于多孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5^^02培养箱内 37°C培养不同时间，0.25%胰酶消化及传代。待测样品用PBS缓冲液稀释成多个浓度梯度并 用0.22μπι无菌滤膜过滤除菌。
[0035] 2.ΜΤΤ法检测活性蛋白对多种癌细胞生长的抑制作用
[0036] 取对数生长期的肿瘤细胞，胰酶消化成单个细胞悬液后，收集细胞悬液，细胞计 数。按每孔180yL接种于96孔细胞培养板中，调整细胞密度，使每孔中的细胞数目在4 X ΙΟ3 个左右，于细胞培养箱中37 °C培养，24小时后分别加入终浓度为0、0.5、1、2、5、10yg/mL的活 性蛋白，每个浓度设5个复孔，继续培养48h。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)30yL，培养箱中继续 孵育4h，终止培养，小心吸去上清，然后用排枪每孔加入150yLDMS0，溶解结晶，震荡混匀 lOmin，用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸收值，并计算细胞存活率和细胞的增殖抑制 率：
[0037] 细胞存活率（％) = (实验组A570平均值/空白对照组A570平均值）X100%，
[0038] 细胞增殖抑制率（％ ) = (0D对照组-0D样品处理组)/0D对照组X 100%，用改良寇 氏法计算IC5Q值。实验重复3次，数据以平均值土 SD表示。
[0039]实验结果分析：
[0040] 参见表1，从MTT结果分析显示，活性蛋白对人肝癌细胞ML-7402、人肝癌细胞 HepG2、人卵巢癌细胞NIH-OVCAR、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人胶质瘤细胞U251和人肾透 明细胞腺癌细胞786-0细胞具有明显的体外生长抑制作用。不同浓度的活性蛋白作用于 BEL-7402细胞后，活性蛋白浓度小于lyg/mL时，活性蛋白对肿瘤细胞生长抑制不明显，活性 蛋白浓度大于2yg/mL后，随着活性蛋白浓度的升高，肿瘤细胞存活率显著下降，结果见图2。 [0041 ]随着浓度的增加，活性蛋白对癌细胞的抑制率也增加；活性蛋白对BEL-7402、 拖口6241!1-0￥041?、％1-!1460、1]251和786-0细胞作用48小时的105()值分别为：2.55、2.56、 2.74、2.97、3.88和4.31以 8/11^，结果见表1。
[0042] 表 1
[0043]
【主权项】
1. 一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白，其特征在于所述蛋白的核苷酸序列为 SEQIDNO. 1，该序列能编码上述海洋芽孢杆菌蛋白。2. 根据权利要求1所述的一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白的氨基酸序列为 SEQIDNO.2。3. 权利要求1或2所述的一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白的制备方法，其特征 在于它包括构建原核表达载体，利用超滤和离子交换方法纯化重组蛋白，所述的表达载体 为PET22b，所用的酶为NcoI和HindIII，其中特异性引物5' -CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGT C-3 '为PCR扩增反应的正向引物，5 ' -CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3 '为相应的反向引 物，以编码该蛋白的DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得带有酶切位点的目的片段，将目的 基因与载体双酶切后连接，连接产物转化到感受态细胞E. coliBL21 (DE3)中，涂布在Amp/LB 琼脂固态培养基上培养，将长出的阳性克隆重组菌培养发酵，发酵液经离心通过超滤、硫酸 铵沉淀和离子交换方法分离纯化得到重组蛋白。4. 权利要求3所述的一种具有抗肿瘤活性的海洋芽孢杆菌蛋白的制备方法，其特征在 于它的具体步骤如下： 1) 采用特异的引物对编码蛋白的基因进行扩增，扩增的同时在引物上设计NcoI和 HindIII的酶切位点，引物为： Forward:5 '-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3 ' Reverse:5 '-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3 ' PCR扩增体系为：2 X ESTaqMasterMix25yL，上游引物2yL，下游引物2yL，DNA模板2yL，加 FreeWater 至 50yL;PCR 扩增条件为：90 ~96°C 预变性 4 ~7min，90 ~96°C 变性 30s，54~60°C 退火3〇8,71~76°(：延伸0.9~1.2111丨11，循环25~35次，最后71~76°(：延伸8~1211^11; 2) 用NcoI和HindIII分别双酶切PET22b质粒和扩增产物，电泳后回收目的产物，然后用 T4DNA连接酶16°C过夜连接，将目的基因与载体连接，最后将连接产物转化到感受态细胞 E. Co I iBL21 (DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上，37 °C过夜培养，获得重组菌株，其中 氨苄浓度为90~120mg/L，琼脂浓度为1.8~2.2 % ; 3) 将重组菌株接种于灭菌后的初始发酵液中，在37°C，100~300r/min下，发酵培养，待 培养至0D600 = 0 · 7~1 · 0时，加入终浓度为0 · 8~1 · 2mM的IPTG，30°C，100~300r/min诱导8 ~IOh，得到发酵菌液，所述的初始发酵液，以质量分数计，包括0.8~1.5 %的胰蛋白胨，0.7 ~1.3 %的氯化钠，0.4~0.6 %的酵母提取物，余量为水； 将发酵液离心，取上清，然后使用3kd、50kd的超滤膜截留；接着使用30 %~60 %的硫酸 铵沉淀，将得到的沉淀重溶后透析、除盐;然后使用阳离子交换色谱，经过挂柱、洗脱，得到 纯化的活性蛋白。5. 权利要求1或2所述的海洋芽孢杆菌活性蛋白在制备治疗肿瘤疾病药物和/或保健品 中的应用，所述的肿瘤包括人肝癌细胞BEL-7402、人肝癌细胞HepG2、人卵巢癌细胞NIH-0VCAR、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人胶质瘤细胞U251和人肾透明细胞腺癌细胞786-0细 胞。
【文档编号】C12N15/31GK105884871SQ201610280527
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】郑兰红, 杨康利, 朱美虹, 康道乐, 梁方方
【申请人】中国水产科学研究院黄海水产研究所