一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治水稻稻曲病方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植 物病害的芽孢杆菌及其用途，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
【背景技术】
[0002] 植物病害严重影响农林作物生长，甚至引起作物死亡，造成重大的经济损失。对于 植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病 品种周期长，抗性单一。化学防治使用药剂时间长、使用量大，造成农药残留，环境污染；同 时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。利用有益 微生物防治植物病害具有广阔的前景。
[0003] 芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧 的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，可以产生内生耐热抗逆的芽孢。芽孢不仅对热有抗逆性， 还对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性，它可以忍受各种不良环境。由于具 有如此强的抗逆性，使得它有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、 定殖与繁殖。由于它们生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆性能力的芽孢，在产品开 发中较非芽孢杆菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生 防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害 的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制， 芽孢杆菌的生防机制主要是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质 绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于高效防治水稻稻曲病的芽孢杆菌一一解淀粉芽孢 杆菌菌株QZ-003H。本发明的芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在水稻根 际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
[0005] 本发明所提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens) QZ-003H，是从土壤中分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 11051。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼 脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛 肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28 °C下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染 色呈阳性（以大肠杆菌为对照）。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
[0006] 本发明解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)菌株QZ-003H的培养方 法或繁殖方法包括：
[0007] (1)普通培养保存采用牛肉膏蛋白胨琼脂（NA)培养基，配方为：胰蛋白胨10g，牛 肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水lOOOmL，pH调至7. 0-7. 2 ;
[0008] (2)实验室液体培养采用牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，牛肉 膏3g，氯化钠5g，蒸馏水lOOOmL，pH调至L 0-7. 2 ;
[0009] (3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比I :L 8的比例配制。其中所 述固料由质量比为60 :40的玉米芯和麸皮组成；所述无机盐溶液的组分及质量百分比为： 3. 5%磷酸二氢钾，0. 04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水。
[0010] (4)大量发酵培养基配方：同（3)中固体培养基配方。
[0011] 本发明还公开了一种含有上述解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的生物防治制剂。
[0012] 本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
[0013] (1)制备解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的种子液；
[0014] (2)将步骤（1)制备的种子液接种到固体培养基中，28_30°C下恒温培养3~5d ;
[0015] (3)将步骤（2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养 基，在室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。
[0016] 其中，步骤（2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，二者质量比为I :1. 8 ; 其中所述固料由质量比为60 :40的玉米芯和麸皮组成；所述无机盐溶液的组分及质量百分 比为：3. 5%磷酸二氢钾，0. 04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水。
[0017] 并且，步骤（3)中的大量发酵培养基同固体培养基
[0018] 在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
[0019] (1)将解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 28-30 °C摇床振荡培养3~5d得到种子液；
[0020] (2)将步骤（1)制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28_30°C 下振荡培养3~5d ;
[0021] (3)将步骤⑵培养的培养物加入无菌水按质量比I :15的比例混合，过滤，将滤 液按体积比1 :6的比例接种至发酵培养基，室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中发 酵培养8~9d。
[0022] 本发明也提供了上述解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H或者上述生物防治制剂在防 治水稻稻曲病中的用途。
[0023] 本发明还提供了一种用于防治水稻稻曲病的方法，包括向具有水稻稻曲病的水稻 施用上述解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H或者上述生物防治制剂。优选方法为：水稻破口前 3-5天及破口后5-7天各施药1次，使用时应植株叶面喷雾，使用量为有效成分9000-15000 亿孢子/公顷，兑水750公斤/公顷。
[0024] 实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产芽孢量大、抗逆性 强，在水稻根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该解淀粉芽孢杆菌 制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，防治水稻稻曲病。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0026] 实施例1
[0027] 1、解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H的分离与纯化
[0028] 本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H是从土壤中采用稀释平板法和平板划线 法分离获得的，分离方法为：
[0029] ⑴芽孢杆菌的分离：土样的采集，在全国不同地区选取种植不同作物类型的地块， 采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。 标明采集地点、时间和采集人。称取Ig 土样于IOOmL无菌水中，置于30°C摇床中150rpm震 荡lOmin，然后置于60°C水浴锅中孵育30min，取100 μ L 10 2、10 3、10 4稀释液涂布于牛肉 膏蛋白胨培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30Γ培养2d后挑取牛肉膏蛋白胨培养 基上的不同形态的微生物菌落于牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长 情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。
[0030] ⑵水稻稻曲病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
[0031] ①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在芽孢杆菌、水稻稻曲病边缘 打取直径为5_的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25°C恒温培养，逐日观察芽孢杆 菌对病原菌的抑制作用。
[0032] ②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐 温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间 试验。
[0033] 本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的解淀粉芽孢 杆菌菌株QZ-003H。实验证明，该解淀粉芽孢杆菌原粉在防水稻稻曲病显示出非常高效的防 治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的解淀粉芽孢杆菌是具有广泛应用前景的解淀 粉芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。
[0034] 2、菌株鉴定
[0035] (1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或 不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28°C下培养两天 后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性（以大肠杆菌为对照）。经芽孢染 色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
[0036] (2)分子生物学特性
[0037] 该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下（SEQ-I):
[0039] 实施例2
[0040] I、芽孢杆菌菌株QZ-003H发酵过程
[0041] 牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水 lOOOmL，pH 调至 7. 0-7. 2。
[0042] 大量固体发酵培养基配方（质量百分含量）：固料：玉米芯60 %，麸皮40% ;所述 无机盐溶液的组分及质量百分比为：磷酸二氢钾3. 5%，硫酸镁0. 04%，硫酸铵4%，剩余为 水。固液比为1:1.8 (质量比）。
[0043] 解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H大量固体发酵过程：
[0044] ①菌种种子液培养：将解淀粉芽孢杆菌菌株QZ-003H从试管斜面中挑取少量细 菌，移至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30°C摇床振荡培养3~5d，此为种子液；
[0045] ②固体生产菌种的培养：将种子液按10%的比例接种到固体培养基（500