利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌，所述杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ?ID?NO.14所示。本发明采用进化工程与全基因组测序结合的方法，发现了有利于枯草芽孢杆菌利用木糖生长的基因突变，通过基因工程技术将点突变引入野生菌株，获得了能够利用木糖快速生长的重组枯草芽孢杆菌。
【专利说明】利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及三种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002]木质纤维素作为自然界广泛存在的可再生生物质资源，具有广阔的应用前景。而木糖是木质纤维素水解液中含量第二位的糖类，仅次于葡萄糖。因此有效地利用木糖是如何更好地高效地利用木质纤维素的关键因素之一。但目前已知的微生物中仅有少数具有很好的利用木糖的能力，包括枯草芽孢杆菌在内的众多重要工业微生物都不具有良好的木糖利用能力，甚至完全无法利用木糖。
[0003]目前关于枯草芽孢杆菌利用木糖的研究都基于传统的基因工程手段，通过敲除基因、更换基因启动子和过表达相应的基因等手段都能使得枯草芽孢杆菌获得利用木糖生长的能力，但这些通过传统方法所获得的工程菌株在含木糖的培养基中的生长能力和木糖消耗能力都较低。
[0004]而进化工程手段被广泛地用于底物利用改善等方面，通过微生物自身的进化突变，更直接地获得具有优良生长性状的菌株。但进化过程具有不确定性，伴随着有利突变产生的同时，一些无关的突变也可能产生，这些突变会造成菌株的基因组背景不明确，影响后续的基因工程操作，而有些突变甚至可能对菌株的某些特性产生负面的效果，限制了菌株今后的应用前景。因此无论通过基因工程手段还是进化工程方法改良菌株都具有明显的不足之处。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆`菌。
[0006]本发明的第二个目的是提供第二种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌。
[0007]本发明的第三个目的是提供第三种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌。
[0008]本发明的技术方案概述如下:
[0009]一种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),所述杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示。
[0010]一种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),所述杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，所述杆菌的sinR基因第319位T碱基被C碱基替换，碱基替换后的sinR基因序列如SEQ IDN0.15所示。
[0011]—种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),所述杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，所述杆菌的sinR基因第319位T碱基被C碱基替换，碱基替换后的sinR基因序列如SEQ IDN0.15所示，所述杆菌的comP基因第1121位T碱基缺失，碱基缺失后的comP基因序列如SEQ ID N0.16 所示。
[0012]本发明的优点:本发明采用进化工程与全基因组测序结合的方法，发现了三个有利于枯草芽孢杆菌利用木糖生长的基因突变，通过基因工程技术将点突变引入野生菌株，获得了能够利用木糖快速生长的重组枯草芽孢杆菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为菌株168AR有氧条件下发酵的生长曲线。
[0014]图2为菌株168ARSR有氧条件下发酵的生长曲线。
[0015]图3为菌株168ARSRCP有氧条件下发酵的生长曲线。
【具体实施方式】
[0016]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。
[0017]本发明为三种可以利用木糖生长的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分别命名为 168AR、168ARSR、168ARSRCP。
[0018]实施例1
[0019]通过进化工程获得可以利用木糖生长的枯草芽孢杆菌。
[0020]通过将枯草芽孢杆菌168 (源自BGSC，BGSC编号1A1，常用的革兰氏阳性菌生理研究模式菌株)在以木糖为碳源的基本盐培养基中连续传代培养，提高枯草芽孢杆菌利用木糖的生长能力。
[0021]具体操作如下:将枯草芽孢杆菌168先在额外添加葡萄糖至终浓度为lg/L的以木糖为碳源的基本盐培养基中培养，培养条件为37°C，220rpm,待菌体0D_约为2时转接至以木糖为碳源的基本盐培养基中培养，之后在菌体生长至0D_至2左右时在木糖为碳源的基本盐培养基中进行连续转接培养，转接72次后，分离到能在以木糖为碳源的基本盐培养基中以比生长速率0.4511-1生长的菌株，命名为E72。
[0022]以木糖为碳源的基本盐培养基的配方为:Na2HP046.8g/L, KH2P043.0g/L, NaCl0.5g/L, NH4Cll.0g/L, MgSO4.7H20246mg/L, CaCl216.6mg/L, FeCl2.6H2013.5mg/L, MnCl2.4H201.0mg/L, ZnCl2L 7mg/L, CuCl2.2H200.43mg/L, CoCl2.6H200.6mg/L, Na2MoO4.2H200.6mg/L,色氨酸 50mg/L,木糖 9g/L。
[0023]实施例2
[0024]将实施例1中所述枯草芽孢杆菌168及E72菌株委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组测序，通过比对两菌株全基因组序列，发现E72菌株的araR基因第184位A碱基被G碱基替换、sinR基因第319位T碱基被C碱基替换及comP基因在1121位T碱基缺失。
[0025]实施例3
[0026]为了能够将突变引入野生枯草芽孢杆菌168，需要使用不留抗生素标记的重组方案，采用参考文献I中所述方案。该方案中所需要的upp基因敲除菌株可以通过参考文献I中所述方式或其他 方式构建，本实施例中枯草芽孢杆菌168的upp基因敲除菌株构建过程如下:[0027]以pUC18质粒(购自Thermo公司)为载体,将upp基因上游同源臂、来源于pUBllO质粒(源于BGSC，为BGSC编号1E6菌株所含质粒)的卡那霉素抗性基因neo以及upp基因下游同源臂按上述顺序组装在一起，最终得到用于upp基因敲除的质粒pUCMupp,将pUCMupp质粒转化入枯草芽孢杆菌168中，使用卡那霉素筛选，经PCR验证得到upp基因敲除的出发菌株 168 Δ upp。
[0028]实施例4
[0029]将实施例2中所述的E72菌株中araR基因的突变序列引入实施例3所述的168 Aupp菌株。所获得168AR菌株构建过程如下:
[0030]利用扩增引物Pcul/Pcu2以质粒pHP13(源自BGSC，为BGSC编号1E50菌株所含质粒)为模板扩增含有pBMlori及氯霉素抗性基因cat的DNA片段，利用引物Pcu3/Pcu4以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，扩增upp基因及其启动子区，将上述2个DNA片段以XhoI/SalI及BamHI/Bglll位点连接并通过大肠杆菌DH5 α (购自Invitrogen公司)克隆,得到质粒ρ9⑶。
[0031]利用扩增引物ParaRl/ParaR2以Ε72基因组为模板，扩增含有araR基因第184位A碱基被G碱基替换突变的DNA片段，在SmaI位点克隆到质粒pUC18 (购自Thermo公司)中得到质粒pUCaraR。
[0032]利用扩增引物Pcu3/Pcu5以质粒p9CU为模板，扩增含有cat及upp基因的DNA片段,在AfeI位点克隆到质粒pUCaraR中，得到质粒pMaraR。
[0033]利用扩增引物ParaRl/ParaR2以pMaraR为模板进行扩增，所获得的片段转化入枯草芽孢杆菌168 Aupp，用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，并通过PCR验证，获得菌株168 ΔuppΔaraR。
`[0034]利用扩增引物ParaR3/ParaR4以E72基因组为模板，扩增含有araR基因第184位A碱基被G碱基替换的DNA片段，所获得的片段转化入枯草芽孢杆菌168 Δ upp Δ araR,用5-氟尿嘧啶筛选重组成功的阳性克隆，并通过DNA测序验证，获得菌株168AR，该菌株便是杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ IDN0.14所示的菌株。
[0035]将168AR菌株在以木糖为碳源的基本盐培养基中进行有氧摇瓶发酵，发酵液装液量为500ml规格的锥形瓶中含有50ml发酵液，培养条件为37°C，220rpm，结果如图1所示。
[0036]168AR菌株获得以木糖为碳源生长的能力，在有氧摇瓶发酵条件下其最大比生长速率为0.28h'因突变的序列公开，他人可以通过其他的方式构建本实施例中所构建的菌株，本实施例构建的168AR菌株仅为验证araR基因第184位A碱基被G碱基替换可以使168 Aupp菌株获得以木糖为碳源生长的能力。
[0037]实施例5
[0038]将实施例2中所述的E72菌株中sinR基因的突变引入实施例4中所述的168AR菌株，所获得168ARSR菌株构建过程如下:
[0039]利用扩增引物PsinRl/PsinR2以E72菌株基因组为模板，扩增含有sinR基因第319位T碱基被C碱基替换的DNA片段，在SmaI位点克隆到实施例4中所述的质粒p9CU中得到质粒p9QJ-sinR。
[0040]将质粒p9⑶-sinR转化入168AR菌株，用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，接入LB培养基中37°C 220rpm培养至0D600=2时，取5ul菌液涂布于含有5-氟尿嘧啶的平板37°C培养16小时筛选第二次重组成功的克隆，经PCR及DNA测序验证，获得菌株168ARSR，该菌株便是杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，杆菌的sinR基因第319位T碱基被C碱基替换，碱基替换后的sinR基因序列如SEQ ID N0.15所示的菌株。
[0041]将168ARSR菌株在以木糖为碳源的基本盐培养基中进行有氧摇瓶发酵，发酵液装液量为500ml规格的锥形瓶中含有50ml发酵液，培养条件为37°C，220rpm，结果如图2所示。
[0042]168ARSR菌株在以木糖为碳源的基本盐培养基中有氧摇瓶发酵比生长速率较168AR得到提高。因突变的序列公开，他人可以通过其他的方式构建本实施例中所构建的菌株，本实施例构建的168ARSR菌株仅为验证araR基因第184位A碱基被G碱基替换与sinR基因第319位T碱基被C碱基替换可以使168 Aupp菌株获得以木糖为碳源生长的能力，在有氧摇瓶发酵条件下其最大比生长速率为0.44h-1，最大菌体浓度为0D600=5.5。
[0043]实施例6
[0044]将实施例2中所述的E72菌株中comP基因的突变序列引入实施例5中所述的168ARSR菌株，所获得168ARSRCP菌株构建过程如下:
[0045]利用扩增引物PCOmPl/PCOmP2以E72菌株基因组为模板，扩增含有comP基因第1121位T碱基缺失的DNA片段，在SmaI位点克隆到实施例4中所述的质粒p9CU中得到质粒 p9CU_comP。
[0046]将质粒p9⑶-comP转化入168ARSR菌株，用氯霉素筛选重组成功的阳性克隆，接入LB培养基中37°C 220rpm培养至0D600=2时，取5ul菌液涂布于含有5-氟尿嘧啶的平板37°C培养16小时筛选第二次重组成功的克隆，经PCR及DNA测序验证，获得168ARSRCP菌株，该菌株便是杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ IDN0.14所示，杆菌的sinR基因第319位T碱基被C碱基替换，碱基替换后的sinR基因序列如SEQ ID N0.15所不，杆囷的comP基因第1121位T喊基缺失，喊基缺失后的comP基因序列如SEQ ID N0.16所示的菌株。
[0047]将168ARSRCP菌株在以木糖为碳源的基本盐培养基中进行有氧摇瓶发酵，发酵液装液量为500ml规格的锥形瓶中含有50ml发酵液，培养条件为37°C，220rpm，结果如图3所示。
[0048]168ARSRCP菌株在以木糖为碳源的基本盐培养基中有氧摇瓶发酵能获得较168ARSR更高的最大菌体浓度。因突变的序列公开，他人可以通过其他的方式构建本实施例中所构建的菌株，本实施例构建的168ARSRCP菌株仅为验证araR基因第184位A碱基被G碱基替换、sinR基因第319位T碱基被C碱基替换及comP基因第1121位T碱基缺失可以使168AUPP菌株获得以木糖为碳源生长的能力，在有氧摇瓶发酵条件下其比生长速率为
0.44h-1，最大菌体浓度为0D600=6.4。
[0049]表1菌株构建所用引物序列
[0050]
【权利要求】
1.一种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌，其特征是所述杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示。
2.一种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌，其特征是所述杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，所述杆菌的sinR基因第319位T碱基被C碱基替换，碱基替换后的sinR基因序列如SEQ ID N0.15所示。
3.一种利用木糖生长的重组枯草芽孢杆菌，其特征是所述杆菌的araR基因第184位A碱基被G碱基替换，碱基替换后的araR基因序列如SEQ ID N0.14所示，所述杆菌的sinR基因第319位T碱基被C碱基替换，碱基替换后的sinR基因序列如SEQ ID N0.15所示，所述杆菌的comP基因第1121位T碱基缺失，碱基缺失后的comP基因序列如SEQ ID N0.16所示。
【文档编号】C12R1/125GK103627663SQ201310664891
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】陈涛, 章博, 王智文, 赵学明 申请人:天津大学