一种拮抗放线菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物领域，具体涉及一种拮抗放线菌及其应用。

背景技术：

禾谷丝核菌，拉丁名rhizoctoniacerealis，属无孢霉目真菌类。可引起小麦、大麦、玉米、水稻的纹枯病，是我国小麦种植区普遍发生、危害严重的一种土传性真菌病害。

禾谷丝核菌侵染引起的小麦纹枯病是一种世界性病害。在我国近20个省（市）都有不同程度的发生和危害，以江苏、浙江、安徽、山东、河南、陕西、贵州、湖北及四川等省麦区发生普遍，危害严重，轻者产量损失5%-10%，重者减产20%-40%。甚至造成枯孕（白）穗而颗粒无收。近年来，由于小麦品种、栽培措施和肥水条件的改变，纹枯病危害逐渐加重，己成为影响小麦稳产高产的重要障碍。目前对小麦纹枯病的防治是在农业防治的基础上进行药剂防治，药剂防治主要用三唑类杀菌剂迸行“一喷一拌”。由于纹枯病发生在小麦茎基部，防治方法不当则效果不理想。而且长期连续地使用化学农药，易导致一系列严重后果：使病菌产生抗药性、农药残留造成环境污染以及威胁人类的健康等。生物防治则是利用生物及其代谢产物防治植物病虫害，可避免化学农药使用带来的一系列环境和能源方面的问题，促进农业的可持续发展。小麦纹枯病的生物防治研究目前还处于开始阶段，筛选有效控制小麦纹枯病的生防菌、研究生防菌的控病机理将为小麦纹枯病的生物和生态防治提供一定的理论基础，使其成为小麦纹枯病综合治理中的重要环节。

平脐蠕孢菌（bipolarissorokiniana）和黄色镰孢菌（fusariumculmorum）不仅可以引起小麦的根腐病，还可以侵染玉米、水稻、多种蔬菜甚至牧草，引起根腐病。近些年小麦根腐病发生严重，小麦种子的带菌率比较高，一般病田发病率为1%~5%，较重病田发病率在10%左右。小麦根腐病对小麦产量的影响比较大，一般病田减产10%~30%，严重地块会减产30%~70%（李可凡等，2003）。在我国，防治小麦根腐病比较常用的农药有三唑酮、三唑醇、克菌丹、福美砷、退菌特、赛力散等，一般采用药剂拌种的方法，采用药剂拌种与田间药剂喷施相结合的方法，能更有效的减轻小麦根腐病的为害程度。李可凡等（2003）小麦开花始期施用喷洒25%粉锈宁可湿性粉剂或50%的福合剂，每公顷用商品药量1500g，可控制叶部病害的发展，有较好的防病增产的效果。朱统泉等（2005）研究发现，使用立克秀、禾果利拌种对小麦纹枯病和根腐病的防治效果较好。化学农药的使用会造成环境污染、农药残留，同时化学农药的长期并且超标使用，严重危害甚至破坏农业生态系统，同时杀死了环境中的有益微生物，提高了植物病原菌的抗药性，最终致防治效果下降甚至防治失败。发展生物防治是当前研究的一大趋势。

技术实现要素：

为解决现有技术上的不足，本发明目的是提供一种拮抗放线菌，可用于禾谷丝核菌、平脐蠕孢菌和/或黄色镰孢菌引起的多种农作物病害的生物防治。

本发明的技术方案如下：

一种拮抗放线菌，保藏编号为cgmccno.9793的海棠链霉菌(streptomycesspectabilis)fx-h-51。

优选的，所述放线菌培养温度为28℃，摇床转速为200r/min，培养时间为7d。

所述的放线菌在生物防治中的应用。

优选的，所述的放线菌在防治禾谷丝核菌、平脐蠕孢菌和/或黄色镰孢菌引起的病害中的应用。

优选的，所述的放线菌在防治小麦纹枯病、小麦根腐病中的应用。

所述放线菌可以制备放线菌菌剂。

优选的，拮抗放线菌菌剂，其活性成分为如下(a)、(b)、(c)、（d）和（e）中的至少一种：

（a）权利要求1所述放线菌；

（b）权利要求1所述放线菌的发酵上清液；

（c）权利要求1所述放线菌的发酵培养物；

（d）权利要求1所述放线菌的发酵上清液的提取物；

（e）权利要求1所述放线菌的发酵培养物的提取物。

优选的，通过以下方法提取活性物质:溶媒萃取、旋转蒸发、柱层析、薄层层析等技术对发酵液中的抑菌活性物质进行分离提纯。

优选的，萃取剂为乙酸乙酯。

优选的，以氯仿︰甲醇=20︰1进行层析。

本发明的有益效果是：本发明是一种高效拮抗禾谷丝核菌、平脐蠕孢菌和/或黄色镰孢菌等多种农作物病害的放线菌，放线菌及其发酵上清液、发酵培养物、相关提取物，在小麦、玉米、水稻等多种病害的生物防治上具有重要意义，本发明的应用可以减轻化学防治带来的生态环境污染、人畜危害等问题，降低农业生产投入，减轻环境压力。

生物样品保藏信息如下：

海棠链霉菌(streptomycesspectabilis)fx-h-51，于2014年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.9793。

附图说明

图1是土壤分离的部分放线菌。

图2是拮抗放线菌fx-h-51菌株的菌丝、孢子形态；其中左图是菌丝形态；右图是菌丝与孢子形态。

图3是拮抗放线菌fx-h-51菌株生理生化特性测定结果。其中a是明胶液化实验结果;b是牛奶凝固与胨化实验结果;c是淀粉水解实验结果;d是纤维素水解实验结果。

图4是拮抗放线菌fx-h-51菌株16srdna扩增结果。

图5是拮抗放线菌fx-h-51菌株与相关菌株的系统发育树。

图6是温度对放线菌fx-h-51菌株发酵产物抑菌活性的影响结果。

图7是初始ph对放线菌fx-h-51菌株发酵产物抑菌活性的影响结果。

图8是摇床转速对放线菌fx-h-51菌株发酵产物抑菌活性的影响结果。

图9是发酵培养基装液量对放线菌fx-h-51菌株发酵产物抑菌活性的影响结果。

图10是不同发酵时间对放线菌fx-h-51菌株发酵产物抑菌活性的影响结果。

图11是发酵培养条件趋势图。

图12是放线菌对小麦纹枯病、根腐病的防治效果图。其中1代表fx-h-71；2代表fx-h-51；3代表fx-s-178；4代表fx-s-114；5代表fx-h-51和fx-h-71混合；6代表fx-h-71和fx-s-178混合；7代表fx-h-51和fx-s-178混合；8代表fx-h-51、fx-h-71、fx-h-178混合；9代表空白对照。

图13是放线菌防治禾谷丝核菌（wk-207）引起小麦纹枯病效果（左：对照右：fx-h-51处理）。

图14是放线菌防治镰孢菌（wf25）引起的小麦根腐病结果（左：对照右：fx-s-178处理）。

图15是防治蠕孢菌引起的小麦根腐病结果（左：对照右：fx-h-51、fx-h-71、fx-s-178混合处理）。

图16是发酵液热稳定性试验。

图17是发酵液酸碱稳定性试验图。

图18是发酵液紫外线稳定性试验图。

图19是溶媒萃取结果。

图20是薄层层析结果。

图21是薄层层析结果。

图22是色谱条带抑菌活性。

图23是第二次硅胶层析的tlc结果图。

图24是样品对禾谷丝核菌的拮抗作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述：

实施例1拮抗放线菌来源和筛选

1.样本采集

2012～2013年，分别从陕西、山西、甘肃等地的苹果园以及山东各地小麦田中采集土样50多份，其中苹果园中采集的为果树根际重茬土，小麦田中采集的为根际土。共计分离得到217株放线菌，见图1（仅为部分分离菌株）。

2.放线菌的分离纯化

采用稀释涂布法，选用高氏1号培养基进行分离，抑菌剂为重铬酸钾（80mg/l）。取10g土样，加入到90ml灭菌水中，摇瓶30min，静止20min，取上清液，用无菌水分别稀释到10-2、10-3、10-4，用移液枪取0.1ml稀释后的菌液到高氏1号培养基平板上，然后用无菌涂布器进行平板涂布，25℃倒置培养两周。用接种环挑取形态各不相同的单菌落接种到不含重铬酸钾的高氏1号培养基平板上培养，再经过多次挑取单菌落到培养基平板上进行纯化，将纯化后的菌株进行试管斜面4℃编号保存。

3.拮抗放线菌的初步筛选

将纯化后的放线菌进行拮抗活性测定，记录具有较好抑制效果的菌株。采用平板对峙法（王兰英等，2006）：将分离到的放线菌接种到高氏1号培养基上，供试靶标真菌接种到pda平板上，分别培养。7d后用直径5mm的打孔器打取靶标菌菌饼，接种在pda平板中央，同样方法取放线菌菌饼，等距离接种在靶标菌两侧，以不接放线菌，只接种靶标菌作为对照，25℃培养4～7d，每处理重复3次。观察放线菌各菌株对靶标菌的抑菌效果，选取有明显抑菌圈的菌株作为复筛菌株。

表1拮抗放线菌对禾谷丝核菌的抑制作用

表2拮抗放线菌对小麦根腐病菌的抑制作用

试验结果表明，184株放线菌对峙小麦纹枯病致病菌禾谷丝核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis），其中抑菌圈半径超过5mm的放线菌48株，其中拮抗效果最明显的放线菌为fx-h-51，抑菌半径达16.75mm，见表1。选取对小麦纹枯病菌抑菌半径达8mm以上的放线菌对小麦根腐病致病菌黄色镰孢菌（wf25，fusariumculmorum）、平脐蠕孢菌（wb112，bipolarissorokiniana）进行拮抗试验，抑菌圈半径超过5mm的放线菌分别有5株、7株，见表2。

4.拮抗放线菌的复筛

利用灰色关联度分析法对初步筛选得到的4株放线菌菌株的生防效果及其耐性进行综合评判（徐文凤等，2011；郭建博等，2007；徐文凤等，2012）。生防效果测定以禾谷丝核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis）属agd融合群为靶标菌，进行平板对峙时,不同放线菌的抑菌效果作为判定依据。耐性试验主要包括不同放线菌对温度、酸碱性、抗生素等耐受能力，其中放线菌的耐低温性是以10℃条件下培养6d的菌落直径表示，耐高温性是以40℃条件下培养6d的菌落直径表示；耐酸性以ph=3时，菌株在25℃条件下培养6d的菌落直径表示；耐碱性是以ph=11时，菌株在25℃条件下培养6d的菌落直径表示；对链霉素的耐性测定是以菌株在含链霉素为1mg/l的高氏1号培养基上培养6d后的菌落直径表示。

根据灰色系统理论，将所有供试菌株视为一灰色系统，每一菌株都是系统中的单一的灰因素，作为参考数列χ0的是“理想菌株”各项性状性质指标构成的数列，作为比较数列χi（i=1、2、3…7）是供试菌株各项性状性质指标构成的数列，将参考数列χ0与比较数列χi进行数据量化处理，求出各供试菌株与参考菌株的关联度，并按关联度大小排出关联序。

综合初筛结果选取4株放线菌菌株fx-h-51、fx-h-71、fx-s-114、fx-s-178，进行灰色关联度分析，结果如表3所示：在对靶标菌的抑制作用、对链霉素的抗性上菌株fx-h-51的效果较好；在耐高温性、耐酸碱性上菌株fx-s-114的耐受性较好；在耐低温性上菌株fx-s-178的耐受性较好。

表3四株放线菌的生防性状测定结果

表4供试菌株的灰色关联度及排序

根据灰色关联分析，关联度越大的菌株，其与参考菌株越接近，综合性能越好。由表4中可以看出，菌株fx-h-51的灰色关联度r0i=0.9025最大，表明菌株fx-h-51的综合性状与构建的理想菌株最接近，是比较理想的拮抗丝核菌的放线菌菌株。其次是菌株fx-s-114、fx-s-178，而菌株fx-h-71的灰色关联度最小，表明其菌株的综合性状与构建的理想菌株相差最大。

实施例2拮抗放线菌fx-h-51的鉴定

参照《链霉菌鉴定手册》（周德庆等，1986）和《微生物学实验手册》（中科院微生物研究所，1975）的相关内容进行形态学特征、生理生化鉴定。培养特征观察培养基包括高氏1号培养基、伊莫松培养基、、察氏培养基、葡萄糖-天门冬素培养基、无机盐淀粉培养基、马铃薯块培养基。生理生化特征试验培养基包括明胶液化培养基、牛奶凝固胨化培养基、淀粉水解培养基、纤维素水解培养基、硝酸盐还原培养基、格里斯氏试剂a液、格里斯氏试剂b液、硫化氢产生培养基。

1.形态特征观察

通过复筛，筛选出生防效果好、耐性较强的菌株fx-h-51。采用插片法、载片培养法观察菌株fx-h-51形态。插片法：主要观察菌株的气生菌丝和基内菌丝的形态结构、生长状况。将拮抗放线菌fx-h-51菌株在高氏1号培养基平板上划线，然后将盖玻片45°斜插在培养基上，使菌丝能够沿着盖玻片与培养基交界处生长并附着于盖玻片上，25℃恒温培养7d，置于光学显微镜下观察并记录菌落的形态结构、气生菌丝和基内菌丝的结构、生长状况以及有无可溶性色素及其颜色。载片培养法：用于观察菌株的孢子和孢子丝形态。将高氏1号培养基滴在载玻片上，接种菌株，盖上盖玻片，25℃恒温培养7d后，置于光学显微镜下观察孢子丝和孢子的形态。

拮抗放线菌fx-h-51菌株在高氏1号培养基上25℃恒温培养7d后观察形态特征，见图2。试验结果表明，该菌株菌落生长繁茂，边缘不规则向四周扩散，菌落呈现橙红色，表面绒状隆起且干燥不透明。气丝直杆状，浅粉色，基丝橙红色，无横隔，孢子椭圆形，表面光滑。

2.培养特征观察

将菌株fx-h-51分别接种在高氏1号、伊莫松、察氏、葡萄糖-天门冬素、无机盐淀粉及马铃薯块培养基上（刘姝等，2007），25℃恒温培养，分别在7、14、28d观察菌株的培养特征和颜色变化。观察并记录气生菌丝和基内菌丝的生长状况及其颜色、有无可溶性色素等特征。

表5拮抗放线菌fx-h-51菌株的培养特征

25℃恒温培养7d后观察拮抗放线菌fx-h-51菌株的培养特征。试验结果表明，拮抗放线菌fx-h-51在伊莫松、葡萄糖-天门冬素、马铃薯块培养基上生长状态良好，在高氏1号、察氏、无机盐淀粉培养基上生长状况很好，菌落圆形、隆起、粉状、在培养基上不产生可溶性色素。fx-h-51菌株在6种不同培养基上的培养特征见表5。

3.生理生化特征测定

（1）明胶液化

放线菌能够分泌明胶酶，这种酶可以分解明胶，使其无法凝固从而呈现液体状态。将菌株fx-h-51接种于装有明胶的试管中，25℃恒温培养，以未接种菌株的明胶培养基作为空白对照，分别在5、10、20d观察液化程度。观察前应冷却30min后，查看明胶的液化程度，若试管中明胶出现液体，说明明胶已液化或部分液化，反之说明明胶未液化。

（2）牛奶凝固与胨化

将菌株fx-h-51接种于装有牛奶的试管中，25℃恒温培养，以未接种菌株为空白对照，分别在3、6、10、20、30d，观察牛奶是否出现凝固、胨化。若牛奶呈现透明或半透明状，为胨化现象(denisek.zinnieletal，2014)，测定的是菌株产生蛋白酶的能力。

（3）淀粉水解

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌块，接种于淀粉水解培养基平板上，25℃恒温培养7d，以未接种菌块的培养基为空白对照。7d后，在菌落周围滴加卢戈氏碘液，铺满平板，几分钟后将多余的碘液倒出，若在菌块周围培养基出现透明圈，说明菌株fx-h-51产生淀粉酶；若菌块周围培养基没有透明圈，说明菌株fx-h-51不产生淀粉酶。透明圈的大小表示该菌株产生淀粉酶能力的强弱或水解淀粉能力的强弱。

（4）纤维素水解

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌块，接种于纤维素水解培养基上，25℃恒温培养7d，以未接种该菌株的培养基作空白对照。7d后，在培养基上加入1mg/ml刚果红溶液，10～15min后，倒去刚果红溶液，再加入1mol/l的nacl溶液，15min后倒掉nacl溶液。若在菌块周围培养基出现透明圈，说明该菌株产生纤维素酶，透明圈的大小表示该菌株分解纤维素的能力的强弱。

（5）硝酸盐还原反应

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌块，接种于硝酸盐还原培养基上，25℃恒温培养7d，以未接菌种的硝酸盐还原培养基为空白对照。检测时，取1ml菌液加到试管中，格里斯氏试剂a、b液各加2滴，若有亚硝酸盐存在会使菌液呈现红色、棕色或橙色等，为阳性反应。若无红色出现，则再加2滴二苯胺试剂，若菌液呈蓝色，表示无亚硝酸盐存在，标定为阴性，不成蓝色标定为阳性。

（6）硫化氢产生试验

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌块，接种于硫化氢产生培养基上，25℃恒温培养7d，已未接菌种的培养基为空白对照，观察菌落周围培养基是否变黑。若菌落周围变黑，说明该菌株能够产生硫化氢；反之，则表示该菌株不能产生硫化氢。

生理生化测定结果表明，拮抗放线菌fx-h-51菌株能使明胶全部液化，牛奶凝固且胨化，能够水解淀粉跟纤维素，但水解纤维素能力较弱，硝酸盐不还原，不产生硫化氢。见表6及图3。

表6拮抗放线菌fx-h-51菌株的生理生化特性测定结果

注：+代表发生；—代表不发生。

4.分子生物学鉴定

放线菌fx-h-51菌株总dna的提取方法参考徐平等人的方法（徐平等，2003；姜淑梅等，2007）但有所改进。提取步骤如下：

（1）将菌株fx-h-51接种到铺有玻璃纸的高氏1号培养基平板上，在25℃恒温培养5d左右，待菌落形成后，刮取菌落于离心管中。

（2）加入300μl～500μlte，振荡悬起沉淀并充分混匀反应液。

（3）加入1/100体积浓度10mg/ml的溶菌酶，1/100体积浓度20mg/ml的蛋白酶k，倒管并充分混匀反应液，37℃反应30min。

（4）加入1/10体积的10%sds和0.5mol/ledta，倒管充分混匀，55℃反应1h。

（5）加入2/3体积7mol/l预冷乙酸铵溶液，倒管充分混匀，10000r/min，保留上清。

（6）加入2倍体积无水乙醇-20℃醇沉30min，12000r/min离心5min，弃上清。

（7）加入70%乙醇倒管洗沉淀2次，每次1ml，12000r/min离心5min，小心弃上清。

（8）真空抽干沉淀并溶入50μlte，4℃保存备用。

取提取dna5μl上样，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下观测所提取dna的质量。

目的片段pcr扩增

根据16srdna的结构特点及其保守区使用特异引物，序列为：

正向引物27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′

反向引物its4：5′-tacggctaccttgttacgactt-3′

pcr扩增选用50μl反应体系，反应程序如下：

表7pcr反应程序

扩增反应条件：

用于pcr扩增的各种试剂（dntpmixture、l0×buffer、taqdna聚合酶）由北京全式金生物技术有限公司提供，扩增引物由上海生工生物技术有限公司。

扩增结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，1倍tbe为电泳缓冲液，上样量5μl。通过凝胶成像系统观察并拍照。

使用takaraminibestdnafragmentpurificationkitver.4.0试剂盒纯化回收扩增片段。

1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1倍tbe，加样3μl进行回收产物检测。

特异扩增片段的克隆

克隆载体采用peasy-t3载体，由北京全式金生物技术有限公司提供，克隆感受态细胞为大肠杆菌dh-5α。

（1）克隆反应体系的建立

在微型离心管中加入pcr回收产物3.7μl、peasy-t3载体0.3μl，轻轻混匀，室温反应10min，冰浴5min。

（2）转化

a、加连接产物于33μldh-5α感受态细胞中，混匀，冰浴反应25min。

b、42℃热激90s，立即置于冰上5min。

c、加入800μllb液体培养基，200rpm，37℃孵育1h。

d、8000rpm离心2min，去除部分上清，保留100~150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液均匀涂布含氨苄青霉素lb平板，培养过夜。

（3）单克隆检测

挑取平板上长出的单克隆于lb/amp⁺液体培养基中，200rpm，37℃培养过夜。以培养的菌液为模板，进行pcr检测。

（4）序列测定及分析

将含有目的片段的克隆委托铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。用dnaclub软件对每一序列的正向(5′-3′)和反向(3′-5′)进行核对，并生成5′-3′的完整序列。利用blast，从genbank、ncbi等公共数据库中进行相似性查询，选出同源性最高且有效发表的典型菌株序列，用clustalx进行序列比对，最后用mega4.0构建系统进化树，来确定放线菌的亲缘关系和分类地位。

拮抗放线菌fx-h-51菌株分子生物学鉴定如下：

通过pcr方法克隆拮抗放线菌fx-h-51菌株的16srdna，并进行基因测序，获得16srdna序列，共1447bp,16srdnapcr扩增序列见seqidno:1。电泳结果见图4。

在ncbi数据库中查询与菌株fx-h-51相近的16srdna序列，与其同源性较高的菌株均属于链霉菌属；最后利用mega4.1软件构建系统发育树，见图5。通过blast相似性分析，放线菌fx-h-51菌株与海棠链霉菌（streptomycesspectabilis）的16srdna序列同源性最高，并且在系统发育树中聚于同一分枝中。

实施例3菌株fx-h-51发酵条件优化

微生物的发酵除了受到培养基的氮、碳以及微量元素影响之外，还要受到培养时间、ph、摇床转速、装液量、温度等因素的影响，是一个十分繁杂的过程（王永宏等，2006）。因此，需要把优化的各种因素充分组合在一起才能发挥菌种的生产潜力。

1实验材料

（1）供试菌种

放线菌fx-h-51菌株，经过分离、筛选获得

供试病原菌：丝核菌wk207由本实验室提供

（2）培养基

活化培养基：高氏1号培养基

发酵培养基：麦芽糖50.3g、胰蛋白胨9.6g、nacl2.5g、caco32.0g、蒸馏水1000ml。

2单因素试验初步优化放线菌fx-h-51菌株的发酵条件

（1）温度对发酵滤液抑菌作用的影响

温度对菌株的发酵有很大的影响，尤其是在改变发酵过程中酶的活性上，并且温度还能够改变氧的溶解度和传递速率（田黎等，2003）。

本实验将ph为7的100ml发酵培养基装入250ml三角瓶中，分别置于22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，160r/min振荡培养6d后，测定发酵液对小麦纹枯病菌的抑制效果，以测定菌株最佳的发酵温度。

结果显示（图6），当发酵温度在28℃时，对禾谷丝核菌的抑制作用相对最高，抑菌直径达到34.67mm。当温度为22℃、37℃时，对禾谷丝核菌的抑制作用相对较低，抑菌直径分别为23.67mm、26.50mm。

（2）初始ph值对发酵滤液抑菌作用的影响

将100ml发酵培养基装入250ml三角瓶中，ph值分别调成4、5、6、7、8、9、10、11，25℃、160r/min振荡培养6d后，测定发酵液对小麦纹枯病菌的抑制效果，以测定菌株发酵的最佳初始ph。

结果表明（图7），当ph为8时，对禾谷丝核菌的抑制作用最好，抑菌直径达37.17mm，当ph为4时，抑菌作用最小，直径为23.17mm。由此可见，该菌在初始ph为3时，产生抑菌活性物质的能力较弱。

（3）摇床转速对发酵滤液抑菌作用的影响

将ph为7的100ml发酵培养基装入250ml三角瓶中，摇床转速分别设置为160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min，25℃振荡培养6d后，测定发酵液对小麦纹枯病菌的抑制效果，以测定菌株发酵的最佳摇床转速。

结果表明（图8），当转速为200r/min时，对禾谷丝核菌的抑菌作用最大，抑菌直径可达34.50mm；当转速为240r/min时，抑菌作用较差，抑菌直径为28.50mm。

（4）装液量对发酵滤液抑菌作用的影响

将ph为7的发酵培养基装入250ml三角瓶中，装液量分别设置为50ml、75ml、100ml、125ml、150ml，25℃、160r/min振荡培养6d后，测定发酵液对小麦纹枯病菌的抑制效果，以测定菌株发酵的最佳装液量。

结果表明（图9），当装液量为100ml时，对禾谷丝核菌的抑菌作用最大，抑菌直径可达33.67mm；当转速为150ml时，抑菌作用较差，抑菌直径为28.84mm。

（5）发酵时间对发酵滤液抑菌作用的影响

将ph为7的100ml发酵培养基装入250ml三角瓶中，25℃、160r/min振荡培养，发酵时间分别设置为3d、5d、7d、9d、11d，测定发酵液对小麦纹枯病菌的抑制效果，以测定菌株的最佳发酵时间。

结果表明（图10），当发酵时间为7d时，对禾谷丝核菌的抑菌作用最大，抑菌直径可达34.00mm；当发酵时间为3d时，抑菌作用较差，抑菌直径为20.00mm。

3菌株fx-h-51发酵条件的正交试验

通过对前面单因素的试验，确定了三个单因素为主要影响条件：发酵温度、摇床转速和发酵时间，进行l9（3⁴）正交试验，各个因素水平如下表：

表8因素水平表

根据正交试验，来确定最优发酵培养条件。见表9-11和图11。

表9中的9个处理结果表明，第5个处理的抑菌直径最大，为34.6mm，说明抑菌效果较好，相应的水平组合为a2b2c3，培养条件是28℃、7d、220r/min。从图11的趋势图可以看出，最佳组合是a2b2c2，培养条件是28℃、7d、200r/min。这组试验并没有包括在正交试验设计表中，为了检验一下真实结果是否与试验推测的结果相吻合，所以又追加了a2b2c2试验处理，追加的a2b2c2试验处理的抑菌直径为35.7mm，发酵菌液表现出较高的抑菌效果。

表9正交设计表l9（3⁴）

表10正交试验方差分析表

表11极差分析表

表10表明，培养温度和培养转速的水平间存在显著差异，而培养时间三个水平间不存在显著差异。从表11中还可以看出，温度在各因素中影响最大，其次是转速、时间。因此，通过正交设计试验优化的最佳发酵培养条件是28℃、200r/min，7d。

实施例4拮抗放线菌防治小麦纹枯病、根腐病的温室实验

选取4株对小麦纹枯病菌（wk-207）、根腐病病原菌（wb112、wf25）有较好抑制效果的放线菌菌株fx-h-51、fx-h-71、fx-s-114、fx-s-178，对其各自及组合的菌液进行温室盆栽试验，测定不同放线菌菌株对小麦纹枯病、根腐病的生防效果。

具体方法：4株放线菌菌株划线接种在高氏1号培养基上，25℃培养7d，然后打取菌块接种于装有100ml液体发酵培养基的250ml的锥形瓶中，200r/min振荡培养7d，以小麦纹枯病致病菌禾谷丝核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis）和小麦根腐病致病菌菌平脐蠕孢菌（wb112，bipolarissorokiniana）、黄色镰孢菌（wf25，fusariumculmorum）作为靶标菌，取3种病原真菌分别接种在麦粒培养基中，25℃培养7d，进行扩大繁殖，作为病原菌接种体。将供试小麦种子播于装有土壤的盆中，每盆10粒，小麦种子均匀分布于盆中，每粒小麦种子附近接入1粒接种体，然后用土壤覆盖。取5ml放线菌菌液均匀洒入盆中。以不接放线菌菌液的为对照，每个处理3个重复，每隔3～4d定量浇水，30d后调查发病情况。

小麦纹枯病严重度分级标准（徐娜娜等，2014）：

0级：不发病

1级：小麦植株叶鞘外部发病，且病斑长度小于叶鞘1/2

3级：小麦植株叶鞘外部发病，且病斑长度大于叶鞘1/2

5级：小麦植株叶鞘外部发病，并侵入茎，且病斑长度环茎不足1/2

7级：小麦植株叶鞘外部发病，并侵入茎，且病斑长度环茎超过1/2

9级：植株枯死

小麦根腐病严重度分级标准（李鹏昌等，2014）：

0级：不发病

1级：小麦植株茎基部外部叶鞘变黑褐色，且病斑长度小于叶鞘的1/2

3级：小麦植株茎基部外部叶鞘变黑褐色，且病斑长度大于叶鞘的1/2

5级：小麦植株茎基部内部叶鞘变黑褐色，且病斑长度小于叶鞘的1/2

7级：小麦植株茎基部内部叶鞘变黑褐色，且病斑长度大于叶鞘的1/2

9级：根部腐烂，植株死亡

从图12可以看出，每个处理对小麦纹枯病、根腐病都有一定的防治效果，在防治小麦纹枯病上处理2防治效果最好，达到81.20%，即菌株fx-h-51防治效果最好；在平脐蠕孢菌引起的小麦根腐病的防治上，处理8即fx-h-51、fx-h-71、fx-h-178组合防治效果最好达到75.10%；在黄色镰孢菌引起的小麦根腐病防治上，处理3即fx-s-178的防治效果最好，达到76.53%。防治效果如图13-15所示。

实施例5放线菌fx-h-51菌株发酵液稳定性实验

农用抗生素不管是施用在作物表面，还是深入到土壤中，都要受到阳光、温度以及土壤酸碱度的影响，因此，农用抗生素在不同环境下的稳定性成为了评价其是否有开发利用价值的一个重要指标（朱昌雄等，2002）。另外，在活性物质的提取、精制以及加工过程中，也需要对其有效成分进行光、热、ph条件下稳定性的测定（nobilimdcetal，2001）。

按照实施例3试验优化后的发酵条件获得放线菌fx-h-51的发酵液，再经过离心、过滤得到上清液，然后测定发酵液的稳定性。

1.发酵液对热的稳定性测定

取5份发酵液，分别置于10℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃处理60min后，待自然冷却到室温（张玲玲等，2009）。以无菌水作为空白对照，丝核菌wk-207作为靶标菌，采用抑制菌丝生长速率法测定生物活性（慕立义等，1994），试验重复3次，25℃培养箱中培养4d后，观察并测量菌丝直径，从而确定其热稳定性。

试验结果表明，温度对发酵液的稳定性有较大的影响。低温时发酵液的抑菌活性比较稳定，抑菌效果较好，抑菌直径达到35.33mm；40℃以后，随着温度的升高，抑菌效果降低，但到100℃，抑菌效果仍未完全丧失。见图16，因此，该发酵液的抑菌活性物质不耐热，保存温度不宜高于40℃。

2.发酵液对酸碱的稳定性测定

取5份发酵液，分别用1mol/lhcl和1mol/lnaoh调ph至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0静置2h后，再分别用1mol/lnaoh和1mol/lhcl调至中性，以无菌水为对照，重复3次，方法同上，确定其ph稳定性。

试验结果表明，发酵液的抑菌活性在ph值为3～11的条件下抑菌效果变化不大，但在ph值为7时的抑菌效果最好，抑菌直径达到31.50mm。因此，说明该发酵液的抑菌活性物质在酸碱环境下有较高的耐受性。见图17。

3.发酵液对紫外线的稳定性测定

取5份发酵液，在紫外线下分别处理0min、5min、15min、25min、35min、45min后，以无菌水为对照，重复3次，方法同上，确定其光稳定性。

试验结果表明，发酵液在受到紫外线不同时间照射后，对禾谷丝核菌抑菌效果有影响，发酵液的抑菌活性随紫外线照射时间的延长逐渐降低。发酵液经紫外线照射5min后，对禾谷丝核菌的抑菌直径为39.67mm，照射45min后，对供试菌的抑菌直径为35.83mm，与照射5min时的抑菌活性相比，有所下降。见图18。

实施例6放线菌fx-h-51菌株发酵产物抑菌活性成分分离纯化和抑菌实验

一般情况下，发酵液中含有一些菌体代谢副产物，这些杂质的含量会远远高于活性物质千百倍，尤其是这些杂质的理化性质与活性物质极其相似（高群等，2007），因此，清除发酵液中的杂质是后续工作顺利进行的前提。

1材料

（1）培养基

活化培养基：高氏1号；发酵培养基：优化后的发酵培养基；生物活性测定培养基：pda。

（2）主要试剂仪器

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇、碘、柱层析硅胶、薄层层析板、梨形漏斗、旋转蒸发仪、离心机。

2．发酵液的制备

用实施例5的方法制备发酵上清液。

3．萃取剂的选择

分别选用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇四种有机溶剂作为发酵液的萃取剂，将发酵上清液和不同的萃取溶剂置于分液漏斗内，上下颠倒、使其充分接触混合，萃取3次，分离有机相、水相。取各有机溶剂萃取剂，以丝核菌wk207作为靶标菌，采用抑制菌丝生长速率法进行生物活性测定，以未经溶剂萃取的发酵液和无菌水作为对照，25℃恒温培养5d，试验重复3次，观察并记录菌丝生长直径，对结果进行差异显著性和相关性分析，比较各萃取溶剂间的抑菌效果，选取最佳的溶媒萃取剂。

试验结果表明，以乙酸乙酯为萃取剂的抑菌效果直径最大，达32.50mm，这表明乙酸乙酯中活性物质含量最高，见图19。同时说明拮抗放线菌fx-h-51菌株发酵代谢产生的抑菌活性物质极性较高。

4.粗提物的制备

用乙酸乙酯对发酵上清液按照少量多次的原则进行萃取，收集有机相，使用旋转蒸发仪对有机相进行浓缩，将浓缩物蒸干获得膏状物，即为抑菌组分粗提物。

5.抑菌活性物质粗提物的薄层层析检测

(1)点样

首先将膏状粗提物溶入乙酸乙酯中，点样与距底边2cm处的直线上，点的扩散直径不能超过3mm，如果在一个点上需要重复多次点样，需等待上一次点样的溶剂完全挥发后再进行。点样完成后，室温下将薄层板晾干进行展层。

(2)展层系统的选择

薄层层析检测的关键在于展开剂的选择，展开剂的选择要从样品的极性、挥发性、溶解度等方面综合考虑。通常展开剂的展开能力与溶剂极性成正比，rf值在0.3～0.5之间比较合适（王艳红等，2006）。本着展开剂极性大，加大极性低溶剂的比例或选用极性小的溶剂的原则试验，反之亦然。

本试验选用正丁醇︰甲醇︰水=4︰1︰2、石油醚︰环己烷=10︰1、氯仿︰甲醇=30︰1、氯仿︰甲醇=20︰1四种展开体系进行展开剂的选择。

不同极性的溶剂系统展层后，碘熏蒸法显色见图20。试验结果表明，一种溶剂比例的rf值过高，一种溶剂比例的rf值过低，其中以氯仿︰甲醇=20︰1层析效果较好，碘熏蒸后可以看到4个较为理想的斑点，rf值分别为0.49、0.39、0.23、0.09。

(3)展层

展层采用上行法，将点样后的薄层层析板放入充满饱和展开剂蒸气的层析缸中，一段时间后，用铅笔标记展开剂前沿位置，利于计算rf值。展开剂不要过多，应在点样线以下，以免影响展开效果。展层结束后，将薄层层析板拿出，室温自然风干，进行下一步检测。

(4)检测

检测方法常用荧光显影和碘熏蒸显色法，本试验检测使用碘熏蒸显色法。将风干的薄层层析板置于充满饱和蒸气的碘缸中，待显色后，标记棕黄色斑点位置，测量并计算相对迁移率rf值。

6.抑菌活性物质粗提物的硅胶柱层析

(1)预处理

将浓缩后的粗提物与适量的200～300目的硅胶混合均匀，待有机溶剂挥发完全后，备用。

(2)上样洗脱

称取硅胶干法装柱，加入粗提物干法拌样。然后依次经石油醚、石油醚︰氯仿(1︰1)、氯仿、氯仿︰乙酸乙酯(1︰1)、乙酸乙酯、丙酮和甲醇梯度洗脱。用的离心管或试管收集洗脱液，一管约收集12ml，共收集70管。tlc检测分析洗脱液，展开剂为氯仿︰甲醇（20︰1），从第一管开始检测，每隔一管点样。检测完毕后，合并rf值相同或相近的组分，旋转蒸发浓缩。使用抑制菌丝生长速率法，测定浓缩后不同组分的生物活性。

(3)色谱条带的活性跟踪

将具有高生物活性的组分在薄层层析板上点样，以氯仿︰甲醇（20︰1）作为展开剂，碘熏蒸染色，将相应的条带刮取下，用少量的乙酸乙酯溶解，检测条带的抑菌活性。

发酵粗提物经过一次硅胶柱层析、tlc检测结果如图21，共有4个较为明显的条带，rf值分别为rf1=0.53、rf2=0.45、rf3=0.19、rf4=0.08。

表12色谱条带活性跟踪结果

分别将rf1、rf2、rf3编号为样品1、样品2、样品3，相应条带刮下，以禾谷丝核菌为靶标菌，对其进行抑菌试验，培养5天后，测定其抑菌效果，结果如图22、表12所示，从表12可以看出，样品2的抑菌作用相比其他样品效果更好，抑菌直径达到35.00mm，在5%的显著水平上，样品2与样品1,3存在显著差异。

(4)二次硅胶柱层析

以具有高生物活性的组分作为样品，进行二次硅胶柱层析纯化，方法同上，收集洗脱液。tlc检测分析洗脱液，合并rf值相同或相近的组分，旋转蒸发浓缩。

(5)抑菌活性物质的纯度检测

将分离纯化得到的化合物单体，用tlc检测，在碘缸中显色进行观察，检测其纯度，若为单一斑点则为纯化合物。

(6)放线菌fx-h-51菌株发酵产物中活性化合物抑菌活性测定

使用抑制菌丝生长速率法，丝核菌wk-207为靶标菌，以加无菌水的培养基作为空白对照，25℃恒温培养4d，观察并测量菌丝直径，进行抑菌活性检测。

样品2经过二次硅胶柱层析、薄层制备以及tlc检测，获得抑菌效果良好的活性物质a，经碘熏蒸法检测，活性物质a纯度较好。以禾谷丝核菌为靶标菌，对活性物质a进行抑菌试验。结果见图23和图24，96h后纯化产物的抑菌率达到76.47%。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种拮抗放线菌及其应用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1447

<212>dna

<213>海棠链霉菌（streptomycesspectabilis）的16srdna

<400>1

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