一种洞穴动球菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种洞穴动球菌。同时，本发明还涉及所述洞穴动球菌的应用。
背景技术：
：微生物种类丰富，长期以来，人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调查研究和开发利用。随着科学技术的发展，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资源，其不断丰富将为我国生物技术的发展奠定坚实的物质基础。加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是有效提升卷烟抽吸品质，形成卷烟特有风格的有效手段之一。目前我国烟草中添加的烟用香料大多是采用传统方法萃取再加以调配所得，虽然生产操作简单，但也存在香气单调、改善卷烟抽吸效果不明显等缺点。利用微生物对香原料进行发酵，可以增加传统提取香料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性。而现有工业产香微生物存在种类固化，发酵香料类型有限等问题，迫切需要寻找并筛选新的能够发酵产生特殊香气的微生物菌株，以拓展烟用香料的丰富性，满足卷烟生产需求。国内外烟草工作者在利用微生物发酵生产烟用香料方面已经做了很多工作，但多限于产香酵母。本发明提供的洞穴动球菌为首次被分离得到，经鉴定为微生物新种，目前未有任何关于所述洞穴动球菌及相关应用的公开报道。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种洞穴动球菌。本发明的目的还在于提供所述洞穴动球菌的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的。一种洞穴动球菌，分类命名为洞穴动球菌(kineococcuscavernaesp).sysuzl-1，该菌株于2016年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号m2016738。所述的洞穴动球菌sysuzl-1的16srrna基因核苷酸序列如序列表所示。所述的洞穴动球菌sysuzl-1在大多数培养基上生长良好，基内菌丝红褐色到棕色。明胶液化、牛奶凝固、胨化呈阳性，淀粉水解、硝酸还原呈阴性，不产生硫化氢，形成黑色素。能利用葡萄糖、半乳糖、果糖木糖、棉子糖、鼠李糖、蜜二糖、甜醇、甘油、甘露醇、山梨醇、醋酸钠。细胞壁含有l-二氨基庚二酸和甘氨酸。所述的洞穴动球菌sysuzl-1从云南省石林县印象烟庄烟田相邻近的喀斯特洞穴土壤中分离得到，固体培养过程中，发现绝大部分的微生物具有产生挥发性物质的能力，经液体发酵后产生的气息明显不同。在获得的纯培养分离菌株中，筛选得到可在含有简单碳氮源的培养基上产生挥发性、且为特殊香味气息的菌株sysuzl-1。所述的洞穴动球菌sysuzl-1具有产生特殊香气的功能，gc-ms鉴定结果显示，菌株sysuzl-1能够产生几类主要挥发性化合物，苯甲醛及土味素、榄香烯、榄香醇、a-桉叶醇。因此可以用于发酵制备烟用香料的工业生产中，对拓展烟用香料的丰富性，满足卷烟生产需求具有良好的应用前景。利用所述洞穴动球菌sysuzl-1发酵制备烟用香料的优选方法，将洞穴动球菌sysuzl-1经扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃摇瓶培养6d后，进行回流提取，过滤除渣，将上清液减压浓缩得到所需烟用香料。该香料具有十分特殊的香气，能够强化卷烟风格，丰富烟香，使香气更加圆润饱满。本发明的有益效果是：从烟田相邻近的喀斯特洞穴土壤中分离得到的纯培养菌株中，筛选得到可在含有简单碳氮源的培养基上产生挥发性，且为特殊香味气息的菌株sysuzl-1。经过微生物学特性分析和16srrna基因序列分析表明该菌株是一种新的细菌。该菌株能够产生苯甲醛及土味素、榄香烯、榄香醇、a-桉叶醇等几类主要挥发性化合物。其中，苯甲醛具有香味气息，微生物中较常见，但产量不高；土味素为放线菌产生的常见化合物，本身有腥味。榄香烯具有抑制癌细胞的作用，是目前一类上市抗癌药中的主要成分，具有较高经济价值，特别是微生物自主代谢产生。榄香醇常用作香精原料。桉叶醇本身具有一定香味，且可做定香剂来使用。利用该菌株发酵，能够得到特殊香气的烟用香料，所得香料具有强化卷烟风格，丰富烟香，圆润烟气的作用，并且具有抗细菌及真菌的活性，效果稳定而持久。此外，该菌株还具有开发新型、高效、无毒天然药物的巨大潜力。保藏生物材料的说明本发明的菌株，已于2016年12月9日，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，该中心地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学内，该菌株分类命名为：洞穴动球菌(kineococcuscavernaesp)sysuzl-1，保藏编号cctccno：m2016738。附图说明图1为本发明的洞穴动球菌在r2a培养基上的显微和电镜照片。图2为本发明的洞穴动球菌及部分相关菌株依据16srrna基因序列构建的系统发育树。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不是对本发明技术方案的限定。实施例1——洞穴动球菌sysuzl-1的分离于云南省石林县印象烟庄烟田相邻近的喀斯特洞穴中取土壤样品，塑料袋密封带回，4℃保存待用。准确称取10g土样，加入90ml无菌水，30℃、180rpm摇床振荡30min。用无菌水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5浓度，分别取0.2ml涂布于lb平板培养基上，每个设3个重复。在30℃培养48h后，从每份土样的平板上挑取不同单菌落，在相应固体培养基上纯化后按菌液体积20％加入甘油、置于-80℃冰箱保存备用。将分离得到的微生物分别接种于lb液体培养基中，于30℃、160rpm摇床振荡培养，细菌培养过夜至菌液浓度为od＝2.0，作为种子液备用。将每一待测菌株的种子液按1％接种在筛选培养基中，于30℃、160rpm摇床振荡培养3-5天，每天观察发酵液外观和香气特征变化情况，筛选得到能够产生特殊香味气息的微生物，编号sysuzl-1。实施例2——洞穴动球菌sysuzl-1的鉴定分离纯化的sysuzl-1进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定。将sysuzl-1分类命名为洞穴动球菌(kineococcuscavernaesp.nov.)。sysuzl-1在r2a培养基上的显微和电镜照片见附图1。sysuzl-1在大多数培养基上生长良好，基内菌丝红褐色到棕色。明胶液化、牛奶凝固、胨化呈阳性，淀粉水解、硝酸还原呈阴性，不产生硫化氢，形成黑色素。能利用葡萄糖、半乳糖、果糖木糖、棉子糖、鼠李糖、蜜二糖、甜醇、甘油、甘露醇、山梨醇、醋酸钠。细胞壁含有l-二氨基庚二酸和甘氨酸。(表1-3)表1sysuzl-1的培养特征表2sysuzl-1的生理生化特征表3sysuzl-1的碳氮源利用情况碳源利用结果碳源或氮源利用结果葡萄糖+蜜二糖+半乳糖+甜醇+果糖+甘油+蔗糖肌醇-阿拉伯糖-甘露醇+木糖+山梨醇+棉子糖+醋酸钠+鼠李糖+sysuzl-1的16srrna序列见序列表所示。该序列与genbank数据库中的已知序列进行blast比较分析，并从数据库获得相关种属的16srrna基因序列，构建系统发育树，见于图2。经比较分析发现，本发明的洞穴动球菌与菌株(kineococcusradiotoleranssrs30216t)亲缘关系最近，洞穴动球菌的16srrna基因序列与kineococcusradiotoleranssrs30216t有99.03的同源性，且dna-dna杂交值低于<70％，在系统进化树上形成独立的分枝。因此，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，洞穴动球菌与动球菌属参考菌株kineococcusradiotoleranssrs30216t有明显差异，表明本发明的洞穴动球菌是一个新物种，命名为kineococcuscavernaesp.nov.sysuzl-1在genbank数据库的16srrna基因序列登录号ky593935。中国武汉大学专利保藏中心菌种保藏号为m2016738。sysuzl-1及部分相关菌株依据16srrna基因序列构建的系统发育树见附图2。实施例3——洞穴动球菌sysuzl-1在发酵制备烟用香料中的应用上述筛选出的洞穴动球菌sysuzl-1在发酵生产烟用香料中的应用，具体步骤如下：(1)斜面培养：培养基：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；琼脂15g；蒸馏水1000ml，ph7.2；培养温度为28℃，培养时间为7d。(2)种子培养：从斜面挑取部分菌丝体接入种子液中，摇瓶培养36小时。种子培养基：糊精120g；大豆粉40g；酵母膏2g；色氨酸0.5g；β-丙氨酸5g；硫酸镁0.5g；磷酸铵0.2g；蒸馏水1000ml，ph7.2，培养温度为28℃。(3)发酵培养：按10％的接种量接到发酵培养基中，摇瓶培养6d。培养基：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000ml，ph7.2，培养温度为28℃，培养时间为6d。将发酵液进行回流提取，过滤除渣，将上清液减压浓缩得到所需烟用香料。该香料为不澄清棕色液体，将其按0.2‰的量加入到卷烟烟丝中，对照组加入等量蒸馏水。将处理组和对照组的烟丝放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡24h后，制成卷烟。由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。该香料具有十分特殊的香气，能够强化卷烟风格，丰富烟香，使香气更加圆润饱满，并且具有抗细菌及真菌的活性，效果稳定而持久(表4，表5)。表4sysuzl-1发酵香料的理化指标序号检测项目sysuzl-1发酵香料1酸值12.232相对密度d20201.16313折光指数nd201.42564乙醇中的溶混度(25℃)1体积样品在1-20体积50％-70％的乙醇溶液中溶解稍好5挥发成份总量(％)43.46澄清度不澄清7xds未检出8hzs未检出表5sysuzl-1发酵香料的感官评吸表洞穴动球菌sysuzl-116srrna1tggctcaggacgaccgctggcggcgtgcttacacatgcaagtcgaacggtgaagcccttc61ggggtggatcagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagcaacctgcccctggctctggga121caaccactggaaacggtggctaataccggatacgacctaccaccgcatggtgtgtgggtg181gaaagtttttcggctggggatgggctcgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcc241taccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagac301acggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctg361atgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagctccga421agaagcgcaagtgacggtaggagcagaagaagcaccggctaactacgtgccagcagccgc481ggtaatacgtagggtgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcgg541tgtgtcgcgtctgctgtgaaaactcagggctcaactctgagcttgcagtgggtacgggca601cacttgagtgctgtaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatc661aggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagttactgacgctgaggagcgaaa721gcatggggagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcgcta781ggtgtggggtccattccacggattccgtgccgcagctaacgcattaagcgccccgcctgg841ggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcgga901gcatgcggattaat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