一种海洋放线菌基因组文库及其构建方法与流程

本发明涉及基因组文库构建领域，尤其涉及一种海洋放线菌基因组文库及其构建方法。

背景技术：

放线菌是生物活性物质、尤其是天然药物的重要来源。面对日益严重的病原微生物耐药性，以及天然药物筛选过程中大量的重复发现，如何采用新技术、新资源、新模型筛选发现新的活性次生代谢产物，已成为天然药物开发中亟待研究的重要课题。而海洋放线菌因其在海洋特殊环境(高盐、高压、 低温、 低氧、 低光照和寡营养)的选择压力下可能调整其次级代谢过程，从而产生并积累具有特殊化学结构和生物活性的功能物质。有学者曾认为海洋环境分离到的放线菌也存在于陆地环境中或来源于陆地，因此海洋放线菌的次生代谢产物的新颖性受到怀疑。2006年发现的盐孢菌属(Salinispora)是第一个海洋专一性的放线菌属，对海洋放线菌的研究具有里程碑式的意义。海洋放线菌S. arenicola CNS-205属于小单孢菌科中的一种。2006年，Fenical小组从菌株S. arenicola CNS-205的发酵液中得到一系列新颖的天然产物，如两个聚酮类化合物saliniketal A和 saliniketal B。正是由于这种放线菌能够产生具有化学和生物多样性的天然产物，2008年，S. arenicola CNS-205的基因组得到了测序。令人惊讶的是这个放线菌的基因组含有至少20种不同天然产物的基因簇。如何表达这些潜在的天然产物的基因簇一直是科学界一个很重要的研究方向。异体表达这些基因簇可以成为解决这个问题的一个方法之一。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种海洋放线菌基因组文库及其构建方法，旨在解决现有技术异体表达菌株S. arenicola CNS-205中天然产物的基因簇尚缺乏的问题。

本发明的技术方案如下：

一种海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，包括：

步骤A、提取海洋放线菌S.arenicola CNS-205的DNA；

步骤B、采用注射器的针头随机剪切提取的DNA；

步骤C、采用末端修复酶修复经随机剪切后的DNA，然后与载体连接；

步骤D、采用包装蛋白包装成噬菌体后侵染宿主细胞，得到海洋放线菌S.arenicola CNS-205的基因组文库。

所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，所述步骤B具体包括：采用注射器的针头随机剪切提取的DNA，直至剪切后的DNA片段集中到25～45kb之间。

所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，剪切后的DNA片段集中到40kb。

所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，所述步骤C中，所述末端修复酶为T 4 DNA聚合酶或T 4多聚核苷酸激酶。

所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，所述步骤C中，所述载体为pWEB^TM载体。

所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，所述pWEB^TM载体为去磷酸化的pWEB^TM载体。

所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，所述步骤D中，所述包装的条件为28℃水浴120min。

所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，所述步骤D之后还包括：

步骤E、对基因组文库的质量进行鉴定。

所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，步骤E中，鉴定内容包括：插入片段的大小、克隆数的多少及覆盖基因组 DNA 的程度。

一种海洋放线菌的基因组文库，其中，所述基因组文库采用如上任一所述的方法构建而成。

有益效果：本发明旨在以稀有海洋放线菌菌株S. arenicola CNS-205作为研究对象，构建该菌株的基因组文库，以便于下一步异体表达菌株S. arenicola CNS-205中具有生物活性的次级代谢产物生物合成有关的基因簇， 以及对些基因簇的基因功能进行分析，从而将代谢工程或组合生物合成方法应用于化合物结构的改造，为海洋放线菌新药物开发研究工作奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例中提取的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图。

图2为本发明实施例中质粒DNA酶切后的电泳检测图。

具体实施方式

本发明提供一种海洋放线菌基因组文库及其构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的一种海洋放线菌基因组文库的构建方法，其中，包括：

步骤A、提取海洋放线菌S.arenicola CNS-205的DNA；

步骤B、采用注射器的针头随机剪切提取的DNA；

所述步骤B具体包括：采用注射器的针头随机剪切提取的DNA，直至剪切后的DNA片段集中到25～45kb之间。优选地，剪切后的DNA片段集中到40kb。

本发明用注射器的针头随机剪切基因组 DNA，琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA，直至 10%或者更多的基因组 DNA 片段集中在25～45kb之间，优选DNA片段集中到40kb，如果片段太小则重新提取总 DNA。

本发明大片段 DNA对于基因组文库的构建至关重要，在分离过程中应保证 DNA不被过度剪切或降解，同时保证DNA的纯度。不同的载体对基因组 DNA长度的要求不同，对于pWEB^TM载体，基因组DNA合适的片段长度大约为40kb，需要将基因组DNA采用物理方法反复抽打来随机剪切 DNA。

步骤C、采用末端修复酶修复经随机剪切后的DNA，然后与载体连接；

本发明所述末端修复酶为T 4 DNA聚合酶或T 4多聚核苷酸激酶。

所述步骤C中，所述载体为pWEB^TM载体，所述pWEB^TM载体为去磷酸化的pWEB^TM载体。

本发明经随机剪切后的基因组 DNA用末端修复酶修复，可以提高 DNA连接入载体的效率，本发明优选T 4 DNA聚合酶和 T 4多聚核苷酸激酶末端修饰，与去磷酸化的线性pWEB^TM载体连接，较大的提高了连接效率。

步骤D、采用包装蛋白包装成噬菌体后侵染宿主细胞，得到海洋放线菌S.arenicola CNS-205的基因组文库。

所述步骤D中，所述包装的条件为28℃水浴120min。本发明对包装的条件进行了优化，由原来的30℃水浴90min调整为28℃水浴120min，在相对低的温度下适当延长了包装的时间，发现优化后，包装的效率明显增加，文库的滴度由原来的6.5×10⁴CFU/mL变为现在的8.1×10⁴CFU/mL，使文库的覆盖率明显提升，文库质量明显提高。

本发明所述步骤D之后还包括：

步骤E、对基因组文库的质量进行鉴定。鉴定内容包括：插入片段的大小、克隆数的多少及覆盖基因组DNA的程度等。对于不同的用途，对基因组文库的要求也有所不同。用来大规模测序则插入片段越长越好，用来克隆基因和测序则对基因组文库覆盖率要求较高。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1）、本发明对提取的DNA，即对插入序列的随机剪切的方法进行了改进，现有方法是用200μL的黄色枪头反复吸吹2000次，才能将总DNA片段打碎，将片段集中到25～45kb之间。而本发明是采用一次性注射器的针头对总DNA（即提取的DNA）进行片段打碎，发现吸吹50次即可达到之前的效果，大大节省了工作量，而且采用这种打断方法最后检测发现插入载体的平均片段长度明显增加，由原来的36kb增加为现在的38kb。该文库是基因簇的克隆，所以插入片段越长越好。

2）、在用包装蛋白进行噬菌体包装时，本发明对包装的条件进行了优化，由原来的30℃水浴90min调整为28℃水浴120min，在相对低的温度下适当延长了包装的时间，发现优化后，包装的效率明显增加，文库的滴度由原来的6.5×10⁴CFU/mL变为现在的8.1×10⁴CFU/mL，使文库的覆盖率明显提升，文库质量明显提高。

本发明采用随机机械剪切而不采用内切酶不完全酶切构建了无偏见性的基因组文库，容量达到8.1×10⁴CFU/mL，平均插入片段大小约38kb，比现有插入片段要大，获得了3000个克隆，文库覆盖倍数约为5，重组率100%， 该基因组文库为生物合成基因簇的克隆和大肠杆菌的异体表达奠定了基础。

本发明的一种海洋放线菌的基因组文库，其中，所述基因组文库采用如上任一所述的海洋放线菌基因组文库的构建方法构建而成。

下面通过实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

1、材料及试剂

材料：海洋放线菌S. arenicola CNS-205为作者实验室保存；

试剂：Bam HⅠ限制性内切酶、质粒小量提取试剂盒购自TaKaRa公司；蛋白酶K、溶菌酶均购自Sigma公司；pWEB^TM Cosmid Cloning Kit 购自 Epicentre公司；其余均为国产分析纯试剂。

2、主要仪器

低温超速离心机5415R(Eppendorf公司)；恒温恒湿培养箱PYX－150H －B(科力仪器)；恒温循环器HX－2015(郑州长城科工贸有限公司)；恒温培养摇床ZHWY－211B(上海智城分析仪器制造有限公司)；凝胶成像分析仪(BIO－RAD公司Gel Documentation 2000)；ND－2000微量紫外分光光度计(北京托摩根生物科技有限公司)；Powerpac Basic电泳仪(BIO－RAD)。

3、培养基

海洋放线菌普遍培养基(L^-1)：蛋白胨5g、酵母提取物1g、NaCl 19. 45g、MgCl₂ 5. 9g、Na₂SO₄ 3. 24g、CaCl₂ 1.8g、微量元素溶液100mL、pH 7. 6。

微量元素溶液(L^-1)：KCl 5. 5g、Na₂CO₃ 1. 6g、KBr 0. 8g、SrCl₂ 340mg、H₃BO₃ 220mg、硅酸钠40mg、NaF 24mg、NH₄NO₃ 16mg、Na₂HPO₄ 80mg、柠檬酸铁1g。

4、方法

4.1、海洋放线菌S. arenicola CNS-205 DNA的提取和纯化

根据海洋放线菌的特性，取海洋放线菌的200μL菌液接种在20mL的海洋放线菌普遍培养基中，加入10g左右灭菌的玻璃珠，30℃、220r/min摇床培养5.5d；12000r/min离心10min，收集菌丝体。取约100μL菌丝体， 加入1mL TE(pH8. 0)缓冲液洗涤菌丝体，12000r/min离心1min，去掉上清。加入500μL溶菌酶，37℃水浴1h。加入10μL蛋白酶K，55℃水浴1h。加入500μL 2%的SDS，将溶液分装到4管，各管添加TE至1mL。每管加入 200μL中性苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，以体积份计)，充分混匀，直至溶液变为乳白色，12000r/min离心5min，小心吸取上清，加入200μL氯仿，充分混匀，12000r/min离心5min，小心吸取上清加到灭菌的玻璃管中，加入0.1倍体积的NaCl(5mol/L)和等体积的异丙醇，颠倒混匀，直至出现白色絮状物，用枪头将挑出的絮状物在70%乙醇中浸泡5min，空气中自然风干，在500μL TE缓冲液中4℃过夜溶解，－20℃保存备用。

4.2、插入序列的随机剪切

用注射器的针头随机剪切海洋放线菌S. arenicola CNS-205的 DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，直至10%或者更多的DNA片段集中在40kb附近，如果片段太小则重新提取总DNA。

4.3、切割片段与载体的连接及包装

按Epicentre公司pWEB^TM 粘粒克隆试剂盒文库构建试剂盒说明书进行。取约20μg DNA片段，加入1μL 10×快速连接缓冲液、 1μL 10mmol/L ATP、1μL pWEB^TM 载体、1μL 快速连接DNA酶、5. 16μL灭菌ddH₂O，充分混匀，室温放置90min，70℃水浴10min。－20℃保存备用。向10μL酶连反应液中加入25μL噬菌体包装提取物，混匀，28℃水浴120min，加入噬菌体稀释缓冲液将反应液稀释至1mL，轻轻混匀，加入25μL氯仿，轻轻混匀，于4℃保存备用。

4.4、文库效价的测定

用噬菌体稀释缓冲液对包装的噬菌体颗粒做10^-1、10^-2、10^-3、10^-4系列梯度稀释。分别取10μL包装的噬菌体颗粒加入100μL E. coli EPI100菌液，充分混匀，37℃保温20min，将感染细胞涂布在含氨苄的LB平板上，37℃过夜培养。单菌落计数，计算效价，公式如下:CFU/mL = (克隆数)(稀释倍数)(1 000μL/mL) /(用于涂布噬菌体的体积)。

4.5、转化和文库的保存

基于对效价的测定以及对文库克隆数的估算，计算构建pWEB^TM粘粒文库所需粘粒克隆的体积。按4.4所述方法进行转化获得阳性克隆子。挑取单菌落，放入加有含氨苄的LB培养基的96孔板过夜培养，加入甘油至最终浓度为20%，－70℃长期保存。

4.6、文库质量的检测

随机挑取单菌落培养用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，对提取的质粒 DNA分别做Bam HⅠ酶切:质粒DNA 15～20μL，50μL酶切体系，Bam HⅠ 1μL，酶切混合体系于30℃反应过夜，电泳检测。

5、结果与分析

5.1、海洋放线菌S. arenicola CNS-205的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。DNA片段较大，都集中在48kb以上，拖尾现象不明显，DNA片段整齐度较高。DNA纯度分析结果显示:OD 260/OD 280 = 1. 96，A 260 /A 230=2.18，表明提取的DNA纯度较高，没有被蛋白质和其他杂质污染。因此，所提取的总DNA达到了构建基因组文库的要求。

5.2、插入序列的随机剪切

对提取的总DNA用一次性注射器的针头随机剪切，剪切到50次时，片段都集中到了25～45kb之间。结果如图1。M.Lambda Mixer marker；1-3为S. arenicola CNS-205的基因组DNA分别被剪切50、30和20次。

5.3、文库效价的测定

用 Phage Dilution Buffer 对 packaged phage particles 做10^-1、10^-2、10^-3、10^-4系列梯度稀释。发现用稀释10倍的噬菌体包装原液进行侵染转化后的平板上有81个单菌落，通过如下计算，能推测此文库的滴度为8.1×10⁴ CFU/mL。

5.4、文库质量的检测

随机挑取单菌落，提取质粒DNA，用B a mHⅠ酶切，电泳检测。结果见图2。平均插入片段约为38kb，且每个质粒均释放了一条大小为8.1kb的条带，这个条带的大小和文库质粒载体的大小吻合。每个质粒经过酶切后所释放的外源片段大小各不相同，代表这些质粒都是不同的, 说明这个基因组文库基因多样性较好。并未发现空载现象，文库的重组率接近100%，说明文库质量较高。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。