来自海洋的链霉菌的分离培养方法及其用途的制作方法

专利名称：：来自海洋的链霉菌的分离培养方法及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种菌种的培养方法，特别是一种来自海洋的链霉菌BM-2的分离培养方法；本发明还涉及链霉菌BM-2的用途。
背景技术：
：许多放线菌的次生代谢产物具有医药和植物保护方面的用途，已广泛用作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物，现在已发现的数万种微生物来源的生物活性物质中，约有70%是由放线菌所合成的。目前分离得到的绝大多数放线菌都来源于土壤，陆生放线菌产生的抗生素占天然来源抗生素的三分之二以上，然而随着病原微生物对抗生素抗性的日益提高，寻找具有新型作用机制的抗生素已迫在眉睫。近20年来，从陆生放线菌中分离得到的先导化合物的数量锐减，于是人们把目光投向了更为广阔的生境-海洋。海洋放线菌的生活环境十分特殊，如高盐度，高压，低营养，低温及与不同生物之间的关系等。在这些所谓生命的极限环境中，海洋放线菌已发展出独特的代谢方式，这不仅确保其在极端环境中生存，也提供了产生新颖抗生素的潜力。因此，海洋环境将成为放线菌和放线菌代谢产物的重要新来源。虽然海洋放线菌不是海洋微生物生态系统中的主要组成部分，但越来越多的研究结果显示，其代谢产物具有独特性。来自国际著名的海洋天然产物研究机构加州大学的W.Fenical教授于2001年6月在日本举行的第10次国际海洋天4然产物研讨会上报道了他们的最新发现:他们首次发现并成功培养了一属海洋放线菌，命名为Mw/mw/om.，这种菌只能在有盐的条件下生长，具有独特的16SrRNA序列。对100株这种菌进行了抗菌及抗肿瘤活性筛选试验，结果有80%的发酵液抽提物显示出明显的抗菌和抗肿瘤活性。对其中一株菌发酵液进行化学研究，从中分离纯化出一系列结构新颖的化合物，命名为Salinosporamides，这些化合物具有很强的抗癌活性。许多放线菌的次生代谢产物具有医药和植物保护方面的用途，己广泛用作抗细菌、抗真菌和抗肿瘤药物。据不完全统计，目前关于海洋放线菌活性物质的研究已经引起人们的重视，从海洋环境中分离得到了多种产生新活性物质的海洋放线菌，并对得到的菌株的发酵条件、生物活性以及活性物质的.分离鉴定进行了研究，取得了可喜的成果，但己有的研究主要集中在医药的开发上，而海洋放线菌对植物病原真菌的抗菌物质研究还刚刚起步，从海洋环境中寻找具有新的抗菌机制的海洋放线菌应用于植物病害的生物防治对于开发高效环保新型农药具有重要意义。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种对多种植物病原真菌有强抗菌作用的链霉菌BM-2(&印tomK"sp.BM-2)的分离培养方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种来自海洋的链霉菌BM-2(&reptomyc"sp.BM-2)的分离培养方法，其特点是，其步骤如下(1)富集培养从连云港海域采集海泥，将海泥10g放入盛有50mL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中，190r/min，25。C条件下摇床培养5天；(2)菌体的分离纯化用移液枪取富集培养5天的培养液1.0mL加入到盛有9.0mL无菌海水的试管中，制备成10—i的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10—2、10-3、10-4、10-5、l(T、10—7的样品稀释液；然后分别取10—5、10—6和10—7的样品稀释液0.2ml放到海水高氏l号培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25'C的培养箱中培养，长出菌落；再分别挑取海水高氏l号培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到海水高氏l号培养基平板上，置于25i:培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到海水高氏l号培养基试管斜面中保存；(3)菌株的筛选采用平板对峙培养法，以供试的植物病原真菌小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌为受试菌，分别测定分离纯化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作时在PDA培养基平板中央接种培养5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培养皿壁15mm处对称划线接种分离纯化得到的不同菌株，25"C倒置恒温培养，观察植物病原真菌菌落生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；每个菌株为一处理，每处理重复3次；选取一株对前述2种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于15mm的菌株，记为BM-2菌株；(4)菌株的鉴定将BM-2菌株于25"C下培养5天，观察记录菌落和细胞形态，同时进行生理生化试验，并进行16SrDNA测序分析；根据形态学和生理生化试验结果初步认为菌株BM-2属于链霉菌属；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于5^e/tom_yc"sp.，二者的16SrDNA序列相似性为99%，BM-2菌株为链霉菌(5^印tomyce!rsp.)。以上所述的来自海洋的链霉菌BM-2sp.BM-2)的分离培养方法技术方案中，所述的链霉菌BM-2菌株的优化发酵条件为最适培养基为淀粉14g、乳糖16g、黄豆粉16g、磷酸氢二钾3g、碳酸钙4g、氯化钾0.4g、氯化钠30g，水1000ml，pH为7.5;发酵条件为接种量7%，装瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，摇床转速190r/min，最适温度28""C，培养时间5d。本发明中所涉及的生物材料"链霉菌BM-2(6^印to附yc"sp.BM-2)"菌株己于2009年2月4日在Genebank公开(登录号为FJ595715，网址为(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi7db二nuccore&id=222145980)。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日期起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。本发明所述的链霉菌BM-2(5Vreptom_yc"sp.BM-2)具备抑制多种植物病原真菌的用途。以下是发明人所做的链霉菌BM-2(&reptom少c"sp.BM-2)菌株(以下简称BM-2菌株)的相关试验。1、分离筛选试验。1.1培养基(1)富集培养基酵母膏5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaC15g、陈海水1000mL，pH7.5-8.0。(2)海水高氏l号培养基可溶性淀粉20g，KN03lg，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.5g，MgS04*7H200.5g，FeS04'H20O.Olg，琼脂20g，海水1000mL，pH7.27,4。(3)PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g,水1000mL，pH自然。1.2供试病原菌玉米小斑病菌(丑—/鎖.a附ay血)、玉米圆斑病菌(//e/脂'w^7aspor/wmcar6owM附)、小麦赤霉病菌(F"S(3r/wmgra附/"earww)、棉花丰古萎病菌(Fwjan.wwo平/or簡f.sp.vasinfectum)、小麦雪腐镰刀病菌(Fwsa"'簡m.va/e)、斑点落叶病菌(兹m7fl〃'aa/femato)、小麦根腐病菌(5—/腦i5WY^:/m'""a)、细链格孢病菌"/ter""n'flfe"w&)、番茄早疫病菌(J/ter"an'aso/a"/)共9禾中，由中国农科院所植保所提供，淮海工学院海洋微生物实验室保存。1.3分离方法(1)富集培养从连云港海域采集海泥，将海泥10g放入盛有50mL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中，190r/min，25"C条件下摇床培养5天；(2)菌体的分离纯化用移液枪取富集培养5天的培养液1.0mL加入到盛有9.0mL无菌海水的试管中，制备成10—'的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10—2、10—3、10"、10,10,10—7的样品稀释液；然后分别取10—5、1(T和l(T7的样品稀释液0.2ml放到海水高氏l号培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25。C的培养箱中培养，长出菌落；再分别挑取海水高氏l号培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到海水高氏l号培养基平板上，置于25'C培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到海水高氏l号培养基试管斜面中保存；(3)菌株的筛选采用平板对峙培养法，以供试的上述9种植物病原真菌(包括小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌)为受试菌，分别测定分离纯化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作时在PDA培养基平板中央接种培养5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培养皿壁15mm处对称划线接种分离纯化得到的不同菌株，25。C倒置恒温培养，观察植物病原真菌菌落生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；每个菌株为一处理，每处理重复3次；选取一株对前述小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌的抑菌带宽度平均值大于15mm的菌株，记为BM-2菌株。筛选试验的具体结果如下上述步骤(2)分离纯化得到的若干个菌株中有7株对上述9种植物病原真菌有较强的抑制作用，见表l。其中BM-2菌株的抑菌作用最强，其对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，对棉花枯萎病菌和小麦赤霉病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度分别达到了18.0mm和16.5mm，对番茄早疫病菌、玉米小斑病菌、玉米圆斑病菌的抑菌带宽度都达到了10mm以上。表17菌林对9种病原真菌的抑制作用(ran)供试病原菌BM-2T-6XS-X5-3菌抹号D-3T-l-lMH-7XL-7小麦赤霉病菌16.50.08.07.00.00.07.5小麦根腐病菌5.53.03.54.02.03.02.0玉米圆斑病菌10.03.05.07.00.00.01.0番茄早疫病菌11.53.07.04.51.53.04.0棉花枯萎病菌18.00.00.011.50.05.06.0斑点落叶病菌9.54.54.04.00.02.03.5小麦雪腐镰刀病菌9.00.00.06.00.04.00.0玉米小斑病菌10.59.01.55.50.03.56.092、BM-2菌株的鉴定试验。2.1培养基鉴定试验中所涉及的高氏1号培养基、PDA培养基、察氏琼脂培养基、无机盐淀粉培养基、燕麦片琼脂培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、瓦氏肉汁琼脂培养基、明胶培养基、淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、醋酸铅培养基、尿素培养基、油脂培养基、糖醇发酵培养基、石蕊牛奶培养基和苯丙氨酸培养基均为常规培养基，但在配制时用相应量的海水替换水。2.2形态特征及培养特征观察2.2.1形态特征观察采用扦片法。在高氏I号琼脂培养基平板上划线接种BM-2菌株，将灭菌的盖玻片以大约45。角扦入琼脂内(扦在接种线上)，将扦片平板28"C下倒置培养，根据观察的目的，分别在培养3d、5d、7d时，用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检盖玻片上BM-2菌株的形态特征。取扦片及印片经光学显微镜观察，结果显示该菌的基内菌丝和气生菌丝均生长旺盛，分枝多；孢子丝为直线形和波曲形，无轮生。孢子丝成熟后形成的孢子链成串珠状。2.2.2培养特征观察主要观察孢子、气生菌丝体、基内菌丝体的颜色和可溶性色素的有无。将BM-2菌株分别接种在高氏I号琼脂培养基、马铃薯培养基、察氏琼脂培养基、无机盐淀粉培养基、燕麦片琼脂培养基、葡萄糖天门冬素琼脂培养基、瓦氏10肉汁琼脂培养基上，28。C培养715d，观察记录菌株在各种培养基上孢子、气生菌丝、基内菌丝体的颜色以及可溶性色素是否产生等特征。结果菌株BM-2在高氏I号、瓦氏肉汁、葡萄糖天门冬素、无机盐淀粉等琼脂培养基上生长良好，在马铃薯培养基上长势较差。在不同的培养基上气生菌丝的颜色变化不大，基内菌丝颜色变化较大，无可溶性色素产生。结果见表2。表2BM-2菌株的培养特征<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>"++++":生长良好；"+++":生长一般；"+":生长差。2.3生理生化试验生理生化试验包括明胶液化试验、淀粉水解试验、纤维素分解试验、油脂水解试验、尿素酶试验、石蕊牛奶试验、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验、硫化氢试验、柠檬酸盐试验、过氧化氢酶试验、糖醇发酵试验、氨基酸脱羧酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验和葡萄糖的氧化发酵试验等多项试验。生理生化试验结果见表3。__表3BM-2菌林的生理生化特性_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>糖醇发酵试验结果，综合见表4。糖醇发酵试验中产酸呈阳性的说明待测菌能分解该糖或醇产生酸因而使指示剂溴甲酚紫显现出黄色，糖醇发酵试验产酸呈阴性的说明待测菌不能分解该糖醇产生酸因而不使指示剂显现黄色；糖醇发酵试验产气呈阳性说明待测菌能分解该糖或醇产生气体。表4BM-2菌株糖醇发酵试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>麦芽糖+-乳糖++蔗糖++甘露糖++D-果糖+-棉子糖_-D-木糖+_L-鼠李糖+-纤维二糖+-甘露醇+-肌醇-+D-山梨醇+-根据形态、培养特征观察及生理生化试验结果，査阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版和《链霉菌鉴定手册》，BM-2菌株符合链霉菌科链霉菌属的特征。2.4BM-2菌株16SrDNA基因的序列分析2.4.1BM-2菌株液体培养BM-2菌株经斜面活化后，将孢子用无菌水洗下制成孢子悬液，浓度约为1(^个/mL，接种于液体海水高氏1号培养基(250mL三角瓶装液量30mL)，28°C180卬m摇床培养3d。2.4.2DNA的提取采用CTAB裂解法。2.4.3PCR扩增扩增引物序列为fDl:16SF:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'rDl:16SR:5'-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT-3'由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。按表5反应体系和条件进行扩增表5PCR扩增体系(25fU体系)试剂含量(P1)dNTP(10mMeach)0.510xbuffer2.5Mg2+(20mM)2.5引物1(25jiM)0.5引物2(25jiM)0.5模板DNA1.0Taq酶(5U/y1)0.3ddH2017.2扩增条件为95"C预变性5min;94。C变性lmin，65。C退火lmin，72。C延伸3min，3个循环；94。C变性lmin，63。C退火lmin，72。C延伸3min，3个循环；94。C变性lmin，61。C退火lmin，72"延伸3min，3个循环;94。C变性lmin，59。C退火lmin，72"C延伸3min，3个循环；94。C变性lmin，57。C退火lmin，72。C延伸3min，3个循环；94。C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸3min，3个循环；94。C变性lmin，54。C退火lmin，72。C延伸3min，20个循环；72'C再次延伸10min;4'C永久保存。2.4.4PCR扩增产物的检测及其序列测定采用LO^琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。点样量为5)al。将扩增出的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测得序列已于2009年2月4日在Genebank公开(登录号为FJ595715)。在GenBank中对所得序列进行BLAST分析，BM-2菌株的16SrDNA基因序列与5^印tomyc"sp.(FJ001761)同源性达99%。结合形态学观察和生理生化测定结果，认为BM-2菌株属于链霉菌(S^e/tom_ycassp.)3、BM-2菌株抑菌试验。3.1无菌发酵液对病原真菌菌丝生长的抑制作用(1)无菌发酵液的制备。将BM-2菌株接种到海水高氏1号培养基斜面上，培养4d，用5mL无菌海水冲洗下菌体，接种到装有50mL液体海水高氏1号培养基的250mL三角瓶内，25°C，190r/min振荡培养5d，培养液于4。C，5000r/min离心10min，去除菌体，上清液用直径0.22fim的细菌过滤器过滤，得到无菌发酵液。(2)无菌发酵液对9种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用测定。在PDA培养基平板中央接种直径为5mm的受试植物病原真菌菌苔，距皿边缘15mm处，对称打直径为5mm的孔，三个孔内滴200^UBM-2菌株的无菌发酵液，另一孔作为对照，内滴等量的液体海水高氏1号培养基，25"C恒温培养5d后，观察受试植物病原真菌的菌落生长状况，测量抑菌带宽度。重复3次。BM-2菌株的发酵液的抑菌范围广，抗菌作用强，对所有供试病原真菌都具有较强的抑制作用，其中对小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌的抑菌带宽度分别达到了25.1mm和20mm，表现出了良好的应用前景。表6BM-2菌株无菌发酵液对病原真菌的抑制作用供试病原菌抑菌带宽度(mm)小麦赤霉病菌25.1小麦根腐病菌6.5玉米圓斑病菌14.0番茄早疫病菌11.5棉花枯萎病菌20.0斑点落叶病菌10.5雪腐镰刀病菌10.0玉米小斑病菌12.5细链格孢菌10.53.2无菌发酵液对细链格孢菌分生孢子萌发的影响(1)细链格孢菌分生孢子悬浮液的制备。将培养7d的细链格孢菌用无菌水洗下孢子，用4层纱布过滤去除菌丝，滤液在室温下3500r/min离心5min，沉淀为孢子，用BM-2菌株的无菌发酵液配制成浓度为1()S个孢子/mL的孢子悬浮液，以液体海水高氏l号培养基为对照。(2)孢子萌发率的测定。取0.1ml孢子悬浮液涂布在无菌玻片上，置于铺有湿润滤纸的培养皿内，25。C下黑暗恒温培养，分别于l、2、3、4、5、6h观察孢子萌发情况，计算孢子萌发率，测量芽管长度。如6h对照的孢子萌发率低于90%，则继续定时观察，同时观察无菌发酵液对病原真菌孢子及芽管的破坏作用。孢子萌发率(％)=孢子萌发数/调查孢子总数BM-2菌株的发酵液对细链格孢菌的分生孢子的萌发有一定的抑制作用，处理后的孢子萌发率降低，芽管伸长缓慢。BM-2菌株的发酵液对孢子萌发的抑制作用强，处理后的孢子萌发率明显降低，6h孢子萌发率仅为30%，芽管生长慢，6h芽管长度为140um，而对照的萌发率高，6h孢子萌发率达到96%,芽管生长速度快，6h芽管长度达到了280um。显微观察结果表明处理孢子的原生质浓縮，细胞壁变薄，芽管生长较慢。随着处理时间的延长，处理孢子的芽管开始畸形，出现扭曲，粗短，孢子体形异常，甚至串珠状膨大。而对照组的芽管细长，分枝多，很少有泡囊出现。3.3无菌发酵液对5种细菌的抑菌作用(1)5种细菌大肠杆菌(五sc/zen'c/n'aco/0、枯草芽孢杆菌CBac///2^s由z'fe)、金黄色葡萄球菌(5"啤/z卢"occt^awrg—、嗜水气单胞菌(爿er纖o"os/^(irap/zz7a)、耳卩尔森菌(7erw'm'asp.)。大肠杆菌(五"/zen'c/z/aco//)、枯草芽孢杆菌CSac"/ussw6"fc)、金黄色葡萄球菌(Stop/^/ococcusawews)用牛肉膏蛋白胨培养基培养。嗜水气单胞菌(^erawo"oy/^Jrap/n'/a)、耶尔森菌(F簡'w'flsp.)用2216E培养基培养。(2)培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏0.3g、蛋白胨l.Og、氯化钠0.5g、琼脂20g，水1000mL。2216E培养基蛋白胨5g、酵母膏lg、琼脂20g、陈海水1000mL，pH8.0。(3)BM-2菌株发酵液对5种细菌的抑菌作用测定方法。采用打孔扩散法。将在细菌培养基斜面上培养24h的5种细菌用0.85%的无菌生理盐水洗下，制备成浓度为5X106个/mL菌悬液，取0.2mL菌悬液滴在平板培养基表面中央，用无菌涂布棒平涂布均匀。用直径5mm的打孔器在距离培养皿边缘1.5cm处的含菌平板四周打孔，每孔分别注入BM-2菌株的发酵液50yL，以等量的无菌海水高氏1号液体培养基为对照。2『C培养箱中恒温，培养24h后观察测定抑菌圈直径，结果见表7。表7BM-2菌林发酵液对细菌的抑菌作用测定结果枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌嗜水气单胞菌17耶尔森菌_^_从表7可以看出，BM-2菌株发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜水气单胞菌有很强的抑制作用，但对金黄色葡萄球菌和耶尔森菌的抑制作用较弱。4、BM-2菌株抑菌物质产生条件优化4.1培养基对BM-2菌株产生抑菌物质的影响。配制6种不同的液体培养基(见表8，用陈海水配制)，分装到250ml的三角瓶中，每个三角瓶装入50ml。接种量为7%，在28。C、转速为190r/min的条件下，培养5d，每种培养基3个重复，测定不同培养基发酵液的抑菌效果，根据抑菌效果确定最适培养基。表8培养基配方沐养A培养基组分(1000ml)编号i可-溶性淀粉20g,~~滩酸钾lg,~"氯化钠0.5g,磷酸氢二钟0.5g,硫酸镁0.5g~葡糖糖5g,淀粉40g,鱼粉5g，黄豆饼粉10g,磷酸氢二钟3g,碳酸鈣4g,氯化钙5g3淀粉14g,乳糖16g,黄豆粉16g，磷酸氢二钟3g,碳酸妈4g，，氯化钾0.4g4葡糖糖4g,鱼粉5g，黄豆饼粉10g,磷酸氫二钾3g,碳酸钙4g,氯化钙5g黄豆饼粉10g,淀粉10g,玉米粉15g,鱼粉5g，蛋白胨2g,葡萄糖5g，硝酸郜0.5g,破酸钾4g玉米粉40g>麸皮10g,麸质粉5g>硫酸铵lg,磷酸氢二钾lg,碳酸钩4g，葡萄糖10g结果发现，培养基组成对丽-2菌株发酵液的抑菌活性有较大影响，3号培养基发酵液的抑菌作用最强，发酵液的抑菌带宽度最大，为9.0ran，其次为1、6号培养基，认为3号培养基为供试的培养基中BM-2菌株产生抗菌物质的最适培养基。4.2BM-2菌株产生抑菌物质发酵条件的优化。根据筛选出的产生抗菌物质的最适培养基配方，进行发酵条件优化。4.2.1培养时间对BM-2菌株产生抑菌物质的影响。配制最适培养基，分装到250ml的三角瓶中，每瓶装入50ml。接种量为7%，放入振荡培养箱中，在28。C、180r/min条件下，分别培养ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d，每个培养时间做3个平行，测定不同培养时间的发酵液抑菌效果，根据抑菌效果确定最适培养时间。结果发现，不同培养时间对BM-2菌株发酵液的抑菌作用影响较大，在前3d发酵液抑菌活性较低，随时间的延长，抑菌活性增强，培养时间为5d时，发酵液的抑菌带宽度最大，达到7.0mm，因此确定BM-2菌株产抑菌物质最佳时间为5d。4.2.2培养温度对BM-2菌株产生抑菌物质的影响。配制最适培养基，分装到250ml的三角瓶中，每个三角瓶装入50ml。接种量7%，转速为180r/min，分别在15。C，20°C,25°C，28°C，30°C，35°C，37。C条件下培养5d。每个温度做3个平行，测定发酵液的抑菌效果。结果发现，BM-2菌株在15t^37。C之间培养时，其发酵液均具有抑菌作用，培养温度为28。C时，发酵液的抑菌带宽度最大，达到13mm，因此BM-2菌株产生抑菌物质最佳温度为28°C。4.2.3pH对BM-2菌株产生抑菌物质的影响。配制最适培养基，分别调pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每个pH值做3个平行。接种量为7%，28°C、180r/min条件下培养5d，测定不同pH值发酵液的抑菌效果。测定不同pH下BM-2菌株发酵液的抑菌带宽度结果表明pH为7.5时抑菌带宽度最大，可达13.0mm，为产生抗菌物质的最佳pH。4.2.4接种量对BM-2菌株产抑菌物质的影响。配制最适培养基，接种量分别为.-1%、3%、5%、7%、9%、11%、13°/。、15%，每个接种量重复3次。放入28'C、180r/min的振荡培养箱中培养5d，测定不同接种量发酵液的抑菌效果。接种量实验结果表明BM-2在接种量为7%时抑菌效果最好。4.2.5装瓶量对BM-2菌株产生抑菌物质的影响。配制最适培养基，在250ml三角瓶中装液量分别为30、40、50、60、70、80、90、100ml，每个装瓶量做3个平行，接种量为7%，28°C，180r/min条件下振荡培养5d，分别测定发酵液的抑菌效果。测定不同装瓶量下BM-2菌株发酵液的抑菌带宽度，结果表明装瓶量在30mrS0ml时抑菌带宽度不断增大，装瓶量为80ml时抑菌带最宽，此后增加装液量，抑菌效果逐渐减弱，因此装瓶量为80ml时为最佳装瓶量。4.2.6盐度对BM-2菌株产生抑菌物质的影响。在最适培养基中加入NaCl，分别配制含1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%NaCl培养基，接种量为7%，28°C、180r/min振荡培养5d，测定不同NaCl含量培养基发酵液的抑菌效果。结果发现，在Nad含量为1%3%时，随着盐浓度的提高，抑菌作用逐渐增强，浓度超过3%时抑菌作用下降，Nacl含量为3。/。时抑菌效果最好。4.2.7转速对BM-2菌株产生抑菌物质的影响。配制最适培养基，接种量为7%，将摇床转速分别调节为160，170，180，190，200，210，220r/min，每个转速做3个平行，28。C培养5d，测定不同转速条件下发酵液的抑菌效果。20测定不同摇床转速下发酵液的抑菌带宽度结果表明BM-2菌株在转速为190r/min时，其发酵液的抑菌带宽度最大，说明抑菌效果最好。当摇床转速高于或低于190r/mi时，抑菌作用逐渐降低。因此认为该菌株的最佳摇床转速为190r/min。上述试验对BM-2菌株发酵条件进行优化，认为BM-2菌株产生抑菌物质的最适培养基为淀粉14g、乳糖16g、黄豆粉16g、磷酸氢二钾3g、碳酸钙4g、氯化钾0.4g、氯化钠30g，水1000ml，pH为7.5;发酵条件为接种量为7%，装瓶量为80ml(250ml三角瓶)，摇床转速为190r/min，最适温度为28匸，培养时间为5d。具体实施例方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1。一种来自海洋的链霉菌BM-2(&r印fcw^cessp.BM-2)的分离培养方法，其步骤如下(1)富集培养从连云港海域采集海泥，将海泥10g放入盛有50mL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中，190r/min，25。C条件下摇床培养5天；(2)菌体的分离纯化用移液枪取富集培养5天的培养液1.0mL加入到盛有9.0mL无菌海水的试管中，制备成10—'的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10—2、10-3、10-4、10-5、10-fi、10—7的样品稀释液；然后分别取10—5、10—6和10—^勺样品稀释液0.2ml放到海水高氏l号培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25t:的培养箱中培养，长出菌落；再分别挑取海水高氏l号培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到海水高氏l号培养基平板上，置于25i:培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到海水高氏1号培养基试管斜面中保存；(3)菌株的筛选采用平板对峙培养法，以供试的植物病原真菌小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌为受试菌，分别测定分离纯化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作时在PDA培养基平板中央接种培养5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培养皿壁15mm处对称划线接种分离纯化得到的不同菌株，25。C倒置恒温培养，观察植物病原真菌菌落生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；每个菌株为一处理，每处理重复3次；选取一株对前述2种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于15mm的菌株，记为BM-2菌株；(4)菌株的鉴定将BM-2菌株于25'C下培养5天，观察记录菌落和细胞形态，同时进行生理生化试验，并进行16SrDNA测序分析；根据形态学和生理生化试验结果初步认为菌株BM-2属于链霉菌属；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于5V^towyc"sp.，二者的16SrDNA序列相似性为99%，BM-2菌株为链霉菌(^SVe/tow;;c"sp.)。本实施例培养方法所得的链霉菌BM-2sp.BM-2)具有抑制9种植物病原真菌菌丝生长的作用，而且对其中的细链格孢菌分生孢子的萌发有抑制作用；还具备对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌很强的抑制作用。实施例2。实施例1所述的来自海洋的链霉菌BM-2(5^印towyc"sp.BM-2)的分离培养方法中，所得的链霉菌BM-2菌株的发酵条件为最适培养基为淀粉14g、乳糖16g、黄豆粉16g、磷酸氢二钾3g、碳酸钙4g、氯化钾0.4g、氯化钠30g，水1000ml，pH为7.5;发酵条件为接种量7%，装瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，摇床转速190r/min，最适温度28。C，培养时间5d。权利要求1、一种来自海洋的链霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)的分离培养方法，其特征在于，其步骤如下(1)富集培养从连云港海域采集海泥，将海泥10g放入盛有50mL的无菌海水的三角瓶中振荡摇匀，取5mL悬浮液加入到50mL富集培养液中，190r/min，25℃条件下摇床培养5天；(2)菌体的分离纯化用移液枪取富集培养5天的培养液1.0mL加入到盛有9.0mL无菌海水的试管中，制备成10-1的样品稀释液；然后采用梯度稀释的方法连续稀释，分别制备成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的样品稀释液；然后分别取10-5、10-6和10-7的样品稀释液0.2ml放到海水高氏1号培养基平板上，用涂布棒涂布均匀后，置于25℃的培养箱中培养，长出菌落；再分别挑取海水高氏1号培养基平板上的菌落，用三区划线的方法接种到海水高氏1号培养基平板上，置于25℃培养箱中培养，反复划线直至得到纯的菌株单菌落，将若干个纯化的菌株分别转接到海水高氏1号培养基试管斜面中保存；(3)菌株的筛选采用平板对峙培养法，以供试的植物病原真菌小麦赤霉病菌和棉花枯萎病菌为受试菌，分别测定分离纯化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作时在PDA培养基平板中央接种培养5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培养皿壁15mm处对称划线接种分离纯化得到的不同菌株，25℃倒置恒温培养，观察植物病原真菌菌落生长状况，培养5d后测量抑菌带宽度；每个菌株为一处理，每处理重复3次；选取一株对前述2种植物病原真菌的抑菌带宽度平均值大于15mm的菌株，记为BM-2菌株；(4)菌株的鉴定将BM-2菌株于25℃下培养5天，观察记录菌落和细胞形态，同时进行生理生化试验，并进行16SrDNA测序分析；根据形态学和生理生化试验结果初步认为菌株BM-2属于链霉菌属；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于Streptomycessp.，二者的16SrDNA序列相似性为99％，BM-2菌株为链霉菌(Streptomycessp.)。2、根据权利要求1所述的来自海洋的链霉菌BM-2(&reptomyc^sp.BM-2)的分离培养方法，其特征在于，所述的链霉菌BM-2菌株的发酵条件为最适培养基为淀粉14g、乳糖16g、黄豆粉16g、磷酸氢二钾3g、碳酸钙4g、氯化钾0.4g、氯化钠30g，水1000ml，pH为7.5;发酵条件为接种量7%，装瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，摇床转速l術/min，最适温度28'C，培养时间5d。3、权利要求1或2所述的链霉菌BM-2(6Vreptow少c"sp.BM-2)的抑制植物病原真菌的用途，以及抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌的用途。全文摘要本发明是一种来自海洋的链霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)的分离培养方法，其特征在于，其步骤如下它包括富集培养、菌体的分离纯化、菌株的筛选和菌株的鉴定等步骤，根据形态学、生理生化试验结果以及16SrDNA的同源性分析表明分离培养的菌株为链霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)。该链霉菌BM-2具有抑制多种植物病原真菌及抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜水气单胞菌的作用。文档编号A01N63/04GK101497867SQ20091002516公开日2009年8月5日申请日期2009年2月18日优先权日2009年2月18日发明者吴少杰,张晓君,暴增海,李福后,王伟霞,马桂珍申请人:淮海工学院