一种通过表面展示实现人源精氨酸酶-1固定化的方法
【技术领域】
[0001]本发明设及的是人源精氨酸酶-UHuman Arginasel)的固定化技术，特别是通过 优化的冰核形成蛋白展示来实现固定化的方法，是人源精氨酸酶I固定化的一种新思想、新 途径、新方法。
【背景技术】
[0002] 人源精氨酸酶-IW=聚体的形式存在于人肝脏细胞之中，参与尿素代谢循环，催 化水解kArg化-精氨酸)生成k^na-乌氨酸）和尿素。精氨酸酶I缺陷，会导致发育迟缓， 智力缺陷，癒痛和运动失调等一系列相关疾病，人源精氨酸酶-1还可W用于做为药物治疗 癌症。
[0003] 由于大部分精氨酸酶难W实现在大肠杆菌中实现高效可溶性表达，从肝脏中提取 精氨酸酶作为精氨酸酶主要的来源，但存在着可能携带各种病毒的风险。人源精氨酸酶-1 在己斯德毕赤酵母能够实现有效的分泌表达，纯化的人源精氨酸酶-1，经过几下质包埋固 定W后，实现有效的转化kArg合成，然而，此固定化方法，制备时间较长，制备过程复 杂，在操作过程中，存在损失部分酶活等缺点。
[0004] 大肠杆菌表面展示技术，作为一种全新的固定技术，有广泛的应用前景，诸如，将 谷氨酸脱簇酶展示在大肠杆菌表面，重组大肠杆菌细胞可作为"固定化细胞工厂"来转化谷 氨酸生产药物中间体丫 -氨基下酸;将腊水解酶展示在大肠杆菌细胞表面，重组大肠杆菌细 胞可作为"固定化细胞分子筛"拆分手性化合物邻-6-扁桃酸;将有机憐水解酶展示大肠杆 菌表面，重组大肠杆菌细胞作为"固定化生物吸附剂"降解环境存在的有害有机憐试剂；
[0005] 简述现有技术冰核形成蛋白展示系统。冰核形成蛋白来源于假单胞菌，作为错定 蛋白，可W通过憐脂酷基醇(GPI)错定在大肠杆菌细胞外膜，利用运一特征，人们已开发为 一类在大肠杆菌表面展示异源蛋白的展示系统。冰核形成蛋白由=部分组成，氨基端功能 域，高度重复区域和簇基端功能域。据报道，全长的冰核形成蛋白，氨基酸端剪切突变体，簇 基端剪切突变体和去掉重复序列的剪切突变体都可W介导异源蛋白在大肠杆菌表面展示。 然而，现在的冰核形成蛋白展示系统，不能有效的实现多聚体蛋白的表面展示及其固定化。 通过不断地努力和改进，人们期待研究出高效的，广泛实用的冰核形成蛋白展示系统，来满 足各种科研和生产需求。
【发明内容】
[0006] 本发明提出了一种通过表面展示实现人源精氨酸酶-1固定化的方法，提供了一种 全新的，有效的人源精氨酸酶-1固定化的方法。
[0007] 设计在冰核形成蛋白剪切变体（InaK-N)的氨基端分别融合信号肤（Sec信号肤和 Tat信号肤)和带电荷多肤(6 XLys，6 XGlu和6 XAsp)，在簇基端融合人源精氨酸酶-1，并在 其簇基端设计HA标签，便于检测展示效率；
[000引 1)首先，设计PCR引物分别携带编码信号肤Sec、化t，带电荷多肤6XLys、6XGlu、6 XAsp和标签蛋白HA的序列（信号肤和带电荷多肤及其氨基酸序列见表1和附图1、附图2)， 通过PC时尋其分别融合在冰核形成蛋白剪切变体（InaK-N)的氨基端，和人源精氨酸酶-1的 簇基端，然后将两类基因片段通过PCR融合在一起，构建出含有各种含有冰核形成蛋白和精 氨酸酶重组表达质粒；
[0009] 所述引物名称及引物序列见表2
[0010] 表1信号肤和带电荷多肤及其氨基酸序列
[0011]
[
[
[0014]
[001引 a引物方向为5'-3'
[0016] 2)将构建好的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受态细胞，37°C静 置培养过夜，获得基因工程菌株；
[0017] 3)将基因工程菌株，接种于IOOmL LB培养基，氨节青霉素的终浓度为50iig/mL，37 °C震荡培养，OD值为0.5~0.6之间，加入IPTG，终浓度为lmM，37°C震荡培养8小时。然后， 12000RPM，4°C，10分钟离屯、收集菌体，菌体用预冷憐酸缓冲液清洗2次，去掉残留的培养基， 重悬于IOmL的预冷憐酸缓冲液中备用；
[001引4)分别取200iiL重悬的菌液，细胞经巧光抗体标记后，用流氏细胞术（Flow Cytometry，FCM)分析不同的信号肤和带电荷多肤展示人源精氨酸酶-1的效率；
[0019] 5)用化inard反应检测含量，进而分析不同的信号肤和带电荷多肤展示人源 精氨酸酶-1的基因工程菌催化转AkArg合成酶活。整个反应体系为ImL,组成如下： 100化底物kArg，浓度为0.2M，800化碳酸氨盐缓冲液(50mM，pH= 10)和100化步骤3)中重悬 备用的菌液。操作步骤如下:首先，将反应缓冲液在40°C预热5分钟，然后;在40°C水浴，震荡 反应10分钟，120003?1，41：，10111111离屯、收集反应后的上清，将上清在100°(：加热5分钟终止 反应。最后，上清中的kOrn用化inard反应测量，并转化为相对应的人源精氨酸酶-1酶活；
[0020] 6)经过测量后，选出转化kArg合成的酶活最高的基因工程菌株，大规模培 养，转化kA巧生成具体操作如下:首先，将步骤5)中酶活最高的工程菌株，重新接种 新鲜于IL LB培养基，氨节青霉素的终浓度为50iig/mL，37°C震荡培养，OD值为0.5~0.6之 间，加入IPTG，终浓度为ImM, 37 °C震荡培养8小时。然后，12000RPM，4°C，IOmin离屯、收集菌 体，菌体用预冷PBS清洗2次，去掉残留的培养基，重悬于50mL的预冷碳酸氨盐缓冲液，加入 底物kA巧终浓度为200g/L，40°C水浴中震荡反应16小时。反应产物之一用LC-MS质谱 鉴定，确认为心化11反应产物。经计算其中kOrn含量达到130g/L，转化效率达到95 %。
[0021] 本发明展示人源精氨酸酶-1，包括原始的冰核形成蛋白人源精氨酸酶-1展示系 统，信号肤和带电荷多肤优化的冰核形成蛋白人源精氨酸酶-1展示系统。
[0022] 本发明具有的优势。
[0023] 本发明通过冰核形成蛋白剪切变体融合人源精氨酸酶-1在大肠杆菌细胞表面有 效展示，从而实现了人源精氨酸酶-1固定化。与原始的冰核形成蛋白展示系统相比，明显提 高人源精氨酸酶-1展示效率和酶活，与现有几下质固定化法相比，降低合成成本，缩短工艺 流程，简化纯化步骤。
[0024] 比原始的冰核形成蛋白人源精氨酸酶-1的展示效率提高近3倍，人源精氨酸酶-1 的酶活提高近3倍。
【附图说明】
[0025] 图1、图2为本发明实验设计方案。如图所示，InaK-N为冰核形成蛋白氨基酸端剪切 突变体的英文缩写;ARGl为人源精氨酸酶-1的英文缩写;HA为标签蛋白的英文缩写；SSMa化 为Sec途径其中一种信号肤英文缩写；SSTorA为化t途径其中一种信号肤英文缩写;D6为六 个天冬氨酸的英文缩写;E6为六个谷氨酸的英文缩写;K6为六个赖氨酸的英文缩写。设计方 案如下，分别在冰核形成蛋白氨基端剪切变体的氨基端加上信号肤，分别是Sec途径的信号 肤和化t途径的信号肤;带电荷氨基酸，六个天冬氨酸，六个谷氨酸和六个赖氨酸。在簇基端 分别加上人源精氨酸酶-1和标签蛋白HA。
[0026] 图3为流氏细胞术分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率。如图所示，其中图A为阴 性对照结果；图B为InaK-N/ARGl为流氏细胞术分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的结 果；图C为ssMa化-InaK-N/ARGl为流氏细胞术分析展示人源精氨酸酶-I的展示效率的结果； 图D为ssTorA-InaK-N/ARGl为流氏细胞术分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的结果；图E 为D6-InaK-N/ARGl为流氏细胞术分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的结果；图F为E6-InaK-N/ARGl为流氏细胞术分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的结果；图G为k6-InaK-N/ ARGl为流氏细胞术分析展示人源精氨酸酶-1的展示效率的结果。
[0027]图4为化inarD反应监测展示人源精氨酸酶-1的酶活。如图所示，pET23a为空载阴 性对照结果；InaK-N/ARGl，ssMa化-InaK-N/ARGl，ssTorA-InaK-N/ARGl，D6-InaK-N/ARGl， E6-InaK-N/ARGl和K6-InaK-N/ARGl分别为展示人源精氨酸酶-I的酶活监测结果。
[00巧]图5为LC-MS监测展示人源精氨酸酶-1转化レArg合成图标准品 LC-MS监测结果；图B为L-Orn标准品LC-MS监测结果；图C为转化产物LC-MS监测结果。
【具体实施方式】
[0029] 下面W实例对本发明进一步说明：
[0030] 实施例1:
[0031] 利用本发明方法在大肠杆菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，将构建好的含有InaK-N/ARG1重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta Blue菌株，37°C静置培养过夜。然后，挑 取单菌落，接种于IOOmL LB培养基，抗生素氨节青霉素的终浓度为50iig/mL，37°C震荡培养， OD值为0.5~0.6之间，加入IPTG，终浓度为lmM，37°C震荡培养8小时。然后，12000RPM，4°C离 屯、收集菌体，菌体用预冷PBS清洗2次，去掉残留的培养基，最终重悬于IOmL预冷PBS缓冲液 备用。然后用化inard反应测量，并转化为相对应的人源精氨酸酶-1酶活。（图3,图4)
[0032] 实施例2
[0033] 利用本发明方法在大肠杆菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，将构建好的含有 SSMa化-InaK-N/ARGl重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta Blue菌株，37°C静置培养 过夜。然后，挑取单菌落，接种于IOOmL LB培养基，抗生素氨节青霉素的终浓度为50iig/mL， 37 °C震荡培养，OD值为0.5~0.6之间，加入IPTG，终浓度为ImM，37°C震荡培养8小时。然后， 12000RPM，4°C离屯、收集菌体，菌体用预冷PBS清洗2次，去掉残留的培养基，最终重悬于IOmL 预冷PBS缓冲液备用。然后用化inard反应测量，并转化为相对应的人源精氨酸酶-1酶活。 (图3,图4)
[0034] 实施例3
[0035] 利用本发明方法在大肠杆菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，将构建好的含有 ssTorA-InaK-N/ARGl重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta Blue菌株，37°C静置培养 过夜。然后，挑取单菌落，接种于IOOmL LB培养基，抗生素氨节青霉素的终浓度为50iig/mL， 37 °C震荡培养，OD值为0.5~0.6之间，加入IPTG，终浓度为ImM，37°C震荡培养8小时。然后， 12000RPM，4°C离屯、收集菌体，菌体用预冷PBS清洗2次，去掉残留的培养基，最终重悬于IOmL 预冷PBS缓冲液备用。然后用化inard反应测量，并转化为相对应的人源精氨酸酶-1酶活。 (图3,图4)
[0036] 实施例4
[0037] 利用本发明方法在大肠杆菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，将构建好的含有Ds-InaK-N/ARGl重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta Blue菌株，37°C静置培养过夜。然 后，挑取单菌落，接种于IOOmL LB培养基，抗生素氨节青霉素的终浓度为50iig/血，37 °C震荡 培养，OD值为0.5~0.6之间，加入IPTG，终浓度为ImM，37°C震荡培养8小时。然后，12000RPM， 4°C离屯、收集菌体，菌体用预冷PBS清洗2次，去掉残留的培养基，最终重悬于IOmL预冷PBS缓 冲液备用。然后用化inard反应测量，并转化为相对应的人源精氨酸酶-1酶活。（图3,图4) [00 3引实施例5
[0039] 利用本发明方法在大肠杆菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，将构建好的含有Es-InaK-N/ARGl重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta Blue菌株，37°C静置培养过夜。然 后，挑取单菌落，接种于IOOmL LB培养基，抗生素氨节青霉素的终浓度为50iig/血，37 °C震荡 培养，OD值为0.5~0.6之间，加入IPTG，终浓度为ImM，37°C震荡培养8小时。然后，12000RPM， 4°C离屯、收集菌体，菌体用预冷PBS清洗2次，去掉残留的培养基，最终重悬于IOmL预冷PBS缓 冲液备用。然后用化inard反应测量，并转化为相对应的人源精氨酸酶-1酶活。（图3,图4)
[0040] 实施例6
[0041] 利用本发明方法在大肠杆菌中展示人源精氨酸酶-1。首先，将构建好的含有Ks-InaK-N/ARGl重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta Blue菌株，37°C静置培养过夜。然 后，挑取单菌落，接种于IOOmL LB培养基，抗生素氨节青霉素的终浓度为50iig/血，37 °C震荡 培养，OD值为0.5~0.6之间，加入IPTG，终浓度为ImM，37°C震荡培养8小时。然后，12000RPM， 4°C离屯、收集菌体，菌体用预冷PBS清洗2次，去掉残留的培养基，最终重悬于IOmL预冷PBS缓 冲液备用。然后用化inard反应测量，并转化为相对应的人源精氨酸酶-1酶活。（图3,图4)
[0042] 实施例7
[0043] 利用优化的冰核形成蛋白人源精氨酸酶-1展示系统转化kArg合成首先， 将构建好的含有Ks-InaK-N/ARGl重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta Blue菌株，37 °C静置培养过夜。然后，重新接种新鲜菌种于IL LB培养基，氨节青霉素的终浓度为50yg/ mL，37 °C震荡培养，OD值为0.5~0.6之间，加入IPTG，终浓度为ImM，37 °C震荡培养8小时。然 后，12000RPM，4°C，IOmin离屯、收集菌体，菌体用预冷PBS清洗2次，去掉残留的培养基，重悬 于50mL的预冷碳酸氨盐缓冲液，加入底物L-Arg终浓度为200g/L，40°C水浴中震荡反应16小 时。反应产物用LC-MS质谱鉴定。（图5)
[0044] 各种实例结果分析
[0045] 经过流氏细胞术分析，TorA信号肤，6XG1U和6XLys可W提高冰核形成蛋白展示 人源精氨酸酶-1的展示效率，分别是原始的冰核形成蛋白展示人源精氨酸酶-1的1~2倍左 右，其中6 XLys取得了最高的展示效率。Ma化信号肤和6 XAsp降低了冰核形成蛋白展示人 源精氨酸酶-1的展示效率。用化inard反应分析酶活，可W得到相同的结果，TorA信号肤，6 XGlu和6XLys可W提高冰核形成蛋白展示人源精氨酸酶-1的酶活，分别是原始的冰核形 成蛋白展示人源精氨酸酶-1的酶活的1~2倍左右，其中6 XLys酶活最高为1 1U/OD6〇〇dLC-MS 质谱鉴定结果显示，本研究提出的固定化方法，可W有效的转化底物心4巧合成反应 16小时，可W将200g/L的底物L-A巧完全转化为L-Orn。
[0046] 本发明大肠杆菌菌株Rosetta Blue购于美国Novagen公司，不同的重组质粒均为 本实验构建，分析用各种试剂为分析纯，LC-MS用的标准品为色谱纯。
【主权项】
1. 一种通过表面展示实现人源精氨酸酶-1固定化的方法，其特征在于： 1) 首先，设计?01?引物分别携带编码信号肽36〇3&1，带电荷多肽6/1^8、6/6111、6乂 Asp和标签蛋白HA的序列，通过PCR将其分别融合在冰核形成蛋白剪切变体(InaK-N)的氨基 端，和人源精氨酸酶-1的羧基端，然后将两类基因片段通过PCR融合在一起，构建出含有各 种含有冰核形成蛋白和精氨酸酶重组表达质粒； 2) 将构建好的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受态细胞，37°C静置培 养过夜，获得基因工程菌株； 3) 将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，此菌株经荧光抗体标记后，用流氏细 胞术分析不同的信号肽和带电荷多肽对冰核形成蛋白展示人源精氨酸酶-1的效率的影响； 用Chinard反应检测L-〇rnithine含量，进而分析不同的信号肽和带电荷多肽对冰核形 成蛋白展示人源精氨酸酶-1催化转化L-Arg合成L-〇rn酶活的影响； 4) 经过测量后，选出转化L-Arg合成L-〇rn的酶活最高的基因工程菌株，大规模培养，菌 体经收集，洗涤去掉残存的培养基成分，重悬于碳酸氢盐缓冲液，以L-Arg作为底物，转化合 成L_0rn〇
【专利摘要】本发明提出了一种通过表面展示实现人源精氨酸酶?1固定化的方法。步骤为：设计在冰核形成蛋白剪切变体(InaK?N)的氨基端加入信号肽和带电荷多肽，在羧基端融合人源精氨酸酶?1，在羧基端设计HA标签；构建各种重组质粒分别转化大肠杆菌感受态细胞，获得不同基因工程菌株；将不同菌株摇瓶培养；检测人源精氨酸酶?1展示效率和酶活；挑取酶活最高的菌株大量培养，高效转化L?精氨酸，合成L?鸟氨酸。本发明通过冰核形成蛋白剪切变体融合人源精氨酸酶?1在大肠杆菌细胞表面有效展示，从而实现了人源精氨酸酶?1固定化。与原始的冰核形成蛋白展示系统相比，明显提高人源精氨酸酶?1展示效率和酶活，与几丁质固定化法相比，降低成本，缩短流程，简化纯化步骤。
【IPC分类】C12N15/70, C12N9/78
【公开号】CN105713888
【申请号】CN201610097606
【发明人】张贞, 易犁, 马立新
【申请人】湖北大学