T细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤过继性免疫细胞治疗技术领域，具体设及一种能够特异扩增的肿 瘤浸润淋己细胞(Tumor Infiltrating Lympho巧te,TIL)中CD8+T细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤浸润淋己细胞(TIL)最初是由Rosenberg等研究者从小鼠肿瘤组织中发现和 分离的一类具有肿瘤抗原特异性细胞群，运类群细胞WCD4+、CD8+T细胞为主，同时还包含少 量NK和NKT细胞。TIL细胞由其具有特异性肿瘤细胞杀伤功能而被应用于抗肿瘤治疗研究当 中，行使杀伤功能的主要效应细胞由CD8+T细胞组成。虽然TIL细胞治疗技术已经进入临床 应用，对鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、淋己癌、黑素癌等晚期癌症有一定疗效，但TIL细胞的大规模 扩增难、抑制性Treg细胞比例较高等问题限制了其在临床肿瘤治疗上的广泛应用。因此，解 决W上技术限制是本专利发明主要目的。
[0003] 目前临床应用的TIL细胞扩增技术通常是采用IL-2XD3单克隆抗体作为诱导剂活 化和扩增CD8+T细胞，为满足临床用量，常规技术加入高剂量的IL-2，但是高剂量IL-2会对 患者产生毒性作用，也可刺激TIL中CD4+CD25+Treg细胞增殖，从而抑制CD8+T细胞的增殖与 杀伤作用。PD-I是程序性死亡分子，与其配体PD-Ll结合后，可抑制淋己细胞功能。研究表 明，多数肿瘤浸润CD8+T淋己细胞表面表达PD-I分子，其与肿瘤细胞表面高表达PD-Ll结合 后，可诱导活化CD8+T淋己细胞调亡，抑制其产生细胞因子和颗粒酶，进而减弱CD8+T淋己细 胞对肿瘤的杀伤作用，最终导致肿瘤发生免疫逃逸。另一方面PD-I和PD-Ll结合能够诱导 化eg细胞分化，促进其分泌IL-10、TGF-e等抑制性细胞因子而抑制免疫应答。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有CD8+T细胞增殖与杀伤功能受抑制的问题，本发明提供一种有效的、 简便的扩增CD8+T细胞的方法，采用癌性胸腹水来源提取TIL细胞，经过体外多种细胞因子 刺激，获得大量具有较强杀伤能力的TIL细胞，提高了CD8巧细胞增殖与杀伤作用，同时抑制 CDA+CDSS+heg细胞增殖，减弱其免疫抑制作用，提高TIL细胞抗肿瘤作用。
[0005] 为实现发明目的，本发明采取的技术方案为：
[0006] -种体外扩增CD8+T细胞的方法，包括从癌性胸腹水来源提取得到TIL细胞，向TIL 细胞培养液中添加细胞因子比-2、CD3McAb和抗PD-I单克隆抗体。
[0007] 作为优选，所述的比-2浓度为300-1000U/ml，CD3McAb浓度为10-50ng/ml，抗PD-I 单克隆抗体50-200ng/ml。
[000引经研究发现，利用抗PD-I单抗封闭活化的CD8+T细胞表面的PD-I分子，能有效抑制 PD-I和PD-Ll结合产生的免疫抑制信号，另外也可促进CD8+T细胞扩增，加强细胞因子和颗 粒酶分泌，提高对肿瘤细胞杀伤能力。本发明将抗PD-I单抗添加至TIL细胞培养过程中，W 获得扩增倍数大、细胞杀伤效果强的TIL细胞。
[0009]更具体的，本发明关于一种体外扩增CD8+T细胞的方法，包括如下步骤：
[0010] (I)获取肿瘤细胞和TIL细胞混合体：
[0011] 准备无菌肝素抗凝的抗凝瓶，从患者体内抽取胸腔积液或腹水，离屯、，弃上清液， 生理盐水洗涂重悬。
[001^ (2)TIL细胞的分离：
[001引细胞贴壁培养：
[0014] 往步骤(1)获得的重悬细胞中缓慢加入100%淋己分离液分离得到肿瘤细胞与TIL 细胞混合体，生理盐水重悬细胞，离屯、收集细胞;收集得到的细胞用无血清培养液稀释至细 胞浓度为5 X 105-2 X lOVml，放置37°C、5%C02培养箱培养，24小时后取出，将所得的TIL悬 浮细胞移至另一培养瓶;或采用
[0015] 非连续密度梯度培养：
[0016] 对步骤（1)获得的重悬细胞采用非连续密度梯度离屯、法进行离屯、，从下往上依次 加入100%淋己细胞分离液、75%淋己细胞分离液、去除上清液的胸腹水，经离屯、后，吸取 100 %淋己细胞分离液界面TIL细胞，离屯、，弃上清，生理盐水洗涂重悬。
[0017] (3)TIL细胞扩增培养：
[001引用无血清培养液稀释步骤(2)所得的TIL细胞密度为5 X 105-2 X lOVml，向培养液 中添加细胞因子抗PD-I单体，第2天加入细胞因子IL-2和CD3单抗，之后每隔2-3d加入含有 细胞因子IL-2的无血清培养液，培养14-21天收集细胞。
[0019] 作为优选，所述步骤(2)细胞贴壁培养中稀释至细胞浓度为2Xl〇6/ml。
[0020] 作为优选所述步骤(3)中TIL细胞密度为2 X 106/ml。
[0021] 作为优选所述步骤(3)所述的无血清培养液为含有80U硫酸庆大霉素的X-VIV015。
[0022] 作为优选所述步骤(3)中抗PD-I单体的浓度为50-200ng/ml，化-2的浓度为300-1000U/ml，CD3McAb 的浓度为 lO-lOOng/ml。
[0023] 作为优选所述步骤(3)中抗PD-I单体的浓度为50ng/ml，化-2的浓度为500U/ml， CD3McAb 的浓度为 30ng/ml。
[0024] 与现有技术相比，本发明采用的细胞因子组合能够提高TIL细胞扩增倍数，有效抑 制化eg细胞对CD8巧细胞的负向调节作用，促进抗肿瘤效应。
[0025] 具体实施方法
[0026] 下面结合实施例对本发明的技术方法进行详细说明。
[0027] 实施例1(实验组）：
[002引（1)获取肿瘤细胞和TIL细胞混合体：
[0029] 将患者体内抽取500ml胸腹水注射到含有肝素钢的抗凝瓶中，轻轻摇晃使其混匀， 将其平均分到离屯、管中，200化/min离屯、IOmin，离屯、结束后，弃上清液，用生理盐水洗涂2 次。
[0030] (2)分离 TIL 细胞：
[0031 ] 贴壁法:取步骤(1)获得的细胞15ml加入等体积生理盐水至30ml (运样才对吧），充 分混匀，将100%淋己细胞分离液15ml加入至离屯、管中，淋己分离液与细胞悬液的体积比为 1:2，沿管壁缓慢将30ml细胞悬液叠加至淋己分离液上，20(K)r/min离屯、20min，离屯、后收集 白膜层，即为肿瘤细胞和TIL细胞混合体，150化/min离屯、5min，生理盐水洗涂1次后，用生理 盐水重悬至50ml，取样计数，进行第2次洗涂，150化/min离屯、5min，弃上清液。将上述分离后 的细胞用X-VIVOl5培养液稀释至细胞浓度为I X lOVml，放置37 °C、5 % C02培养箱培养，24 小时后取出，将悬浮细胞（即为TIL细胞)移至另一培养瓶中培养，贴壁细胞为肿瘤细胞，弃 去;或义用
[0032] 非连续密度梯度培养:将步骤（1)获得的细胞用生理盐水重悬至20ml，充分混匀， 从下往上依次缓慢加入15ml 100%淋己细胞分离液、15ml 75%淋己细胞分离液、20ml上述 细胞悬液，2000r/min离屯、20min，吸取100%淋己细胞分离液界面1'化细胞，150化/111111离屯、 Smin，弃上清，生理盐水洗涂1次后，用生理盐水重悬至50ml，取样计数，进行第2次洗涂， 15(K)r/min离屯、5min，弃上清液。（3)TIL细胞扩增培养：
[0033] W上巧巾分离方法均能很好的分离TIL细胞，将(2)分离后的TIL细胞用X-VIV015培 养液稀释至细胞浓度为0.5~lX10シml，并向其加入100ng/ml抗PD-l单体，放置37°C、5% C02培养箱培养，第2天加入300~lOOOU/ml比-2和30~lOOng/ml CD3McAb，之后每隔2-3天 根据细胞数量和状态，添加适量的含有浓度为500U/ml化-2的X-VIVOl5培养液扩增培养， 培养至14-21天收集细胞。
[0034] 对上述的获得的TIL细胞进行质量检验：
[0035] 培养至第7-8天和回输前48小时，按照《中国药典》取样进行细菌、真菌、支原体、内 毒素检测，回输当天取样进行台吩蓝染色检测细胞活性，活细胞应在80% W上，同时进行革 兰氏染色，细菌、真菌、支原体、内毒素、革兰氏染色结果均为阴性，收集细胞回输。
[0036] 实施例2:未添加抗PD-I单抗(对照组）
[0037] 除了（3)细胞扩增中，未添加抗PD-I单抗，其他具体操作步骤如实施例1。
[0038] 对实施例1的实验组和实施例2的对照组所得的TIL细胞进行扩增倍数检测
[0039] 在第1、7、14、21天取20化1细胞，吹打成单个细胞，利用Counterstar自动血细胞计 数仪进行计数，细胞扩增倍数=当天计数的细胞总数/第1天培养前的细胞总数。实验结果 如表1。
[0040] 表1 TIL细胞在不同时间细胞数量的变化（XioVL)
[0041]
[0042] 对实施例1的实验组和实施例2的对照组所得的TIL细胞进行Treg表型检测
[0043] 在第1、7、14、21天收集2 XioVml细胞于流式管内，加入相应抗体避光混匀放置 20min，用PBS洗涂2次，15(K)rpm离屯、5min，加入50化IPBS重悬等待上机测定。实验结果如表 2。
[0044] 击9 TTT会田0^太同口皆甘日1^~^"^。"会田0^^^/捕1白句亦/心、
[0045]
[0046] 对实施例1的实验组和实施例2的对照组所得的TIL细胞对K562细胞杀伤能力检测
[0047] 取对数生长期K562细胞系，用PBS缓冲液将祀细胞浓度调整为1 X lOVml，按照1: 20效祀比，调整效应细胞(TIL细胞)5 X lOVml、1 X lOVml、2 X lOVml，实验组:效应细胞和 祀细胞各加入50iil，效应组：效应细胞和RPMI1640培养液各加入SOiil，祀细胞组:祀细胞和 RPMI1640培养液各加入SOiil，使每孔终体积为10化1，每组设3个平行组，放于37°C，5 %C〇2 培养箱解育16-1化，每孔加入MTT，继续培养4h后，每孔加入I(K)山DMSO，等紫色结晶完全溶 解后，酶标仪(波长570nm)测定OD值。计算公式:杀伤率=[1-(效祀混合组OD值一祀细胞组 OD值)/效应组OD值]X 100%。实验结果如表3。
[004引表3 TIL细胞对K562细胞毒性比较（％)
[0049]
【主权项】
1. 一种体外扩增CD8+T细胞的方法，其特征在于包括从癌性胸腹水来源提取得到TIL细 胞，向TIL细胞培养液中添加包括细胞因子IL-2、⑶3McAb和抗Η)-1单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的一种体外扩增CD8+T细胞的方法，其特征在于所述的IL-2浓度 为300-1000U/ml，CD3McAb浓度为 10-50ng/ml，抗PD-1 单克隆抗体50-200ng/ml。3. 根据权利要求1所述的一种体外扩增CD8+T细胞的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 获取肿瘤细胞和TIL细胞混合体： 准备无菌肝素抗凝的抗凝瓶，从患者体内抽取胸腔积液或腹水，离心，弃上清液，生理 盐水洗涤重悬。 (2) TIL细胞的分离： 细胞贴壁培养： 往步骤(1)获得的重悬细胞中缓慢加入100%淋巴分离液分离得到肿瘤细胞与TIL细胞 混合体，生理盐水重悬细胞，离心收集细胞;收集得到的细胞用无血清培养液稀释至细胞浓 度为5 X 105-2 X 106/ml，放置37°C、5%C02培养箱培养，24小时后取出，将所得的TIL悬浮细 胞移至另一培养瓶;或采用 非连续密度梯度培养： 对步骤（1)获得的重悬细胞采用非连续密度梯度离心法进行离心，从下往上依次加入 100 %淋巴细胞分离液、75 %淋巴细胞分离液、去除上清液的胸腹水，经离心后，吸取100 % 淋巴细胞分离液界面TIL细胞，离心，弃上清，生理盐水洗涤重悬。 (3) TIL细胞扩增培养： 用无血清培养液稀释步骤(2)所得的TIL细胞密度为5 X 105-2 X 106/ml，向培养液中添 加细胞因子抗PD-1单体，第2天加入细胞因子IL-2和CD3单抗，之后每隔2-3d加入含有细胞 因子IL-2的无血清培养液，培养14-21天收集细胞。4. 根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8+T细胞的方法，其特征在于所述步骤(2)细胞 贴壁培养中稀释至细胞浓度为2 X 106/ml。5. 根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8+T细胞的方法，其特征在于所述步骤⑶中 TIL细胞密度为2X106/ml。6. 根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8+T细胞的方法，其特征在于所述步骤⑶所述 的无血清培养液为含有80U硫酸庆大霉素的X-VIV015。7. 根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8+T细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中抗 PD-1 单体的浓度为50-200ng/ml，IL-2的浓度为300-1000U/ml，CD3McAb的浓度为 10-100ng/ ml〇8. 根据权利要求3所述的一种体外扩增CD8+T细胞的方法，其特征在于所述步骤(3)中抗 TO-1单体的浓度为50ng/ml，IL-2的浓度为500U/ml，CD3McAb的浓度为30ng/ml。
【专利摘要】本发明提供一种体外扩增CD8+T细胞的方法，包括从癌性胸腹水来源提取得到TIL细胞，向TIL细胞培养液中添加细胞因子IL?2、CD3McAb和抗PD?1单克隆抗体，所述的IL?2浓度为300?1000U/ml，CD3McAb浓度为10?50ng/ml，抗PD?1单克隆抗体50?200ng/ml。该方法采用的细胞因子组合能够提高TIL细胞扩增倍数，有效抑制Treg细胞对CD8+T细胞的负向调节作用，促进抗肿瘤效应。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105713878
【申请号】CN201610203410
【发明人】吴晓星, 杨军, 刘广平
【申请人】杭州特马赛生物技术有限公司