专利名称：报告基因小鼠t细胞体外培养分化模型及药物筛选方法的建立的制作方法
报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及药物筛选方法的
建立技术领域：
本发明涉及免疫学中T细胞培养分化和药物筛选技术领域，更具体 地，本发明涉及荧光报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及其药物筛选平台的建立方 法，以及利用该方法筛选治疗哮喘病的药物。背景技术：
初始CD4+T细胞在不同的因子诱导下，分化成为功能及表型不同 的效应性Th细胞和调节性T细胞(Treg)，并表达特定的细胞因子执行其功能在IL-12 和anti-IL4作用下向Thl分化，产生IFN-Y等，诱导细胞介导的免疫反应；在IL-4和 anti-IFN-y作用下向Th2分化，产生IL-4等，诱导细胞介导的免疫反应；在IL-6和TGF-旦 作用下向Thl7分化，产生IL-17等，诱导炎症反应；在TGF-0作用下向Treg分化，产生 IL-10等，实行免疫抑制。T细胞亚群含量和比例及其产生的细胞因子与各种疾病的发生密 切相关，过高或过低都有可能导致疾病的发生。报告细胞因子的荧光报告基因小鼠是转基因技术的应用，是在T细胞分化后产生 的特定细胞因子(例如Th2分化中IL-4)基因下游连接荧光蛋白编码序列，使细胞因子的 产生可以被荧光蛋白报告，并能被荧光探测系统检测到的一种技术。传统T细胞体外培养分化途径如下(1)脾细胞的分离与计数；(2)细胞的激活培养；(3)再刺激与抑制蛋白分泌；(4)表面染色与胞内染色检测分化；T细胞体外培养分化的形态学特征如附图1所示。传统T细胞培养分化一般需要4-5天，经激活培养、再刺激、抑制蛋白分泌、胞内染 色(此时产生的大量细胞因子)等步骤检测是否分化为Th细胞或调节性T细胞(Treg)，其 中再刺激、抑制蛋白分泌、胞内染色等技术是鉴定初始CD4+T细胞是否分化以及分化成为何 种Th或Treg细胞的必要手段。要用到包被好Anti-mouse_CD3和Anti-mouse_CD28的培 养板，以及Golgi-plug、甲醛、Saponin来对细胞行固定打孔，还要使用荧光标记的胞内细 胞因子抗体进行胞内染色。而此过程不仅使筛选药物变得繁琐耗时、增加成本费用，也无法 实现高通量筛选。基本步骤如下1、超净台内取哺乳动物脾脏、淋巴结，用注射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解 红细胞后制成单细胞悬液；2、96 孑L 包被板 Anti-mouse-CD3 (10 u g/ml)禾口 / 或 Anti-mouse_CD28 (1 u g/ml) 中，以2X106个细胞/mL密度、200iU每孔培养于RPMI培养基内，并加入抗体与细胞因子 刺激初始CD4+T细胞分化；3. 48h换液，视细胞密度转孔，加入新鲜的IL-2 (2ng/mL)刺激1天；4. 72h转到另外包被好的96孔板再刺激。37°C，2_4h ；5.加 Golgi-plug，37°C 2h ；6.收细胞于流式管，荧光抗体APC-Anti-mouse-CD4或PE-Anti-mouse-CD4，200倍稀释(即终浓度1 P g/ml)表面染色，遮光冰浴15min ；7. PBS洗去未结合的抗体，离心、弃上清；8.每管加2%甲醛(in PBS溶液)2mL，室温固定30min ；9. PBS洗去甲醛，离心、弃上清；10.加入2mL配制好的0. 5% Saponin溶液，轻轻混勻，遮光室温打孔30min ；11.离心、弃上清，加Saponin buffer 100 y L，胞内染色遮光冰浴30min ；12. Saponin buffer 洗 2 遍，PBS 洗 1 遍；13.每管样品重悬在0.5mL PBS中，流式细胞仪检测(表达某种细胞因子的 Tcell)/CD4+T cell 百分率。该种T细胞体外培养分化方法存在的缺点是步骤繁琐，耗费时间长，难以应用 于药物高通量筛选。需要的成本较高，Anti-mouse-CD3, Anti-mouse_CD28，Golgi-plug, Saponin—般实验室难以获得、且价格昂贵，并非所有实验室都有这个条件，繁琐的步骤使 得每组数据的平行性很难控制，并且容易受制于胞内染色技术不成熟，常常得不到好的结^ o
发明内容本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，通过荧光报告基因小 鼠T细胞体外培养分化模型及筛选平台的建立，提供一种省时高效、高通量完成与机体免 疫系统各种细胞因子相关的药物的筛选方法。本发明提供的T细胞体外培养分化模型及药物筛选方法，包括如下步骤第一、超净台内取荧光报告基因哺乳动物脾脏、淋巴结，浸于1640培养液中，用注 射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；第二、96孔板中，以1 X 106—107个细胞/mL密度、200iU每孔培养于RPMI培养基 内；第三、将第二步的96孔板分成实验组和对照组，并与第四步同时刻或早于第四步 向实验组加入待筛选药物，向对照组加入待筛选药物中使用的溶剂DMS0或H20 ；第四、向第二步的96孔板中加入抗体与细胞因子刺激初始CD4+T细胞分化；第五、48h收取96孔板中细胞，行CD4表面染色后，用流式细胞仪检测荧光报告基 因EGFP T cell/⑶4+T cell百分率，即分化出的T细胞占总体⑶4+T细胞的比例；第六、与对照组相比，能够使EGFP T cell/⑶4+T cell百分率有显著增高或者降 低的药物为候选药物，并用药物剂量效应关系进一步验证。第一步所述的哺乳动物可以是荧光报告基因小鼠或大鼠。第二步所述的细胞接种密度为2X 106/mL。第三步所述的加入药物时刻为_lh或Oh。第四步所述的抗体为包被或可溶的Anti-mouse-⑶3 (5 u g/ml)和/或 Anti-mouse-CD28(1u g/ml)。第四步所述的抗体还可以为刀豆蛋白ConA(2. 5ng/ml)。第四步所述的细胞因子为IL-2(2ng/ml)，以及根据要求T细胞分化的方向需要 加入的细胞因子，包括，向Thl分化加入IL-12(5ng/ml)和/或Anti-IL-4 (10ug/ml)；向 Th2 分化加入 IL-4(20ng/ml)和 / 或 Anti-mouse-IFN-Y (10 u g/ml)；向 Treg 分化加入 TGF-beta(5ng/ml)；向 Thl7 分化加入 TGF-beta(5ng/ml)、IL-6 (20ng/ml)、IL-21 (50ng/
4ml)、IL-23(10ng/ml)或 IL-27(20ng/ml)。第五步所述的EGFP T cell为任一荧光标示的Tcell，例如RFP、cy5标示的T cell寸。此外，第一步所述的单细胞悬液系全脾与淋巴结细胞混合，在得到候选药物后可 以将全脾与淋巴结单细胞悬液行CD44、CD62L表面染色，分选出纯度高的初始CD4+T细胞 (⑶44L°wCD62LHight)继续第二步至第六步验证。此方法可以通过荧光报告基因检测荧光蛋白标记细胞因子的产生，筛选影响初始 T细胞分化和细胞因子分泌的小分子药物。本发明提供的4get小鼠(EGFP可报告Th2分化中IL-4的产生)T细胞体外培养 分化模型及药物筛选方法的具体步骤如下(1)超净台内取4get小鼠脾脏、淋巴结浸于RPMI1640培养液中，以注射器针芯碾 碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；(2)96孔板中(无需包被)，以2X 106个细胞/mL密度、200 yl每孔培养 于 RPMI 培养基内，并加入 conA(2. 5ii g/ml)、IL-2 (2ng/ml)、IL-4(20ng/ml)和或 Anti-mouse-IFN- y (10 u g/ml)刺激初始 CD4+T 细胞向 Th2 分化；(3)同时刻，96孔板各孔中加入药物(即0小时加药)实验组加入待筛选药物， 设立对照组加入待筛选药物溶解过程使用的溶剂DMS0或H20 ；(4) 48h收每孔细胞于流式管，荧光抗体APC-Anti-mouse-CD4(0. 2mg/ml)表面染 色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未结合的抗体，离心、弃上清；(6)每管样品重悬在0. 5mL PBS中，流式细胞仪检测EGFP T cell/CD4+T cell百 分率。此方法可以通过检测EGFP标记的IL-4，筛选影响初始T细胞向Th2分化和调节 IL-4分泌的小分子药物，由于该模型产生的IL-4是介导哮喘疾病发生的主要细胞因子，与 人类的哮喘病发病机理相似，故可应用于筛选治疗哮喘病药物。本发明的优点和积极效果本发明与传统T细胞体外培养分化的方法比较具有如下优点1、极大地节省了时间、工作量。48h既能完成上百种药物的筛选，缩短了时间；该 方法应用简单，并且不需要复杂的包板再刺激与胞内染色，大大节省了劳动量。2、降低成本。由于应用荧光报告基因小鼠及可溶性抗体(无需包板)，省略了包 板、再刺激、胞内染色等繁琐步骤，节省了昂贵的包板抗体与胞内荧光染色抗体。3、确保高通量筛选平台的建立。由于应用了可溶性抗体(ConA)以及不需要人工 的包板、转孔、换液等步骤，可以达到计算机控制的自动化水平，现有的多种类荧光报告基 因小鼠可以确保高通量药物筛选平台的建立。4、结果准确。采用荧光报告基因小鼠，化合物的药效结果可以通过光学强度的改 变表现出来，避免了因胞内染色技术不成熟导致的实验结果不稳定或失败，是国际前沿的 高通量筛选体系。5、应用广泛。机体免疫功能的改变直接与体系的荧光强度相连，这些重要的免疫 过程与很多重大疾病相关，包括各种癌症，糖尿病，病毒感染，自身免疫疾病红斑狼疮，类风
5湿性关节炎等。我们的筛选模型可以用于广泛疾病的新药筛选。
图1是初始T细胞培养向Th2分化示意图，图1 (a) Oh初始T细胞培养，细胞相对 圆而小；图l(b)24h T细胞培养及向Th2分化情况，细胞出现变形；图l(c)48h T细胞培养 及向Th2分化情况，更多细胞发生变形，并有明显集落形成；放大倍数40X10 ；黑色箭头 激活的T细胞形成的集落。图l(d)T细胞体外培养48h向Th2分化流式散点图，经流式细 胞仪检测对照组(不加药物)EGFP T细胞/CD4+T细胞百分率为59%。图2、图3、图4是实施例1示意图，从1-8号药物中初步筛选出4号药物可抑制 初始T细胞向Th2分化。图2 1-8号药物结构式；图3 初筛(a)加入药物溶剂DMS0对照 组，(b)-(i)加入1-8号药物组；(j)结果统计，流式细胞仪检测加入4号药物组EGFP T细 胞/CD4+T细胞百分率为22% ；图4-1药物剂量效应关系(a)-(l)0h施加不同浓度4号药 物，48h后初始T细胞向Th2分化情况；每排为一个浓度梯度的三次重复，浓度如图中标出； 图4-2(m)结果统计，误差线为三次独立重复实验的标准差；与DMSO control比较，g/ml 浓度下4号药物具有显著的抑制Th2分化作用，EGFP T细胞/⑶4+T细胞百分率为22. 37% (以 control 为 100% )p < 0. 01 ；图5、图6是实施例2示意图，从1-81种天然提取物中初步筛选出27、29号小分子 化合物可抑制初始T细胞向Th2分化过程中IL-4细胞因子的产生。图5 初筛(a)Rl画门 在淋巴细胞；(b)R2画门在CD4+T细胞；(c)加入药物溶剂DMS0对照组，(d)-(g)加入26-29 号药物组(散点图显示为R1&R2门)；(h)结果统计，流式细胞仪检测加入27，29号药物组 EGFP T细胞/CD4+T细胞百分率分别为38%、13% (以control为100% )；图6_1药物剂 量效应关系(a)-(n)号，图6-2药物剂量效应关系(o)-(w)号及结果统计(X)，其中，(a)Rl 画门在淋巴细胞；(b)R2画门在CD4+T细胞；(c)-(e)加入药物溶剂DMS0对照组，(f)-(w)0h 施加不同浓度27、29号药物，48h后初始T细胞向Th2分化情况；每排为一个浓度梯度的三 次重复，药物及浓度如图左所示；图(x)结果统计，误差线为三次独立重复实验的标准差； 与DMSO control比较，10nmol/ml浓度下29号药物具有显著的抑制Th2分化作用，EGFP T 细胞 /CD4+T 细胞百分率为 21. 64% (以 control 为 100% ), p < 0. 01 ；。
具体实施方式实施例1 应用4get小鼠从1-8号药物中初步筛选出4号药物可抑制初始T细胞向Th2分 化过程中IL-4细胞因子的产生(1)超净台内取4get小鼠脾脏、淋巴结浸于1640培养液中，以注射器针芯碾碎过 200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；(2)96孔板中(无需包被)，以2\106个细胞/1^密度、200111每孔培养于1 ^1 培养基内，并加入 conA(2. 5ii g/ml)与 IL-2 (2ng/ml)、IL-4 (20ng/ml)刺激初始 CD4+T 细胞 向Th2分化；(3)同时刻，96孔板各孔中加入药物(即0小时加药)实验组加入待筛选1-8号 药物结构式见图2 (1-8)，终浓度1 y g/ml，对照组加入待筛选药物溶剂DMS0 ；(4)48h收每孔细胞于流式管，荧光抗体APC-Anti-m0uSe-CD4(终浓度1 y g/ml)表面染色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未结合的抗体，离心、弃上清；(6)每管样品重悬在0. 5mL PBS中，流式细胞仪检测EGFP T cell/⑶4+T cell百分 率。结果如图3(a)-(i)，4号药物可显著降低EGFP T cell/⑶4+T cell百分率如图3 (j)。(7)为进一步验证4号药物的抑制作用，于T细胞体外培养分化0小时加入不同浓 度的4号药物实验组加入4号药物浓度分别为0. 1 u g/mlUu g/ml、5ii g/ml，每浓度设三 个重复，对照组加入待筛选药物溶剂DMS0 ；48h检测EGFP T cell/⑶4+Tcell百分率，4号药 物浓度在5 u g/ml时可显著抑制IL-4产生见图4(m)。实施例2应用4get小鼠从1-81种天然提取物中初步筛选出27、29号小分子化合物可抑制 初始T细胞向Th2分化过程中IL-4细胞因子的产生(1)超净台内取4get小鼠脾脏、淋巴结浸于1640培养液中，以注射器针芯碾碎过 200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；(2)96孔板中(无需包被)，以2\106个细胞/1^密度、200111每孔培养于1 ^1 培养基内，并加入 conA(2. 5ii g/ml)与 IL-2 (2ng/ml)、IL-4 (20ng/ml)刺激初始 CD4+T 细胞 向Th2分化；(3)同时刻，96孔板各孔中加入药物(即0小时加药)实验组加入待筛选1-81种 天然提取物(终浓度lOnmol/ml)，对照组加入待筛选药物溶剂DMS0或H20 ；(4)48h收每孔细胞于流式管，荧光抗体APC-Anti-m0uSe-CD4(终浓度1 y g/ml)表 面染色，遮光冰浴15min ；(5)PBS洗去未结合的抗体，离心、弃上清；(6)每管样品重悬在0. 5mL PBS中，流式细胞仪检测EGFP T cell/CD4+T cell百 分率。其中加入27、29号小分子化合物组EGFP T cell/CD4+T cell百分率分别为38%、 13% (以control为100% )见图5(h)，仅附1_81种天然提取物中四种化合物的检测结果。(7)药物剂量效应关系为进一步验证初筛结果(即27、29号小分子化合物的抑 制作用)，于T细胞体外培养分化Oh加入不同浓度的27、29号小分子化合物三个浓度梯 度分别为0. lnmol/ml、lnmol/ml、lOnmol/ml，每浓度设三个重复，对照组加入待筛选药物溶 剂DMS0 ;48h检测EGFP T cell/CD4+T cell百分率，29号小分子化合物浓度在lOnmol/ml 时可显著抑制IL-4产生见图6 (x)。
权利要求
一种报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及药物筛选的方法，其特征在于该方法包括如下步骤第一、超净台内取荧光报告基因哺乳动物脾脏、淋巴结，浸入1640培养基，用注射器针芯碾碎过200目金属滤网，溶解红细胞后制成单细胞悬液；第二、96孔板中，以1×106--107个细胞/mL密度、200μl每孔培养于RPMI培养基内；第三、将第二步的96孔板分成实验组和对照组，并与第四步同时刻或早于第四步向实验组加入待筛选药物，向对照组加入待筛选药物中使用的溶剂DMSO或H2O；第四、向第二步的96孔板中加入抗体与细胞因子刺激初始CD4+T细胞分化；第五、48h收取96孔板中细胞，行CD4表面染色后，用流式细胞仪检测分化出的T细胞占总体CD4+T细胞的比例，即EGFPT cell/CD4+T cell百分率；第六、与对照组相比，能够使EGFP T cell/CD4+T cell百分率有显著增高或者降低的药物为候选药物，并用药物剂量效应关系进一步验证。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一步所述的哺乳动物是荧光报告基因小鼠 或大鼠。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于第二步所述的细胞接种密度为2X106/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于第三步所述的加入药物时刻为-Ih或Oh。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的抗体为包被或可溶的浓度为 5 μ g/ml 的 Anti-mouse-CD3 禾口 / 或浓度为 1 μ g/ml 的 Anti-mouse_CD28。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的抗体为刀豆蛋白浓度为2.5ng/ ml 的 ConA0
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于第四步所述的细胞因子为2ng/mlIL-2， 以及根据要求T细胞分化的方向需要加入的细胞因子，包括，向Thl分化加入5ng/ ml IL-12 禾口 / 或 10ug/ml Anti-IL-4 ；向 Th2 分化力口 入 20ng/ml IL-4 禾口 / 或 10 μ g/ ml Anti-mouse-IFN-y ；向 Treg 分化力口入 5ng/ml TGF—beta ；向 Thl7 分化力口入 5ng/ml TGF-beta、20ng/ml IL_6、50ng/ml IL-21、10ng/ml IL-23 或 20ng/ml IL-27。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于第五步所述的EGFPT cell为任一荧光标示 的 T cell。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于第五步所述的EGFPT cell为RFP或cy5标 示的T cell。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一步所述的单细胞悬液含有全脾与淋巴 结细胞混合，在得到候选药物后可以将全脾与淋巴结单细胞悬液行CD44、CD62L表面染色， 分选出纯度高的⑶初始⑶4+T细胞继续第二步至第六步验证。
全文摘要
一种荧光报告基因小鼠T细胞体外培养分化模型及药物筛选方法，以及利用4get(IL-4/GFP-enhanced transcript)小鼠筛选治疗哮喘病药物的具体方法，包括T细胞体外培养分化、同时刻药物高通量筛选及流式细胞仪检测。本发明中的T细胞体外培养分化与药物筛选分别涉及免疫学与化学生物学领域，应用特有的荧光报告基因小鼠在T细胞分化过程中可指示特定细胞因子的产生，具备高通量筛选小分子药物及天然产物提取物的能力。基于该模型的药物筛选平台可用于筛选新药，以及开发一批对机体免疫反应和对T细胞分化、重要细胞因子分泌具有调控作用的药物。
文档编号C12Q1/02GK101851657SQ20101013884
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月6日 优先权日2010年4月6日 公开号201010138847.8
发明者刘兰珍, 尹芝南, 张宝童, 温倜, 王璞玥, 赵立青, 陈曦 申请人:南开大学