专利名称：一种牛诱导性多能干细胞诱导方法
技术领域：
本发明涉及细胞诱变技术领域，具体是一种牛诱导性多能干细胞诱导方法。
背景技术：
自从2006年(Takahashi K and Yamanaka S, 2006)第一次报道通过外源性导入四种限定因子(0Ct4、SOX2、C-MyC、Klf4)使小鼠皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)后，到目前为止，已从包括人、猴、大鼠和猪等多个物种、多种类型体细胞中成功诱导产生诱导性多能干细胞(Yu J et al. ,2007 ；Liu H et al.，2008 ；Liao J et al.，2009 ；Esteban MA et al.，2009)。并且，随着研究的进一步发展，已尝试运用某些方法来解决最初诱导产生的小鼠和人诱导性多能干细胞效率低下和安全性等问题。并且最近我国两个研究小组均报道他们诱导产生的小鼠诱导性多能干细胞通过四倍体胚胎互补技术获得了完全由诱导性多能干细胞制备的活体小鼠，有力地证明了诱导性多能干细胞具有真正的全能性(Zhao XY et al.，2009 ；Kang L etal.，2009)。因此，应用限定因子直接重编程体细胞为诱导性多能干细胞是干细胞生物学领域的一项重大突破，在遗传工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。与小鼠、大鼠、猴子等动物来源的胚胎不同，从偶蹄类大家畜胚胎中分离出的胚胎干细胞系在培养过程中很不稳定，很快就会失去其特性。尽管各国科学家已有多年的尝试， 但目前尚未有成功分离牛的多能性胚胎干细胞系的报道。因此如果通过限定因子成功诱导产生具有全能性的牛诱导性多能干细胞，那么就能够有效地利用其干细胞特征进行相关的科学研究，以及利用其与胚胎干细胞相似的特性用于转基因家畜动物的生产应用。然而目前关于牛诱导性多能干细胞的诱导技术国内外尚未有文献报道。
发明内容
本发明提供了一种牛诱导性多能干细胞诱导方法，利用外源限定因子与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)构建融合蛋白慢病毒表达载体用于牛诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的牛胎儿成纤维细胞进行培养传代，逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示0ct4、NanOg、SSEA-I蛋白表达为阳性， 体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实分离培养的细胞克隆具有胚胎干细胞样特征，成功分离培养得到牛诱导性多能干细胞。本发明的技术方案为一种牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤(1)、限定因子慢病毒表达载体的构建根据猪Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列和人0ct4的DNA序列，设计合成出 pSox2、pKlf4、pc-Myc、h0ct4 基因的上、下游引物；从猪囊胚中提取总RNA，利用设计合成出的pSox2、pKlf4和pc-Myc基因的上、下游引物经RT-PCR扩增出猪限定基因DNA，人0ct4的DNA序列经h0ct4基因的上、下游引物直接从人0ct4基因中扩增获取，将猪限定基因DNA和人0ct4的DNA序列进行酶切，然后与逆转录病毒载体pLEGFP-Nl连接，构建出逆转录病毒融合蛋白表达载体，从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出CMV启动子连同限定基因及EGFP基因，同时通过酶切从pLL3. 7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列，最后把CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的PLL3. 7进行重组，构建出慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；所述的pSox2、pKlf4、pc-Myc、h0ct4基因的上、下游引物序列为pSox2 上游5，-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3，；下游5，-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3，；pKlf4 上游5，-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3，；下游5，-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3，；pc-Myc 上游5，-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3，；下游5，-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3，；h0ct4 上游5，-AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3，；下游5，-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3，。(2)、牛胎儿成纤维细胞的诱导采用组织块培养法建立牛胎儿成纤维细胞系，采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包装到细胞，12-16h后换细胞新鲜培养液，病毒包装4 后收集含病毒培养液，经超滤浓缩后添加到含有牛胎儿成纤维细胞培养板内，感染18-20天后，细胞出现初步形态变化后将感染的细胞经Dispase II消化，接种至丝裂霉素C处理过的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养，感染23-25天后， 牛胚胎干细胞样克隆明显可见。所述的慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体构建的具体操作步骤包括首先将 PLL3. 7用Apa I进行酶切，T4 DNA聚合酶将其末端平滑化，再用EcoR I进行单酶切，即从 pLL3. 7质粒中移除TO启动子、CMV启动子和GFP序列；设计载体改造引物，从构建好的逆转录病毒融合蛋白表达载体中经载体改造引物扩增出CMV启动子连同限定基因和EGFP序列， 然后用Mim I进行单酶切，纯化后用T4连接酶将从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出的CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的pLL3. 7连接进行重组，构建好慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；所述的设计载体改造引物的DNA序列为上游5，-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3，；下游5，-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，。所述的病毒包装前一天汇合细胞，293Τ细胞培养液为含8_12%的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml链霉素的高糖DMEM，细胞汇合50-60 %时进行病毒包装；所述的病毒包装采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、 pRSV REV和pVSVg包装到细胞，12-16h后换细胞新鲜培养液，48h后收集含病毒培养液经0. 45 μ m的滤膜过滤后转移到Millipore的100KD超滤管中，在3_5°C下4000rpm离心20-40min得浓缩病毒液。所述的病毒开始感染牛胎儿成纤维细胞的前一天将牛胎儿成纤维细胞注入到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为IXlO5/孔，牛胎儿成纤维细胞培养液为含8-12% 的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml链霉素的高糖DMEM，M小时后换成添加有浓缩病毒液和浓度为10yg/mL Polybrene的牛胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染 12小时后换无病毒液的牛胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染的第二天换成添加有浓缩病毒液和浓度为10μ g/mLPolybrene的牛胎儿成纤维细胞培养液再感染一次，12小时后再换无病毒液的牛胎儿成纤维细胞培养液，经过2次慢病毒感染后即病毒开始感染的第三天将牛胎儿成纤维细胞培养板内的培养液更换为牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液， 18-20天后，用Dispase II消化接种到丝裂霉素C处理的12. 5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加新的牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液在37. 5°C,5% CO2饱和湿度下继续进行培养。所述的牛胎儿成纤维细胞系培养的具体步骤包括取2. 5月龄荷斯坦奶牛胎儿皮肤组织，采用组织块培养法建立成纤维细胞系，培养液为含有8-12%胎牛血清，95-105U/ml 青霉素，0. 08-0. 12mg/ml链霉素的高糖DMEM ；所述的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备方法为选择铺满皿底的2-4代的小鼠胚胎成纤维细胞，经9-1 lug/ml的丝裂霉素C处理2_3h， 常规胰酶消化接种到铺过浓度为0. 008-0. 012g/L明胶的培养皿内进行培养，接种细胞密度为2X IO5个/ml。所述的牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液为含1.5_2.5mM谷氨酰胺、 1. 5-2. 5mM丙酮酸钠、0. 8-1. 2%的非必须氨基酸、0. 08-0. 12mM β -巯基乙醇、990-1100U/ ml LIF、3. 5-4. 5ng/ml bFGF、13-17%的 FBS 和 0. 8-1. 2%青链霉素的高糖 DMEM。本发明所述的％均值占总体积的体积百分比。所述的猪Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列信息来自美国国立生物技术信息中心数据库。所述的pSoX2、pKlf4、pC-MyC基因的上、下游引物是指能从物种猪的DNA片段中扩增出相应基因的特定DNA序列。h0ct4基因的上、下游引物是指从直接人0ct4基因中扩增出h0ct4基因的特定DNA序列。所述的载体改造引物是指从构建好的逆转录病毒载体质粒pLEGFP-hOCT4/ pS0X2/pMYC/pKLF4中扩增出CMV启动子连同限定基因和EGFP序列的特定DNA序列，引物一般是自己设计，专门的生物公司合成。所述的更换细胞新鲜培养液的目的是是将多余的未进入细胞的磷酸钙沉淀和细胞代谢产物去除，换成正常细胞培养需要的培养液，这样有利于细胞生长和在后续时间内细胞包装产生的含病毒的培养液收集。本发明的优点在于(1)、本发明利用外源限定因子与EGFP构建融合蛋白慢病毒表达载体用于牛诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的牛胎儿成纤维细胞进行培养传代， 能够逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示0ct4、Nanog, SSEA-I蛋白表达为阳性，体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实分离培养的细胞克隆为多能性干细胞，可称之为牛诱导性多能干细胞；首次成功诱导产生牛诱导性多能干细胞；(2)与通常的诱导性多能干细胞诱导技术相比，本发明采用的是限定因子和EGFP 组建的融合蛋白进行牛诱导性多能干细胞的诱导，融合蛋白(fusionprotein)是采用DNA 重组技术在基因水平上将两种蛋白质或蛋白质结构域的编码区依读码框架首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达产物；融合蛋白技术因其在目的蛋白的表达、构建具有双功能的目的蛋白等研究方面有具有不可替代的作用，在医药，农业，环境等的生产、研究中有着重要的用途；EGFP是荧光蛋白家族中常用的一种，荧光具有高度稳定性，对于外源限定因子在细胞重编程过程中发挥作用的机制和特点，外源限定因子和EGFP组建的融合蛋白能够有效地检测、追踪和掌握外源限定因子的特点，有助于将来进行牛诱导性多能干细胞的机理研究；(3)本发明采用的牛诱导性多能干细胞诱导和维持其干细胞特征的培养液配方对将来分离培养建立真正的牛胚胎干细胞系具有一定的参考价值。利用外源限定因子与EGFP组建融合蛋白应用于牛诱导性多能干细胞的诱导，可追踪掌握外源限定因子在重编程过程中的发生机制和特点，从本发明可知，外源限定因子在牛诱导性多能干细胞集落中大多数处于不表达或低水平表达，少数细胞则处于高表达状态，说明了体细胞完全重编程形成诱导性多能干细胞后外源基因不表达，不完全重编程的体细胞外源基因仍处于高表达状态。^iao等(Zhao Y et al.，2008)用EGFP作为荧光标记诱导人的诱导性多能干细胞中发现，EGFP表达的沉寂预示着诱导性多能干细胞的完全重编程，EGFP的表达显示诱导性多能干细胞的尚处于不完全重编程。Yu等(Yu J et al., 2009)通过基因芯片检测发现完全重构的人诱导性多能干细胞与人ES细胞0ct4的表达水平一致。Maherali等(Maherali N et al.，2007)采用外源限定因子的诱导表达时证实了小鼠诱导性多能干细胞形成后外源限定因子的表达不为诱导性多能干细胞的生长所必需。众多的研究结果显示了诱导性多能干细胞形成后激活的内源性多能性基因足以维持干细胞的生长发育，外源性限定因子在诱导性多能干细胞中处于沉寂状态。利用限定因子与 EGFP组建融合蛋白此项发明技术用于牛体细胞的重编程，可成功诱导产生牛诱导性多能干细胞，而目前对于牛诱导性多能干细胞技术国内外尚未见有文献报道，因此本发明为国内外首创，拉近了诱导性多能干走向畜牧业应用的距离，具有深远意义。其次，利用EGFP带有稳定绿色荧光的特点，可追踪掌握外源限定因子在细胞重编程过程中发挥作用的机制和特点，为将来深入研究利用牛诱导性多能干细胞相关工作奠定基础。再次，因目前国内外尚未建立牛胚胎干细胞系，本发明技术中采用的诱导和维持牛诱导性多能干细胞培养液配方为将来研究建立牛胚胎干细胞系可提供参考。
图1是pLL3. 7质粒图谱示意图。图2是限定因子融合蛋白逆转录病毒载体构建图谱示意图。图3是限定因子融合蛋白慢病毒载体质粒pLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4-GFP构建图谱示意图。图4是牛诱导性多能干细胞诱导过程示意图。图5是病毒感染前牛胎儿成纤维细胞的形态图。
图6是病毒感染2次后在干细胞培养液培养条件下第19天的牛胎儿成纤维细胞的形态图。图7是牛诱导性多能干细胞克隆形态图。图8是第13代牛诱导性多能干细胞中期分裂相图。图9是RT-PCR检测多能性基因图，图中1代表牛胎儿成纤维细胞，2_3代表牛诱导性多能干细胞，4代表小鼠ES细胞。图10是牛诱导性多能干细胞表达胚胎干细胞AP染色的显微镜图。图11是牛诱导性多能干细胞表达胚胎干细胞0ct4蛋白的表达的显微镜图。图12是牛诱导性多能干细胞表达胚胎干细胞Nanog蛋白的表达的显微镜图。图13是牛诱导性多能干细胞表达胚胎干细胞SSEA-I蛋白的表达的显微镜图。图14是牛诱导性多能干细胞在裸鼠体内的神经样组织(外胚层)的显微镜图。图15是牛诱导性多能干细胞在裸鼠体内的肌肉样组织(中胚层)的显微镜图。图16是牛诱导性多能干细胞在裸鼠体内的腺管样样组织(内胚层)的显微镜图。
具体实施例方式具体实施例荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞诱导为诱导性多能干细胞方法(1)、限定因子慢病毒表达载体的构建根据NCBI 上猪 Sox2 (NM 001123197)、c_Myc (NM 001005154)、Klf4 (NM001031782) 基因的mRNA序列，设计合成上、下游引物，引物序列如下pSox2 上游5，-TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3，下游5，-AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3，pKlf4 上游5，-TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3，下游5，-GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3，pc-Myc 上游5，-GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3，下游5，-AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3，h0ct4 上游5’ -AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’下游5，-CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3，载体改造引物上游5，-AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3，下游5，-GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，从猪囊胚中提取总RNA，经RT-PCR扩增出猪限定基因DNA，人0ct4的DNA序列直接从人0ct4基因中扩增获取，经限制性内切酶酶切，与逆转录病毒载体pLEGFP-m连接，构建出逆转录病毒融合蛋白表达载体。从重构的逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出CMV 启动子连同限定基因及EGFP基因，同时通过酶切从pLL3. 7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列，最后把重组逆转录病毒载体中扩增的启动子和限定基因融合蛋白序列与酶切后的PLL3. 7进行重组，构建出慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体(图3)。具体操作步骤如下首先将PLL3. 7用Apa I进行酶切，T4 DNA聚合酶将其末端平滑化，再用EcoR I进行单酶切，即从PLL3. 7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列。设计载体改造引物从构建好的逆转录病毒载体质粒pLEGFP—h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4中扩增出CMV启动子、目的片段和EGFP序列，然后用Mim I进行单酶切，纯化后用T4连接酶将两者连接即构建好慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体。(2)、牛胎儿成纤维细胞的诱导材料和试剂胎牛成纤维细胞的分离和培养采用组织块培养法建立2. 5月龄荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞系，培养液为含有占体积百分比10%胎牛血清(Hyclone)，100U/ml青霉素， 0. lmg/ml 链霉素的高糖 DMEM(Hyclone)。胎鼠成纤维细胞(mouseembryo fibroblasts，MEFs)系的建立妊娠 12. 5dICR 品系胎鼠，去除头、四肢和内脏后采用胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞。培养液为含有占体积百分比10%新生牛血清(四季青)，100U/ml青霉素，0. lmg/ml链霉素的高糖 DMEM(Hyclone)。饲养层的制备选择铺满皿底的2-4代的小鼠胚胎成纤维细胞，经lOug/ml的丝裂霉素C(Sigma)处理2. 5h，常规胰酶消化接种到铺过0. 01g/L明胶的培养皿内，接种细胞密度为2X IO5个/ml。培养液同小鼠胚胎成纤维细胞培养液。牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液(ES培养液)含有2mM谷氨酰胺 (Gibco)、2mM丙酮酸钠(Gibco)、占体积百分比非必须氨基酸(Gibco)、0. ImM β-巯基乙醇(Sigma)、1000U/ml LIF(ESGR0, Chemicon International)、4ng/ml bFGF(Sigma)、 占体积百分比15 % FBS(Hyclone)、占体积百分比1 %青链霉素(Gibco)的高糖 DMEM(Hyclone)。293T细胞培养液同牛胎儿成纤维细胞培养液，所有细胞均在37. 5°C，5% CO2,饱和湿度下CO2培养箱中培养。通过组织块培养法从2. 5月龄荷斯坦奶牛胎儿皮肤分离培养建立牛胎儿成纤维细胞系，胎牛成纤维细胞从第7代开始感染，具体的重编程方案见图4。采用磷酸钙法转染四因子质粒 PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4 和包装组分 pMLg、pRSV REV 和 pVSVg 到 293T 细胞，12-16h后换新鲜培养液，病毒包装4 后收集含病毒培养液，含病毒培养液经0. 45 μ m 的滤膜过滤后转移到Mi 11 ipore的100KD超滤管中，在4°C下4000rpm离心20-40min得浓缩病毒液。病毒开始感染牛胎儿成纤维细胞的前一天将牛胎儿成纤维细胞注入到6孔板内， 细胞密度为IX IO5/孔，培养液为含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，0. lmg/ml链霉素的高糖DMEM，第二天换成添加有浓缩病毒液和浓度为10 μ g/mL Polybrene的牛胎儿成纤维细胞培养液，12小时后换新鲜牛胎儿成纤维细胞培养液，第三天换成添加有浓缩病毒液和浓度为10 μ g/mL Polybrene的牛胎儿成纤维细胞培养液再感染一次，12小时后再换新鲜牛胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染猪胎儿成纤维细胞的当天记为O天，经过2次慢病毒感染第3d更换牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液，大约19天以后，成纤维细胞的形态开始发生改变，即少量胎牛成纤维细胞由长梭形变成圆球形，并且呈集落样生长，Dispase II(Roche)消化后接种到12. 5d小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液在37. 5°C,5% CO2饱和湿度下继续进行培养，在感染后第23天，圆形的边界清楚的胚胎干细胞样克隆明显可见。用Dispase II消化克隆接种到新的饲养层上继续扩增培养，刚开始按1 1的比例传代，随后按1 4的比例传代，每隔4d左右传代一次。(3)、牛诱导细胞的鉴定RT-PCR检测应用Trizol试剂(Invitrogen)处理牛诱导性多能干细胞，然后提取细胞总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明书(Takara公司)合成cDNA。用下述鉴定引物扩增相应基因，引物序列如下牛0ct4 上游5，-TTGAAGCTTGCCACCATGGCGGGACACCTCGCTT-3，下游5’ -GCAGGATCCTCAGTTTGCATGCATAGGGGAGCCC-3’
牛 Nanog 上游5，-ATTAAGCTTGCCACCATGAGTGTGGGCCCAGCTT-3，下游5，-CGCGGATCCTTACAAATCTTCAGGCTGTA-3，牛Klf4 上游5，-ATTAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCGC-3，下游5’ -GCGGGATCCTTAAAAGTGCCTCTTCATGTGTAAGGCG-3’牛c-Myc 上游5，-TATAAGCTTGCCACCATGCCCCTCAACGTCAGCT-3，下游5，-GCGGGATCCTTAGGCGCAAGAGTTCCGTA-3，GAPDH 上游5，-TTGGTATCGTGGAAGGACTCTA-3，下游5，-TGTCATATTTGGCAGGTT-3，核型分析0. 1 μ g/ml秋水仙素(Sigma)处理牛诱导性多能干细胞2. 5 h，胰酶消化并重悬于0.075 mol/LKCL，37°C孵育25min，固定液(甲醇冰醋酸=3 1)固定lOmin， 离心固定重复3次。收获细胞，滴片，Gimsa染色，空气干燥，封片。显微镜下观察及应用相关软件分析染色体配对。免疫荧光检测细胞经4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室温封闭 30min，添加一抗为兔抗 0ct4 (Abeam)、山羊抗 Nanog (R&D)、鼠抗 SSEA-1 (Chemicon)、鼠抗 SSEA-3 (R&D)、鼠抗 SSEA-4 (R&D)、鼠抗 TRA-1-60 (Chemicon)、鼠抗 TRA-1-81 (Chemicon)，按 1 200稀释后4°C孵育过夜。PBS洗3次，CT3红色荧光标记的二抗按1 200稀释后室温避光孵育lh，PBS洗3次，用1 μ g/mL的DAPI (Roche)进行细胞核染色Imin后荧光镜下观察结果。AP染色用4%多聚甲醛固定细胞，添加碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP) 染液进行染色，以胞浆着色为红棕色或咖啡色颗粒为阳性。体内分化检测=Dispase II消化牛诱导性多能干细胞，无血清DMEM重悬细胞后注射到免疫缺陷鼠(BALB/C-nu)背侧皮下，注射8w后处死裸鼠，取肿瘤组织4%多聚甲醛固定后进行苏木精伊红染色。0)、结果磷酸钙法包装的限定因子慢病毒感染猪牛胎儿成纤维细胞，在干细胞培养液培养条件下18-19天后，牛胎儿成纤维细胞的形态开始发生改变，少量牛胎儿成纤维细胞逐渐由长梭形转变成圆球形，呈聚集性生长。Dispase II消化的圆球形细胞在饲养层细胞上，用含1000U/ml LIF和^g/ml bFGF的干细胞培养液培养条件下，在感染后第23_24d，边界明显的集落状细胞克隆逐渐形成。高倍显微镜下集落中的单个细胞呈现细胞核较大，核质比例较高。在1 4传代的情况下细胞克隆大约每隔3-4天传代一次，细胞集落生长传代稳定(图5，6，7)。对传至第13代的牛诱导性多能干细胞进行核型分析显示猪诱导性多能干细胞染色体数为60，XY正常核型(图8)。RT-PCR检测限定因子融合蛋白诱导的牛诱导性多能干细胞相关多能性基因的表达，牛诱导性多能干细胞表达0ct4、c-Myc、Klf4和Nanog 基因，相同条件下牛胎儿成纤维细胞不表达NanOg、0Ct4、C-MyC、Klf4等相关基因(图9)。 AP在早期胚胎的干细胞中有较高表达，而在已分化的细胞中活性明显降低，甚至不表达，AP的表达是一种ES细胞及相关干细胞的重要特征之一。AP染色结果显示限定因子融合蛋白诱导的牛诱导性多能干细胞AP表达为强阳性(图10)。细胞免疫荧光检测显示诱导培养的牛诱导性多能干细胞表达0ct4、NanOg、SSEA-l蛋白(图11，12，13)，对于0ct4蛋白的表达检测，携带外源限定因子的细胞在整个细胞克隆中呈现0ct4蛋白强表达，EGFP为强表达的细胞则0ct4蛋白检测为强阳性，EGFP表达较弱或沉寂的细胞则0ct4蛋白表达水平呈现一般阳性(图11)，在相同条件下，Nanog蛋白的表达水平在细胞集落中介于表达EGFP或不表达EGFP的细胞之间没有差异。取限定因子融合蛋白诱导的猪诱导性多能干细胞在BALB/C 裸鼠皮下8w后形成的畸胎瘤，HE染色结果显示在畸胎瘤组织内存在神经、肌肉、腺体等三个胚层来源的细胞和组织(图14，15，16)。
权利要求
1.一种牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、限定因子慢病毒表达载体的构建根据猪Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列和人0ct4的DNA序列，设计合成出pSox2、 pKlf4、pc-Myc、h0ct4基因的上、下游引物；从猪囊胚中提取总RNA，利用设计合成出的pSox2、pKlf4和pc-Myc基因的上、下游引物经RT-PCR扩增出猪限定基因DNA，人0ct4的DNA序列经h0ct4基因的上、下游引物直接从人0ct4基因中扩增获取，将猪限定基因DNA和人0ct4的DNA序列进行酶切，然后与逆转录病毒载体pLEGFP-Nl连接，构建出逆转录病毒融合蛋白表达载体，从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出CMV启动子连同限定基因及EGFP基因，同时通过酶切从pLL3. 7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列，最后把CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的PLL3. 7进行重组，构建出慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体； 所述的pSox2、pKlf4、pc-Myc、h0ct4基因的上、下游引物序列为 pSox2 上游5’ -TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC-3，； 下游5’ -AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC-3’ ； pKlf4 上游5’ -TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC-3，； 下游5’ -GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC-3，； pc-Myc 上游5’ -GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG-3，； 下游5’ -AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG-3，； h0ct4 上游5’ -AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3，； 下游5’ -CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC-3，。 O)、牛胎儿成纤维细胞的诱导采用组织块培养法建立牛胎儿成纤维细胞系，采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包装到细胞，12-16h后换细胞新鲜培养液，病毒包装4 后收集含病毒培养液，经超滤浓缩后添加到含有牛胎儿成纤维细胞培养板内，感染18-20天后，细胞出现初步形态变化后将感染的细胞经Dispase II消化， 接种至丝裂霉素C处理过的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养，感染23-25天后，牛胚胎干细胞样克隆明显可见。
2.根据权利要求1所述的牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，所述的慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体构建的具体操作步骤包括首先将PLL3. 7用Apa I进行酶切，T4DNA聚合酶将其末端平滑化，再用EcoR I进行单酶切，即从pLL3. 7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列；设计载体改造引物，从构建好的逆转录病毒融合蛋白表达载体中经载体改造引物扩增出CMV启动子连同限定基因和EGFP序列，然后用Mim I进行单酶切，纯化后用T4连接酶将从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出的CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的pLL3. 7连接进行重组，构建好慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；所述的设计载体改造引物的DNA序列为 上游5’ -AAAGGGCCCGCGGGACTCTGGGGTTCGTAATA-3’ ； 下游5’ -GCGCAATTGTTACTTGTACAGCTCGTCC-3，。
3.根据权利要求1所述的牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于包括以下步骤所述的病毒包装前一天汇合细胞，293Τ细胞培养液为含8-12 %的胎牛血清、 95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml链霉素的高糖DMEM，细胞汇合50-60%时进行病毒包装；所述的病毒包装采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL-h0CT4/pS0X2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包装到细胞，12-16h后换细胞新鲜培养液，48h后收集含病毒培养液经0. 45 μ m的滤膜过滤后转移到Millipore的100KD超滤管中，在3_5°C下4000rpm离心 20-40min得浓缩病毒液。
4.根据权利要求1所述的牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤 所述的病毒开始感染牛胎儿成纤维细胞的前一天将牛胎儿成纤维细胞注入到牛胎儿成纤维细胞培养板内，细胞密度为IXlO5/孔，牛胎儿成纤维细胞培养液为含8-12%的胎牛血清、95-105U/ml青霉素、0. 08-0. 12mg/ml链霉素的高糖DMEM，M小时后换成添加有浓缩病毒液和浓度为10μ g/mL Polybrene的牛胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染12小时后换无病毒液的牛胎儿成纤维细胞培养液，病毒开始感染的第二天换成添加有浓缩病毒液和浓度为10μ g/mLPolybrene的牛胎儿成纤维细胞培养液再感染一次，12小时后再换无病毒液的牛胎儿成纤维细胞培养液，经过2次慢病毒感染后即病毒开始感染的第三天将牛胎儿成纤维细胞培养板内的培养液更换为牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液，18-20天后， 用Dispase II消化接种到丝裂霉素C处理的12. 5天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加新的牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液在37. 5°C,5% CO2饱和湿度下继续进行培养。
5.根据权利要求1所述的牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，所述的牛胎儿成纤维细胞系培养的具体步骤包括取2. 5月龄荷斯坦奶牛胎儿皮肤组织，采用组织块培养法建立成纤维细胞系，培养液为含有8-12%胎牛血清，95-105U/ml青霉素， 0. 08-0. 12mg/ml链霉素的高糖DMEM ；所述的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备方法为选择铺满皿底的2-4代的小鼠胚胎成纤维细胞，经9-llug/ml的丝裂霉素C处理2_3h，常规胰酶消化接种到铺过浓度为0. 008-0. 012g/L明胶的培养皿内进行培养，接种细胞密度为 2X IO5 个/ml。
6.根据权利要求4所述的牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于所述的牛诱导性多能干细胞诱导和维持培养液为含1. 5-2. 5mM谷氨酰胺、1. 5-2. 5mM丙酮酸钠、 0. 8-1. 2% 的非必须氨基酸、0. 08-0. 12mM β -巯基乙醇、990_1100U/ml LIF,3. 5-4. 5ng/ml bFGF、13-17%的FBS和0. 8-1. 2%青链霉素的高糖DMEM。
全文摘要
本发明公开了一种牛诱导性多能干细胞诱导方法，利用外源限定因子与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)报告基因构建融合蛋白慢病毒表达载体用于牛诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的牛胎儿成纤维细胞进行培养传代，逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性，体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实分离培养的细胞克隆具有胚胎干细胞样特征，得到牛诱导性多能干细胞。
文档编号C12N5/073GK102229909SQ20101013876
公开日2011年11月2日 申请日期2010年3月31日 优先权日2010年3月31日
发明者丁建平, 任春环, 刘亚, 刘旭光, 刘洪瑜, 张子军, 张运海, 方富贵, 曹鸿国, 李运生, 殷慧群, 王力生, 章孝荣, 陶勇 申请人:安徽农业大学