基于生物体寿命筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物的方法

专利名称：基于生物体寿命筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物的方法
技术领域：
本发明涉及筛选提高诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,简称iPSC)产生效率的化合物的方法，具体是基于生物体寿命，特别是果蝇寿命筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物的方法。本发明还涉及寿命延长化合物，特别是果蝇寿命延长化合物，具体是雷帕霉素、PP242、PQ401、白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺、LY294002和姜黄色素在提高诱导性多能干细胞产生效率中的新用途。
背景技术：
胚胎干细胞(ESC)是一群来源于胚胎囊胚期内细胞团，能够在体外无限增殖，同时保持多向分化能力的细胞。十多年前，人胚胎干细胞的成功分离给再生医学带来极大希望。科学家们预期ESC定向分化的研究将有助于加速细胞移植临床治疗的步伐。然而，ESC本身无法避免的伦理问题以及异体细胞移植的免疫排斥问题构成了 ESC治疗应用于临床的巨大障碍。诱导性多能干细胞的出现在很大程度上同时解决了以上两个问题，iPSC最初通过向体细胞中以病毒方式导入外源的四个转录因子而获得，具有与ESC相似的形态和表观遗传特征，更重要的是，两者具有相似的分化能力，即分化的全能性(pluripotency)[1]。iPSC的出现使得无伦理争议的患者特异性的干细胞获得成为可能，而由患者特异性的iPSC分化得到的特异性前体细胞和成熟细胞在组织器官移植治疗、基因治疗、药物筛选模型建立，以及特异疾病分子机制的研究方面无疑具有相当大的优势和潜力[2]。自2006年第一篇iPSC的报道以来，这个领域已经在各国科学家的努力下有了突飞猛进的发展。目前，已有三个小组宣布成功获得无病毒整合的人类诱导性多能干细胞[3_5]。这标志着诱导性多能干细胞研究向临床应用迈出了重要一步。同时，蛋白质和维生素C的应用将诱导性多能干细胞的低诱导效率迅速提高，首次利用诱导性多能干细胞克隆出活体实验鼠的四倍体互补试验则证明了诱导性多能干细胞具备和ES同样的发育潜能。因此诱导性多能干细胞在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似，形成嵌合体动物方面也与ES细胞几乎完全相同。但是，在诱导性多能干细胞诱导技术迅速进展的同时，对于诱导性多能干细胞诱导过程中分子机制的研究却进展缓慢，这成为诱导性多能干细胞应用于临床的主要障碍。我们知道，外源因子诱导的细胞重编程是一个非常缓慢的过程，通常需要两周甚至更长时间，在这个过程中，大部分细胞并未被重编程，只有极少数(一般为0. 5%)的细胞在经过了若干个中间态之后被完全重编程[6]。从以前的研究结果上看，诱导性多能干细胞产生效率基本相同，效率大约为从十万个起始细胞获得十个诱导的多潜能干细胞，此效率非常低。低效率会严重影响诱导性多能干细胞的推广和应用。自从诱导性多能干细胞产生以来，对其重编程机制和高效率的探索就没有停止过，目前的研究证明有一些化合物通过调节染色质结构来提高诱导性多能干细胞的产生效率，然而本领域仍然非常需要能提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物，也需要更有效的系统来筛选能提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物。生物体寿命和诱导性多能干细胞的产生过程都是由多信号、多途径调控的。前期的研究工作显示，抗氧化物维生素C能延长果蝇的寿命。也有报道称维生素C能显著提高iPSC诱导效率[8]。这些研究提示，生物体寿命调控途径可能与细胞重编程调控途径，进而与诱导多能干细胞相关。

发明内容
本发明测试了多种具有寿命延长作用的化合物，惊讶地发现这些化合物基本上都具有诱导多能干细胞的作用。因此，本发明的目的在于提供一种能更高效地筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物的方法。这种方法在现有筛选方法的基础上，引入根据生物体寿命进行预筛选的步骤，具有操作简便、参考价值高、经济节约等特点，能够更高效、更准确地筛选到提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物。 具体地，本发明提供一种筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物的方法，所述方法包括I)提供候选化合物；2)用生物体预筛选能延长生物体寿命的化合物；和3)从上述步骤2)中筛选到的化合物中进一步筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物。更具体地，上述本发明方法的步骤2)可包括i)用候选化合物喂食或培育生物体；ii)观察生物体的寿命变化；和iii)选择能延长生物体寿命的化合物。在一个具体实施方式
中，候选化合物可以是任何化合物，优选是根据现有技术推断可能延长生物体寿命的化合物，例如mTOR抑制剂、抗氧化剂或DNA修复促进剂等。在另一实施方式中，本发明所用的生物体可以是细菌、真菌或动物体，优选是生物学实验中用作模式生物的那些。在生物体筛选中候选化合物的用量应该是对该生物体不产生明显毒性的用量，例如，每千克体重O. Ol-IOOmg,例如每千克体重O. 01mg、0. 05mg、0. lmg、0. 5mg、lmg、2mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg或其间任何范围，本领域技术人员根据现有技术和有限实验不难确定这一用量。在另一实施方式中，可通过多种指标或参数观察生物体寿命变化，包括但不限于，记录生物体的存活时间、随时间记录生物体的死亡情况、检测生物体的寿命相关生理指标如基础代谢率、检测生物体的寿命相关分子指标如端粒长度等等。另一方面，上述本发明方法的步骤3)可包括a)提供动物细胞；b)用诱导转录因子转染所述动物细胞并与步骤I)中筛选出的化合物相接触；c)检测诱导性多能干细胞的数量；和d)选择能增加诱导性多能干细胞产生数量的化合物。
在一个具体实施方式
中，所述动物细胞可以是部分分化的细胞或终末分化的细胞。在另一具体实施方式
中，所述动物细胞可从商业途径购得或用本领域分离方法动物体制备，其中所述动物体可以是成体或胚胎。在又一实施方式中，转染诱导转录因子的过程是通过本领域常规方式进行的，例如通过病毒载体转染、通过脂质体转染试剂转染等，优选通过病毒载体转染。所述病毒载体可以是逆转录病毒、腺病毒等，优选逆转录病毒载体，例如PMXs载体。在一个实施方式中，诱导转录因子能诱导多能干细胞的任何转录因子，例如Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc (在本文中缩写为SK0M)。在另一个具体实施方式
中，所述化合物接触步骤可以是简单地将一定浓度的化合物加入动物细胞培养液中，也可以是通过某种载体，例如脂质体、乳化剂等将一定浓度的化合物与动物细胞相接触。所述化合物接触步骤可以在转染过程之前、期间或之后开始进行，例如，可以在转染过程开始之前或之后1-10天开始进行，并持续1-20天或更长时间。具体说，所述化合物接触步骤可以在转染过程之前或之后I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天开始进行。更具体说，所述化合物接触步骤可持续进行(例如)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、14天、16天、18天或20天或其间 任何范围。在动物细胞筛选中所用的化合物终浓度可以是对该动物细胞没有明显毒性的任何浓度，根据具体化合物，可以是(例如)0. OlnM至100 u M，例如0. 01nM、0. 03nM、0. 05nM、
0.07nM、0. lnM、0. 3nM、0. 5nM、0. 7nM、lnM、3nM、5nM、7nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、1uM、5uM、10uM、15 u M、20 u M、25 u M、30 u M、35 u M、40 u M、45 u M、50 u M、55 u M、60 u M、65 u M、70 u M、75 uM,80u M、85 uM,90u M、95 u M、100 u M或其间任何范围，本领域技术人员根据现有技术和有限实验不难确定这一浓度。在一个实施方式中，所述检测诱导性多能干细胞数量的步骤可通过本领域技术人员已知的一种或多种方法进行，包括但不限于，可通过本领域已知的染色法，例如免疫染色 法直接检测携带诱导性多能干细胞标志基因的细胞。这些标志基因可以分布在细胞表面或细胞内，甚至是细胞核内的标志基因，例如碱性磷酸酶、SSEA-I和/^Nanog ;也可以是本发明所述的诱导转录因子，例如是Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc中一种或多种。染色后，可通过例如以下方法进行定量测定利用血球计数板计数法在显微镜下观察染色细胞的数量；利用流式细胞术对染色细胞计数；对染色总量的定量分析；等等。另外，也可通过本领域已知的报告基因法间接检测携带诱导性多能干细胞标志基因的细胞的数量。所述报告基因可以构建成在标志基因表达时表达的可检测基因，包括如上所述标志基因表达时驱动其表达的可检测基因，优选Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc中一种或多种表达时驱动其表达的可检测基因，更优选0ct4表达时驱动其表达的可检测基因，例如是荧光蛋白基因，如GFP或YFP基因。所述报告基因可以在进行本发明步骤2)之前、期间或之后引入所述动物细胞中，优选在进行本发明步骤2)之前引入所述动物细胞中。染色后，可通过例如以下方法进行定量测定利用血球计数板计数法在荧光显微镜下观察发出荧光的细胞数量；利用流式细胞术对发出荧光的细胞计数；对荧光总量的定量分析；等等。另外，还可通过本领域已知的蛋白质或mRNA定量测定法对经处理的全部细胞中的标志基因进行定量测定，来确定诱导性多能干细胞的相对数量。这种方法具体可包括但不限于，蛋白质印迹法、逆转录PCR和/或实时定量PCR等。运用上述基于生物体寿命来进行诱导性多能干细胞相关化合物的筛选，成功筛选出雷帕霉素、PP242、PQ401等寿命延长化合物具有提高诱导性多能干细胞产生效率的作用，且它们对诱导性多能干细胞的多潜能干细胞特性没有影响。因此，本发明的目的还在于提供寿命延长化合物在提高诱导性多能干细胞产生效率中的应用。经过实验证实，本发明测试的 所有寿命延长化合物基本上都能提高诱导性多能干细胞产生效率。另外所筛选出的提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物不影响诱导转录因子的表达、不影响干细胞多能性；获得的诱导性干细胞在生理条件下具有多潜能性。


图IA和B分别说明PP242和PQ401处理后，绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞占小鼠胚胎成纤维细胞总数的百分数，η = 4，数据表示为平均值土标准误ΓΡ < O. 01，*Ρ<0. 05)。图IC和E分别说明饲喂3μΜ雷帕霉素以及如图所示不同浓度ΡΡ242和PQ401的情况下，W1118果蝇成活百分比的时程变化。图ID和F分别说明饲喂3 μ M雷帕霉素以及如图所示不同浓度ΡΡ242和PQ401的情况下，W1118果蝇平均存活时间的柱形图，数据表示平均值土标准误Γ"Ρ < O. 001广P < O. 01)。图IG说明所有测试化合物(O. 3ηΜ雷帕霉素、
O.InM PP242、0.3nM PQ401、3 μ M 白藜芦醇、3 μ M 非瑟酮、30ηΜ 亚精胺、O. 3 μ M LY294002、10 μ M姜黄色素)均引起绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞百分数增加。图IH是图IG所示所有测试化合物的功能机制、寿命延长的证据和重编程效率提高倍数的汇总。图2Α和C分别说明用不同浓度的雷帕霉素(Rapa)处理小鼠胚胎成纤维细胞16天或用O. 3ηΜ雷帕霉素处理小鼠胚胎成纤维细胞不同时间后产生的绿色荧光蛋白(GFP)阳性集落占所有集落数量的百分数，数据表示平均值土标准误。图2Β说明雷帕霉素(Rapa)处理后GFP阳性细胞占小鼠胚胎成纤维细胞总数的百分数，η = 4，数据表示平均值土标准误(**Ρ < O. 01，*Ρ < O. 05)。图2D从左到右分别是雷帕霉素(Rapa)处理后诱导的诱导性多能干细胞的明场显微照片、荧光(GFP)显微照片和碱性磷酸酶染色显微照片。图2Ε显示雷帕霉素(Rapa)处理诱导的诱导性多能干细胞中内源多能性标记Nanog、0ct4和Sox2的相对mRNA表达水平，其中#2、#4和#5分别代表不同集落的编号。图2F分别是雷帕霉素(Rapa)处理后产生的GFP阳性诱导性多能干细胞的Nanog和SSEA-I免疫染色显微照片。图2G是雷帕霉素(Rapa)处理后产生的诱导性多能干细胞的核型分析图。图2H显示雷帕霉素(Rapa)处理后产生的诱导性多能干细胞产生的嵌合体小鼠。图3显示经流式细胞术分析，对照和雷帕霉素(O. 3nM)处理条件下逆转录病毒转染第12天绿色荧光蛋白阳性细胞占全部细胞的百分数。图4A-F分别显示不同浓度的白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺、LY294002、姜黄色素和二甲双胍诱导的GFP阳性诱导性多能干细胞的百分数。
具体实施例方式I.定义本文所用术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”指衍生自胚胎、能够在体外无限增殖同时保持多向分化能力的细胞。
本文所用术语“诱导性多能干细胞”或“iPSC”指具有与ESC相似的形态、表观遗传特征和分化能力，但不衍生自胚胎的细胞。具体说，诱导性多能干细胞可以是通过物理、化学、生物学、遗传工程学等手段诱导产生的多能干细胞。所述诱导性多能干细胞可以来自无脊椎动物或脊椎动物，优选来自脊椎动物，具体可以来自鱼类、鸟类或哺乳动物，更具体可以来自啮齿动物、猫科动物、犬科动物或灵长动物，最优选来自小鼠、大鼠、犬、称猴、黑猩猩或人。本文所用术语“诱导转录因子”指能诱导多能干细胞的转录因子，具体可以是SKOM转录因子，即Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc。本领域已知，以病毒方式向体细胞中导入所述诱导转录因子后可获得诱导性多能干细胞。本文所用术语“生物体”指细菌、真菌或动物，常常是生物学实验中用作模式生物
的生命周期较短的那些，包括但不限于真细菌、酵母菌、线虫、昆虫、啮齿动物、鱼类等，具体可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母、秀丽新小杆线虫(C. elegans)、果蝇(Drosophila)、小鼠、大鼠或斑马鱼等等，优选果蝇、小鼠、大鼠、酵母或鱼，更优选果蝇。当然，小鼠和大鼠生命周期长达1-2年，饲养条件要求苛刻，不大适用于大规模的化合物筛选研究。本文所用术语“寿命延长化合物”指能够延长生物体寿命的化合物，包括但不限于mT0R抑制剂、抗氧化剂、DNA修复促进剂、雷帕霉素、PP242、PQ401、白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺、LY294002和姜黄色素等。本文所用术语“雷帕霉素”也称为西罗莫司(Sirolimus)，是一种mTOR信号通路的抑制剂，在果蝇和小鼠动物模型上均能延长生物体寿命[9];本文所用术语“PP242”为
\[一~(C16H16N6O)，它也是mTOR信号通路抑制剂；本文所用术语“PQ401”
、入N』
人
Cl
为(Ci8Hi6c1na),它是类胰岛素一号生长因子拮抗剂。本文所用术语
[TyS 0Me
O
“LY294002，，*;Y o. N,、(C19H18ClNO3)。
A1本文所用术语“全能性”指分化形成完整生物体的能力。本文所用术语“动物细胞”指来源于动物体的细胞。一方面，这类细胞可来自无脊椎动物或脊椎动物，优选来自脊椎动物，具体可以来自鱼类、鸟类或哺乳动物，更具体可以来自啮齿动物、猫科动物、犬科动物或灵长动物，最优选来自小鼠、大鼠、犬、猕猴、黑猩猩或人。另一方面，这类细胞可以是部分分化的细胞或终末分化的细胞。所述“部分分化的细胞”指从全能干细胞分化的、不具有全能性、但仍保持一定分化能力的细胞；所述“终末分化的细胞”指从全能干细胞分化的、不具有全能性、也丧失进一步分化能力的细胞。所述“部分分化细胞”包括成纤维细胞、神经母细胞、淋巴母细胞、造血干细胞、基底细胞、成骨细胞、上皮细胞、毛细胞；所述“终末分化细胞”包括血细胞、淋巴细胞、肌细胞、肝细胞、肾细胞、神经细胞、星形细胞、粘液细胞等。该术语可以指来源于动物胚胎的细胞，例如来源于动物胚胎的成纤维细胞，优选来源于小鼠胚胎的成纤维细胞。II.实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。材料W1118果蚬由英国剑桥大学医学研究所Damian Crowther博士提供；pMXs载体为东京大学Toshio Kitamura教授馈赠；plat_E细胞来自广州生物医药健康研究院； 原味米粉购自中国上海市的雀巢公司(目录号Q/SCQC0005S)，人工气候箱购自江南宁波仪器公司(中国浙江省宁波市)；雷帕霉素购自惠氏公司(中国上海市)；PQ401和PP242购自中国上海市的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich);白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺购自中国上海的西格玛公司(Sigma) ;LY294002和姜黄色素购自美国密苏里州的特克利公司(Tocris) ;Polybrene购自中国上海的密理博公司(Milipore);实验中所用培养基、FBS、KSR和LIF购自中国上海的吉布科公司(Gibco BRL) ;L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇等基本生化试剂购于中国上海实验试剂有限公司。 Trizol试剂和PCR混合物(PCR MIX)和碱性磷酸酶染色试剂盒(85L3R)购自中国上海的西格玛公司(Sigma) ;M_MLV购自中国上海的普洛麦格公司(Promega) ;Eva绿(EvaGreen)购自美国加利福尼亚州拜腾公司(Biotium) ;SSEA_1抗体480 (sc21702)和Nanog抗体M-149(sc33760)均来自美国加利福利亚州圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz)；MX3000P型PCR机购自美国加利福尼亚州司查塔基公司(Stratagene)。方法 果蝇寿命学野生型果蝇回交6次以上，产生Fl子代分为20只/管，每个处理5管共100只果蝇。所有实验用果蝇均饲养在保持25°C、65%湿度饲养条件和白天12小时晚上12小时昼夜周期的人工气候箱中，每天记录果蝇的死亡数目。果蝇食物由1.4mL相应浓度化合物的水溶液与O. 55g速溶原味米粉充分混合而成。果蝇食物每两天更换一次，果蝇寿命数据用SPSS 13. O软件(IBM公司，美国纽约市)中Kaplan-Meier统计分析作图。 小鼠胚胎成纤维细胞分离按Huangfu Dff等所述的方法[19]获得含有GFP报告基因并由0CT4驱动表达的转基因小鼠模型0G2+/-/R0SA26+/-(0G2)GFP小鼠，将0G2+/-/R0SA26+/-(0G2)GFP小鼠(13. 5胚胎期)处死，去掉所有的腺体和内脏，直接由胚胎分离胚胎成纤维细胞，细胞经过传代3次后在后续试验中使用。所用小鼠基因组中带有绿色荧光蛋白基因，该基因的表达受0ct4转录因子驱动表达，而0ct4只有在转染了 SKOM的诱导性多能干细胞中才有表达，因而可通过检测绿色荧光蛋白发出的荧光来检测诱导性多能干细胞。 逆转录病毒制作和诱导性多能干细胞的诱导逆转录病毒用含鼠源Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc编码序列的逆转录病毒载体pMXs转染逆转录病毒包装细胞系plat_E，包装病毒。并用此病毒液转染液感染小鼠胚胎成纤维细胞2轮,加入终浓度8 μ g/mL的Polybrene以提高病毒转染率。在此之后，将细胞换入mES培养液(含有15% FBS (胎牛血清)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巯基乙醇和1000U/ml LIF的DMEM中继续培养，并将这天定义为感染后第O天。 化合物处理化合物先用水或者DMSO溶解，用mES培养液稀释到相应浓度，加入培养有小鼠成纤维细胞的mES培养液中。并在感染后第12天用流式细胞仪检测GFP阳性集落，在荧光显微镜下计算G FP阳性细胞的数目(至少计算两盘细胞)。为了获得完全的重编程诱导性多能干细胞，在感染后第16天，从SKOM转染的小鼠胚胎成纤维细胞中挑取ES样集落，胰酶消化为单细胞悬液转入含有15% KSR(Knockout Serum Replacement,敲除血清替代物)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巯基乙醇和1000U/ml LIF的DMEM培养液的96孔板中。 诱导性多能干细胞的验证碱性磷酸酶(AP)和SSEA-I为诱导性多能干细胞表面的标志蛋白，Nanog是诱导性多能干细胞特异性表达的核内转录因子，本领域技术人员常常用它们的特异染色来验证诱导性多能干细胞。具体是将建立好的诱导性多能干细胞以I X IO4个/孔密度转入24孔板，两天后使用碱性磷酸酶染色试剂盒、SSEA-I抗体480和Nanog抗体M-149对细胞中的碱性磷酸酶、Nanog和SSEA-I染色。 逆转录实时定量PCR :用Trizol试剂从细胞裂解液中提取总的RNA，用M-MLV逆转录，PCR反应体系2x PCR混合物(PCR MIX)加上Eva绿(EvaGreen)在MX3000P型PCR机上反应测出基因相对表达并用内参标准化。实时定量PCR反应条件如下94°C初始变性5分钟，后接94°C变性30秒钟、58°C退火60秒钟、72°C扩增60秒钟的35个循环。实时定量PCR中所用的引物如下0CT4 正义引物TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC(SEQ ID NO :1)；0CT4 反义引物TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC(SEQ ID NO :2)；Sox 2 正义引物TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA(SEQ ID NO :3)；Sox 2 反义引物TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA(SEQ ID NO :4)；Nanog 正义引物AGGGTCTGCTACTGAGATGCTCTG(SEQ ID NO :5)；Nanog 反义引物CAACCACTGGTTTTTCTGCCACCG (SEQ ID NO :6)。 嵌合体小鼠通过显微注射的方法将iPSC细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中，从而获得嵌合体小鼠。 核型分析方法取实验组与对照的中期细胞，用细胞核碱性染料进行染色后，将染色体配对，在显微镜下拍照后进行对比。除非另有特别说明，以下实施例均采用上述材料和方法进行。实施例I雷帕霉素、PP242和PQ401对果蝇寿命的影响本发明人根据上述方法检测3 μ M雷帕霉素、不同浓度的PP242和不同浓度的PQ401对果蝇寿命的影响。结果发现，3μΜ雷帕霉素，(λ 3μΜ、1μΜ和3μΜ ΡΡ242，以及
3μ Μ、10 μ M和30 μ M PQ401均能显著增加果蝇的成活百分比(如图IC和E所示)和平均存活时间(如图ID和F所示)。 实施例2ΡΡ242和PQ401对小鼠成纤维细胞GFP+百分数的影响本发明人根据上述方法检测不同浓度的ΡΡ242和不同浓度的PQ401作用下用SKOM
转染产生的GFP+细胞百分数和GFP+集落数，以确定ΡΡ242和PQ401对SKOM成功转染小鼠成纤维细胞的影响。结果表明，与不用主题化合物处理的对照相比，0. 03nM、0. lnM、0. 3nM和InM PP242,以及0. 3nM、lnM、3nM和IOnM PQ401均能提高GFP+细胞百分数和GFP+集落数，即提高了 SKOM成功转染小鼠成纤维细胞，使其变为诱导性多能干细胞的效率(如图IA和B所示)。通过定量分析，可确定这些化合物能提高诱导性多能干细胞诱导效率达3倍之多。实施例3多种化合物对小鼠成纤维细胞GFP+百分数的影响本发明人还选取了雷帕霉素和文献报道的在酵母、线虫、果蝇、小鼠等模式生物上有寿命延长效果的化合物，包括白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺、LY294002、姜黄色素和二甲双胍[14_18]，根据上述方法检测在它们作用下用SKOM转染产生的GFP+细胞百分数。令人惊讶地发现，与仅用载体如水和DMSO处理的对照相比，除二甲双胍外，这些化合物(3yM白藜芦醇、3111非瑟酮、301^亚精胺、0.311|1 LY294002、10iiM姜黄色素)均能提高GFP+细胞百分数，即提高了 SKOM成功转染小鼠成纤维细胞，使其变为诱导性多能干细胞的效率(如图IG和H所示)。实施例4雷帕霉素对小鼠成纤维细胞GFP+百分数的影响 在实施例3的基础上，本发明人进一步根据上述方法检测雷帕霉素作用下用SKOM转染产生的GFP+细胞百分数和GFP+集落数。结果表明，与不用雷帕霉素处理的对照相比，不同浓度的雷帕霉素处理16天(如图2A和B所示)，或用0. 3nM雷帕霉素处理不同时间(如图2C所示)，能够提高GFP+细胞百分数和/或GFP+集落数，即提高了 SKOM成功转染小鼠成纤维细胞，使其变为诱导性多能干细胞的效率。通过定量分析，可确定雷帕霉素能提高诱导性多能干细胞诱导效率达4倍之多。这一分析结果与流式细胞仪分析结果相一致(如图3所示)。通过前述诱导性多能干细胞的验证方法观察雷帕霉素处理对GFP+小鼠成纤维细胞的碱性磷酸酶(AP)、Nanog和SSEA-I表达的影响。结果发现，雷帕霉素处理过程对这些诱导性多能干细胞标志物的表达无影响(如图2D和F所示)。还通过前述逆转录实时定量PCR方法进一步在mRNA水平验证GFP+小鼠成纤维细胞中0CT4、Sox 2和Nanog的相对表达水平。结果标明，雷帕霉素处理过程对诱导性多能干细胞标志物Nanog以及转染基因0CT4和Sox2的表达无显著影响(如图2E所示)。还通过前述核型分析方法分析雷帕霉素处理后得到的GFP+小鼠成纤维细胞，发现这些细胞仍然是正常的诱导性多能干细胞(图2G)。这样经雷帕霉素处理而诱导出的多能干细胞能在生理条件下发挥功能并成功分化形成嵌合体小鼠(如图2H所示)。实施例5白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺、LY294002、姜黄色素和二甲双胍对小鼠成纤维细胞GFP+百分数的影响。在实施例3的基础上，本发明人进一步根据上述方法检测在不同浓度的白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺、LY294002、姜黄色素和二甲双胍作用下用SKOM转染产生的GFP+细胞百分数。结果进一步证实，除二甲双胍外，这些化合物均能提高GFP+细胞百分数，即提高了SKOM成功转染小鼠成纤维细胞，使其变为诱导性多能干细胞的效率(如图4所示)。讨论据分析，寿命延长化合物可能通过以下途径促使体细胞重编程，进而诱导多能干细胞I)抗细胞衰老途径在转入逆病毒起始重编程会加速体细胞衰老、细胞凋亡过程，使很少的细胞进入到重编程的过程，进而产生诱导性多能干细胞。寿命延长化合物的主要机制就是延缓衰老，因而可以使更多的细胞进入重编程过程，从而提高诱导性多能干细胞产生效率。2)mT0R信号通路途径mT0R信号途径为感知环境中生长因子、氨基酸，抑制mTOR有很强的抗细胞衰老、能量限制作用[1°_13]，除此以外mTOR信号途径下游TGFP信号途径起作用，在重编程的过程中TGFii水平上升抑制体细胞重编程的发生，所以抑制mTOR可能通过TGFii信号途径延长生物体寿命和提高重编程的效果。(3)抗氧化途径维生素等抗氧化物能延长生物体寿命，并提高体细胞重编程效率就是通过抗氧化途径起作用。 (4)增强DNA修复功能抑制mTOR可增加细胞修复基因组的作用，而在体细胞重编程过程中过表达转录因子增加基因组损伤而影响重编程效率。参考文献[I]Yamanaka S. Cell Stem Cell,2007，11) :39-49 ；[2]Daley GQ, Lensch MW，Jaenisch R.等，Cell Stem Cell, 2009,4 (3) :200-1 ；[3] Yu J, Hu K, Smuga-Otto K.等，Science, 2009 ;[4]Kaji K, Norrby K，Paca A.等，Nature, 2009，458 (7239) :771-5 ；[5]ffoltjen K, Michael IP, Mohseni P.等，Nature，2009，458 (7239) :766-70 ；[6]Brambrink T,Foreman R,Welstead GG.等，Cell Stem Cell, 2008, 2) :151-9;[7]Fontana L, Partridge L, Longo VD (2010) · Science. 328,321-326 ;[8]Miguel Angel Esteban 等，Cell Stem Cell. 2010 年 I 月 8 日；61) :71_9 ；[9]David E. Harrison 等，Nature 460,392-395 ；[10]Powers Rff, Kaeberlein M, Caldwell SD, Kennedy BK, Fields S(2006 年 I月).Genes Dev.202) :174-84 ；[II]Kaeberlein M,Powers Rff,Steffen KK,Westman EA,Hu D,Dang N，Kerr E0,Kirkland KT, Fields S, Kennedy BK(2005 年 9 月)·Science 310(5751) :1193-6;[12]Jia K，Chen D, Riddle DL. (2004 年 8 月)· Development 131(16) :3897-906;[13]Kapahi P, Zid BM, Harper T, Koslover D, Sapin V, Benzer S(2004 年 5月)·Curr· Biol. 14(10) :885-9 ；[14]Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY 等(2003 年 9 月).Nature 425(6954)191-6 ；[15]Lee KS, Lee BS, Semnani S.等，Rejuvenation Res. 20100ct ；13 (5) :561-70;[16]Tobias Eisenberg, Heide Knauer. Alexandra Schauer 等.NatureCellBiology 11,1305-1314(2009)；[17] A. A. Moskalev and Μ. V. Shaposhnikov. REJUVENATION RESEARCH 第 13 卷，第2-3 期，201 ；[18]Mouchiroud L, Molin L, Dalliere N, Solari F. Biofactors· 2010 年 9 月；36(5) :377-82 ；[19]Huangfu Dff, Maehr R, Guo WJ 等，Nat Biotechnol. 2008 ；26 :795_797。
权利要求
1.一种筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物的方法，所述方法包括 1)提供候选化合物； 2)用生物体从候选化合物中预筛选能延长生物体寿命的化合物；和 3)从上述步骤2)中筛选到的化合物中进一步筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤2)包括 i)用所述候选化合物喂食或培育生物体； ii)观察所述生物体的寿命变化；和 iii)选择能延长生物体寿命的化合物。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)包括 a)提供动物细胞； b)用诱导转录因子转染所述动物细胞并与所述步骤2)中筛选出的化合物相接触； c)检测诱导性多能干细胞的数量；和 d)选择能增加诱导性多能干细胞产生数量的化合物。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物体是细菌、酵母菌、线虫、昆虫、啮齿动物或鱼类。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物体是果蝇、酵母或鱼。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤ii)通过记录生物体的存活时间、随时间记录生物体的死亡情况、检测生物体的寿命相关生理指标或检测生物体的寿命相关分子进行。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中所用的诱导转录因子是Sox2、Klf4、0ct4和c_Myc中的一种或多种。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤c)可通过染色法、报告基因法、蛋白质定量测定法或mRNA定量测定法进行。
9.寿命延长化合物在提高诱导性多能干细胞产生效率中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述寿命延长化合物是mTOR抑制剂、抗氧化剂、DNA修复促进剂、雷帕霉素、PP242、PQ401、白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺、LY294002和姜黄色素等。
全文摘要
本发明涉及筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物的方法，具体是基于生物体寿命，特别是果蝇寿命筛选提高诱导性多能干细胞产生效率的化合物的方法。本发明还涉及寿命延长化合物，特别是果蝇寿命延长化合物，具体是雷帕霉素、PP242、PQ401、白藜芦醇、非瑟酮、亚精胺、LY294002和姜黄色素在提高诱导性多能干细胞产生效率中的新用途。
文档编号A01K67/033GK102758000SQ20111011035
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月29日 优先权日2011年4月29日
发明者万洪江, 于洁, 沈立, 裴钢, 赵简, 陈涛涛 申请人:中国科学院上海生命科学研究院