繁殖生物体及相关方法和组合物的制作方法
【专利说明】繁殖生物体及相关方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月13日提交的、申请号为13/798，617且名称为“PROPAGATINGAN ORGANISM AND RELATED METHODS AND COMPOSIT1NS”的美国非临时专利申请的权益，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
[0002]本发明涉及繁殖一种或多种生物体，该生物体可以通过发酵将一种或多种单糖转化为醇，比如乙醇。
【背景技术】
[0003]可以将一种或多种单糖转化成一种或多种生化物质的，比如生物燃料，的生物体是众所周知的。例如，基因修饰(被称为GM)的酵母和非转基因修饰(被称为非GM)的酵母都是可以通过发酵将糖转化为醇，比如乙醇和丁醇的众所周知的生物体。
[0004]通常，这样的生物体由制造商，例如，乙醇制造商，繁殖以产生用户想要的细胞团。但是，相比其它生物体，许多生物体是相当昂贵的。例如，比起非GM酵母，许多GM酵母可能是相对非常昂贵的。因此，在一些情况下，购买尽可能少的GM酵母，然后其可以使该酵母再生，以提供足够用于发酵的数量，对于乙醇制造商来说在经济上可能是可取的。
[0005]但是，繁殖酵母可能具有挑战性。例如，当在葡萄糖上生长时，即使在高度通气的条件下，如果培养基中葡萄糖浓度过高(例如，每升超过5克)，一些生物体(比如，酿酒酵母)易受众所周知的“克勒勃屈利效应(Crabtree effect) ”的影响。如果葡萄糖水平变得过高，酵母可以开始通过发酵途径制造乙醇，而非通过呼吸途径产生更多酵母(即，高水平葡萄糖抑制呼吸)。为了帮助防止克勒勃屈利效应，酵母制造商通常通过分批补料使酵母生长或放慢进料过程，其中以避免过度生产乙醇的速率引入生产酵母生物质的碳源(葡萄糖)。但是，分批补料系统可以是相当昂贵的，对乙醇制造商的控制和管理构成挑战。
[0006]由于控制分批处理可能相对更简单并且可能更能忍受处理参数的变化(例如，相对于碳源的变化水平和克勒勃屈利效应)，需要发展利用分批处理协议而非分批补料处理协议繁殖生物体(比如，酵母)的方法。此外，需要利用可选择的、更易于使用的、和/或繁殖培养基所用的更经济的成分(例如，碳源、营养源等等)。
【发明内容】
[0007]本发明涉及使用营养源繁殖生物体的方法，该营养源包括酒糟成分(例如，稀酒糟)，优选来自玉米制乙醇过程的酒糟成分。令人惊讶地，包括酒糟成分作为繁殖培养基的营养源的一部分(或全部)可以提供像常规营养源(比如，酵母提取物)一样好，或比常规营养源的结果。此外，已经发现，非常低量的初始细胞团可以用于繁殖生物体，比如，酵母(例如，每升培养基低至1.0克酵母，每升培养基低至0.02克酵母，或甚至更低)
此外，在繁殖培养基的营养成分中包括酒糟成分允许在木质纤维素乙醇过程中使用来自玉米制乙醇过程的副产物。在两个过程在同一位置的情况下，这可以是特别方便的。
[0008]进一步地，本发明涉及使用营养源和碳源繁殖生物体的方法，该营养源包括酒糟成分(例如，稀酒糟)，该碳源具有木糖。对于可以使用木糖代替葡萄糖，或除了葡萄糖之外，使用木糖进行繁殖的生物体，使用木糖可以避免使用葡萄糖观察到的克勒勃屈利效应。例如，木糖水平可以在广泛的范围变化(例如，包括与会引起克勒勃屈利效应的葡萄糖水平对应的水平)，但是通过有氧呼吸途径的繁殖会继续，而不转变成厌氧发酵途径从而过度生产乙醇。可以以这种方式使用木糖的生物体包括一些基因修饰的酵母。有利地，使用木糖可以防止“污染物”酵母(比如，野生型酿酒酵母)与目标为繁殖的生物体竞争。
[0009]进一步地，因为利用木糖可以避免克勒勃屈利效应，可以利用分批处理进行繁殖。
[0010]最后，在碳源中包括木糖可以有利地使酵母适应预期的发酵环境，这可以帮助酵母更有效地进行发酵。
[0011 ] 根据本发明的一个方面，一种繁殖生物体的方法，该生物体可以将一种或多种单糖转化成生化物质，该方法包括:
提供该生物体的第一细胞团；
提供碳源，该碳源可以支持生物体的第一细胞团的生长，其中该碳源至少包括木糖；提供营养源，该营养源可以支持该生物体的第一细胞团的生长，其中该营养源包括酒糟成分；
至少使该碳源和该营养源结合以形成用于繁殖该生物体的培养基；以及使该生物体的第一细胞团与该碳源和该营养源结合，以在一段时间繁殖该生物体的第一细胞团，从而形成生物体的第二细胞团。
[0012]根据本发明的另一方面，一种繁殖生物体的方法，该生物体可以将一种或多种单糖转化成生化物质，该方法包括:
提供该生物体的第一细胞团；
提供碳源，该碳源可以支持生物体的第一细胞团的生长，其中该碳源包括至少一种或多种单糖；
提供营养源，该营养源可以支持该生物体的第一细胞团的生长，其中该营养源包括酒糟成分；
至少使该碳源和该营养源结合以形成用于繁殖该生物体的培养基；其中该第一细胞团以每升培养基少于1.0克生物体的数量存在；以及
使该生物体的第一细胞团与该碳源和该营养源结合，以在一段时间繁殖该生物体的第一细胞团，从而形成生物体的第二细胞团。
[0013]根据本发明的另一方面，一种组合物包括:
生物体的第一细胞团，所述生物体可以将一种或多种单糖转化成生化物质，其中该生物体以每升组合物少于1.0克生物体的数量存在。
[0014]木糖，数量范围为所述组合物重量的0.1%至10% ；以及酒糟成分，数量范围为每升组合物5克至35克。
[0015]在优选的实施例中，该生物体包括基因修饰的酿酒酵母，特别是可以将木糖和葡萄糖转化为乙醇的基因修饰的酿酒酵母。
【附图说明】
[0016]图1展示了根据本发明的用于繁殖可以将一种或多种单糖转化为生化物质的生物体的繁殖系统的流程图。
[0017]图2展示了在木质纤维素乙醇系统与玉米谷物制乙醇系统在同一位置的背景下，根据本发明的用于繁殖可以将一种或多种单糖转化为生化物质的生物体的繁殖系统的流程图。
[0018]图3A和3B分别展示了酿酒酵母的基因修饰菌株在培养基中生产的乙醇的表和图，该培养基含有各种水平的木糖，且补充酵母提取物，蛋白胨或稀酒糟作为营养源。
[0019]图4A和4B分别展示了由酿酒酵母的基因修饰菌株在培养基中发酵后生产的乙醇的表和图，该培养基具有11 W/V%木糖，且补充各种水平的稀酒糟。
[0020]图5A展示了使用纯木糖作为碳源和来自玉米-乙醇生物精炼厂的稀酒糟作为营养源的酿酒酵母的基因修饰菌株的细胞生长的图。
[0021]图5B展示了酿酒酵母的基因修饰菌株使用来自稀酸预处理的木质纤维素生物质的木糖溶液作为碳源和来自玉米制乙醇生物精炼厂的稀酒糟作为营养源的细胞生长的图。
【具体实施方式】
[0022]本发明涉及繁殖可以将一种或多种单糖转化为生化物质的生物体。繁殖这样的生物体在许多情况下是有用的。例如，繁殖可以用于使生物体的初始(例如，起始物)群落再生，从而产生足以用于发酵的更大的生物体群落以制造发酵产物。图1展示了典型的处理流程图。如图1所示，生物体100的第一细胞团、碳源105，和营养源110在繁殖系统115中结合，使得第一细胞团100可以再生并且形成第二细胞团120。接着，第二细胞团可以用于发酵系统125，从而将一种或多种单糖(例如，来自预处理的木糖纤维素生物体)130转化成包括生化物质比如生物燃料(例如，乙醇、丁醇，等等)的发酵产物135。
[0023]可以将一种或多种单糖转化为生化物质的生物体是众所周知的，并且包括，例如，细菌和/或真菌，比如，酵母。生产的生化物质可以根据所提供的条件而变化。在许多实施例中，该生化物质包括生物燃料，比如，乙醇、丁醇，等等。在优选的实施例中，该生物体包括一种或多种产乙醇的生物体(即，“产乙醇菌(ethanologens)”)。在此使用的“产乙醇菌”指的是可以将一种或多种单糖(例如，葡萄糖、木糖，等等)至少转化成乙醇的微生物。产乙醇的生物体可以是原核生物和/或真核生物，比如，大肠杆菌(fecAericAia cold酸克雷伯菌{Klebsiella运动发酵单胞菌{Zymomonas热纤维梭菌(Clostridium 酿酒酵母，和 / 或毕赤酵母(/3ZcAia stipitis)。在优选实施例中，产乙醇菌包括至少能将木糖代谢为乙醇的酵母。可以至少将木糖代谢为乙醇的酵母的例子包括基因修饰的重组酵母。在优选实施例中，这样的基因修饰的酵母包括基因修饰的重组酿酒酵母。根据一个实施例，产乙醇菌为改变成将木糖和葡萄糖转化成乙醇的酿酒酵母的菌株(即，从专利号为7，622，284的美国专利中所述的生物体获得的基因修饰的酵母)。
[0024]在此使用的