用于通过发酵生产氨基酸的微生物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及产生和/或分泌有机化合物的微生物，其中所述微生物具有增加的转 氨酶（LpdA蛋白质，IpdA基因的基因产物）活性，W及使用根据本发明的微生物用于生产 有机化合物的方法。
[0002] 本发明在由德国联邦教育及研究部（FederalMinistryforEducationand Research) @MB巧（授权号0313917A)提议的项目的范围内发生。
【背景技术】
[0003] 有机化合物包括特别是氨基酸、有机酸、维生素、核巧和核巧酸，在人类医学、制药 工业、食品工业且尤其特别是动物营养中有用。
[0004] 通过经由棒状细菌菌株尤其是谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum)， 或通过肠杆菌科巧nterobacteriaceae)菌株尤其是大肠杆菌巧scherichiacoli)的发 酵，产生大量运些化合物例如k赖氨酸。由于相当大的经济重要性，存在改良生产方法的 不断努力。工艺改良可W设及发酵中的技术措施，例如揽拌和供应氧，或设及营养培养基的 组成，例如在发酵期间的糖浓度，或设及例如通过离子交换层析逐渐达到产物形式，或设及 微生物自身的固有性能特性。 阳〇化]在野生型菌株中，氨基酸的生物合成途径遭受严格的代谢控制，其确保氨基酸仅 在细胞自身需要的水平下产生。对于有效生产方法的一重要需求因此是可获得合适的微生 物，其与野生型生物体相比较具有产生所需氨基酸的能力，其中所需氨基酸急剧增加超出 其自身需求（过度生产）。
[0006] 运些微生物的性能特性的改良采用诱变、选择和挑选突变体的方法。W运种方式， 获得的菌株对抗代谢药具有抗性，或对于具有调节重要性的代谢产物是营养缺陷型的，并 且产生k氨基酸。已知的抗代谢药是赖氨酸类似物S-(2-氨乙基）A-半脫氨酸（AEC)。
[0007] 运些年来，重组DNA技术的方法也已用于改良棒状杆菌属（Corynebacterium)尤 其是谷氨酸棒状杆菌，或埃希氏杆菌属巧scherichia)尤其是大肠杆菌的k氨基酸生产菌 株，通过修饰或强化或弱化个别氨基酸生物合成基因并且研究对氨基酸生产的作用。
[0008] 众多细菌的染色体的核巧酸序列是已知的。
[0009] 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组的核巧酸序列在化eda和化kagawa(Applied MicrobiologyandBiotechnology62,99-109(2003))、EPI108 790W及Kalinowski等 人（JournalofBiotechnology104(1-3)，（2003))中得到描述。
[0010] 谷氨酸棒状杆菌R的基因组的核巧酸序列在化kawa等人（Microbiology 153(4) :1042-1058(2007))中得到描述。
[0011] Corynebacteriumefficiens的基因组的核巧酸序列在Nishio等人（Genome Research. 13(7),1572-1579(2003))中得到描述。
[0012] 白喉棒状杆菌（Corynebacteriumdi地theriae)NCTC13129的基因组的核巧酸序 列由Cerdeno-Tarraga等人（NucleicAcidsResearch31 (22) ,6516-6523 (2003))进行描 述。
[0013] 杰氏棒状杆菌（Corynebacteriumje化eium)的基因组的核巧酸序列由Tauch等 人（JournalofBacteriology187 (13) ,4671-4682 (200巧）进行描述。
[0014] 谷氨酸棒状杆菌的基因组的核巧酸序列还在美国国立医学图书馆（化tional LibraryofMedicine)度ethesda，MD,USA)的美国国家生物技术信息中屯、（化tional CenterforBiotechnologyInformationHNCBI)的数据库、日本DNA数据库值NAData BankofJapan)值DBJ，Mishima，日本）、或欧洲分子生物学实验室巧uropeanMolecular BiologyL油oratories) (EMBL，Heide化erg,德国或Cambridge,UK)的核巧酸序列数据库中 可获得。
[001引 通过发酵生产k氨基酸的各个方面在R.Faurie和J.Thommel,Advances inBiochemicalEngineeringBiotechnology， 第 79 卷（Springer-Verlag，Berlin， Heide化erg(Germany) 2003)中总结。
[0016] 在使用微生物的上述有机化合物的生产中，运些化合物各自在微生物细胞中的生 物合成途径中产生。对于生物合成系统中的重要酶的功能必需的重要辅酶之一是还原型烟 酷胺腺嚷岭二核巧酸憐酸（下文被称为NADPH)。
[0017]NADPH和使用微生物生产有机化合物之间的关系例如在EP0733712B中说明。
[0018] 烟酷胺腺嚷岭二核巧酸转氨酶（下文简称为"转氨酶"）已知为负责NADPH生 产的酶之一。已知运种酶存在于各种生物体中，包括埃希氏杆菌属的微生物中。在大肠 杆菌（埃希氏杆菌属的典型微生物）中，进行转氨酶的纯化值avidM.Clarke和化ilip D.化agg，化r.J.Biochem.，149, 517-523 (1985))、其编码基因的克隆值avidEClarke和 PhilipD. &ragg，J.Bacteriology.，162,367-373(1985))、W及基因核巧酸序列的测定 值avidM.Clarke，TipW.Loo，ShirleyGillam和PhilipD.Bragg，Eur.J.Biochem. 158， 647-653(1986))，并且证实该酶的存在。然而，该酶的生理功能仍是几乎未知的。运通常通 过缺乏该酶的变体不展示任何表型表达的事实得到证实。
[0019]MakotoIshimoto"Met油olicMaps", 1971 年 7 月 25 日化yoritsuSu卵anCo.， Ltd.)，第30-32页，公开了NA畑或NADPH的还原活性是几种氨基酸的生物合成必需的。然 而，该文件未公开用于祀物质生物合成的NADH至NADPH转换。
[0020] BunjiMaruo,NobuoTamiya(作者）"Enzyme化nclbook"，1983 年 3 月 1 日 (01. 03. 83)，AsakuraShoten,第 132-133 页，和Arch.Biochem.Bio地ys.第 176 卷，No. 1， 1976,WermuthB等人"Pyridinenucleotidetr曰nshydrogen曰sefromPseudomonss aeruginosapurificationbyaffinitychromatographyandphysiochemical properties",第136-143页，在每种情况下，公开了能够将NADP转换为NADPH并且反之亦 然的酶。运些文件无一设及祀物质的产生或可W用于产生祀物质的NADPH的生产力增加。
[0021] 大肠杆菌含有可溶性和膜结合的化晚核巧酸转氨酶。可溶性化晚核巧酸转氨酶是 基因产物StM(Sth，lMM);它的主要生理作用看起来是NADPH的再氧化。膜结合的质子 转移化晚核巧酸转氨酶是化tAB基因产物；PntAB是NADPH的重要来源（Sauer等人，化e JournalofBiologicalQiemistry279(8) (2004))。
[0022] Anderlund等人（Appliedand!EnvironmentalMicrobiology56 巧）（1999))研究 在重组酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)中，来自大肠杆菌的膜结合的转氨酶（pntA 和pn巧基因）表达的生理效应。
[0023] 针对运个背景，待由本发明解决的问题是提供相对于现有技术中描述的微生物得 到改良的微生物，产生所述微生物的方法和使用所述微生物用于过度生产有机化合物的方 法，其中所述改良设及此类因素，如细胞内获得的过度生产化合物浓度，在处理培养物后的 过度生产化合物的产率，微生物的生长特性，W及化合物过度生产和加工所需的方法步骤 的时间和数目，W及所述方法例如就使用的时间、能量W及菌株和析出物量而言的资源需 求。
[0024] 运些及其他问题通过本申请的主题且尤其通过独立权利要求的主题解决，其中实 施方案呈现于从属权利要求。
【发明内容】
[00巧]在第一个方面，待通过本申请解决的问题通过使用微生物经由发酵生产有机化合 物的方法解决，所述方法含有下述步骤：
[00%]a.发酵产生有机化合物的微生物，其中在所述微生物中，编码多肤的多核巧酸是 过表达的，所述多肤的氨基酸序列与SEQIDNO: 2的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%相同，并且其中发酵在合适的发酵培养基中发生，形 成发酵液，和
[0027] b.富集（累积）来自a)的发酵液中的有机化合物。
[0028] 在本发明的上下文中，产生有机化合物的微生物意指产生超出维持微生物活力所 需的有机化合物的微生物。
[0029] 在本发明的上下文中，发酵液中的有机化合物的富集或累积意指有机化合物在微 生物的细胞中的富集/累积，W及有机化合物分泌到微生物周围的营养培养基内即发酵液 内。
[0030] 在另一个方面，待通过本申请解决的问题用产生有机化合物的微生物加W解决， 其中编码多肤的多核巧酸在微生物中是过表达的，所述多肤的氨基酸序列与SEQIDN0:2 的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同。
[0031] 在用于产生有机化合物的根据本发明的方法，或根据本发明的微生物的一个实施 方案中，其氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%相同的所编码的多肤具有转氨酶的活性。
[0032] 转氨酶的活性通过根据Argyrou等人（2004)的酶测试进行检测。在该测试中，就 5-HNQ(人工电子受体）的NAD(P)H依赖性还原而言对纯化的转氨酶进行研究。
[0033] 用于测量权利要求中公开的多肤的过表达的微生物或菌株（起始菌株）优选已经 具有用于富集细胞中的所需有机化合物或将其分泌到周围营养培养基中且在其中累积其 的能力。
[0034] 本发明的优点在于进一步增加生物技术生产方法例如氨基酸生产中的产物得率。 使用根据本发明的方法，或通过使用根据本发明的微生物，可W进一步增加有机化合物的 微生物生产。
[0035] 因此，根据本发明用于生产有机化合物的方法的特征还在于：相对于其中编码氨 基酸序列与SEQIDN0:2的氨基酸序列至少80%相同的多肤的多核巧酸未过表达的微生物 的发酵，有机化合物的生产增加至少0. 5%、至少1%、至少I. 5%或至少2%。令人惊讶的 是，谷氨酸棒状杆菌中的转氨酶由与结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)中具有 转氨酶活性的蛋白质（LpdA蛋白质）的高序列相同性得到鉴定。转氨酶表达的增加导致： 当使用相应的生产菌株时，有机化合物的生产增加。
[0036]在根据本发明的方法/根据本发明的微生物的优选实施方案中，编码多肤的多核 巧酸衍生自谷氨酸棒状杆菌，所述多肤与SEQIDN0:2的氨基酸序列至少80%、至少85%、 至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %或100 %相同。尤其优选地，该编码的多肤具有 转氨酶的活性。
[0037] 与各自的起始菌株相比较，根据本发明的微生物具有编码多肤的多核巧酸的增加 表达，所述多肤具有与SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列展示80%或更高相同性的氨基酸 序列。
[0038] 优选实施方案包括与SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列至少80%、至少85%、至 少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的变体，即其中至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%的氨基酸位置与SEQIDN0:2中所示的氨基酸序列 相同。相同性百分比优选在氨基酸或核酸区域的整个长度上进行计算。
[0039]在一个优选实施方案中，与各自的起始菌株相比较，微生物具有多核巧酸的表达 增加，所述多核巧酸编码具有根据SEQIDN0:2的氨基酸序列的多肤。
[0040] 因为WNADPH形式的还原等价物是有机化合物的生物合成所需的，所W具有还原 等价物的改良供应是有利的。
[0041] 对于本发明的措施，"有机化合物"意指维生素例如硫胺素（维生素BI)、核黄素 (维生素B2)、氯钻胺（维生素B12)、叶酸（维生素M)、生育酪（维生素巧或烟酸/烟酷胺、 核巧或核巧酸例如S-腺巧甲硫氨酸、肌巧5' -单憐酸和鸟巧5' -单憐酸、k氨基酸、有机 酸或胺例如尸胺。优选产生k氨基酸和含有其的产品。
[0042]通过根据本发明的微生物产生和/或分泌的有机化合物优选选自维生素、核巧或 核巧酸、k氨基酸、有机酸和胺。
[0043] 术语心氨基酸包含蛋白氨基酸，加上k鸟氨酸和心高丝氨酸。蛋白k氨基酸 应理解为在天然蛋白质中出现的k氨基酸，所述天然蛋白质例如微生物、植物、动物和人 的蛋白质。蛋白氨基酸包括k天冬氨酸、k天冬酷胺、k苏氨酸、k丝氨酸、k谷氨酸、 k谷氨酷胺、k甘氨酸、k丙氨酸、k半脫氨酸、k鄉氨酸、k甲硫氨酸、k异亮氨酸、 k亮氨酸、k酪氨酸、k苯丙氨酸、k组氨酸、k赖氨酸、k色氨酸、k精氨酸、k脯氨 酸W及任选的k砸代脫氨酸和k化咯赖氨酸。 W44] 术语有机酸包含a-酬酸，尤其是选自a-酬异己酸、a-酬戊酸和a-酬-0 -甲 基戊酸的a-酬酸。
[0045] 尤其优选地，有机化合物选自蛋白k氨基酸a-鸟氨酸和心高丝氨酸W及a-酬 异己酸、a-酬戊酸和a-酬-0-甲基戊酸。尤其优选地，蛋白原心氨基酸选自k苏氨 酸a-赖氨酸a-甲硫氨酸a-鄉氨酸a-脯氨酸a-谷氨酸盐a-亮氨酸和k异亮氨酸， 尤其是k赖氨酸、k甲硫氨酸和k鄉氨酸，尤其特别是k赖氨酸和k甲硫氨酸。
[0046]如果在下文中提及氨基酸或k氨基酸，则该术语还包含其盐，例如在氨基酸k赖 氨酸的情况下，赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。类似地，术语a-酬酸还包含其盐，例如 在a-酬异己酸化IC)的情况下：KIC巧、KIC钟或KIC钢。
[0047] 微生物优选选自细菌、酵母和真菌，在细菌中尤其优选选自棒状杆菌科 (Coryne