后，在发酵后获得的发酵液可W用无 机酸（例如盐酸、硫酸或憐酸，或有机酸例如丙酸）调整至酸性抑(GB1，439, 728或EP1 331 220)。还能够酸化具有完全包含的生物量的发酵液。最后，发酵液还可W通过添加亚 硫酸氨钢（化服〇3,GB1，439, 728)或一些其他盐得到稳定，所述一些其他盐例如亚硫酸的 锭盐、碱金属盐或碱±金属盐。 阳211] 在生物量的分离期间，任选部分或完全去除发酵液中含有的有机或无机固体。溶 解于发酵液中的有机副产物和溶解的发酵培养基（进料材料）未耗尽的成分至少部分 (〉〇 % )保留在产物中，优选至少25 %，尤其优选至少50 %且尤其特别优选至少75 %。任选 地，运些还完全（100% )或几乎完全即〉95%或>98%或超过99%保留在产物中。如果产 物在运个意义上含有至少一定比例的发酵液的组成成分，则它还用术语"基于发酵液的产 物"进行描述。 阳212] 随后，使用已知方法例如使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器、通过反渗透 或纳米过滤，使发酵液脱水、或者增稠或浓缩。随后可W通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾造粒 或其他方法例如根据PCT/EP2004/006655描述的循环流化床，将运种浓缩的发酵液处理为 自由流动的产物，尤其是精细划分的粉或优选粗粒颗粒。任选地，通过筛分或粉尘分离从所 获得的颗粒分离所需产物。
[0213] 还能够直接使发酵液干燥，即无需通过喷雾干燥或喷雾造粒的预先浓缩。
[0214]"自由流动"指粉末从具有不同大小的出口开口的一系列玻璃排放容器，至少从 具有5mm(毫米）开口的容器中未受阻碍地流出化lein:Seifen，〇le,化tte，Wachse 94，12(1968))O
[0215]"精细划分的"意指主要（>50% )具有20-200ym直径的粒度的粉末。
[0216]"粗粒"意指主要（>50% )具有200-2000ym直径的粒度的产物。 阳217] 粒度可W通过激光衍射光谱法的方法进行测定。相应方法在通过R. H. Milller 和R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)关于 "TeilchengrOssenrnessunginderLaborpraxis"[Particlesizemeasurementin I油oratorypractice]的教科书，或通过M.Miodes，Publ.Wiley&Sons(1998)的教科书"IntroductiontoParticleTechnology"中描述。
[0218]自由流动、精细划分的粉末可W另外通过合适的压实或造粒技术转换成粗粒的、 自由流动、可胆存和很大程度上无尘的产物。
[0219] 术语"无尘"意指产物仅含有小比例（巧％ )的低于100ym直径的粒度。
[0220] 在本发明的意义上，"可胆存的"意指产物可W在干燥凉爽处胆存至少一（1)年或 更久，优选至少1.5年或更久，尤其优选两（2)年或更久，而无各自氨基酸的任何大量损失 (最多5% )。 阳22U本发明进一步设及在WO2007/042363A1中概括描述的方法。为此，使用生物量已 任选从其中完全或部分分离的根据本发明获得的发酵液，进行包括下述步骤的方法： 阳222]a)通过添加硫酸使抑下降至4. 0-5. 2,尤其是4. 9-5. 1，在发酵液中建立 0. 85-1. 2、优选0. 9-1. 0、尤其优选〉0. 9-<0. 95的硫酸盐/1-赖氨酸摩尔比，任选地通过添 加另一种或几种含硫酸盐化合物，和 阳223] b)通过脱水将所得的混合物浓缩且任选地造粒，
[0224] 其中任选在步骤a)前，进行下述措施中的一个或两个：
[02巧]C)测量硫酸盐/1-赖氨酸摩尔比，用于测定含硫酸盐化合物的所需量，
[0226] d)添加W相应比例的选自硫酸锭、硫酸氨锭和硫酸的含硫酸盐化合物。 阳227] 任选地，此外，在步骤b)前，亚硫酸的盐优选亚硫酸氨碱金属，尤其优选亚硫酸氨 钢，W相对于发酵液0.01-0. 5重量％、优选0.1-0. 3重量％、尤其优选0.1-0.2重量％的浓 度添加。
[0228] 作为在上述方法步骤的优选的含硫酸盐缓冲液，我们可W特别提及硫酸锭和/或 硫酸氨锭或氨和硫酸的相应混合物和硫酸本身。
[0229] 硫酸盐/1-赖氨酸摩尔比由下式进行计算：V= 2x[S042 ]/比-赖氨酸]。该式考 虑到S〇42阴离子或硫酸是二价的。比率V=I意指存在具有化学当量组成的Lys2-H2SO4， 而在V= 0.9的比率下，发现10%硫酸盐短缺，并且在V=1.1比率下，发现10%硫酸盐过 量。 阳230] 在造粒或压实期间，有利地使用通常的有机或无机助剂，或载体例如淀粉、明胶、 纤维素衍生物，或例如通常在食品加工或动物饲料加工中有用的类似物质例如粘合剂、胶 凝剂或增稠剂，或其他物质例如娃酸、娃酸盐巧P0743016A)和硬脂酸盐。 阳23U 此外，如WO04/054381中所述，用油或脂肪处理颗粒表面是有利的。可W使用的 油是矿物油、植物油或植物油的混合物。此类油的例子是豆油、橄揽油、豆油/卵憐脂混合 物。类似地，硅油、聚乙二醇或径乙基纤维素也是合适的。用上述油处理表面获得增加的产 物耐磨损性和灰尘比例中的减少。相对于饲料添加剂的总量，产物中的油含量为0.02-2.0 重量％、优选0.02-1.0重量％、且尤其特别优选0.2-1.0重量％。 阳232] 具有> 97重量％的100-1800ym粒度比例或> 95重量％的300-1800ym直径的 粒度比例的产物是优选的。灰尘即具有粒度<100ym的颗粒的比例优选为>0-1重量％，尤 其优选最多0.5重量％。 阳233] 可替代地，然而，产物还可W应用于有机或无机载体上，所述有机或无机载体是 动物饲料加工中已知且常用的，例如娃酸、娃酸盐、谷物、麦教、面粉、淀粉、糖或其他，和 /或混合且由常用增稠剂或粘合剂得到稳定。关于运点的实际例子和方法在文献值ie 1化16+113油化1:161'16油]111^ 132(1995)49，第817页）中得到描述。
[0234] 最后，如DE-C-4100920中所述，通过用成膜剂例如金属碳酸盐、娃酸、娃酸盐、海 藻酸盐、硬脂酸盐、淀粉、树胶和纤维素酸包衣，产物还可W达到其中它针对动物胃中尤其 是反当动物的胃中的消化是稳定的状态。
[0235] 为了建立产物中的所需心赖氨酸浓度，取决于需求，心赖氨酸可WW液体或固体 形式，W浓缩物、或任选基本上纯的物质或其盐的形式在加工期间加入。运些可W个别地或 作为混合物加入所获得或浓缩的发酵液中，或在干燥或造粒过程期间加入。 阳236] 本发明进一步设及用于生产固体含赖氨酸产物的方法，其在US20050220933中 概括描述。在运种情况下，使用根据本发明获得的发酵液，进行包括下述步骤的方法： 阳237] a)优选使用膜滤器将发酵液过滤，使得获得含生物量渣块（sludge)和滤液，
[0238] b)使滤液浓缩，优选使得获得48-52重量％的固体含量， 阳239] C)对步骤b)中获得的浓缩物造粒，优选在50°C-62°C的溫度下，和
[0240]d)用一种或多种包衣剂对C)中获得的颗粒进行包衣。 阳241] 步骤b)中的滤液浓缩还可W W运样的方式进行，使得获得52-55重量％、55-58重 量％或58-61重量％的固体含量。 阳242] 对于步骤b)中的包衣，优选使用选自下述的包衣剂： 阳243] dl)步骤a)中获得的生物量， 阳244] d2)优选选自k赖氨酸盐酸盐或k赖氨酸硫酸盐的含k赖氨酸化合物，
[0245] d3)具有k赖氨酸含量<1重量％、优选<0.5重量％的基本上无k赖氨酸物质， 优选选自淀粉、角叉菜胶、琼脂、娃酸、娃酸盐、谷物、麦教和面粉，和 阳246] d4)拒水物质，优选选自油、聚乙二醇和液体石蜡。 阳247] 使用对应于步骤dl)至d4)、尤其是dl)至d3)的措施，将k赖氨酸的含量调整至 所需值。
[0248] 如通过Kushiki等人在US20030152633中描述的，在含心赖氨酸产物的生产中， 离子比率优选运样调整，使得根据下式的离子摩尔比共计0. 68-0. 95、优选0. 68-0. 90、尤 其优选0.68-0.86:
[0249] 2x[SO42] +[Cl]-[畑/] - [Na+] - [r] [Mg2+] [化扣]/ [L-Lys]。
[0250] 在心赖氨酸的情况下，相对于产物的干物质，在发酵液的基础上W运种方式制备 的固体产物具有10重量％ -70重量％或20重量％ -70重量％，优选30重量％ -70重量％， 并且尤其特别优选40重量％ -70重量％的赖氨酸含量（作为赖氨酸碱）。71重量％、72重 量％、73重量％的赖氨酸碱的最大含量也是可能的。 阳巧1] 含k赖氨酸固体产物的水含量最高达5重量％、优选最高达4重量％、且尤其优 选小于3重量％。 阳巧引 菌株DM1547于2001年1月16日在登录号DSM13994下保藏于DeutscheSammlung 扣rMikroorganismenundZeHkulturen[德国微生物和细胞培养物保藏中屯、（German CollectionforMicroorganisms曰ndCellCultures)]〇
【附图说明】 阳巧引 图I显不了质粒地18msb_Pg3_lpdA。 阳巧4] 图2显示了质粒pZ8-l: :IpdA。 实施例 。巧引连施例1: 阳巧6] 如来自结核分枝杆菌的LpdA蛋白质的情况下（Argyrou等人，2004)，来自谷氨酸 棒状杆菌的IpdA基因（cg0790)的基因产物在大部分自动基因组注释中分类为属于黄素蛋 白二硫化物还原酶（FDR)家族的可能的二氨硫辛酷胺脱氨酶，而不管其催化的氧化还原反 应的多样性，但所述FDR家族的成员在序列和结构水平上彼此具有大体上的高同源性。借 助于BLAST程序（基本局部比对捜索工具）的bias化功能，通过谷氨酸棒状杆菌LpdA的 生物信息学分析，测定该蛋白质与已经表征的来自结核分枝杆菌的LpdA、W及来自谷氨酸 棒状杆菌和各种其他生物体的其他黄素蛋白二硫化物还原酶的同源性。 。巧7] 连施例2： 阳巧引 交换载体地18msb_Pg3_lpdA的构建 阳巧9] 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组的核巧酸序列在化eda和化kagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99-109(2003))、EP I 108 790 W及Kalinowski等 人（Journal of Biotechnology 104(1-3)，（2003))中得到描述。
[0260] 谷氨酸棒状杆菌的基因组的核巧酸序列还在美国国立医学图书馆度ethesda，MD， USA)的美国国家生物技术信息中屯、（NCBI)的数据库、日本DNA数据库值DBJ，Mishima，日 本）、或欧洲分子生物学实验室（EMBL，Heide化erg,德国或Cambridge,UK)的核巧酸序列数 据库中可获得。 阳％U 从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组序列开始，在GeneArt公司巧egensburg， 德国）合成1.7-化〇臟片段669 10^:3)，除口邑曰口3启动子值6102011118019.6)之外， 其还具有用于在天然IpdA基因前插入启动子的侧翼序列。通过Schjifer等人（Gene, 145， 69-73 (1994))描述的，通过XmaI和甜al切割经由末端插入的切割位点XmaI和甜al，将该 片段切割且随后克隆到同样用XmaI/甜al切割的可移动载体地ISmobsacB内。质粒命名为 pK18msb_Pg3_lpdA且显示于图1中。
[0262]连施例3： 阳％3] 载体pZ8-l_lpdA的构建
[0264] 使用两种引物扩增来自谷氨酸棒状杆菌的IpdA基因（cg0790)，通过所述两种引 物提供上游具有EcoRI切割位点和下游具有Sail切割位点的基因。基于对于谷氨酸棒状 杆菌已知的IpdA基因的序列，下述寡核巧酸用作引物：lpdA_pZ8-1-l(SEQ IDN0:4):5'GG TGGTGAATTCAAAGGAGGACAACCATGGCAAAGAGGATCGTAAT 3' 阳2化]lpdA_pZ8-l-2(SEQIDN0:5):5'GGTGGTGTCGACTTAGCCTAGATCATCATGTT3'
[0266] 所示引物通过MWGBiotech公司脚>ersberg，德国）进行合成。
[0267] 它们使得能够扩增根据SEQIDNO:6的长1448-bp的DNA片段. 阳26引使用Nl战Ieospb猿Ext掷过II试剂盒纯化PCR产物。片段通过EcoRI和SalI切 割经由末端插入的切割位点EcoRI和Sail进行切割，并且随后借助于T4DNA连接酶，克隆 到同样通过EcoRI/Sall切割的载体PZ8-1内值E3841454A1 ;大肠杆菌D册/pZ8-l在编号 DSM4939 下保藏于德国微生物保藏中屯、（GermanCollectionforMicroorganisms))。该 质粒具有命名pZ8-l: :IpdA且显示于图2中。 阳％9] 连施例4： 阳270]菌株DM1547_Pg3_lpdA的产生 阳271] 将突变Pg3_lpdA引入谷氨酸棒状杆菌菌株DM1547内。菌株DM1547是谷氨酸棒 状杆菌ATCC13032的氨乙基半脫氨酸抗性突变体。它于2001年1月16日W命名DSM13994保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中屯、值SMZ，化aunschweig，德国）。
[0272]使用Liebl等人（FEMSMicrobiologicalLetters, 53:299-303 (1989))的电穿孔 技术，将实施例2中所述的载体地18msb_Pg3_lpdA电穿孔到谷氨酸棒状杆菌DM1547中。 通过将电穿孔制备物铺板到LB琼脂（Sambrook等人，MolecularCloning=AL油oratory Manual.第 2 片反ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.， 1989)上，进行携带质粒的细胞的选择，所述LB琼脂已补充有25mg/l卡那霉素。载体不能在 DM1547中独立地复制，并且仅当它由于重组事件而整合到染色体中时，才保留在细胞中。通 过将接合（con化gation)制备物铺平板到LB琼脂（其已补充有25mg^卡那霉素和50mg/ 1糞晚酸）上，进行转化接合子（transcon化gant)即具有整合的地18msb_Pg3_lpdA的克隆 的选择。卡那霉素抗性转化接合子随后在补充有卡那霉素（25mg/l)的LB琼脂平板上划线