来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法

来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法
【专利摘要】使获自患遗传性心脏疾病个体的人体细胞重编程成为诱导性多能干细胞(iPS细胞)，并且分化为用于分析、筛选程序等应用的心肌细胞。
【专利说明】来自患者的诱导性多能干细胞的心肌细胞及其使用方法
[0001]联邦资助研究与开发
[0002]本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同HL099776下于政府资助下完成。政府享有本发明的某些权利。
【背景技术】
[0003]多种心脏病具有潜在的遗传病因。例如，扩张型心肌病(DCM)是一种特征为心室扩张和心脏收缩障碍的心脏病。DCM是排在冠状动脉疾病和高血压之后最常见的心力衰竭的病因，并且是心脏移植的主要指示。仅在美国，控制DCM的花费已被估计为40亿-100亿美元。治疗的另一种重要病症是肥大型心肌病(HCM)，其中肌节复制导致心肌细胞在尺寸上增加。另外，心肌细胞的正常排列被打乱，这种现象称为心肌混乱(myocardial disarray)。由于9个肌苄基因中有I个突变，因而HCM是最常见的。
[0004]编码肌节蛋白、细胞骨架蛋白、线粒体蛋白和核膜蛋白以及钙代谢相关蛋白质的基因中的突变与大约三分之一到一半的DCM病例相关联。心脏肌钙蛋白T(cTnT)是肌钙蛋白复合物(肌钙蛋白T、C和I)的3个亚基之一，该肌钙蛋白复合物调节心肌细胞(CM)中肌节细肌丝的活性以及肌肉收缩。CTnT对于肌节组装、收缩和力量产生是必需的。心脏肌钙蛋白T基因(TNNT2)中的突变常导致DCM，并且常常表达为关于在幼年时心脏性猝死和心力衰竭的恶性表型。体外生物化学研究已经发现导致力量产生受损的Ca2+敏感性和/或ATP酶活性降低可能是某些TNNT2-突变诱导的DCM的潜在机制。
[0005]TNNT2 突变的小鼠模型涵盖了人DCM表型并且提供对于该疾病的可能机制的更广泛认识。然而，在小鼠模型和人模型之间存在几种差异。例如，小鼠静息心率比人快约10倍。小鼠CM的电特性、离子通道贡献和心脏发育也与人不同。体外生化试验中的心肌细胞内复杂细胞内互相作用的缺乏和小鼠模型的物种差异，削减了这些方法对于理解DCM的细胞和生理学过程以及药物筛选的价值。
[0006]另外，很难得到来自DCM患者的心脏组织并且该组织不能在长期培养中存活。人们对将扩张型心肌病和其它遗传心脏病症的有效细胞模型用于筛选和开发有效的治疗方法有很大兴趣。
[0007]药品发现是一个数十亿美元的产业，其包括治疗靶标的鉴定和验证，以及先导化合物的鉴定和优化。在最近几年中，由基因组学和组合化学方法产生的潜在新靶标和化学实体数量激增对筛选程序施加了很大的压力。虽然对有用药物鉴定的回报是巨大的，但是从任何筛选程序命中的百分比一般都很低。理想的化合物筛选方法同时通过如下方式解决这一问题:允许高通量，从而能够测试很多个体化合物；以及提供生物学相关的信息，使得筛选试验产生的信息与化合物的药效良好关联。
[0008]对于药效而言，一些更重要的特征是针对靶向细胞或疾病的特异性、在相关剂量下无毒，以及所述化合物对于其分子靶标的特定活性。本发明解决了这一问题。
[0009]出版物。使灵长类的分化的体细胞重编程成多能状态的方法包括分化体细胞的核转移、分化体细胞与多能干细胞的融合以及直接重编程，来产生诱导性多能干细胞 QPS 细胞)(Takahashi K 等，(2007)Celll31: 861-872 ；Park IH 等，(2008)Nature451: 141-146 ；Yu J 等，(2007) Science318: 1917-1920 ；Kim D 等，(2009) CellStem Cell4: 472-476 ；Soldner F 等，(2009) Cell.136: 964-977 ；Huangfu D 等，(2008)Nature Biotechnology26: 1269-1275 ；Li W 等，(2009)Cell Stem Cell4: 16-19)。
[0010]感兴趣的其它出版物包括Stadtfeld 等，Science322,945-949 (2008) ;0kita 等，Science322,949-953(2008) ；Kaji 等，Nature458,771-775 (2009) ；Soldner 等，Celll36,964-977 (2009) ；ffoltjen 等，Nature458, 766-770 (2009) ；Yu 等，Science (2009)。
[0011]发明概述
[0012]提供用于心肌细胞的疾病相关筛选的组合物和方法，供于治疗性药物和治疗方案，其中该方法采用体外细胞培养或其衍生的动物模型。特别感兴趣的疾病包括扩张型心肌病(DCM)、肥大型心肌病(HCM)、蒽环类抗生素诱导的心脏中毒、心律失常性右心室发育不良(ARVD)、左心室致密化不全(LVNC)、左心室双入口(DILV)以及长QT(1型)综合征(LQT-1)，其中该疾病存在遗传基础。该方法采用诱导性人多能干细胞(iPS细胞)，所述iPS细胞可获自患者或载体细胞样品(例如脂肪细胞、成纤维细胞等)。
[0013]在本发明的一些实施方式中，提供了疾病相关心肌细胞的体外细胞培养，其中从诱导性人多能干细胞(iPS细胞)分化心肌细胞，所述iPS细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因。感兴趣的突变包括以下基因中的突变:心脏肌钙蛋白T(TNNT2);肌球蛋白重链(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亚基Y_2(PRKAG2) ;3型肌钙蛋白I (TNNI3);肌联蛋白(TTN);肌球蛋白，轻链2 (MYL2);肌动蛋白，α心肌I (ACTCl);电压门控性钾通道，KQT-样亚家族，成员I(KCNQl)；斑菲素蛋白2(plakophilin2) (PKP2);以及心脏UM蛋白(CSRP3)。感兴趣的特定突变包括但不限于 MYH7R663H 突变、TNNT2R173W、PKP22013delC 突变、PKP2Q617X 突变和 KCNQ1G269S错义突变。
[0014]在一些实施方式中，提供一组这样的心肌细胞，其中该组包含两种或更多种不同的疾病相关心肌细胞。在一些实施方式中，提供一组这样的心肌细胞，其中使所述心肌细胞接触多种候选试剂，或候选试剂的多个剂量。候选试剂包括小分子，即，增加或减少感兴趣的RNA的表达、电学变化等的药物、基因构建体。在一些实施方式中，疾病相关心肌细胞被引导或诱导在体内环境中从iPS细胞分化，例如作为动物模型中的外植体。在一些实施方式中，一组是指采用患者特异性心肌细胞的系统或方法，所述心肌细胞来自两种或更多种不同的心脏病症，并且可以是三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种不同的病症，其中所述病症选自:扩张型心肌病(DCM)、肥大型心肌病(HCM)、蒽环类抗生素诱导的心脏中毒、心律失常性右心室发育不良(ARVD)、左心室致密化不全(LVNC)、左心室双入口 (DILV)以及长QT(1型)综合征(LQT-1) ?
[0015] 在本发明的一些实施方式中，提供用于测定候选试剂对疾病相关心肌细胞的活性的方法，该方法包括:将所述候选试剂与一种或一组分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞接触，所述多能干细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因；和，测定该试剂对于形态、遗传或功能参数的影响，所述参数包括但不限于钙瞬变幅度、细胞内Ca2+水平、细胞尺寸收缩力产生、搏动速率、肌节α-辅肌动蛋白分布和基因表达谱。人们对单细胞水平的分析方法特别感兴趣，例如原子力显微镜、微电极阵列记录、膜片钳、单细胞PCR和钙成像等。
[0016]在所述疾病是DCM的情况中，可以在与候选试剂接触前、中或后通过正性肌力压力(positive inotropic stress)(如β -肾上腺素激动剂)来刺激心肌细胞。在一些实施方式中，所述β_肾上腺素激动剂是去甲肾上腺素。本文显示DMC心肌细胞具有响应正性肌力压力的初始正性变时作用，其之后变成以衰竭为特征的负性作用，所述衰竭特征如搏动速率减小，收缩减弱和具有异常肌节α-辅肌动蛋白分布的细胞显著增多。β-肾上腺素阻断剂处理和肌质网Ca2+ATP酶(Serca2a)的过表达改善所述功能。DCM心肌细胞也可以用通路中的遗传物质来测试，所述遗传因子包括促进心脏发生的因子、整联蛋白和细胞骨架信号传导以及泛素化通路，如表8所示。相比相同家族组群中的对照健康个体，DCM心肌细胞展现出减小的钙瞬变幅度、减弱的收缩和异常肌节α -辅肌动蛋白分布。
[0017]在所述疾病是HCM的情况中，可以在与候选试剂接触前、中或后通过正性肌力压力(如肾上腺素激动剂)来刺激心肌细胞。在这种情况下，HCM心肌细胞展现出较高的肥大反应，这能够通过肾上腺素阻断剂来逆转。相比健康个体，HCM心肌细胞展现出细胞大小增大和HCM相关基因的上调，以及较不规律的收缩(以不完全搏动为特征)，包括较高频率的异常Ca2+瞬变(以次级不完全瞬变(secondary immature transient)为特征)。这些心肌细胞的细胞内Ca2+水平升高，并且在一些实施方式中，靶向钙依赖磷酸酶或其它钙粘附相关靶标的候选试剂。
[0018]同时提供包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因的多能干细胞群。感兴趣的突变包括以下基因中的突变:心脏肌钙蛋白T(TNNT2);肌球蛋白重链(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亚基Y-2 (PRKAG2)；3型肌钙蛋白I(TNNI3);肌联蛋白(TTN);肌球蛋白，轻链2 (MYL2);肌动蛋白，α心肌I (ACTCl);电压门控性钾通道，KQT-样亚家族，成员I (KCNQl);斑菲素蛋白2 (ΡΚΡ2);以及心脏LM蛋白(CSRP3)。感 兴趣的特定突变包括但不限于:MYH7R663H突变、TNNT2R173W、PKP22013delC突变、PKP2Q617X突变和KCNQ1G269S错义突变。所述多能干细胞群可以细胞培养物形式提供，可任选地以无饲养层细胞培养物形式提供。不同体细胞都可用作iPS细胞的来源；特别感兴趣的是脂肪源性的干细胞、成纤维细胞等。由此衍生的多能细胞和心肌细胞可用于移植，用于实验性评估，作为谱系或细胞特异性产物的来源等。阅读以下更完整描述的主题方法和组合物细节，本领域技术人员将明白本发明的这些和其他目的、优点和特征。
[0019]附图简要说明
[0020]图1.患者特异性DCM iPSC的产生。(a)在该研究中募集的7名DCM家族成员的谱系示意图。实心方块(男性)和圆圈(女性)代表1号染色体上的两个等位基因之一中携带特定TNNT2R173W突变的个体。(b)通过PCR和DNA测序确定R173W点突变存在于DCM患者的TNNT2基因的外显子12上。C0N，对照。(c)从皮肤活检扩增的源自患者的皮肤成纤维细胞的代表性图像。(d)ESC-样和(e)用Yamanaka因子使源自患者的皮肤成纤维细胞重编程获得的TRA-1-60阳性集落的代表性图像。(f)患者皮肤成纤维细胞衍生的iPSC的免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色。(g)针对患者特异性iPSC中的0ct4和Nanog的启动子区域上的甲基化状态的定量亚硫酸氢盐焦磷酸测序分析。在患者特异性iPSC中，Nanog和0ct4启动子区域都是高度去甲基化的。(h)由注射进入免疫缺陷小鼠的肾小囊的患者特异性iPSC衍生的畸胎瘤显示全部3种胚层的组织。标尺，200 μ m。
[0021]图2.在NE处理之后，DCM iPSC_CM展现出具有异常肌节α-辅肌动蛋白分布和早期衰竭的细胞数目明显较高。(a)在分化后30天对肌节α-辅肌动蛋白和cTnT进行免疫染色。单个DCM iPSC-CM展现出点状肌节α-辅肌动蛋白分布图案，这表明混乱的肌丝结构。合并的显微照片的方框区的放大图显示细胞中α-辅肌动蛋白和cTnT的详细染色图案。标尺，20 μ m。(b)与对照iPSC-CM (η = 368)相比，明显较高百分比的DCM iPSC-CM (η = 391)在超过总细胞面积的四分之一中显示点状肌节α-辅肌动蛋白染色图案(**p=0.008)。(c)在对照(η = 36)和DCM iPSC-CM (η = 39)之间没有观察到细胞尺寸的显著差异。(d)追踪随时间变化的收缩性质的代表性的MEA试验，所述收缩性质是用NE处理或不用NE处理的对照(η = 14)和DCM(η = 14)搏动ΕΒ。在双室MEA探针中接种ΕΒ，一侧用NE处理，另一侧不用NE处理。在实验中同时记录电信号。使搏动频率针对不用NE处理的EB的搏动频率进行标准化。(e)通过视频成像的，在NE处理之后随时间变化的经标准化的CM簇的搏动频率(η = 10)。(f)在NE处理7天之后，对单个对照和DCM iPSC-CM进行肌节α -辅肌动蛋白免疫染色的代表性图片。与对照相比，长期的NE处理显著恶化了 DCM细胞的肌节组织。标尺，20 μ m。(g)用NE处理(对照，η = 210 ；DCM, η = 255)或不用NE处理(对照，η = 261 ；DCM, η = 277)的，具有混乱肌节染色图案的CM的百分比。NE处理显著增加了在DCM组中混乱CM的数量(**p < 0.001)，并且对于对照iPSC-CM(*p=0.05)的效果不太显著。(h)追踪在NE处理之后iPSC-CM随时间的形态变化和收缩性变化。标尺，200 μ m。数据以平均值土标准误表不。
[0022]图3.DCM iPSC-CM展现出较小的[Ca2Ii瞬变。(a)在对照(左)和DCMiPSC-CM(右)中的代表性线性扫描图像和(b)自发钙瞬变。(c)在对照和DCMiPSC-CM中自发钙瞬变的频率。(d)在对照和DCM iPSC-CM中[Ca2+] 变的整合显示相对于对照细胞，在DCM中每次 瞬变释放的Ca2+较少(对照，η = 87细胞；DCM，η = 40, **P=0.002)。在对照和DCM细胞之间，(e)节律的不规则性(标准偏差/平均值)或⑴自发钙瞬变的幅度没有显著的差异。
[0023]图4.Serca2a的过表达恢复了 DCM iPSC-CM的收缩性。(a)在腺病毒转导DCMiPSC-CM之后Serca2a表达的Western印迹。在用Ad.Serca2a转导的细胞中Serca2a蛋白水平上调，但在用Ad.GFP转导的细胞中Serca2a蛋白水平没有上调。(b)显示AFM悬臂靠近GFP阳性的单个搏动CM的代表性图像。标尺，50 μ m。(c)通过AFM测量的超过100-400次搏动的所有单个iPSC-CM的收缩力的直方图。Serca2a的过表达明显将DCM iPSC-CM的收缩力恢复至接近对照的水平。(d)由AFM测量的单个CM的平均收缩力的点图。单向ANOVA分析表明在所有组的平均值之间存在显著差异(#p=0.002)。徒吉(Tukey)多重比较检验表明相比用 Ad.GFP(η=17)的转导，对照 iPSC-CM(η=13) (P=0.001)和 Ad.Serca2a(n=12)(P=0.005)转导的DCM iPSC-CM展现出显著更强的收缩力。Ad.Serca2a转导的DCM iPSC-CM显示与对照iPSC-CM相当的收缩力(ρ=0.578)。(e)在分别用Ad.GFP和Ad.Serca2a转导的单个DCM iPSC-CM中的代表性自发钙瞬变。(f)与用Ad.GFP转导的细胞(n=14)相比，用Ad.Serca2a转导的DCM iPSC-CM (n=22)展现出增加的全钙瞬变(*ρ=0.04)(双尾斯氏t检验)。(g)在 Ad.Serca2a (n=40)或 Ad.GFP (n=40)过表达的 DCM iPSC-CM 中，具有混乱肌节染色图案的CM的百分比。在两组之间没有观察到显著的差异(双尾斯氏t检验)。数据表示为平均值土标准误。
[0024]图5.在源自家族中DCM患者的iPSC中的R173W突变。TNNT2的基因座的基因组PCR和DNA测序表明来自所有DCM患者的iPSC携带R173W(C到T)突变。
[0025]图6.通过微阵列比较人ESC (H7)、皮肤成纤维细胞和患者特异性iPSC的全mRNA表达模式。皮尔森相关和散点图都表明患者特异性iPSC的全基因表达图案与人ESC的全基因表达图案高度相似。
[0026]图7.在扩展培养(extended culture)之后，患者特异性iPSC保持正常的核型。显示培养20代之后的来自两种DCM iPSC细胞系的代表性图像。
[0027]图8.总量相对内源性Yamanaka重编程因子的相对表达水平的定量PCR。通过比较各重编程因子的总基因表达水平与内源性基因表达水平，在大多数已建立的患者特异性iPSC中，外源性转基因0ct4、Sox2、Klf4和c_MYC被沉默。在所有患者特异性iPSC中，内源性Nanog表达被上调，这表明各细胞系的多能性状态。注:使Nanog表达水平针对H7人ESC的Nanog表达水平进行标准化(未显示)。用于定量PCR的引物信息列于补充表6中。
[0028]图9.患者特异性iPSC在体外能够分化为来自3种胚层的细胞。从所有患者特异性iPSC的自发分化中检测到不同的细胞类型，如神经元、内皮细胞、血红细胞，和表达中胚层标记物平滑肌肌动蛋白(SMA)的细胞、表达内胚层标记物甲胎蛋白(AFP)的细胞以及表达外胚层标记物(Tuj-1)的细胞。标尺，100 μ m。
[0029]图10.患者特异性iPSC的相对心脏分化效率。心脏分化效率表示为搏动EB的百分比(就细胞系而言n=3，数据以平均值土标准误表示)。
[0030]图11.在衍生自对照和DCM iPSC的搏动EB中cTnT阳性CM的百分比的FACS分析。在搏动EB中约50-60%的细胞是cTnT阳性心肌细胞。
[0031]图12.DCM和对照iPSC-CM中野生型(Wt)和突变体(R173W)TNNT2表达的等位基因特异性PCR。确定了患者IIa、IIb和IIIa在他们各自的iPSC-衍生的CM中表达突变体TNNT2。用于等位基因PCR的引物列于补充表6中。
[0032]图13.检测iPSC-衍生的搏动EB的电生理性质的多重电极阵列(MEA)。(a)MEA探针和接种的4种搏动EB的代表性图像。(b)通过(a)中所示的4种搏动EB的MEA反射场电位记录的电信号。(c)显示场电位时程(FPD)、最大正幅度(MPA)、最大负幅度(MNA)和峰电位间隔(ISI)的提取的MEA场电位照片。
[0033]图14.分析在分化后30天时24个对照和24个DCM iPSC-CM中基因表达水平的单细胞PCR。分析了相对于α-微管蛋白的基因表达水平的(a)心脏特异性转录因子，(b)钙操作相关蛋白，(C)离子通道，(d)肌节蛋白和(e)骨骼肌特异性蛋白的基因表达。在对照和DCM CM之间没有观察到显著的差异。数据以平均值土标准误表示。使用双尾斯氏t检验检验统计学差异。
[0034] 图15.1PSC-CM表达的心脏特异性蛋白。对照和DCM iPSC_CM都表达心脏特异性蛋白肌节α-辅肌动蛋白、cTnT、连接蛋白43和MLC2a。箭头表示在细胞-细胞接触处的连接蛋白43的阳性染色。标尺，20μπι。
[0035]图16.图2a中所示的单个CM中肌节α -辅肌动蛋白和cTnT的免疫染色的放大图。标尺,20 μ m。
[0036]图17.图2f中所示的在单个CM中肌节α -辅肌动蛋白和cTnT的双免疫染色。标尺，20 μ m。
[0037]图18.图2f中所示的各细胞的合并照片的放大图。应注意的是在NE处理之后，一些单个DCM iPSC-CM显示肌丝的完全变性，这在对照CM中未观察到。标尺，20 μ m。
[0038]图19A-C.单个DCM iPSC-CM对比对照iPSC-CM的实时PCR显示在NE处理一周后的基因表达变化。在分化后19天时对照和DCM iPSC-CM接种在培养盘上，并且在48小时后用或不用10 μ M NE处理，持续7天。挑取来自对照(用NE处理，η = 8 ;不用NE处理，η=8)和DCM (用NE处理，η = 8 ;不用NE处理，η = 8) iPSC的单个CM，并且如方法部分所述来实施PCR。第一次计算在用NE处理和不用NE处理的细胞之间的净循环阈值(CT)。然后数据表示为相对于对照组净CT值的DCM组的净CT值。在NE处理之后，基因被分为上调基因(CT中> I的循环差异)，下调基因(CT中> I的循环差异)和没有表达变化的基因(CT中< I的循环差异)。
[0039]图20.通过膜片钳测量的iPSC-CM的电生理特征。(a)在对照和DCMiPSC-CM中都观察到3种类型的自发AP (左:心室样；中:心房样；右:节点样)。估计70-80%的细胞是心室样CM，而其它是心房样细胞和/或节点样细胞。对照和DCM iPSC之间的心脏命运没有显著差异(数据未显示)。(b)通过电流钳记录对照和DCM心室肌细胞的自发AP。与对照细胞相比，DCM心室细胞具有稍短的AP(P=0.112) (c)。在测量的时点上(分化后19天-25天)，对照和DCM细胞之间在频率(d)，AP的峰幅度(e)或静息膜电位(f)上没有显著差异(对照，n=18 ；DCM, n=17)。使用双尾斯氏t检验检验统计学差异。
[0040]图21.1PSC-CM的收缩力的原子力显微镜(AFM)测量。(a)在单个心肌细胞水平上，AFM的力测量的方法示意图。(b)显示AFM悬臂探测单个心肌细胞的代表性图像。标尺，20μπι。(c)显示通过AFM得到的信号和检测的参数(力、频率和搏动时程)的代表性照片。
[0041]图22.通过AFM测量的，单个iPSC_CM的搏动频率和时程。(a)通过AFM测量的平均搏动频率的点图。在对照iPSC-CM (η = 13)、Ad.Serca2a (n=12)和Ad.GFP (n=17)转导的DCM iPSC-CM之间没有观察到搏动频率和节奏中的显著差异。(b)通过AFM测量的平均搏动时程的点图。Serca2a的过表达显著缩短了搏动时程(*p=0.029)。使用单向ANOVA然后使用徒吉多重比较检验来检验统计学差异。通过AFM所测量的，所有单个iPSC-CM的超过100-400次搏动的(c)搏动频率和(d)搏动时程的直方图。
[0042]图23.通过AFM所测量的，各个单细胞的相对细胞大小对比收缩力的点图。在(a)对照(R2=0.006)、(b)DCM/DCM-Ad.GFP (R2=0.105)和(c)DCM-Ad.Serca2a(R2=0.061)组中细胞大小和收缩力之间没有明显的线性关系。
[0043]图24.在Serca2a和GFP过表达之后，在培养盘中搏动点(beating focus)的经标准化的百分比。数据表示实验的3次独立重复的平均数(平均值土标准误)。
[0044]图25.对于用Ad.Serca2a或Ad.GFP腺病毒转导的iPSC_CM，使用红色荧光Ca2+指示物Rhod-2AM进行Ca2+成像。(a)合并的共焦图像显示GFP阳性CM摄入Rhod_2染料。(b)对于(a)中的相同细胞沿图中所示的箭头线扫描。(C)记录在(a)和(b)中所示的特定CM的线扫描图像。标尺，20 μ m。
[0045]图26.通过AFM测量的，用Ad.Serca2a或Ad.GFP转导的对照iPSC-CM的收缩性。Ad.Serca2a(n=10)或Ad.GFP(n=10)转导的对照iPSC-CM的(a)收缩力、(b)搏动频率和(C)搏动时程的点图。在每组的平均值之间没有观察到统计学显著差异。使用双尾斯氏t检验检验统计学差异。通过AFM测量的所有单个对照iPSC-CM的100-400次搏动的(d)收缩力、(e)搏动频率和(f)搏动时程的直方图。
[0046]图27.具有Serca2a过表达特征的富集通路的DCM iPSC-CM的基因表达谱，所述富集通路可能在拯救DCM表型中发挥作用。(a)与没有用Serca2a处理的DCM iPSC_CM相t匕，在对照iPSC-CM和用Serca2a-处理的DCM iPSC-CM的生物学重复中，表达水平上超过1.5倍差异的191个基因的热图。(b)可能涉及通过Serca2a过表达来拯救DCM表型的富集通路的热图。
[0047]图28.美托洛尔处理改善了 DCM iPSC-CM的肌节组织并且减轻NE处理的恶化效果。(a) 10 μ M美托洛尔处理增加了具有完好的肌节完整性的DCM iPSC-CM的数量(未处理的，n=100 ;处理的，n=86, *p=0.023)。(b)美托洛尔处理防止由NE处理诱导的DCMiPSC-CM的恶化。与没有美托洛尔处理的细胞(n=108)相比，I μ Μ(η=107，**ρ=0.008)和10 μ Μ(η=101，**ρ=0.001)美托洛尔都能显著减少混乱细胞的数量。(c) 10 μ M美托洛尔处理对于对照iPSC-CM的肌节完整性没有显著的效果(未处理的，n=88 ;处理的，n=75)。数据以平均值土标准误表示。使用双尾斯氏t检验检验统计学差异。
[0048]图29.DCM iPSC-EC和对照iPSC_EC的相似功能性质。(a) FACS分析表明DCM和对照iPSC向⑶31+EC的分化的效率是相似的。(b)来自分化的DCM和对照iPSC的FACS分离的⑶31+细胞都表达内皮细胞标记物⑶31和⑶144。(c)DCM和对照iPSC-衍生的EC展现出低密度脂蛋白(LDL)的摄入能力(红色荧光)。(d)对照和DCM iPSC-衍生的EC都能够在基质胶表面上形成网状管。标尺，100 μ m。
[0049]图30.在DCM iPSC_CM中通过Serca2a基因治疗的潜在机制的示意图。在心脏肌钙蛋白T中的突变负面影响收缩性、肌节形成和钙信号传导，这造成该钙相关基因(如肌集钙蛋白、NFAT和TRIC通道)中的变化。然而，在TNNT2R173W DCM iPSC-CM中，电激发是正常的。Serca2a、SR/ER膜钙泵的递送恢复了钙操作分子的水平，逆转了减小的钙瞬变和收缩性，从而改善DCM iPSC-CM的整体功能。cTnT，心脏肌钙蛋白T ；LTC, L-型钙通道；RyR，雷诺定(Ryanodine)受体韩释放通道；CSQ,肌集韩蛋白；PM,质膜。
[0050]图31A-M.患者特异性HCM iPSC_CM的产生和表征。(A)先征者和对照匹配家族成员在收缩末期和舒张末期的代表性长轴MRI图像，证明下壁的不对称肥大。(B)通过PCR和序列分析对HCM患者(11-1、111-1、111-2、II1-3和II1-8)中MYH7基因的外显子18上的Arg663His错义突变进行确证。(C)本研究募集的在MYH7中携带Arg663His突变的先征者(I1-1)及其丈夫(I1-2)以及8个孩子(II1-1到II1-8)的谱系示意图。圆圈代表女性家族成员而方块代表男性。实心标志表示HCM表型的临床表现，而空心标志代表没有表现。在家族成员之下的“ + ”和符号分别表示Arg663His突变的存在和不存在。发现2个个体(II1-3和II1-8)携带Arg663His突变，但是由于年龄年轻，所以还没有表现出HCM表型。(D)心脏肌钙蛋白T和F-肌动蛋白的代表性免疫染色证明与对照iPSC-CM相比，在HCM iPSC-CM中增加的细胞大小和多核化现象。(E)在心脏分化诱导之后40天，对4种对照iPSC-CM 细胞系(11-2，111-4，111-6，II1-7)(每名患者细胞系 n=55)和 4 种 HCM iPSC-CM细胞系(11-1，111-1，111-2，II1-8)(每名患者细胞系n=59)的的细胞大小定量。(F)对对照(n=55，4名患者细胞系)和HCM iPSC_CM(n=59，4名患者细胞系)中多核化的定量。(G)代表性的免疫荧光染色揭示了与对照相比，HCM iPSC-CM中ANF的表达升高。(H)在心脏分化诱导之后20天、30天和40天时，由单细胞定量PCR所测量的，对照和HCM iPSC-CM中ANF基因表达的变化(每个时间点n=32，5名患者细胞系)。(I)在HCM iPSC-CM和对照中MYH7/MYH6表达比率的定量(每个时间点n=32，5名患者细胞系)。(J)代表性的免疫荧光染色图像揭示了 HCM iPSC-CM中的NFATC4的核移位。(K)在对照(n=187，5名患者细胞系)和HCM iPSC-CM(n=169，5名患者细胞系)中展现出阳性NFATC4染色的心肌细胞的百分比。(L)在用钙依赖磷酸酶抑制剂Cs-A和FK506的连续5天处理之后，对对照和HCM iPSC-CM的细胞大小的定量(n=50，每组5名患者细胞系)。(M)在心脏分化诱导后20天、30天和40天，对单个对照和HCM iPSC-CM中与心脏肥大相关基因的基因表达的代表性热图。*表示HCM对比对照，P < 0.05 表示HCM对比对照，P < 0.0OOl0
[0051]图32A-N.对HCM iPSC_CM中心律失常和不规则Ca2+调节的评估。(A)由电流钳模式中的膜片钳所测量的，对对照和HCM iPSC-CM中的自发动作电位的电生理测量。方框中表示在延长的时间尺度下HCM iPSC-CM波形的划线部分，显示有DAD-样心律失常。(B)对对照(n=144，5名患者细胞系)和HCM iPSC_CM(n=131，5名患者细胞系)中DAD出现的定量。DAD比率被定义为总DAD/总搏动。(C)展现出有推定DAD的对照(n=144，5名患者细胞系)和HCM iPSC-CM(n=131，5名患者细胞系)的百分比的定量。⑶在对照和HCMiPSC-CM中的代表性线扫描图像和自发Ca2+瞬变。红色箭头表明在HCM细胞中而不是在对照中观察到的快速心律失常样的波形。(E)在心脏分化诱导后20天、30天和40天时，展现出不规则Ca2+瞬变的对照和HCM iPSC-CM的百分比的定量(n=50，每个时间点5名患者细胞系)。(F)用驱动表达野生型MYH7或携带Arg663His的突变体MYH7的慢病毒进行稳定诱导的H9hESC_CM和hESC-CM的代表性线扫描图像和自发Ca2+瞬变。红色箭头表示不规则的Ca2+波形。(G)在WA09hESC-CM、过表达野生型MYH7的hESC-CM和过表达携带Arg663His突变的MYH7的hESC-CM中，展现出不规则Ca2+瞬变的细胞的定量(n=40，每组5名患者细胞系)。⑶对于hESC-CM、过表达野生型MYH7的hESC-CM和过表达携带Arg663His突变的MYH7的hESC-CM，由电流钳模式记录的自发动作电位。红色箭头表示DAD-样波形。(I)在hESC-CM、由驱动表达野生型MYH7或携带Arg663His突变的突变体MYH7的慢病毒进行稳定转导的hESC-CM中，展现出DAD-样波形的细胞的定量(n=20,每组5名患者细胞系)。(J)对于对照(n=122,4名患者细胞系)和HCM iPSC-CM(n=105，4名患者细胞系)，基线Fluo-4Ca2+染料强度的定量。⑷使用Indo-1比率计的Ca2+染料的、对照和HCM iPSC-CM的代表性Ca2+瞬变。(L)通过对对照(n=17，4名患者细胞系)和HCM iPSC-CM(n=26，4名患者细胞系)中Indo-1比率的测量进行静息Ca2+水平的定量。(M)来自对照和HCM iPSC-CM然后通过咖啡因暴露的代表性Ca2+瞬变踪迹。(N)在给予咖啡因之后，AF/FO比率的平均峰幅度，代表了对照(n=23，3个细胞系)和HCM iPSC-CM (n=35, 3个细胞系)的SR Ca2+负荷的释放。*表示HCM对比对照，P < 0.05 表示HCM对比对照，P < 0.01。
[0052] 图33A-E.由正性肌力压力所致的HCM表型的恶化。㈧通过β _激动剂异丙基肾上腺素对对照(η=50，5名患者细胞系)和HCM iPSC-CM(η=50，5名患者细胞系)进行肌力刺激，与对照对应物相比，这加速了 HCM iPSC-CM中的细胞肥大的出现。共同给予β-阻断剂普萘洛尔防止了在HCM iPSC-CM中由20邻苯二酚胺诱导的肥大。(B)在通过异丙基肾上腺素的正性肌力刺激之后，在对照和HCM iPSC-CM中的代表性Ca2+线扫描和波形。黑色箭头表示异常的Ca2+波形。(C)对于通过异丙基肾上腺素处理和普萘洛尔共同给药的处理展现出不规则Ca2+瞬变的对照(n=50，5名患者细胞系)和HCM iPSC-CM(n=50, 5名患者细胞系)的定量。(D)在对照和HCM iPSC-CM中在基线上的自发动作电位和心律失常的电生理测量，然后是通过异丙基肾上腺素的正性肌力刺激。红色箭头表示DAD-样波形。(E)在给予异丙基肾上腺素之后，对照和HCM iPSC-CM中DAD比率的定量(总DAD/总搏动)。*表示HCM对比对照，P < 0.05 表示HCM对比对照，P < 0.001 ；##表示异丙基肾上腺素+普萘洛尔对比异丙基肾上腺素，P < 0.01。
[0053]图34.通过维拉帕米处里HCM iPSC-CM显著减轻了 HCM表型的发展。(A)从心脏分化诱导后25天开始，用0nM、50nM和IOOnM的L-型Ca2+通道阻断剂维拉帕米连续5天处理的HCM iPSC-CM的代表性免疫染色图像。用维拉帕米处理的HCM iPSC-CM的相对细胞大小的定量(n=50，每个处理组5名患者细胞系)。(B)用0nM、50nM和IOOnM的维拉帕米连续5天处理的HCM iPSC-CM的代表性Ca2+线扫描图像和波形。HCM iPSC-CM的百分比的定量展现出在用维拉帕米处理之后，Ca2+瞬变不规则(n=40，每个处理组5名患者细胞系)。(C)用0nM、50nM和IOOnM的维拉帕米连续5天处理的HCM iPSC-CM中，自发动作电位的代表性电生理记录。在用维拉帕米处理之后，对HCM iPSC-CM21中DAD频率的定量(n=25，每个处理组5名患者细胞系)。(D)由MYH7中HCM突变引起的HCM表型的发展的示意图。红色框表示减轻疾病发展的潜在方法。*表示未处理对比50nM维拉帕米处理对比IOOnM维拉帕米处理，P < 0.01。
[0054]结合附图，通过以下详述更好地理解本发明。
【具体实施方式】
[0055]在描述本发明组合物和方法之前，应理解，本发明不限于所述的具体组合物和方法，因为它们当然可能变 化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述【具体实施方式】，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
[0056]提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值，所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
[0057]除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。应理解，出现抵触时，用本发明公开内容代替任何本文所纳出版物的公开内容。
[0058]必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到“重编程因子多肽”包括多种这类多肽，提到“诱导的多能干细胞”包括本领域技术人员已知的一种或多种多能干细胞及其等同物，等等。[0059]提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际
【公开日】期不同，这可能需要单独确认。
[0060]定义
[0061]扩张型心肌病(DCM)是心肌症的一种，心肌症是主要影响心肌膜的一组疾病。在DCM中，心肌膜的部分扩张，通常没有任何明显的病因。心脏的左心室或右心室收缩泵功能被破坏，导致进行性心脏扩大和肥大，这一过程称为重塑。虽然在很多情况中没有明显病因，但是扩张型心肌病能够由多种毒性试剂、代谢试剂或感染试剂引起。大约25-35%的患者以家族形式患有疾病，其中大多数的突变影响编码细胞骨架蛋白的基因，同时一些突变影响参与收缩的其它蛋白质。该疾病具有遗传异质性，但是其传递的最常见形式是常染色体显性模式。涉及DCM的细胞骨架蛋白包括心脏肌钙蛋白Τ(ΤΝΝΤ2)、α -心脏肌动蛋白、结蛋白以及核纤层蛋白A和C和各种其它收缩蛋白。
[0062]肥大型心肌病(HCM)是这样一种病症，其中肌节复制造成心肌细胞的大小增加，这导致心肌细胞的增厚。另外，肌肉细胞的正常排列被打乱，这种现象称为心肌混乱(myocardial disarray)。HCM也造成心脏电学功能的破坏。HCM最常见地归因于9个肌苄基因之一发生突变，该突变导致肌节中的蛋白质突变。肌球蛋白重链突变与家族性肥大型心肌病的发展相关联。肥大型心肌病通常以常染色体显性特征遗传，有关于其在以下基因中突变的报道:心脏肌钙蛋白T(TNNT2);肌球蛋白重链(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亚基Y-2 (PRKAG2) ;3型肌钙蛋白I (TNNI3);肌联蛋白(TTN);肌球蛋白，轻链2(MYL2);肌动蛋白，α心肌I (ACTCl);以及心脏LM蛋白(CSRP3)。在编码血管紧张素转化酶(ACE)的基因中的插入/缺失多态性改变了该疾病的临床表型。 ACE的D/D (缺失/缺失)基因型与更显著的左心室肥大相关联，并且可能与不良结果的较高风险相关联。
[0063]蒽环类抗生素诱导的心脏中毒(和对蒽环类抗生素诱导的毒性的耐受性)。蒽环类抗生素(如多柔比星)是用于治疗白血病、霍奇金淋巴瘤以及乳腺、膀胱、胃、肺、卵巢、甲状腺和肌肉以及其它器官的实体瘤的一线化疗剂。蒽环类抗生素的主要副作用是心脏中毒，对于很多接受采用这种化疗剂的方案的受者而言，其导致严重的心力衰竭。
[0064]心律失常性右心室发育不良(ARVD)。ARVD是心脏桥粒的常染色体显性疾病，其会导致右心室心律失常以及心脏性猝死。这是仅仅排在肥大型心肌病之后的造成年轻人心脏性猝死的第二大主要原因。
[0065]左心室致密化不全(LVNC，又名非致密化心肌病)。LVNC是遗传性心脏病，其由在胚胎发生期间心肌膜(心肌)发育损伤引起。带有导致LVNC的突变的患者在生命的早期发生心力衰竭和有不正常的心脏电生理特性。
[0066]左心室双入口(DILV)。DILV是先天性心脏缺陷，其中左右心房都输送进入左心室。结果是，天生带有这种缺陷的儿童仅仅有一个有功能的心室，并且难于将氧合的血泵送进入全身循环。
[0067]长QT(1型)综合征(LQT-1，KCNQl突变)。长QT综合征(LQT)是遗传性心律失常疾病，其中心电图的QT阶段被延长，导致对心律失常和心脏性猝死的易感性增加。有13种已知的基因与LQT相关。[0068]“多能性”和多能干细胞表示这样的细胞具有分化成生物体中所有类型细胞的能力。术语“诱导的多能干细胞”包括多能细胞，像胚胎干细胞(ES)，所述多能细胞能够长时间培养，并且同时保持分化成生物体中所有类型细胞的能力，但是与ES细胞(ES细胞衍生自胚泡的内细胞群)不同的是，所述多能细胞衍生自经分化的体细胞，即所述多能细胞具有更缩小、更限定的潜力，并且在没有实验操作的情况下不能产生生物体中所有类型的细胞。iPS细胞具有hESC-样的形态，以具有更高细胞核-胞质比、确定的边界和显著细胞核的平板群落生长。另外，iPS细胞能够表达本领域普通技术人员已知的一种或多种关键的多能性标记物，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、0ct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGFl、Dnmt3b、FoxD3、ffl)F3、Cyp26al、TERI^P zfp42。另外，iPS 细胞能够形成畸胎瘤。另外，它们能够形成活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织，或对于形成活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织起作用。
[0069]本文使用“ 重编程因子”是指一种或多种生物活性因子(例如生物活性因子混合物)，其作用在细胞上以改变转录，从而使细胞重编程为多潜能性(multipotency)或多能性(pluripotency)细胞。可以向细胞提供重编程因子，所述细胞例如来自具有感兴趣心脏病的家族史或遗传组成的个体的细胞，例如成纤维细胞、脂肪细胞等，该因子能够单独提供或以重编程因子的单一组合物(即预先混合的组合物)来提供。可以相同的摩尔比或不同的摩尔比来提供该因子。可以在培养本发明的细胞的过程中一次或多次提供该因子。在一些实施方式中，重编程因子是转录因子，包括但不限于0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin-28o
[0070]如上所述使体细胞与重编程因子接触，所述重编程因子以组合形式提供，并且其量足以使所述细胞重编程为多能性细胞。可向体细胞提供单独的或单一组合物(即重编程因子的预混组合物)形式的重编程因子。在一些实施方式中，以载体上的多种编码序列的形式提供重编程因子。
[0071]可以为了多种目的向体细胞或体细胞衍生的iPS细胞中导入基因，例如为了取代具有功能缺失突变的基因、提供标记基因等。或者，可引入表达反义mRNA或核酶的载体，从而阻断不需要的基因的表达。基因治疗的其他方法是引入药物抗性基因以使正常祖细胞具有优势并经受选择压力，所述药物抗性基因例如多重耐药基因(MDR)或抗凋亡基因如bcl-2。本领域已知的各种技术可用于将核酸引入靶细胞，所述技术例如上述的电穿孔、钙沉淀DNA、融合、转染、脂质体转染、感染等。DNA引入的具体方法对实施本发明不重要。
[0072]iPS细胞分化为心肌细胞。对骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的抑制可能导致心脏肌细胞(或心肌细胞)的产生，例如，参见Yuasa等，(2005), Nat.Biotechnol.,23(5): 607-11。因此，在一个示例性实施方式中，在允许形成胚体之前，在头蛋白存在的情况下培养诱导的细胞约2天-约6天，例如约2天、约3天、约4天、约5天或约6天，并且培养胚体约I周-约4周，例如，约I周、约2周、约3周或约4周。
[0073]能够通过在培养基中包含心性剂(cardiotropic agent)来促进心肌细胞分化，所述心性剂如活化素A和/或骨形态发生蛋白-4(参见本文实施例，Xu等，RegenMed.2011 年 I 月；6 (I): 53-66 ;Mignone 等，Circ J.201074(12): 2517-26 ;Takei 等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.2009296(6): H1793-803，所述各文献皆通过引用明确纳入本文)。此类方案的例子还包括，例如可任选地在细胞因子(如BMP4、VEGF和活化素A)存在的情况下加入Wnt激动剂，如Wnt3A ;然后在Wnt拮抗剂(如可溶的卷曲蛋白)存在的情况下培养。然而，可以使用任意合适的诱导心肌细胞分化的方法，例如Fujiwara等，PLoS One.20116(2): el6734 ;Dambrot 等，Biochem J.2011434(1): 25-35 所述的环孢菌素A ;Foldes等，J Mol Cell Cardiol.201150(2): 367-76所述的等轴周期性拉伸(equiaxial cyclic stretch)、血管紧张素 II 和苯肾上腺素(PE) ;Wang 等，Sci ChinaLife Sc1.201053(5): 581-9所述的抗坏血酸、二甲亚砜和5-氮杂-2'-脱氧胞苷，Chen等，J Cell Biochem.2010111(1): 29-39所述的内皮细胞等，所述各文献皆通过引用明确纳入本文。
[0074]在合适的发育阶段收获细胞，这可以根据标记物的表达和需要的细胞类型的表型特征来确定，例如约1-4周。可以通过对感兴趣的标志物的存在进行染色、通过形态学测定来实验性地测试培养物。可任选地在通过药物选择、淘选、密度梯度离心等的正选择步骤之前或之后富集细胞。在另一个实施方式中，实施负选择，其中所述选择基于ES细胞、成纤维细胞、表皮细胞等上发现的一种或多种标志物的表达。选择可以采用淘选方法、磁性颗粒选择、颗粒分选选择等。
[0075]心肌细胞。在哺乳动物心脏发育中出现的心肌细胞的表型能够分为:原代心肌细胞、节点心肌细胞(nodal cardiomyocyte)、传导心肌细胞(conducting cardiomyocyte)和工作心肌细胞。使所有具有肌节和肌浆网(SR)的心肌细胞通过间隙连接偶联并且展现出自律性。原始心管(heart tube)的细胞的特征为高度自律性、低传导速度、低收缩性和低SR活性。这种表型主要在节点细胞中持续存在。相反，心房和心室的工作心肌细胞实际上没有展现出自律性，并且在细胞间良好偶联，具有良好发育的肌节并且具有高SR活性。来自房室束、束支和外周心室传导系统的传导细胞具有发育不良的肌节、低SR活性，但是细胞良好偶联并且展现出高自律性。
[0076]对于a -Mhc, β -Mhc和心脏肌钙蛋白I以及慢骨骼肌肌钙蛋白I，在分化的ES细胞培养中已经观察到发育转变。通常使用Mlc2v和Anf的表达来分别划分ES细胞培养中的心室样细胞和心房样细胞，虽然在ESDC中，Anf表达并不能排他性地鉴定心房心肌细胞，并且可以用作工作心肌细胞的通用标记物。
[0077]“心肌细胞前体”被定义为能够产生后代的细胞，所述后代包含心肌细胞。
[0078]除了用作在体外培养的细胞的各种用途以外，可以在合适的动物模型中测试心肌细胞。在一个水平上，评估细胞在体内存活和维持它们的表型的能力。向免疫缺陷的动物(如裸小鼠，或化学产生或通过辐射产生的免疫缺陷动物)给予细胞组合物。在一段时间的再生长之后收获组织，并且评估经给予的细胞或其后代是否还存在，并且可以根据对于感兴趣处理的反应来进行表型分析。也能够通过评估用本发明分化细胞处理之后的心脏恢复程度来确定在动物模型中的适宜性。能够得到多种动物模型以用于此类测试。例如，能够通过将预先冷却的铝棒与前左心室壁的表面接触来冷冻损伤心脏(Murry等，J.Clin.1nvest.98: 2209，1996 ;Reinecke 等，CirculationlOO: 193，1999 ;美国专利号6，099，832)。在大型动物中，能够通过将液体N2中冷却的30_50mm铜盘探针放置在左心室前壁上约20分钟来施加冷冻损伤(Chiu等,Ann.Thorac.Surg.60: 12,1995)。能够通过绑扎左冠状动脉主干来诱导梗塞(Li等，J.Clin.1nvest.100: 1991,1997)。用本发明的细胞制剂来处理受伤处，并且通过在损伤区域中细胞的存在的组织学分析来检测心脏组织。能够通过测定参数(如左心室末端舒张压、发展压、压力升高速率、压力降低速率等)来监测心脏功能。
[0079]本文所用术语“疗法”、“治疗”、“处理”等通常指获得所需的药理学和/或生理学作用。从完全或部分防止疾病或其症状方面来说，这种作用可以是预防性的，和/或从部分或完全稳定或治愈疾病和/或由该疾病产生的不良影响来说，这种作用可以是治疗性的。本文所用术语“治疗”包括在哺乳动物(特别是人)中进行的任何疾病治疗，包括:(a)在可能易患该疾病或症状但尚未诊断患有的对象中防止该疾病或症状的发生；(b)抑制所述疾病症状，即阻滞其发展；或(C)缓解所述疾病症状，即引起该疾病或症状消退。
[0080]术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中互换使用，指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象，尤其是人。
[0081]发明方法
[0082]提供了获得和应用疾病相关心肌细胞的体外细胞培养物的方法，其中如上所述，从包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因的诱导性人多能干细胞(iPS细胞)分化心肌细胞。感兴趣的特定突变包括但不限于:MYH7R663H突变，TNNT2R173W ；PKP22013delC突变；PKP2Q617X突变JPKCNQ1G269S错义突变。在一些实施方式中，提供了一组这样的心肌细胞，其中该组包括两种或更多种不同的疾病相关性心肌细胞。在一些实施方式中，提供了一组这样的心肌细胞，其中该心肌细胞经受多种候选试剂，或候选试剂的多个剂量。候选试剂包括小分子，例如增加或减少感兴趣的RNA表达、电学变化等的药物、基因构建体。
[0083]提供了用于测定候选试剂对疾病相关心肌细胞的活性的方法，该方法包括:使候选试剂与一种或一组分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞接触，所述多能干细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因；和测定该试剂对于形态学参数、遗传参数或功能参数的影响，所述参数包括但不限于:钙瞬变幅度、细胞内Ca2+水平、细胞尺寸收缩力的产生、搏动速率、肌节α -辅肌动蛋白分布和基因表达谱。
[0084]在所述疾病是DCM的情况中，可以在与候选试剂接触之前、之中或之后通过正性肌力压力(如β_肾上腺素激动剂)来刺激心肌细胞。在一些实施方式中，所述β_肾上腺素激动剂是去甲肾上腺素。本文显示DMC心肌细胞具有响应正性肌力压力的初始正性变时作用，其之后变成以衰竭为特征的负性作用，所述衰竭特征如搏动速率减小，收缩减弱和具有异常肌节α-辅肌动蛋白分布的细胞显著增多。β_肾上腺素阻断剂处理和肌浆网Ca2+ATP酶(Serca2a)的过表达改善所述功能。DCM心肌细胞也可以用通路中的遗传物质来测试，所述遗传物质包括促进心脏发生的因子、整联蛋白和细胞骨架信号传导以及泛素化通路，如表8所示。相比相同家族组群中的对照健康个体，DCM心肌细胞展现出减小的钙瞬变幅度、减弱的收缩和异常肌节α-辅肌动蛋白分布。
[0085]在所述疾病是HCM的情况中，可以在与候选试剂接触前、中或后通过正性肌力压力(如肾上 腺素激动剂)来刺激心肌细胞。在种情况下，HCM心肌细胞展现出较高的肥大反应，这能够通过肾上腺素阻断剂来逆转。相比健康个体，HCM心肌细胞展现出细胞大小增大和HCM相关基因的上调，以及较不规律的收缩(以不完全搏动为特征)，包括较高频率的异常Ca2+瞬变(以次级不完全瞬变(secondary immature transient)为特征)。这些心肌细胞的细胞内Ca2+水平升高，并且在一些实施方式中，靶向钙依赖磷酸酶或其它与钙粘附相关靶标的候选试剂。[0086]在用于小分子的筛选试验中，用一组细胞和细胞环境来测试向培养中的细胞添加候选试剂的效果，其中所述细胞环境包括以下的一种或多种:包括电离度改变的电刺激、药物刺激等，并且其中细胞组可以在基因型方面、在预先暴露于感兴趣环境方面、在提供的试剂剂量方面不同，其中通常包含至少一个对照，例如阴性对照和阳性对照。通常在无菌环境中实施细胞的培养，例如，在37°C下在含有92-95%湿润空气/5-8% CO2气氛的培养箱中。可以在含有非限定生物液体(如胎牛血清)的营养混合物中，或在完全限定且不含血清的培养基中进行细胞培养。环境变化的影响通过监测多个输出参数(包括形态学变化、功能变化和遗传变化)来评估。
[0087]在遗传物质的筛选试验中，向组中的一种或多种细胞添加多核苷酸来改变所述细胞的遗传组成。监测输出参数来确定表型是否变化。通过这种方式，鉴定编码感兴趣通路中的蛋白质或影响所述蛋白质表达的遗传序列。可将所得结果输入数据处理器中一得到筛选结果数据库。使用算法来比较和分析在不同条件下得到的筛选结果。
[0088]用于分析的方法包括钙成像法，其中用合适染料处理细胞，并且在感兴趣的条件下使细胞暴露于钙，并用例如共焦显微镜来成像。可以对Ca2+反应定量，并且然后针对连续Ca2+瞬变节律的不规则性和每次瞬变中总Ca2+流入来分析时间依赖性的Ca2+反应。通过对各波之下相对于基线的面积进行积分来测定每次瞬变中的总Ca2+释放。
[0089]能够使用原子力显微镜(AFM)来测量收缩力。通过AFM使用悬臂来研究搏动细胞。为了测量力，用悬臂尖端轻触细胞，然后使悬臂尖端保持在位置上供于间隔，同时收集偏离数据。能够计算力、搏动之间的间隔和各细胞每次收缩的时程的统计数据。
[0090]还能够通过微电极阵列(MEA)来分析细胞，其中将搏动心肌细胞置于MEA探针上，并且测量和确定场电位 时程(FPD)来提供电生理参数。
[0091]人们对单细胞水平的分析方法特别感兴趣，例如上述的:原子力显微镜、微电极阵列记录、膜片钳、单细胞PCR、钙成像和流式细胞术等。
[0092]参数是高通量系统中细胞的可理想地定量的组分，尤其是可精确测量的组分。参数也能够是任何细胞组分或细胞产物，包括细胞表面决定簇、受体、蛋白质或者其构象或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、核酸(如mRNA、DNA等)、或源自此类细胞组分的部分或其组合。虽然大多数参数会提供定量读数，在一些情况中可接受半定量或定性结果。读数可包括单一确定值，或可包括均值、中值或方差等。预期会有差异，因而使用用于提供单一值的常见统计方法的标准统计方法获得各组测试参数的数值范围。
[0093]感兴趣的参数包括胞质、细胞表面或分泌的生物分子、常见生物聚合物例如多肽、多糖、多核苷酸、脂质等的检测。细胞表面和分泌的分子是优选的参数类型，这是因为这些分子介导细胞通讯和细胞效应物反应并且能够更易于测定。在一个实施方式中，参数包括特定表位。通常使用特异性单克隆抗体或受体探针来鉴定表位。在一些情况下，包含表位的分子实体来自两种或更多种物质并且包含确定的结构；例子包括与异二聚体整联蛋白相关的组合决定表位。参数可以是对特定修饰的蛋白质或寡糖的检测。可以通过特异性单克隆抗体或配体或受体结合决定簇来限定参数。
[0094]感兴趣的候选试剂是生物活性试剂，其涵盖许多化学种类，主要是有机分子，其可包括有机金属分子、无机分子、遗传序列等。本发明的一个重要方面是以优选的生物反应功能来评价候选药物、选择治疗性抗体和基于蛋白质的疗法。候选试剂包含与蛋白质发生结构相互作用(特别是形成氢键)的必要官能团，且通常至少包含至少一个胺、羰基、羟基或羧基基团，常常包含至少两种化学官能团。所述候选试剂常包含环状碳或杂环结构，和/或用一个或多个上述官能团取代的芳香结构或多芳香结构。候选试剂也可以选自生物分子，包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶，其衍生物、结构类似物或组合。
[0095]包括药学上的活性药物、遗传活性分子等。感兴趣的化合物包括化疗剂、消炎剂、激素或激素拮抗剂、离子通道改性剂和神经活性剂。适于本发明的药剂示例是在“《治疗的药理学基础》(The Pharmacological Basis ofTherapeutics) ”(Goodman 和 Gilman,麦格劳希尔公司(McGraw-Hill),纽约州纽约，(1996)第9版)中，以下章节中所述的那些:在突触和神经效应器连接位点的药物作用；心血管药物；维生素，皮肤病学；以及毒理学，其全文通过引用纳入本文。
[0096]测试的化合物包括上述分子的所述类型，并且可能还包含未知含量的样品。感兴趣的是源自天然来源(如植物)的天然产生的化合物的复杂混合物。虽然很多样品会包含溶液中的化合物，但是也可以测试能够在合适溶剂中溶解的固体样品。感兴趣的样品包括环境样品，例如地下水、海水、采矿废水等；生物样品，例如来自作物、组织样品的裂解物等；制造样品，例如在药品制备中的时程；以及制备以供分析的化合物文库等。感兴趣的样品包括评估潜在治疗价值的化合物，例如药物候选物。
[0097]术语样品也包括上述的已经添加额外组分的流体，所述组分例如影响离子强度、pH、总蛋白浓度等的组分。另外，可以处理样品来实现至少部分分馏或浓缩。如果要减少(如在氮气下、冷冻或其组合条件下)的化合物降解，可以保存生物样品。使用的样品的体积足够允许进行可测量的检测，通常约0.1: 1-1ml的生物样品是足够的。
[0098]可从多种来源(包括合成或天然化合物文库)来获得化合物，包括候选试剂。例如，可用许多方法随机和 定向合成包括生物分子在内的各种有机化合物，所述方法包括表达随机寡核苷酸和寡肽。或者，在氮气下、冷冻或其组合条件下细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。此外，天然或合成产生的文库和化合物容易通过常规的化学、物理和生化方法修饰，且可用于生产组合文库。已知的药剂可进行定向或随机的化学修饰如酰化、烷化、酯化、胺化等以产生结构类似物。
[0099]本文使用的术语“遗传物质”是指多核苷酸或其类似物，通过向细胞加入遗传物质以在本发明的筛选试验中测试该试剂。遗传物质的引入导致细胞的总遗传组成的变化。遗传物质(诸如DNA)可导致在细胞的基因组中实验性引入变化，所述变化通常通过将序列整合进入染色体中而发生。遗传变化也可以是暂时的，其中外源序列未被整合而是保持为附加体。遗传物质(如反义寡核苷酸)也能够通过mRNA的转录或反义来干扰蛋白质的表达而不改变细胞的基因型。遗传物质的影响是增加或减少细胞中一种或多种基因产物的表达。
[0100]能够采用引入编码多肽的表达载体以在缺少该序列的细胞中表达编码的产物，或过表达该产物。能够使用组成型或受外部调节的各种启动子，在受外部调节的情况中，能够打开或关闭基因的转录。这些编码序列可以全长的CDNA或基因组克隆、其衍生的片段或使天然产生序列与其它编码序列的功能性或结构性结构域结合的嵌合体。另外，引入的序列可以编码反义序列；可以是反义寡核苷酸；RNAi，编码天然序列的显性阴性突变，或显性或组成性活性突变；改变的调节序列等。
[0101]能够通过本领域已知的方法化学合成反义和RNAi寡核苷酸。优选的寡核苷酸从天然磷酸二酯结构中化学修饰，从而增加其细胞内稳定性和结合亲和性。已在文献中描述了一些此类修饰，所述修饰改变主链、糖或杂环碱基的化学性质。主链化学性质中的有用改变为硫代磷酸酯；两个非桥连氧都用硫取代的二硫代磷酸酯；亚磷酰胺；烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯。非手性磷酸酯衍生物包括3' -O' -5' -S-硫代磷酸酯、3' -S-5, -O-硫代磷酸酯、3^ -CH2-5' -O-膦酸酯和3' -NH-5' -O-氨基磷酸酯。肽核酸用肽键替代完整核糖磷酸二酯主链。还使用糖修饰来增强稳定性和亲和性，例如吗啉代寡核苷酸类似物。可使用脱氧核醣的-端基异构体，其中碱基相对天然的-端基异构体倒转。可改变核糖的2，-OH以形成2' -O-甲基或2' -O-烯丙基糖，其提供对降解的抗性而不影响亲和性。
[0102]在一种或多种环境条件下，通过向至少一种细胞并且通常向多种细胞中添加试剂，从而根据生物活性来筛选试剂，所述条件例如在用β-肾上腺素激动剂刺激之后、在电学刺激或机械刺激之后等。对响应试剂的参数读出值的变化进行测量，依照所需进行标准化，并且然后通过与参比筛选结果比较来评估所得的筛选结果，所述参比筛选结果例如具有感兴趣的其它突变的细胞、正常心肌细胞、源自其它家族成员的心肌细胞等。所述参比筛选结果可以包括在不同环境变化存在或不存在下的读出值、用其它试剂得到的筛选结果，其可以包括或不包括已知的药物等。
[0103]所述试剂可在溶液中或以易溶解的形式方便地添加到培养的细胞培养基中。所述试剂可作为间歇或连续的流加入到流通式系统中，或者将一团化合物单一或递增地加入静态溶液中。在流通式系统中，使用两种流体，其中一种是生理中性溶液，另一种是与添加测试化合物相同的溶液。第一种流体通过细胞，然后是第二种。在单一溶液方法中，向细胞周围的培养基体积中添加测试化合物团。所述团块添加后或流通式方法中的两种溶液之间，培养基组分的总浓度不应发 生显著变化。
[0104]优选的试剂制剂不包含可能对整体制剂有显著影响的其他组分，如防腐剂。因此优选的制剂基本由生物活性化合物和生理学上可接受的运载体(如水、乙醇、DMSO等)组成。然而，如果化合物是不含溶剂的液体，制剂可以基本由化合物本身组成。
[0105]用不同的试剂浓度平行进行多种试验，以获得对不同浓度的差异反应。如本领域所知，测定试剂的有效浓度通常使用的浓度范围来自1: 10或其它对数级别的稀释液。如需要，所述浓度还可用第二稀释系列来细化。通常，这些浓度之一用作阴性对照，如零浓度或低于试剂检测水平或者处于或低于不产生可检测的表型变化的试剂浓度。
[0106]能够采用各种方法来对除上述功能性参数以外的所选的参数的存在定量。对于存在的分子的量的检测而言，方便的方法是用可检测部分来标记分子，所述可检测部分可以是荧光的、发光的、放射性的、酶活性的部分等，尤其是以高亲和力结合所述参数的特异性分子。荧光部分易于标记几乎任意的生物分子、结构或细胞类型。免疫荧光部分不仅能导向性地结合特定蛋白质，还能导向性地结合特定构象、切割产物或位点修饰(诸如磷酸化)。可将单独的肽和蛋白质工程改造为自发荧光，例如通过在细胞内将它们表达为绿色荧光蛋白嵌合体(综述可参见 Jones 等，(1999) Trends Biotechnol.17 (12): 477-81)。因此,能够遗传修饰抗体来提供作为其结构的部分的荧光染料。
[0107]根据选择的标签，可以使用除了荧光标签以外的方式来测量参数，所述方式例如免疫试验技术如放射性免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)、均相酶免疫试验和相关的非酶技术。这些技术采用特异性抗体作为报告分子，由于其与单个分子靶标连接的高度特异性，它们特别有用。美国专利号4，568，649描述了采用闪烁计数的配体检测系统。这些技术对蛋白质或修饰的蛋白质参数或表位或糖决定簇特别有用。能够使用荧光或另外加标签的报告分子来得到蛋白质和其它细胞决定子的细胞读出值。基于细胞的ELISA或相关的非酶促方法或基于荧光的方法使得能够测量细胞表面参数和分泌参数。捕获ELISA和相关非酶促方法通常采用两种特异性抗体或报告分子，并且可用于测量溶液中的参数。流式细胞术方法可用于测量细胞表面和细胞内的参数，以及形状变化和粒度，并且可用于分析用作抗体连接试剂或探针连接试剂的珠。来自此类试验的读出值可以是与单一荧光抗体检测的细胞表面分子或细胞因子相关的平均荧光，或平均荧光强度、中值荧光强度、荧光强度的方差或其之间的一些关系。
[0108]在本领域中使用单细胞多参数和多细胞多参数的多重试验，其中通过对定量的成像、荧光和共聚焦显微镜来鉴定输入的细胞类型并读取参数，见《共聚焦显微镜方法和方案》(Confocal Microscopy Methods and Protocols),(分子生物学方法第 122 卷)，Paddock编，胡马纳(Humana)出版公司，1998。这些方法在1999年11月23日授予的美国专利号5，989，833中描述。
[0109]核酸(尤其是信使RNA)的定量也是人们感兴趣的参数。这些可以通过根据核酸核苷酸的序列的杂交技术来测量。技术包括聚合酶链反应方法和基因阵列技术。参见例如，Ausubel等编的《分子生物学试验指南》(Current Protocols in MolecularBiology),约翰韦利森公司(John Wiley&Sons),纽约州纽约，2000 ;Freeman 等，(1999)Biotechniques26(l): 112-225 ;Kawamoto 等，(1999)Genome Res9(12): 1305-12 ;和Chen 等，(1998)Genomics51(3): 313-24。
[0110]通过使用合适的推断方法(deduction protocol)、Al系统、统计学比较等完成从测试化合物得到的筛选结果与参比筛选结果的比较。优选地，使筛选结果与参比筛选结果的数据库作比较。能够汇编参比筛选结果的数据库。这些数据库可以包括来自含有已知试剂或试剂组合的组的参比结果，以及来自对在环境条件下处理的细胞进行分析的参比，在该环境条件下，去除或特定改变了单一或多重环境条件或参数。参比结果也可以产生自含有基因构建物的细胞的组，所述基因构建物特异性靶向或调控特定细胞通路。
[0111]读出值可以是平均、均值、中值或方差或其他与测量相关的统计学或数学数值。参数读出值信息还可以通过与相应的参比读出值的直接比较来改善。在相同条件下得带的各参数的绝对值会展现出活生物系统中固有的差异并且也反映了个体细胞差异和个体之间的固有差异。
[0112]方便起见，本发明的系统可以试剂盒形式提供。该试剂盒可以包括待使用的细胞，用于测量参数的试剂和用于制得筛选结果的软件，所述细胞可以经冷冻、经冷藏或以一些其它方式处理以维持活性。所述软件会接收结果并进行分析，并且能够包括参比数据。所述软件还能使结果针对来自对照培养物的结果进行标准化。所述组合物可任选地被包装在合适容器中，所述容器具有针对所需目的(如筛选方法等)的书面说明书。
[0113]为了进一步详述本发明的实践中有用的一般技术，操作人员能够参考标准教科书并且回顾细胞生物学、组织培养、胚胎学和心血管生理学。对于组织培养和胚胎干细胞，读者可以希望参考《畸胎癌和胚胎干细胞:实践方法》(Teratocarcinomas and embryonicstem cells:A practical approach) (E.J.Robertson 编,IRL 出版有限公司，1987);《小鼠发育技术指南》(Guide to Techniques in Mouse Development) (P.M.Wasserman 等编，学术出版社，1993);胚胎干细胞体外分化(Embryonic Stem Cell Differentiation inVitro) (Μ.V.Wiles,Meth.Enzymol.225: 900,1993);胚胎干细胞的性质和应用:应用于人生物学和基因治疗的前景(Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospectsfor Application to Human Biology and Gene Therapy) (P.D.Rathjen 等，Reprod.Fertil.Dev.10: 31，1998)。对于心脏细胞培养，标准参考文献包括《培养中的心脏细胞》(The Heart Cell in Culture) (A.Pinson编，CRC出版社，1987),《分离的成人心肌细胞》(Isolated Adult Cardiomyocytes)(卷 I 和 II,Piper 和 Isenberg 编，CRC 出版社，1989)，《心脏发育》(Heart Development) (Harvey 和 Rosenthal,学术出版社，1998)。
[0114]分子和细胞生物化学中的一般方法可在下列标准教科书中找到:如《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第三版(Sambrook 等，港实验室出版社，2001);《分子生物学简明实验方案》(Short Protocols in MolecularBiology),第4版(Ausubel等编,约翰韦利森公司，1999);《蛋白方法》(Protein Methods)(Bollag等，约翰韦利森公司，1996);《基因治疗的非病毒载体》(Nonviral Vectors forGene Therapy) (Wagner 等编，学术出版社，1999);《病毒载体》(Viral Vectors) (Kaplift和Loewy编，学术出版社，1995)；《免疫学方法手册》(Immunology Methods Manual)(1.Lefkovits编，学术出版社，1997);和《细胞和组织培养:生物技术中的实验室方法》(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology) (Doyle 和Griffiths，约翰韦利森公司，1998)。本公开中提及的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可购自商品供应商，如伯乐公司(BioRad)、斯查塔基公司(Stratagene)、英杰公司(Invitrogen)、西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)和克隆泰克公司(Clontech)。
[0115]在说明书中引用的各出版物在此通过引用全文纳入本文用于全部目的。
[0116]应理解本发明不限于所述特定方法、方案、细胞系、动物种或属以及试剂，因为这些可能会有变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是为了描述【具体实施方式】，不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
[0117]如本文中所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代形式，除非文中另有明确说明。因此，例如，提到“一个细胞”包括多个这样的细胞，提到“培养”包括本领域技术人员已知的一种或多种培养及其等同物，等等。除非另有明确说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。
[0118]提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不意在限制发明人认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有或仅有的实验。努力保证所用数值(如量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重量均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
[0119]实施例
[0120]实施例1
[0121] 扩张型心肌病(DCM)是最常见的心肌病，其特征为心室扩张、收缩障碍和进行性心力衰竭。DCM是导致心脏移植的最常见诊断结论，并且对全世界的健康护理施加大量负担。在此我们从源自DCM家族患者的iPSC产生心肌细胞(CM)，所述DCM家族患者在编码肌节蛋白心脏肌钙蛋白T的基因中携带点突变(R173W)。相比在相同家族组中的对照健康个体，DCM iPSC-CM展现出钙瞬变幅度减小、收缩减弱和异常肌节α-辅肌动蛋白分布。当用肾上腺素激动剂刺激时，DCM iPSC-CM显示出衰竭的特征，如搏动速率减小、收缩减弱和具有异常肌节α-辅肌动蛋白分布的细胞明显增多。β_肾上腺素阻断剂处理和肌浆网Ca2+ATP酶(Serca2a)的过表达改善了 DCM iPSC_CM的功能。我们的研究证明人DCMiPSC-CM概括了疾病的形态和功能上的表型，因此作为探索分子和细胞机制以及优化该特定疾病的治疗的有用平台。
[0122]我们募集了来自DCM先证者的7个个体的组群，所述DCM先证者在TNNT2基因的外显子12上携带常染色体显性点突变，这导致在蛋白CTnT中氨基酸位置173处的精氨酸(R)突变成色氨酸(W)。通过对17种原发性DCM相关基因的组进行遗传筛选(表1)和遗传共分离研究(表2)确证该特定点突变的DCM致病作用。据报道，在完全独立的比利时家族中也有这个突变。这7个募集的个体涵盖了 3代人(1、11和III)(图la)。通过PCR扩增TNNT2的基因组基因座和DNA测序证明了 4名患者(Ia、IIa、IIb和IIIa)在两个等位基因中的一个上携带TNNT2 R173W突变，而确证其他3个个体(lb、IIc和IIIb)为正常个体并且用作后续研究的对照(图1b)。所有4名携带特定R173W突变的患者显示左心室扩张和射血分数降低的临床DCM症状，并且被医学治疗(表2)。一名14岁的疾病患者(IIIa)由于具有严重的临床症状而接受了原位心脏移植。通过对该特定患者IIIa采用32种最新DCM相关基因的组的外显子组测序的进一步遗传筛选没有发现与所述疾病相关联的任何其它额外的变体(表3)。
[0123]为了产生所述7个个体的患者特异性iPSC，从取自每个个体的皮肤活检中扩增皮肤成纤维细胞(图1c),并且在无饲养层条件下用慢病毒Yamanaka 4因子(0ct4、Sox2、Klf4和c-MYC)使所述细胞重编程。挑取TRA-1-60+染色且具有人胚胎干细胞(hESC)样形态的集落(图1d和Ie)，对其扩增并建立成个体iPSC细胞系。对于每个个体，建立3-4个iPSC细胞系用于后续分 析。通过基因组PCR和DNA测序确证所有的DCM iPSC细胞系都含有特定的R173W突变(图5)。所有建立的iPSC细胞系都表达多能性标志物0ct4、Nanog,TRA-1-81和SSEA-4，并且呈碱性磷酸酶阳性(图1f)。微阵列分析表明这些iPSC细胞系与亲本皮肤成纤维细胞不同，其表达与hESC更相似的全基因模式(图6)。定量亚硫酸氢盐测序显示在所有测试的iPSC细胞系中，0ct4和Nanog的启动子区域被低甲基化，这表明多能基因的活性转录(图1g)。在扩增传代之后，已经建立的iPSC细胞系维持正常的核型(图7)，并且它们中的大多数显示外源转基因的沉默和内源Nanog的再表达(图8)。后续研究除去了具有不完全转基因沉默的iPSC细胞系。这些患者特异性iPSC能够在体外分化成所有三种胚层的细胞(图9)，并且在注射进入免疫缺陷小鼠的肾小囊之后形成畸胎瘤(图1h)。
[0124]我们之后用成熟建立的3D分化方案使DCM iPSC分化成心血管谱系，该方案由Yang，L.等开发，发育自KDR+胚胎干细胞源性群的人心血管祖细胞(Humancardiovascular progenitor cells develop from a KDR+embryonic-stem-cell-derivedpopulation).Nature453，524-528 (2008)。选择来自每个个体的两种iPSC细胞系来分化成自发搏动拟胚体(EB)。早在分化后第8天就观察到自发搏动。向心脏谱系分化的效率在不同细胞系之间不同(图10)。衍生自对照和患者iPSC的搏动EB含有约50-60% cTnT阳性CM(图11)。衍生自3名DCM患者的3个iPSC克隆的搏动EB的等位基因特异性PCR表明野生型和突变体(R173W)TNNT2基因的双等位表达(图12)。将来自对照iPSC和DCM iPSC的搏动EB接种在多重电极阵列(MEA)探针上(图13a)，并且记录它们的电生理学性质(图13b)。对照(η = 45)和DCM(n = 57) iPSC-衍生的搏动EB都显示在基线上搏动频率、场电位、峰电位间隔和场电位时程(FPD)相当(表4和图13c)。
[0125]我们之后将搏动EB分离为小搏动簇(beating cluster)以及单个搏动CM，以供进一步分析。对对照(η = 24)和DCM(η = 24) iPSC-CM采用微流体技术进行的单细胞PCR分析表明所选心脏相关转录因子、肌节蛋白和离子通道的基因表达没有显著差异(图14)。我们下一步通过免疫细胞化学法来评估iPSC-CM中肌原纤维的组织。对照和DCM iPSC-CM都表达肌节蛋白cTnT、肌节α -辅肌动蛋白和肌球蛋白轻链2a(MLC2a)，以及心脏标志物间隙连接蛋白43 (图15)。然而，相比在分化后第30天的对照iPSC-CM (η = 368)，明显较高百分比的DCMiPSC-CM(η = 391)显示出在多于四分之一的总细胞面积上有肌节α -辅肌动蛋白的点状分布(P=0.008)(图2a、2b和图16)。在这一阶段，对照和DCM iPSC-CM之间没有显著的细胞尺寸差异(图2c)。在各来自4名DCM患者的两种不同的DCM iPSC细胞系中一致观察到该现象，表明与疾病致病R173W突变的同质相关性。显然，具有点状肌节α-辅肌动蛋白分布的CM的大多数是在搏动簇周围的单个或多个细胞。肌节α-辅肌动蛋白是肌节完整性和肌节变性的极好标志物。这些结果也表明个体DCM iPSC-CM具有在维持肌节完整性中发生故障的较高倾向。
[0126]正性肌力压力能够在DCM的转基因小鼠模型中诱导DCM表型，并且使临床患者疾病恶化。我们之后检测采用正性肌力压力试剂(如β_肾上腺素激动剂)的处理是否能够加快DCM iPSC-CM的表型反应。实际上，如MEA记录所显示，采用ΙΟμΜ的去甲肾上腺素(NE)处理诱导了正性变时作用，其之后变为负性作用，最终导致DCM iPSC-衍生的搏动EB(η = 14)中自发收缩的失败。相反,对照iPSC-衍生的搏动EB(n = 14)展现出延长的正性变时活性(图2d)。 一周的NE处理显著增加了来自DCM iPSC克隆的，具有肌节α -辅肌动蛋自分布的CM的数量，并且发现几乎90%的DCM iPSC-CM具有混乱的肌节图案(图2f、2g、图17和图18)。在延长的NE处理之后，一些单个DCM iPSC-CM显示肌丝的完全变性，而在对照细胞中没有观察到这种情况。追踪用由NE处理的对照和DCM iPSC-CM的单个搏动簇随时间的视频成像显示出不同的结果。在DCM iPSC-CM中而不是在对照iPSC-CM中观察到降低的肌力活性和变时活性(图2e，图2h)。单细胞PCR分析也揭示了在NE处理之后，在DCM (η = 16)与对照iPSC-CM (η = 16)中不同的基因表达变化(图19)。这些结果表明β -肾上腺素刺激加剧了 DCM iPSC-CM表型。
[0127]如膜动作电位(AP)所显示，CM收缩从肌细胞的电激发开始。为了研究DCM的可能的潜在机制，我们评估了在cTnT中DCM-相连的R173W突变是否影响CM的电激发。我们通过膜片钳检测了分离的单个搏动iPSC-CM的电活性。在对照和DCM iPSC-CM中观察到三种类型的自发AP(心室样、心房样和节点样)(图20a)。DCM心室肌细胞(η = 17)展示出与对照(η = 18)相当的正常AP (图20b)。DCM iPSC-CM的90%复极化(APD90)的平均动作电位持续时间与对照iPSC-CM中看到的没有显著差异(图20c)。两组之间的平均AP频率、峰幅度和静息电位也非常相似(图20d、20e和20f)。这些结果表明对照和DCM iPSC-CM在基线的电激发活性是正常的。[0128]为了进一步研究潜在的DCM发病机理，我们通过荧光Ca2+成像检测了在激发_收缩偶联水平上的Ca2+处理性能。DCM iPSC-CM (η = 40)展示出与对照iPSC-CM (η = 87)相当的全[Cali瞬变的节律性频率、节律和幅度(图3a、3b、3c、3e和3f)。然而，与对照iPSC-CM(p=0.002)相比，DCM iPSC-CM展现出明显较小的[Ca2Ii瞬变幅度(图3d)，表明对于DCM iPSC-CM的每次收缩可用的[Cali明显较低。在所有检测的衍生自4名DCM患者的DCM iPSC细胞系中，一致观察到CM的较小的[Ca2+] i瞬变，表明在DCM iPSC-CM中产生较弱的力。
[0129]收缩力产生中的缺陷是诱导DCM和心力衰竭的最重要的机制之一。为了进一步研究，我们下一步使用原子力显微镜(AFM)来测量iPSC-CM的收缩力，所述原子力显微镜已经用于检测培养的鸡胚胎CM。AFM允许我们在单细胞水平上探测收缩性质(图21)。与单一对照iPSC-CM (η = 13)相比，DCM iPSC-CM (η = 17)显示出相似的搏动频率和持续时间，但是收缩力明显较弱(图4c、4d、图22和表5)。经AFM检测，在来自每个单一细胞的细胞尺寸和收缩力之间没有相关性(图23)。
[0130]先前一种在临床前试验中研究的治疗方法已显示Serca2a过表达在衰竭的人心脏中移动细胞内Ca2+并恢复心肌细胞的收缩性，并且在动物模型中改善衰竭的心脏功能。考虑到我们的结果显示在DCM iPSC-CM中有较低Ca2+瞬变和减弱的收缩性，我们假设Serca2a的过表达能够拯救DCM iPSC_CM的表型。以100计的感染复数(MOI)，用携带共表达GFP的Serca2a的腺病毒(Ad.Seca2a)转导DCM iPSC-CM (参见方法部分)，导致在这些细胞中Serca2a的过表达(图4a)。相比仅仅采用携带GFP的腺病毒(Ad.GFP) (M0I100)转导的DCM iPSC-CM，Serca2a的过表达造成随时间的较大数量的体外自发收缩点(图24)。GFP与Serca2a的共表达使我们能够识别转导的细胞并且通过AFM检测收缩力(图4b)。Serca2a(n = 12)的过表达使单一 DCM iPSC-CM的收缩力恢复至在对照iPSC-CM中观察到的相似水平(图4c、4d和 表5)，但是没有改善肌节的组织性(图4g)。使用红色荧光Ca2+指示剂Rhod-2AM的钙成像(图25)显示相比仅仅用Ad.GFP转导的细胞(η = 14)，用共表达GFP的Ad.Serca2a转导的DCM iPSC-CM (η = 22)具有显著增加的全[Ca叶]i瞬变(图4e和图4f) (p=0.04)，这与恢复的力的产生相一致。相反，在对照iPSC-CM中Serca2a的过表达无法产生收缩性的统计学上的显著增加(图26)，表明对照和DCM iPSC-CM之间在钙处理中的天然差异。总之，这些结果表明Serca2a的过表达增加了 [Ca2+]i瞬变以及DCM iPSC-CM的收缩力，并且改善了它们的功能。
[0131]虽然Serca2a基因治疗现在出于临床试验阶段，但在Serca2a基因治疗之后个体CM细胞反应的整体机制在先前还未被广泛研究。因此，我们开始研究该机制，其中Serca2a递送恢复了DCM iPSC-CM中的缺陷。在Serca2a过表达之后DCM iPSC-CM的基因表达谱显示191个基因(65个上调，126个下调)的表达变化超过1.5倍，并且被拯救至与对照iPSC-CM中相似的表达水平(图27a)。富集通路分析表明几种先前已知的通路(如钙信号传导、蛋白激酶A信号传导和G-蛋白偶联受体信号传导)明显参与了通过Serca2a过表达来拯救DCM表型的过程。有趣的是，发现几种先前与DCM没有联系的通路(包括促心脏发生的因子、整联蛋白和细胞骨架信号传导、以及泛素化通路)也参与拯救DCM CM功能的过程(图27b和表7)。
[0132]临床研究已经表明美托洛尔，一种β 1-选择性β -肾上腺素阻断剂，对于DCM患者的临床症状和血液动力学状态具有有益作用。如肌节α -辅肌动蛋白染色所示(图28a)，当用10 μ M美托洛尔治疗时，DCM iPSC-CM显示肌节组织有所改善。美托洛尔治疗也防止由于NE处理所诱导的DCM iPSC-CM的恶化(图28b)。我们在用美托洛尔处理的对照iPSC-CM中没有观察到对肌节α -辅肌动蛋白分布的显著影响(图28c)。这些结果表明β -肾上腺素通路有助于DCMiPSC-CM抵抗机械恶化。
[0133]总之，我们已经从肌节蛋白cTnT中携带单点突变的DCM家族产生了患者特异性iPSC，并且从这些iPCS中衍生出CM。这已经使我们能够产生大量的DCM-特异性CM并且分析它们的功能性质、探索潜在发病机理并测试有效的治疗方法(表8)。尽管DCM iPSC-CM的基线电生理学活性与对照没有明显不同，但DCM iPSC-CM展现出明显较小的[0&2+\瞬变和降低的收缩力。较弱的抵抗机械刺激的能力也与DCM iPSC-CM相关。如肌节α-辅肌动蛋白染色所示，NE刺激诱导它们的自发收缩的停止，并且显著恶化肌节的组织性。这个TNNT2R173W突变看似仅仅影响CM的功能，而不影响来自心血管谱系的其它细胞(图29)。总之，我们的数据表明TNNT2R173W突变造成CM的力产生中的破坏，这可能是患者DCM临床表型的最终表现的主要病因(图30)。显示β-阻断剂美托洛尔能够拯救DCM iPSC-CM表型。另外，Serca2a的过表达，一种当前在临床试验中用于治疗心力衰竭的新型基因治疗方法，能够显著改善DCM iPSC-CM的功能。基因表达概况还鉴定了几条参与Serca2a拯救的新通路，包括泛素化和整联蛋白信号传导通路。总之，我们的发现证明iPSC平台打开了研究针对DCM的发病机理和治疗靶标的新的、令人激动的研究领域。
[0134]方法
[0135]患者特异性iPSC衍生、培养和表征。用于该研究的所有方案由斯坦福大学人对象研究机构审查委员会(Human Subjects Research Institutional Review Board)批准。如前述实施患者特异性iPSC细胞系的产生、维持和表征。
[0136]免疫荧光和碱性磷酸酶染色。按照生产商的说明书使用定量碱性磷酸酶ES表征试剂盒(开米康公司(Chemicon))实施碱性磷酸酶(AP)染色。如前所述使用合适的一抗以及AlexaFluor偶联的二抗(英杰公司(Invitrogen))来实施免疫突光法。在本研究中使用针对0ct3/4(圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz))、Sox2 (白乐津公司(Biolegend))、SSEA-3(密理博(Millipore))、SSEA-4 (密理博)、Tra-1-60 (密理博)、Tra_l_81(密理博)、Nanog(圣克鲁兹生物技术公司)、AFP(圣克鲁兹生物技术公司)、平滑肌肌动蛋白(SMA)(西格玛公司(Sigma))、Tuj-1 (科文斯公司(Covance))、cTnT(热科学公司(ThermoScientific))、肌节α-辅肌动蛋白(克隆ΕΑ-53，西格玛公司)、连接蛋白-43 (密理博)和肌球蛋白轻链(MLC_2a)(突触系统公司(Synaptic Systems))的一抗。
[0137]亚硫酸氢盐焦磷酸测序。按照生产商的说明书使用Zymo DNA甲基化试剂盒(Zymo研究公司)用硫酸氢盐处理I μ g的样品DNA。然后将PCR产物转化为单链DNA模板并且用焦磷酸测序PSQ96HS系统(Biotage)测序。使用QCpG软件(Biotage)以T/C SNP单独分析各基因座的甲基化状态。
[0138]人ESC和iPSC的心脏分化。使用由Yang等所述的成熟建立的方案使H7ESC和衍生的iPSC细胞系分化成心脏谱系。采用I型胶原酶(西格玛公司(Sigma))分离搏动EB，并将其接种于明胶被覆的培养皿、腔式载玻片或盖玻片上供于功能分析。
[0139]钙成像。将解离的iPSC-CM接种在明胶被覆的4孔LAB-TEK? II腔(耐洁纽恩克国际公司(Nalgene-Nunc International),腔#1.5德国盖玻片系统)供于钙成像。在37°C下，用内含5μΜ Fluo-4AM或Rhod-2AM(针对表达GFP的细胞)和0.02%普流罗尼克(Pluronic) F-127 (皆来自分子探针公司(Molecular Probes))的 Tyrodes 溶液(140mMNaCl, 5.4mM KCl, ImM MgCl2, IOmM 葡萄糖，1.8mM CaCl2 和 IOmM HEPES，在 25°C下用 NaOH调至PH7.4)处理细胞15分钟。然后用Tyrodes溶液洗涤细胞3次。用具有63X透镜(NA=L 4)的共聚焦显微镜(卡尔蔡司公司(Carl Zeiss) LSM510Meta)，使用Zen软件进行钙成像。采用线扫描模式以1.92ms/线的取样速率在室温下获得自发Ca2+瞬变。对于19.2s的记录总共获得10000条线。
[0140]钙成像痕迹分析。使用Fi ji，一种使每条线的荧光强度平均化的ImageJ的派生物(国立卫生研究院)来定量分析Ca2+反应。然后使用MATLAB针对连续Ca2+瞬变节律的不规则性和每次瞬变中总Ca2+流入来分析时间依赖性的Ca2+反应。瞬变之间的时间(节律)被定义为两个连续尖峰的峰之间的时间。通过使用MATLAB的信号处理工具箱计算二阶倒数的零交点来确定尖峰。通过对在每个波之下的面积相对于基线进行积分来测定在每次瞬变中的总Ca2+释放。基线被定义为所有最小值的中值。尖峰周期和幅度的不规则性被定义为一组测量值的标准偏差(s.d.)与均值的比。
[0141]原子力显微镜(AFM)。在各实验之前，将iPSC-CM接种在玻璃底的皮氏培养皿上，将培养基替换成温热Tyrode溶液。使细胞在整个实验过程中维持在36 °C。通过AFM (MFP-3DBio, Asylum Research公司) 使用氮化娃悬臂(弹簧常数约0.04N/m, BudgetSensors公司)来研究搏动细胞。为了测量力，由悬臂尖端用IOOpN的力轻触细胞，具有100-200nm左右的典型细胞缺痕，然后悬臂尖端在没有Z-压电反馈的情况下在该位置上保留多个序贯2分钟间隔，同时以2kHz的取样速率收集偏移数据。在这些检测中的一般噪音约为20pN。偏移数据通过乘以弹簧常数转化为力。通常各单一细胞收集100-400次搏动，并且计算力、搏动间的间隔和各细胞每次收缩的时程的统计数据。使用双尾斯氏t检验来比较细胞间的力。
[0142]iPSC-CM的腺病毒转导。使用了携带巨细胞病毒(CMV)启动子(驱动Serca2a)加单独CMV启动子(驱动GFP)的第一代5型重组腺病毒(Ad.SerCa2a)以及仅作为对照的携带CMV启动子(驱动GFP)的腺病毒(Ad.GFP)。从搏动EB分离的iPSC-CM以M0I100过夜转导，然后更换培养基(补充有10% FBS的DMEM)。细胞在转导后48小时用于后续实验。
[0143]统计学分析。使用Excel或R来分析数据。使用双尾斯氏t检验来检验两组之间的统计学差异。使用单向ANOVA检验和随后的徒吉(Tukey)多重比较检验来分析超过两组之间的统计学差异。当P值小于0.05时，确定为显著差异。
[0144]遗传测试。将来自患者的外周血分入EDTA并且被送至GeneDx实验室(马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD))用于基因组DNA分离和商业遗传测试。对DNA扩增并且用通过合成方法的“下一代(next generation) ”固态序列(亿明达公司(Illumina))来测序。DCM基因的组包括对以下基因的完全编码区域和剪接点的测序:LMNA、MYH7、TNNT2、ACTCl、DES、MYBPC3、TPMl、TNNI3, LDB3、TAZ、PLN、TTR、LAMP2、SGCD、MTTLl、MTTQ, MTTH、MTTK、MTTS1、MTTS2、MTND1、MTND5 和 MTND6。用人参比序列(c DNA NM00108005)与结果相比较。通过双脱氧DNA测序来确定可能的疾病相关序列。还在混合种族的335个假定健康对照中确定候选疾病相关变体的存在。在TNNT2基因中鉴定变体(p.Argl73Trp)。这是用疏水性、中性的酪氨酸来取代亲水性、带正电的精氨酸的非保守氨基酸取代。在几种物种之间，该精氨酸在173位上高度保守。计算机分析(PolyPhen)预测该氨基酸取代破坏心脏肌钙蛋白T2蛋白的结构和功能。在混合祖先335个的对照个体中未发现该变体。
[0145]外显子组测序和数据分析。对来自个体IIIa的基因组DNA进行使用Nimblegen SeqCap EZ Exome Library ν2.0 (罗氏分子生化制品公司(Roche MolecularBiochemicals)的外显子组测序。检测潜在DCM的32个最新常染色体基因(补充表3)的突变。在外显子组捕获中靶向所有的这些基因并且总共覆盖190kb。用HiSeq(亿明达公司)的一条通道来测序产生217x的中值覆盖(四分位距152x至243x)。通过使用由Novoalign、Picard、SAMtools、GATK和ANN0VAR组成的分析管道(analysis pipeline)发现单核甘酸变体(SNV)。通过比较SNP数据库dbSNP132来确定SNP。通过SIFT算法来鉴定有害的SNV。
[0146]微阵列杂交和数据分析。使源自对照和DCM iPSC的未分化iPSC或4周龄CM的(用或不用Serca2a过表达处理)的生物复制品的总RNA样品与艾菲美特(Affymetrix)基因芯片人基因1.0ST阵列杂交，然后用艾菲美特(Affymetrix)表达控制台软件来进行标准化和标注。使用显示在所有样品之间标准偏差大于0.2的转录物的表达水平计算每对样品的皮尔森相关系数。对于分级聚类，我们使用针对平均连锁聚类的皮尔森相关。使用新式通路分析(Ingen uity Pathway Analysis) (IPA)工具来鉴定富集的通路。仅选择基因数>5的那些通路。
[0147]人ESC和iPSC的心脏分化。在基质胶(BD生物科学公司(BD Biosciences))被覆的表面上采用mTESR-1多能干细胞培养基(干细胞技术有限公司(STEMCELLTechnologies))来培养人ESC和iPSC至80%融合。在第O天,用Accutase (西格玛公司)将细胞解离成含有10-20个细胞的小簇并且在2ml的基础培养基(StemPix)34，英杰公司，含有2mM谷胺酰胺，英杰公司，0.4mM硫代甘油，西格玛公司，50μ g/ml抗坏血酸，西格玛公司，以及0.5ng/ml_BMP4，R&D系统公司(R&D Systems))中重悬以形成拟胚体(EB)。在第1-4天，向用于心脏特定分化的基础培养基添加BMP4(10ng/ml)、人bFGF (5ng/ml)和活化素A(3ng/ml)。在第4-8天，对EB更换含有人DKKl (50ng/ml)和人VEGF(10ng/ml)的基础培养基，然后从第8天开始更换含有人bFGF (5ng/ml)和人VEGF (10ng/ml)的基础培养基。所有的因子都获自R&D系统公司。在5% CO2/空气环境中维持培养。
[0148]微电极阵列(MEA)记录。在分化后第19-47天的实验之前1_3天，将1_6个搏动iPSC-CM EB置于明胶被覆的MEA探针(α-医学科学公司(Alpha Med Scientific))上。用MED64放大器(α医学科学公司)在20kHz下获得信号并且用国家设备公司Α/D卡和装有MED64Mobius QT软件的PC将信号数码化。如上所述测量和确定场电位时程(FPD)并且使用IGOR Pro (Lake Oswego)和 MS Excel 进行离线校正。使用 Bazzet 校正公式:CFPD=FPD/ V脉冲间隔使FPD针对搏动频率进行标准化。使用双尾斯氏t检验来进行比较DCM和对照iPSC-CM电生理学参数的统计学分析。
[0149]膜片钳。将分离的iPSC-CM接种在24孔平板中的明胶被覆的15mm的圆盖玻片上供于实验。使用EPC-1O膜片钳放大器(HEKA)和倒置显微镜(尼康公司(Nikon) ,TE2000-U)对由盖玻片上的对照和DCM iPSC产生的CM中的全细胞进行膜片钳记录。使用细丝(萨特仪器公司(Sutter Instrument), #BF150-110-10)采用硼娃酸盐玻璃按照以下参数(热，速度，时间):1)740,20,250 ;2) 730，20，250 ;3) 730，20，250 ;4) 710，47，250，使用微量移液管(萨特仪器公司，Model P-87)来制备玻璃吸管。采用以下的吸移溶液执行记录:在Tyrodes溶液(140mM NaCl,5.4mM KCl, ImM MgCl2, IOmM葡萄糖，1.8mM CaCljPlOmM HEPES,在25°C下用 NaOH调至pH7.4)中的 120mM K D-葡萄糖酸，25mM KCl,4mM MgATP, 2mM NaGTP,4mM Na2-磷酸-肌氨酸，IOmM EGTA, ImM CaCljPlOmM HEPES (在 25°C下用 KCl 调至pH7.4)。使用双尾斯氏t检验进行统计学分析。
[0150]单细胞微流体PCR。在显微镜下人工挑选单个搏动CM。将各细胞引入含有10 μ I反应缓冲液(CellsDirect试剂盒,英杰公司)、ΤΕ缓冲液(安碧公司(Ambion))、感兴趣的引物(应用生物系统公司(Applied Biosystems))和SuperScript III逆转录酶/白金Taq酶混合物(英杰公司)的混合物的PCR管中。在热循环仪(ABI Veriti)上如下实施逆转录和特定转录物的扩增:50°C 15分钟，70°C 2分钟，94°C 2分钟，然后94°C 15秒，60°C 30秒，和68°C 45秒，进行18次循环，然后68°C 7分钟。使用Nanoflex IFC控制器(福路德姆(Fluidigm))将扩增的cDNA加载至Biomark48.48动态阵列芯片上。作为相对荧光强度的测量值的阈值循环(CT)通过BioMark实时PCR分析软件(Fluidigm)来提取。
[0151]内皮细胞分化。使用lmg/ml胶原酶IV(英杰公司)将iPSC分散为含有约500-1000个细胞的细胞聚集体。将细胞聚集体悬浮培养于超低粘附细胞培养皿内的含有20%ES-Qualified FBS(英杰公司)并补充有如下诱导细胞因子的敲除DMEM中:0_7天:20ng/ml BMP4 ; 1-4 天:10ng/ml 活化素 A ;2_14 天:8ng/ml FGF-2 ;4_14 天:25ng/ml VEGF-A0 内皮祖细胞使用小鼠 抗人CD31抗体(BD生物科学公司)磁力分离，并且在EGM-2内皮细胞培养基(龙沙公司(Lonza))中扩增。
[0152]表1.通过下一代测序(亿明达公司)遗传筛选DCM基因的组
[0153]
【权利要求】
1.一种候选试剂的心脏病相关筛选的方法,所述方法包括:将所述候选试剂与一种或一组分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞接触，所述iPS细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因；和测定所述试剂对于形态学参数、遗传参数或功能性参数的影响。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述心脏病选自扩张型心肌病(DCM)、肥大型心肌病(HCM)、蒽环类抗生素诱导的心脏中毒、心律失常性右心室发育不良(ARVD)、左心室致密化不全(LVNC)、左心室双入口(DILV)和长QT(1型)综合征(LQT-1)。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述突变选自:心脏肌钙蛋白T(TNNT2);肌球蛋白重链(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亚基Y_2(PRKAG2) ;3型肌钙蛋白I (TNNI3);肌联蛋白(TTN);肌球蛋白，轻链2 (MYL2);肌动蛋白，α 心肌I (ACTCl);电压门控性钾通道，KQT-样亚家族，成员I(KCNQl)；斑菲素蛋白2(ΡΚΡ2)和心脏LIM蛋白(CSRP3)。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述心脏病是扩张型心肌病(DCM)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述突变是TNNT2R173W。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，相对于正常心肌细胞，所述DCM心肌细胞具有响应正性肌力压力的初始正性变时作用，之后变为以衰竭为特征的负性作用。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述心脏病是肥大型心肌病(HCM)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述突变是MYH7R663H。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，相对于正常心肌细胞，所述HCM心肌细胞展现出细胞大小增大、异常Ca2+瞬变的较高发生率以及细胞内Ca2+水平升高。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述心脏病是心律失常性右心室发育不良(ARVD)。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述突变是PKP22013delC突变或PKP2Q617X 突变之一。
12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述心脏病是长QT(I型)综合征(LQT-1)。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述突变是KCNQ1G269S错义突变。
14.如权利要求2所述的方法，其特征在于，一组心肌细胞包含具有不同基因型的至少两种心肌细胞。
15.如权利要求2所述的方法，其特征在于，一组心肌细胞包含在不同环境条件下的心肌细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，一种或多种所述环境条件包含采用β-肾上腺素激动剂的刺激。
17.如权利要求2所述的方法，其特征在于，对所述试剂的影响的测定包括单细胞分析。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述单细胞分析包括原子力显微镜、微电极阵列记录、膜片钳、单细胞PCR和钙成像中的一种或多种。
19.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述候选试剂是候选药物。
20.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述候选试剂是遗传物质。
21.一种分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞的经分离的群或组，所述iPS细胞包含编码心脏病相关突变的至少一种等位基因。
22.如权利要求20所述的分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞的经分离的群或组，其特征在于，所述心脏病选自:扩张型心肌病(DCM)、肥大型心肌病(HCM)、蒽环类抗生素诱导的心脏中毒、心律失常性右心室发育不良(ARVD)、左心室致密化不全(LVNC)、左心室双入口(DILV)和长QT(1型)综合征(LQT-1)。
23.如权利要求21所述的分化自诱导性人多能干细胞(iPS细胞)的心肌细胞的经分离的群或组，其特征在于，所述突变是选自下组的基因中的突变:心脏肌钙蛋白T(TNNT2)；肌球蛋白重链(MYH7);原肌球蛋白I(TPMl);肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3) ;5' -AMP-活化的蛋白激酶亚基Y_2(PRKAG2) ;3型肌钙蛋白I (TNNI3);肌联蛋白(TTN);肌球蛋白，轻链2 (MYL2);肌动蛋白，α心肌I (ACTCl);电压门控性钾通道，KQT-样亚家族，成员I(KCNQl)；斑菲素蛋白2(ΡΚΡ2)和心脏LIM蛋白(CSRP3)。
24.如权利要求20所述的经分离的群，其特征在于，所述心脏病是扩张型心肌病(DCM)。
25.如权利要求24所述的经分离的群，其特征在于，所述突变是TNNT2R173W。
26.如权利要求24所述的经分 离的群，其特征在于，相对于正常心肌细胞，所述DCM心肌细胞具有响应正性肌力压力的初始正性变时作用，之后变为以衰竭为特征的负性作用。
27.如权利要求20所述的经分离的群，其特征在于，所述心脏病是肥大型心肌病(HCM) ο
28.如权利要求27所述的经分离的群，其特征在于，所述突变是MYH7R663H。
29.如权利要求27所述的经分离的群，其特征在于，相对于正常心肌细胞，所述HCM心肌细胞展现出细胞大小增大、异常Ca2+瞬变的较高发生率以及细胞内Ca2+水平升高。
30.如权利要求21所述的经分离的群，其特征在于，一组心肌细胞包含具有不同基因型的心肌细胞。
31.如权利要求26所述的组，其特征在于，一组心肌细胞包含在不同环境条件下的心肌细胞。
32.如权利要求31所述的组，其特征在于，一种或多种所述环境条件包括采用β-肾上腺素激动剂的刺激。
【文档编号】C12N5/074GK103987854SQ201280045656
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2011年7月21日
【发明者】孙宁, M·T·隆盖克, R·C·罗宾斯, J·吴, F·蓝, A·李, P·伯里奇 申请人:小利兰·斯坦福大学托管委员会