一种诱导心肌细胞凋亡的β1肾上腺素受体单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种β1-AA单克隆抗体，所述单克隆抗体利用以下两条多肽作为免疫原产生，多肽1：序列与HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性为85％至100％的多肽；多肽2：序列与CHWWRAES?DEARR同一性为85％至100％的多肽。本发明使用两条肽段进行免疫，其中多肽1段为β1肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列，但免疫原性较低；而多肽2段为针对多肽1段设计的免疫原性较高的肽段。因此，用这两条肽段分别免疫，在保证获得正确抗体的同时也提高了免疫原性。针对β1肾上腺素受体细胞外第二环、且与临床病人血清中存在的β1-AA具有相同的生物学效应的单克隆抗体首次制备成功，使用该单克隆抗体进行科学研究可以得到更可靠的实验结果。
【专利说明】—种诱导心肌细胞凋亡的β1肾上腺素受体单克隆抗体
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学领域，涉及一种新型的导心肌细胞凋亡的β I肾上腺素受体单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]P1肾上腺素受体自身抗体是一种针对P1肾上腺素受体细胞外第二环产生的自身抗体，它主要存在于扩张性心肌病、恰加斯病以及心衰等多种心血管疾病中。研究发现，β !肾上腺素受体自身抗体对于研究心血管疾病的免疫学机制具有重要意义，且该自身抗体可以直接诱导心肌细胞发生凋亡(Daniel Jane-wit等，Betal-adrenergic receptorautoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonisticalIy inducingcardiomyocyte apoptosis.Circulation.2007 ；116:399-410.)。以往的研究中运用的自身抗体多为从血清中获得的多克隆抗体。通过纯化抗体分子可提高多克隆抗体的滴度。根据抗体与靶分子的相互作用，将抗体从蛋白质混合物中分离出来。
[0003]已经有人采用MAb Trap Kit试剂盒，从β 1_ΑΑ为阳性的血清中提纯总IgG，虽然其中以抗β ^AR抗体为主，并可以通过β丨-AR特异性阻断剂metoprolol和人工合成的β ^AR-EC11抗原肽段间接验证效应主要是由抗P1-AR抗体引起(Antonio S.Tutor等.2007.Ant1-β 1-adrenergic receptor autoantibodies are potent stimulators ofthe ERK1/2 pathway in cardiac cells.Cardiovascular Research76:51-60.)。该方法提纯的抗体为血清中 总的IgG，并不是特异针对P1肾上腺素受体细胞外第二环，无法排除其他IgG的干扰。
[0004]还有一种方法从血清中提纯总的IgG，经过挂有β !-AR-EC11抗原肽段的特异性亲和柱，以便提纯血清中高纯度的抗β !-AR抗体(Wallukat G等1995.Ant1-beta1-adrenoceptor autoantibodies with chronotropic activity fromtheserum of patients with dilatedcardiomyopathy:mapping of epitopes inthe firstand second extracellular loops.J Mol Cell Cardiol.27 (I):397-406)。通过此方法虽能得到特异性针对P1-AR-EC11的抗体，但得到的β「ΑΑ的浓度过低无法进行后续实验，且经济成本太高,因此,该技术应用并不广泛。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中的上述问题，本发明构建一种针对β rAR细胞外第二环并且与心衰患者血清中的β !-AA具有相同生物学效应的新型β !-AA单克隆抗体。
[0006]该新型β rAA单克隆抗体通过以下方法获得:首先设计合成抗原肽段，并将肽段进行偶联；免疫小鼠，获得血清；监测血清，制备单克隆杂交瘤细胞株；筛选特异性单克隆抗体，选取杂交瘤细胞株扩大培养，接种小鼠，收集腹水并Protein G纯化。
[0007]该抗体以单一的亲和性和特异性与β !肾上腺素受体细胞外第二环结合，可有效排除其他抗体的干扰，并且与临床病人血清中存在的β rAA具有相同的生物学效应。因此，使用该单克隆抗体进行科学研究可以得到更可靠的实验结果。
[0008]本发明使用了两条肽段进行免疫，其中多肽I段为β i肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列，但免疫原性较低；而多肽2段为针对多肽I段设计的免疫原性较高的肽段。因此，用这两条肽段分别免疫，在保证获得正确抗体的同时也提高了免疫原性。
[0009]针对β I肾上腺素受体细胞外第二环、且与临床病人血清中存在的β rAA具有相同的生物学效应的单克隆抗体首次制备成功。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1: β「AR细胞外第二环的单克隆抗体的构建。图1的A显示了 ELISA检测杂交瘤细胞上清液中β rAA的含量,其中，< 0.01vs载剂组；η = 3/组；图1的B显示了蛋白质印记检测β rAA单克隆抗体与H9C2细胞表面β rAR的结合，η = 3，其中β rAA是制备合成的β rAA单克隆抗体。
[0011]图2:激光共聚焦技术检测β 1-AA单克隆抗体与心肌细胞的表面的β ι-AR的结合情况。
[0012]图3:乳鼠心肌细胞跳动频率实验检测P1-AA单克隆抗体的功能，其中心衰病人载剂组是来自β rAA阴性心衰病人血清中的总IgG，η = 3 ;心衰病人β rAA组是来自β j-AA阳性心衰病人血清中的总IgG,η = 3 ;单克隆抗体载剂组是生理盐水对照组,η = 3 ；单克隆抗体β rAA组是制备合成的β ι_ΑΑ单克隆抗体，η = 3。
[0013]图4 J1-AA单 克隆抗体诱导心肌细胞H9C2凋亡，A是细胞流式结果图(各小图右下象限结果为凋亡率)，Β是统计柱状图，图中#Ρ < 0.01vs.载剂组；η = 4/组；其中对照组为溶剂对照组，β rAA组为β rAA刺激组，肽组为β !-AR-EC11肽段组，上清组为β rAA和^1-AR-EC11共同刺激组。
【具体实施方式】
[0014]本发明的新型P1-AA单克隆抗体通过包括以下步骤的方法制备:1.抗原多肽的合成；2.利用所合成的抗原多肽通过杂交瘤细胞融合的方法制备单克隆抗体。
[0015]本发明中，抗原多肽的合成可以为以下合成:根据人β !肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列，合成两条抗原肽段，其中多肽1:序列与HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性为85%至100%的多肽；多肽2:序列与CHWffRAES DEARR同一性为85%至100%的多肽。
[0016]本发明所用的两条抗原肽段中，多肽I为序列与HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC同一性为85%至100%的多肽，优选90%至100%，更优选95%至100% ;多肽2序列与CHWffRAES DEARR同一性为85%至100%的多肽，优选90%至100%，更优选95%至100%。
[0017]将合成的多肽用于杂交瘤细胞融合的方法来制备单克隆抗体:1)将多肽I和多肽2分别偶联至载体蛋白KLH、BSA作为免疫原；2)使用偶联制备的两种免疫原分别免疫多只小鼠，制备多抗血清；3)以多抗血清进行生物活性验证；4)选择其中滴度最高的1-2只小鼠，分别进行融合，制备单克隆杂交瘤细胞株；5)对所获得的杂交瘤细胞通过ELISA方法进行筛选，挑选出I~5株高亲和力的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，并将其扩大培养；6)挑选的I株克隆，接种小鼠，收集腹水并Protein G纯化。用ELISA、蛋白质印记及激光共聚焦技术检测β rAA单克隆抗体与细胞表面β !-AR的结合。
[0018]杂交瘤技术是1975年k0hler和miIstein首先报道的，他们用细胞杂交技术使经绵羊红细胞(srbc)免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，建立起第一个b细胞杂交瘤细胞株，并成功地制得抗srbc的单克隆抗体(monoclonal antibody, mcab)。迄今世界已研制成数以千计的mcab。
[0019]采用杂交瘤技术获得的单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且来源容易。
[0020]细胞的选择与融合
[0021]建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的b细胞,通常来源于免疫动物的碑细胞。脾是b细胞聚集的重要场所,无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是b细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。目前常用的 b 细胞瘤株有:p3_x63_ag8 (kohlerandmi I stein, 1975), p3-nsi/l-ag4_l (kohlerandmilstein, 1976)，x63_ag8.563(kearneyetal, 1979)，sp2/0_agl4(schulmanetal,1978)等，这些细胞株皆为hat敏感细胞株。
[0022]有限稀释与抗原特异性选择
[0023]在动物免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇,一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答，实质是众多b细胞群的抗体分泌。而针对目标抗原表位的b细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，需细筛选去除。筛选过程一般分为两步进行:一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在O至数个细胞之间(30%的孔为O才能保证每个孔中是单个细胞)，培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的elisa找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。
[0024]经过ELISA、蛋白质印记及激光共聚焦技术检测确认的本发明单克隆抗体通过以下方式来检验生物学功能:乳鼠心肌细胞跳动频率实验评价P1-AA单克隆抗体的功能。Annexin V/PI双染经流式检测β ^AA单克隆抗体对心肌细胞H9C2凋亡的影响。ELISA检测结果显示，杂交瘤细胞上清液中β ^AA的含量明显高于对照组(2.9896±0.1873vs.0.0635±0.0386，P < 0.01)(图1A);而蛋白质印记的结果也证实，β ^AA单克隆抗体与商业化抗-β 1-AR多克隆抗体阳性对照具有相同分子量的条带(图1B);激光共聚焦结果表明，β rAA单克隆抗体可以与H9C2细胞表面的β rAR结合(图2);而乳鼠心肌细胞跳动频率实验也发现，β ^AA单克隆抗体与心衰病人血清中的β i_AA具有相同的生物学效应，均可使增加乳鼠心肌细胞跳动频率(图3)。以上`结果均提示:针对β rAR细胞外第二环的单克隆抗体已构建成功。Annexin V/PI双染结果显示:β ^AA单克隆抗体可诱导心肌细胞H9C2发生凋亡(图4)。
[0025]实施例
[0026]实施例1:肽段合成:[0027]根据人β i肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列，合成两条抗原肽段，其中多肽 I 序列为 HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC ;多肽 2 序列为 CHWffRAES DEARR。
[0028]实施例2:通过杂交瘤细胞融合的方法合成单克隆抗体:
[0029]I)将多肽I和多肽2分别偶联至载体蛋白KLH、BSA作为免疫原；
[0030]2)使用两种免疫原分别免疫3只小鼠，制备多抗血清；
[0031]3)以多抗血清进行生物活性验证；
[0032]4)选择其中滴度最高的1-2只小鼠，分别进行融合，制备单克隆杂交瘤细胞株；
[0033]5)对所获得的杂交瘤细胞通过ELISA方法进行筛选，挑选出I~5株高亲和力的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，并将其扩大培养；
[0034]6)挑选的I株克隆,接种小鼠，收集腹水并Protein G纯化。
[0035]实施例3:所获得的单克隆抗体的生物学活性测试
[0036]用ELISA、蛋白质印记及激光共聚焦技术检测β ^AA单克隆抗体与细胞表面β rAR的结合。
[0037]乳鼠心肌细胞 跳动频率实验评价β rAA单克隆抗体的功能。
[0038]Annexin V/PI双染经流式检测β rAA单克隆抗体对心肌细胞H9C2凋亡的影响。
[0039]ELISA检测结果显示，杂交瘤细胞上清液中β「AA的含量明显高于对照组(2.9896±0.1873vs.0.0635±0.0386，P < 0.01)(图 1Α);而蛋白质印记的结果也证实，?^-ΑΑ单克隆抗体与商业化抗-P1-AR多克隆抗体阳性对照具有相同分子量的条带(图1Β);激光共聚焦结果表明，P1-AA单克隆抗体可以与H9C2细胞表面的P1-AR结合(图2);而乳鼠心肌细胞跳动频率实验也发现，P1-AA单克隆抗体与心衰病人血清中的P1-AA具有相同的生物学效应，均可使增加乳鼠心肌细胞跳动频率(图3)。以上结果均提示:针对β !-AR细胞外第二环的单克隆抗体已构建成功。
[0040]Annexin V/PI双染结果显示:β ^AA单克隆抗体可诱导心肌细胞H9C2发生凋亡(图 4)。
【权利要求】
1.一种P1-AA单克隆抗体，所述单克隆抗体利用以下两条多肽作为免疫原产生， 多肽 1:序列与 HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNRC 同一性为 85%至 100%的多肽； 多肽2:序列与CHWffRAES DEARR同一性为85%至100%的多肽。
2.如权利要求1所述的β「ΛΑ单克隆抗体，所述抗体通过杂交瘤融合方法制备。
3.如权利要求2所述的P1-AA单克隆抗体，所述杂交瘤融合方法包括以下步骤: 1)将多肽I和多肽2分别偶联至载体蛋白KLH、BSA作为免疫原； 2)使用步骤I)获得的两种免疫原分别免疫多只小鼠，制备多抗血清； 3)验证多抗血清的生物活性； 4)选择其中多抗血清滴度最高的I至2只小鼠，分别取脾细胞进行融合，制备单克隆杂交瘤细胞株； 5)对所获得的杂交瘤细胞通过ELISA方法进行筛选，挑选出I~5株高亲和力的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，并将其扩大培养； 6)挑选的I株克隆，接种小鼠，收集腹水并ProteinG纯化。
4.如权利要求1所述 的P1-AA单克隆抗体，所述多克隆抗体的序列与权利要求3所述方法制备的抗体的序列具有 85%至100%的序列同一性。
【文档编号】C07K16/28GK103626873SQ201310687137
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】刘慧荣, 杜芸辉, 李笑, 张苏丽, 商建宇, 马新亮 申请人:首都医科大学