Nogo受体介导的对轴突生长的阻断的制作方法

专利名称：Nogo受体介导的对轴突生长的阻断的制作方法
发明人Stephen M.Strittmatter相关申请的交叉引用本申请与2000年1月12日提交的美国临时专利申请60/175,707、2000年5月26日提交的60/207,366和2000年9月29日提交的60/236,378有关，在此完整引用作为参考。美国政府的支持本发明部分地在政府支持下进行，国立卫生研究院批准号为5-R01-NS33020。
生长锥能用它的片状伪足和丝足探查位于它前方和任一侧的区域。当延伸接触到不适宜的表面时，即缩回。当延伸接触到适宜的表面时，它继续延伸，并且能控制生长锥以该方向移动。因此，基底表面特性的微小变化能引导生长锥。当生长锥到达合适的靶细胞时，产生突触连接。
在由于创伤和疾病损伤后，损伤的神经元不能在中枢神经系统(CNS)中再生。损伤后轴突不能再生可能是由于存在轴突生长抑制剂。这些抑制剂主要与髓鞘质(myelin)有关，构成再生的一个重要障碍。轴突生长抑制剂存在于CNS-衍生的髓鞘质和少突胶质细胞的质膜中，它们在CNS中合成髓鞘质(Schwab等人，(1993)Ann.Rev.Neurosci.16，565-595)。
CNS髓鞘质是少突胶质细胞膜的精细延伸。单个少突胶质细胞使多达30个不同的CNS轴突节段形成髓鞘。少突胶质细胞膜延伸以同心方式缠绕轴突，形成髓鞘。紧密的成熟髓鞘质由与水合蛋白质层相对的平行双分子脂层组成。活性髓鞘质合成从子宫内开始，在人生命的头两年继续。较缓慢的合成贯穿童年和青春期，而成熟髓鞘质的转化(turnover)以较慢速度贯穿成年期。发育中的和成熟形式的髓鞘质都对疾病或物理创伤造成的损伤敏感，导致轴突周围的髓鞘质降解。
髓鞘质相关的抑制剂似乎是轴突连续性被打断后CNS轴突体内再生失败的主要原因，而CNS中其它非髓鞘质相关的轴突生长抑制剂可能起次要作用。这些抑制剂在由于创伤、中风或病毒感染引起的神经元损伤后阻断轴突再生。
大量髓鞘质衍生的轴突生长抑制剂已经表征(综述见David等人，(1999)WO995394547；Bandman等人，(1999)美国专利5,858,708；Schwab(1996)Neurochem.Res.21，755-761)。也已经描述了CNS白质的几种成分--NI35、NI250(Nogo)和髓鞘质相关的糖蛋白(MAG)，它们对轴突延伸具有抑制活性(Schwab等人，(1990)WO9005191；Schwab等人，(1997)美国专利5,684,133)。具体而言，Nogo是一种250kDa的髓鞘质相关的轴突生长抑制剂，已经克隆和表征(Nagase等人，(1998)DNA Res.5，355-364；Schwab，(1990)Exp.Neurol.109，2-5)。Nogo cDNA首先通过随机分析脑cDNA鉴定，没有所提出的功能(Nagase等人，(1998)DNARes.5，355-364)。
Schwab和同事们公布了由推测的牛NI250(Nogo)蛋白的蛋白水解消化物随机衍生的6种肽的序列(Spillmann等人，(1998)J.Biol.Chem.273，19283-19293)。GenBank最近存放了该蛋白质的一种可能的全长cDNA序列。这一4.1kb的人cDNA克隆--KIAA0886来自于Kazusa DNA研究所测序随机高分子量脑衍生cDNA的工作(Nagase等人，(1998)DNA Res.5，355-364)。这种新的cDNA克隆编码一种135kDa的蛋白质，包含来自牛Nogo的所有6种肽序列。
人Nogo-A序列在其羧基端的三分之一与Reticulon(Rtn)蛋白质家族共有高度同源性。Rtn1也被称为神经-内分泌特异性蛋白(NSP)，因为它只在神经-内分泌细胞中表达(Van de Velde等人，(1994)J.Cell.Sci.107，2403-2416)。所有Rtn蛋白在蛋白质的羧基端共有200个氨基酸残基的序列相似区(Van de Velde等人，(1994)J.Cell.Sci.107，2403-2416；Roebroek等人，(1996)Genomics 32，191-199；Roebroek等人，(1998)Genomics 51，98-106；Moreira等人，(1999)Genomics58，73-81；Morris等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1450，68-76)。有关序列已经在苍蝇和蠕虫基因组中确定(Moreira等人，(1999)Genomics 58，73-81)。该区在Rtn家族中大约70％相同。氨基端区彼此无关，来源于不同的RNA剪接事件。
通过分析GenBank存放的序列，并根据与公布的Rtn1同种型的同源性，预测出3种形式的Nogo蛋白(Nogo-A，Nogo-B，Nogo-C)。37kDa的Nogo-B可能对应于NI35，解释了NI35与NI250(Nogo-A)轴突生长抑制活性的抗原相关性。Nogo-C-Myc通过SDS-PAGE显示25kDa的电泳迁移率，以前曾被描述为Rtn4和vp2015。Nogo-A蛋白抑制轴突再生的能力只是最近才认识到(GrandPre等人，(2000)Nature 403，439-444；Chen等人，(2000)Nature 403，434-439；Prinjha等人，(2000)Nature403，483-484)。
损伤后轴突不能越过CNS中的损伤再延伸被认为是与创伤、中风和脱髓鞘疾病有关的永久有害作用的原因。NI250的调节已经被描述为CNS创伤、梗塞和变性疾病(Schwab等人，(1994)WO9417831；Tatagiba等人，(1997)Neruosurgery 40，541-546)以及CNS恶性肿瘤如恶性胶质瘤(Schwab等人，(1993)美国专利5,250,414；Schwab等人，(2000)美国专利6,025,333)损伤的神经元的一种再生治疗方法。
曾经报道识别NI250的抗体可用于由CNS创伤、梗塞和变性疾病引起的神经损伤的诊断和治疗(Schnell和Schwab，(1990)Nature343，269-272；Schwab等人，(1997)美国专利5,684,133)。在成为有髓鞘的轴突中，髓鞘质的发育与Nogo的出现之间有相关性。在Nogo被抗体阻断后，神经元能越过由神经损伤引起的损伤再次延伸(Varga等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，10959-10963)。
Nogo抑制轴突生长的作用机制尚未阐明。该作用机制及与Nogo作用相关的生化途径的确定和表征将可用于治疗与轴突损伤和轴突脱髓鞘有关的疾病。
本发明还包括含有分离的核酸分子的与一个或多个表达控制元件可操作地连接的核酸分子，包括载体。本发明还包括转化的含有本发明核酸分子的宿主细胞，和生产蛋白质的方法，该方法包括在表达蛋白质的条件下培养本发明的核酸分子转化的宿主细胞的步骤。
本发明包括一种分离的多肽，其选自含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列的分离的多肽；含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的至少6个(例如10、15、20、25、30、40、50、60或70个)氨基酸的片段的分离的多肽；含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列，具有至少1个(例如5、10、15或20个)保守氨基酸置换的分离的多肽；含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列，具有至少1个(例如5、10、15或20个)自然存在的氨基酸序列置换的分离的多肽；与SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20有至少75％(例如80％、85％、90％或95％)氨基酸序列同一性的分离的多肽。本发明也包括含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列的嵌合多肽。
本发明还提供可与Nogo蛋白结合的抗体和可与Nogo受体蛋白结合的抗体。这些抗体可以是单克隆或多克隆抗体。另外，抗体可以人源化。本发明也包括显示抗原结合活性的抗体片段。
本发明包括一种鉴定可调节Nogo蛋白或Nogo受体蛋白表达的试剂的方法，其包括下列步骤提供表达Nogo蛋白或Nogo受体蛋白的细胞；使该细胞接触候选试剂；检测在候选试剂存在下Nogo蛋白或Nogo受体蛋白表达水平相对于无候选试剂时Nogo蛋白或Nogo受体蛋白表达水平的提高或降低。
本发明也包括一种鉴定可调节Nogo蛋白或Nogo受体蛋白至少一种活性的试剂的方法，其包括下列步骤提供表达Nogo蛋白或Nogo受体蛋白的细胞；使该细胞接触候选试剂；检测在候选试剂存在下Nogo蛋白或Nogo受体蛋白活性水平相对于无候选试剂时Nogo蛋白或Nogo受体蛋白活性水平的提高或降低。在本发明的一个实施方案中，该活性是生长锥运动。在另一个实施方案中，该试剂选自Nogo蛋白片段、抗-Nogo抗体和抗-Nogo受体抗体。
本发明还包括鉴定Nogo受体蛋白的结合配偶体的一种方法，其包括下列步骤提供Nogo受体蛋白；使Nogo受体接触候选结合配偶体；检测候选结合配偶体与Nogo受体蛋白的结合。在一个实施方案中，该结合配偶体选自Nogo蛋白片段、抗-Nogo抗体、抗-Nogo受体抗体片段和人源化抗-Nogo受体抗体。
本发明包括一种治疗哺乳动物中枢神经系统疾病的方法，其包括施用有效量的可调节Nogo蛋白或Nogo受体蛋白表达的试剂的步骤。在本发明的一些实施方案中，表达降低，而在另一些实施方案中，表达增强。
本发明还包括一种治疗哺乳动物中枢神经系统疾病的方法，其包括施用有效量的可调节Nogo蛋白或Nogo受体蛋白活性的试剂的步骤。该活性可以提高或降低。如果活性降低，该试剂可能是，例如含有SEQ IDNO8、10、12、18或20的氨基酸序列的多肽；全长Nogo受体蛋白；Nogo受体蛋白片段；可溶性Nogo受体蛋白片段；或者抗-Nogo受体抗体或其活性片段。如果活性提高，该试剂是选自SEQ ID NO14和16的多肽。
可溶性Nogo受体蛋白能含有SEQ ID NO2或4的至少6个(例如10、15、20、25、30、40、50、60或70个)氨基酸的片段；SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列；含有至少1个(例如5、10、15或20个)保守氨基酸置换的SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列；含有至少1个(例如5、10、15或20个)自然存在的氨基酸序列置换的SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列。
在一些实施方案中，中枢神经系统疾病是颅或脑创伤、脊髓损伤、中风或脱髓鞘疾病的结果。脱髓鞘疾病的例子有多发性硬化症、单相脱髓鞘、脑脊髓炎、多灶性白质脑病、全脑炎、马-比病、脑桥髓鞘破坏、肾上腺脑白质营养不良、佩-梅病、海绵状变性、亚力山大病、卡纳万病、异染性脑白质营养不良和克拉伯病。
本发明还包括一种可与Nogo受体蛋白特异性结合的分离的多肽。该肽与Nogo受体蛋白的特异性结合优选地至少具有下列作用之一抑制Nogo蛋白与Nogo受体蛋白结合，阻断Nogo介导的轴突生长抑制，调节Nogo蛋白表达，或者调节Nogo受体蛋白表达。在一些实施方案中，分离的肽含有SEQ ID NO8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列，或者含有一个或多个(例如5、10、15或20个)保守氨基酸置换或自然存在的氨基酸置换的上述氨基酸序列之一。
图2-Nogo片段拮抗Nogo和CNS髓鞘质作用(a)是如图4所述培养并且估计其生长锥破坏(collapse)的鸡E12背根神经节外植体的照片。培养物暴露于下列制品30分钟，之后固定并用罗丹明-鬼笔环肽染色单独的缓冲液(对照)；15nM GST-Nogo(Nogo)；各1μM的Pep1、Pep2和Pep3(Pep)；15nM GST-Nogo+各1μM的Pep1、Pep2和Pep3(Nogo+Pep)。注意到加入肽阻断了Nogo对生长锥的破坏。Pep1，胞外域的残基1-25；Pep2，11-35；Pep3，21-45。(b)是定量(a)中生长锥破坏试验结果的图。各种肽为4μM，肽1-3混合物是各1μM的每种肽。CNS髓鞘质如述制备，培养物中包括指定的总髓鞘质蛋白浓度。所有结果都是由4-7次测定计算的平均值±s.e.m.。标出了与Nogo或髓鞘质浓度相同但不含肽的相应值显著不同的值(星号，p＜0.05，Student二维t检验)。
图3-Nogo拮抗剂Pep2-41(a)是显示鸡E12背根神经节生长锥破坏试验结果的图。这些试验如GrandPre等人，(2000)Nature 403，439-444所述进行并定量。不加(对照)、应用15nM GST-Nogo(Nogo)或15nM GST-Nogo+1μM Pep2-41(Nogo-Pep)进行实验。这些值是由4次测定计算出的平均值±s.e.m.。(b)是显示结合实验结果的图，其中加入指定浓度的Pep2-41，如图4所述测定10nM AP-Nogo与鸡E12背根神经节神经元的结合。
图4-Nogo Pep2-41阻止Nogo和CNS髓鞘质对神经突突起的抑制该图是显示突起试验结果的图，其中在指定浓度的Pep2-41、纯化的GST-Nogo(GST-Nogo-66)蛋白和粗CNS髓鞘质蛋白存在下培养神经元。鸡E13背根神经节神经元在标准条件下培养。对于突起试验，在指定浓度的Pep2-41、纯化的GST-Nogo(GST-Nogo-66)蛋白和粗CNS髓鞘质蛋白存在下培养神经元。这证明Pep2-41能逆转GST-Nogo或总CNS髓鞘质对神经突突起的抑制。
图5-对于轴突Nogo受体的配体结合试验(a)是凝胶和免疫印迹的照片，其中His-AP-Nogo(66个氨基酸)蛋白在HEK293T细胞中表达，在含镍树脂上通过His尾从条件培养基中纯化。纯化的蛋白质进行SDS-PAGE，用CBB对总蛋白质染色，或者用抗-Nogo抗体(抗Nogo)免疫印迹。200、116、97、65和45 kDa的分子量标记示于左侧，AP-Nogo的迁移示于右侧。(b)是解离的鸡E12背根神经节神经元的照片，它们在23℃下与10nM AP-Nogo或10nM AP-Nogo+160nMGST-Nogo温育60分钟。洗涤、固定细胞，在60℃下温育，以灭活内源AP。通过与四唑硝基蓝温育检测结合的AP-Nogo。注意替换为未标记配体的AP-Nogo的强神经元染色。(c)是显示实验数据的图，其中鸡E12背根神经节生长锥破坏试验中AP-Nogo和GST-Nogo的效能如实施例部分所述估计。测定AP-Nogo的EC50为1nM或更低。显示由5-8次测定计算的平均值±s.e.m.。(d)是显示实验数据的图，其中单独测定，或者在100nMGST-Nogo或4μM Pep2存在下测定10nM AP-Nogo与鸡E12背根神经节神经元的结合，这是利用实施例部分所述的方法由(b)中的实验定量。显示由8次测定计算的平均值±s.e.m.。(e)是显示实验数据的图，其中随AP-Nogo浓度的变化测定AP-Nogo与背根神经节神经元的结合。这是具有类似结果的6次实验之一。(f)是总结重新作图的(e)的数据用于Scatchard分析的图。AP-Nogo与鸡E12背根神经节神经元结合的表观Kd是3nM。
图6-Nogo与表达Nogo受体的COS-7的结合该图是用编码鼠Nogo受体的表达载体转染的COS-7细胞的照片。转染两天后，如实施例中背根神经节神经元部分所述估计AP-Nogo或AP的结合。注意AP-Nogo与Nogo受体表达细胞的选择性结合。在过量的未与AP融合的Nogo肽存在下，结合大大降低。
图7-Nogo受体的结构该示意图说明Nogo受体的主要结构特征。
图8-Nogo受体mRNA的分布该图是Nogo受体mRNA的Northern印迹照片，来自指定鼠组织的polyA+RNA样品在左侧，来自不同大鼠脑区的总RNA样品在右侧。RNA大小标记物的迁移示于左侧。
图9-Nogo-66受体免疫组织学(a)是一张免疫印迹照片，其中通过抗-Nogo-66受体免疫印迹分析来自指定细胞或鸡组织的膜级分(10μg蛋白质)(kDa分子量标记在右侧)。(b)是表达Myc-Nogo-66受体的COS-7细胞或鸡E5脊髓外植体(体外8天)的照片，它们用抗-Nogo-66受体、抗-Myc或少突胶质细胞特异性04抗体染色。下面三张图显示相同视野的双标记免疫组织化学(标尺，上面三张图为40μm，下面三张图为80μm)。(c)是多聚甲醛固定的，用抗-Nogo-66受体制品染色的，成年脑或脊髓的振动切片机切片的照片。这证明脑桥和脊髓中的轴突分布的染色(箭头)。在10μg/ml GST-Nogo-66受体抗原存在下，染色显著降低。


图10-Nogo-66受体介导Nogo-66对生长锥的破坏(a)是在PI-PLC或缓冲液预处理后暴露于Nogo-66的鸡E12 DRG外植体的照片。显示了轴突中F-肌动蛋白的染色(标尺，40μm)。(b)是总结3nM AP或AP-Nogo与鸡E12背根神经节解离神经元结合的实验结果的图。在指明处，培养物用PI-PLC预处理，或在与AP-Nogo的温育中包括150nMGST-Nogo-66。(c)是总结(a)中实验的生长锥破坏测定值的图。鸡E12 DRG培养物在暴露于30nM GST-Nogo-66或100pM Sema3A之前用或不用PI-PLC处理。(d)是用对照病毒(HSV-PlexinA1)或HSV-Myc-Nogo-66受体感染，然后与或不与Nogo-66温育的E7视网膜神经节细胞外植体的照片。显示了轴突生长锥的鬼笔环肽染色(标尺，25μm)。(e)是定量(d)中未感染的或病毒感染的E7视网膜神经元中生长锥破坏的图。
图11-Nogo-66受体的结构-功能分析(a)是不同Nogo-66受体缺失突变体的示意图。利用免疫印迹评价这些突变体的表达水平和AP-Nogo结合。注意到富含亮氨酸重复片段和富含亮氨酸重复片段羧基端是Nogo结合所必需的，但是蛋白质的其余部分不是必需的。在纯化和固定后检测第二种蛋白质。(b)是预测的Nogo-66受体头7个富含亮氨酸重复片段的三维结构图。这是由以预测的leutropin受体相关富含亮氨酸重复片段的结构为基础的计算机模拟产生的(Jiang等人，(1995)Structure 3，1341-1353)。模拟用www.expasy.ch/spdbv的Swiss模型进行。也标出了具有β片层和α螺旋二级结构的区域。
图12-可溶性Nogo受体阻断Nogo-66鸡E13 DRG神经元在标准条件下培养。在生长锥破坏试验中，与100nMNogo-66一起加入分泌鼠Nogo受体1-348氨基酸胞外域片段的HEK 293T细胞的条件培养基或对照条件培养基。在左下图中，图中的数据证明，可溶性受体片段阻断Nogo诱导的破坏。对于突起试验，在对照或Nogo受体胞外域条件培养基以及Nogo-66蛋白(50nM)或中枢神经系统髓鞘质(15μg总蛋白/ml)存在下培养神经元。上面四张图显示的照片证明，中枢神经系统髓鞘质抑制突起并且被Nogo受体胞外域蛋白的存在阻断。在右下图中定量突起。
发明详述I.定义除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员所周知的相同的含义。尽管在本发明的实施或测试中能使用与此处所述相似或相当的任何方法与材料，但描述了优选的方法与材料。
在此使用时，术语“轴突”是指从神经元伸出的长的细胞突出，由此传出(输出)作用电位从细胞体向靶细胞传导。
在此使用时，术语“轴突生长”是指源于细胞体且生长锥在前的长的突起或轴突的延伸。
在此使用时，术语“中枢神经系统疾病”是指与中枢神经系统(CNS)异常功能有关的任何病理状态。该术语包括但不限于由于脑组织物理创伤、病毒感染、自身免疫机制、遗传突变和神经变性疾病或紊乱引起的改变的CNS功能。
在此使用时，术语“嵌合蛋白”是指在氨基酸水平上与野生型序列不完全同源，或者由剪接两种不同核酸来源产生的核酸所编码的任何多肽。该术语包括但不限于融合蛋白，和含有使其氨基酸序列不同于野生型序列的一个或多个氨基酸置换的蛋白质。
在此使用时，术语“脱髓鞘疾病”是指一种病理性疾病，其特征在于少突胶质细胞膜的髓鞘降解。
在此使用时，术语“生长锥”是指位于生长的神经突尖端的特化区域，它负责感觉局部环境，并使轴突向其适合的突触靶细胞运动。
在此使用时，术语“生长锥运动”是指生长锥向神经元靶细胞的延伸或萎陷(collapse)。
在此使用时，术语“神经突”是指自神经元向外生长的突起。由于有时难以区别培养中的树突与轴突，术语神经突适用于此两者。
在此使用时，术语“少突胶质细胞”是指CNS的一种神经胶质细胞，其功能是为CNS轴突加髓鞘。
在此使用时，术语“多肽”是指在水解后产生两种以上氨基酸的肽，根据多肽中所含的氨基酸数量，称为三肽、四肽等。在整个说明书中，术语“多肽”与术语“蛋白质”和“肽”同义使用。II.具体实施方案A.Nogo受体蛋白和Nogo受体蛋白的肽试剂本发明提供分离的蛋白质、蛋白质的等位变体和蛋白质的保守氨基酸置换。在此使用时，蛋白质或多肽是指具有SEQ ID NO2所示人氨基酸序列或SEQ ID NO4所示鼠氨基酸序列的Nogo受体蛋白。蛋白质或多肽也指确定为具有SEQ ID NO8、10、12、14、16、18和20所示氨基酸序列的Nogo受体肽试剂的肽。本发明也包括自然存在的等位变体和蛋白质，它们具有与上述略微不同的氨基酸序列。等位变体尽管具有与上述略微不同的氨基酸序列，但仍然具有与SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18和20所示人和鼠Nogo受体蛋白和Nogo受体肽试剂相关的相同或相似的生物学功能。
在此使用时，与Nogo受体蛋白有关的蛋白质家族是指从除人和小鼠之外的生物中分离的蛋白质。以下描述了用于鉴定和分离Nogo受体蛋白相关蛋白质家族的其它成员的方法。
本发明的Nogo受体蛋白和肽试剂优选地是分离的形式。在此使用时，当利用物理、机械或化学方法从通常与蛋白质相关的细胞组分中移出该蛋白质时，称该蛋白质或配体是分离的。技术人员能容易地利用标准纯化方法获得分离的蛋白质或配体。
本发明的蛋白质还包括此处所述的蛋白质和配体的保守变体。在此使用时，保守变体是指不能负面影响蛋白质生物学功能的氨基酸序列的改变。当改变的序列阻止或破坏与蛋白质相关的生物学功能时，称此置换、插入或缺失负面影响该蛋白质。例如，能改变蛋白质的总电荷、结构或疏水-亲水特性，而不负面影响生物活性。因此，能改变氨基酸序列，例如，使肽更具疏水性或亲水性，而不负面影响蛋白质的生物活性。
等位变体、保守置换变体和蛋白质家族的成员一般具有一种氨基酸序列，该序列与SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18和20所示的人和鼠序列有至少75％的氨基酸序列同一性，更优选地至少80％，再更优选地至少90％，最优选地至少95％。对于这些序列，同一性或同源性在此定义为在比对序列和(必要时为达到最大百分同源性)引入缺口，并且不把任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中与已知肽相同的氨基酸残基的百分数。N端、C端或内部的延伸、缺失或向肽序列内的插入将不视为影响同源性。
因此，本发明的蛋白质和肽包括含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列的分子；其片段，它们具有Nogo受体蛋白和肽试剂的至少约3、4、5、6、10、15、20、25、30、35个或更多氨基酸残基的连续序列；这些序列的氨基酸序列变体，其中至少一个氨基酸残基插入公开序列的N端或C端或内部；公开序列的氨基酸序列变体，或如上定义的其片段，它们被置换为另一个残基。预期的变体还包括通过如同源重组、定点或PCR诱变含有预定突变的变体，和其它动物种的相应蛋白质——这些种包括但不限于兔、大鼠、猪、牛、绵羊、马和非人类灵长类动物种，该蛋白质家族的等位或其它自然存在的变体；以及衍生物，其中通过置换、化学、酶或其它适当方法用不是自然存在的氨基酸的部分(例如，可检测部分，如酶或放射性同位素)共价修饰蛋白质。
如下所述，蛋白质家族的成员能(1)用来鉴定可调节该蛋白质至少一种活性的试剂，(2)用于鉴定该蛋白质的结合配偶体的方法，(3)用作抗原产生多克隆或单克隆抗体，(4)用作治疗剂。B.核酸分子本发明还提供编码含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列的蛋白质和肽及此处所述相关蛋白质的核酸分子，优选地为分离的形式。在此使用时，“核酸”包括基因组DNA、cDNA、mRNA和反义分子，以及基于其它骨架或包含来自天然来源或合成的其它碱基的核酸。
利用为序列相似性检索编制的程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx(Karlin等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，2264-2268，Altschul，(1993)J.Mol.Evol.36，290-300，完全引用作为参考)所使用的算法，通过BLAST(基础局部比对检索工具)分析确定同源性或同一性。BLAST程序所使用的方法是，首先考虑查询序列与数据库序列之间的相似片段，然后评估确定的所有匹配的统计学显著性，最后只概括满足预选显著性阈值的那些匹配。关于序列数据库相似性检索中基本问题的讨论，参见Altschul等人，(1994)Nature Genetics6，119-129，完全引用作为参考。直方图、描述、比对、期望值(即报道对数据库序列匹配的统计学显著性阈值)、界值、矩阵和过滤的检索参数均为默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等人，(1992)Proe.Natl.Acad.Sci.USA89，10915-10919，完全引用作为参考)。4个blastn参数如下调节Q＝10(空位生成罚分)；R＝10(空位扩展罚分)；wink＝1(查询过程中在每个第wink位产生单字采样)；gapw＝16(设置在其中产生空位比对的窗口宽度)。相当的Blastp参数设置是Q＝9；R＝2；wink＝1；gapw＝32。GCG软件包10.0版中可利用的序列间的Bestfit比较使用DNA参数GAP＝50(空位生成罚分)和LEN＝3(空位扩展罚分)，蛋白质比较的相当设置是GAP＝8和LEN＝2。
在此使用时，“高严格条件”是指在50％甲酰胺存在下在42℃下杂交，随后在65℃下用含有1％ SDS钠的2×SSC第一次洗涤，然后在65℃下用0.1×SSC第二次洗涤。
在此使用时，当一种核酸分子与核酸来源中编码其它多肽的污染核酸基本上分开时，称该核酸分子是“分离的”。
本发明还提供编码核酸分子的片段。在此使用时，编码核酸分子的片段是指完整蛋白质编码序列的一部分。其片段大小将取决于目的用途。例如，如果选择片段使之编码蛋白质的活性部分，该片段需要大到足以编码蛋白质的功能区。如果片段用作核酸探针或PCR引物，则选择该片段长度，以便在探查/引发过程中获得相对少量的假阳性。
编码本发明的核酸分子的片段(即合成寡核苷酸)——其用作聚合酶链反应(PCR)的探针或特异引物，或用于合成编码本发明的蛋白质的基因序列，能通过化学技术如Matteucci等人，(1981)J.Am.Chem.Soc.103，3185-3191的磷酸三酯法或利用自动合成法容易地合成。另外，较大的DNA片段能利用众所周知的方法制备，如合成确定基因的不同模块片段的一组寡核苷酸，随后连接这些寡核苷酸，建立完整的修饰基因。
本发明的编码核酸分子可以进一步修饰，以含有检测标记，用于诊断和探针用途。许多这样的标记在本领域周知，能容易地用于此处所述的编码分子。合适的标记包括但不限于生物素、放射性标记的核苷酸等。熟练技术人员能利用本领域已知的任何标记获得标记的编码核酸分子。
通过在翻译过程中缺失、添加或改变掺入蛋白质序列中的氨基酸对一级结构本身的修饰，能在不破坏蛋白质活性的情况下进行。这些置换或其它改变产生具有由属于本发明预期范围内的核酸编码的氨基酸序列的蛋白质。C.其它相关核酸分子的分离如上所述，含有SEQ ID NO1、3、7、9、11、13、15、17和19的人核酸分子的鉴定使熟练技术人员在除此处所述的序列外还能分离编码Nogo受体蛋白家族其它成员的核酸分子。此外，当前公开的核酸分子还能使熟练技术人员分离编码Nogo受体蛋白家族其它成员和肽试剂的核酸分子。
熟练技术人员基本上能容易地利用SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列或其含表位片段产生抗体探针，用来筛查由合适的细胞制备的表达文库。来自纯化蛋白质(如下所述)免疫的哺乳动物(如兔)的多克隆抗血清或单克隆抗体一般能用来探查哺乳动物cDNA或基因组表达文库，如λgtll文库，以期获得蛋白质家族其它成员的合适的编码序列。克隆的cDNA序列能作为融合蛋白表达，利用其自身的控制序列直接表达，或者利用适于表达酶的特定宿主的控制序列构建表达。
此外，也能合成此处所述的编码序列的一部分并用作探针，以便从任何哺乳动物中获得编码该蛋白质家族成员的DNA。能够制备含有大约18-20个核苷酸的寡聚体(编码约6-7个氨基酸长度)，用于筛查基因组DNA或cDNA文库，以便在严格条件下或在足以消除不适当的假阳性水平的严格条件下获得杂交。
另外也能制备寡核苷酸引物对用于聚合酶链反应(PCR)，以便选择性克隆编码核酸分子。使用这些PCR引物的PCR变性/退火/延伸循环在本领域众所周知，能适用于分离其它编码核酸分子。D.含有核酸分子的重组DNA分子本发明还提供含有编码序列的重组DNA分子(rDNA)。在此使用时，rDNA分子是已经进行过分子操作的DNA分子。产生rDNA分子的方法在本领域众所周知，例如，参见Sambrook等人，(1989)《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版社。在优选的rDNA分子中，编码DNA序列与表达控制序列和载体序列可操作地连接。
与本发明的蛋白质家族编码序列之一可操作地连接的载体和表达控制序列的选择，如本领域所周知的，直接取决于所希望的功能特性(例如蛋白质表达和将要转化的宿主细胞)。本发明的载体至少可以能够引导rDNA分子中所含结构基因的复制，或者向宿主染色体中的插入，优选地还有表达。
用于调节可操作地连接的蛋白质编码序列表达的表达控制元件在本领域中周知，包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、分泌信号和其它调节元件。优选地，诱导型启动子易于控制，如对宿主细胞培养基中的养分有反应性。
在一个实施方案中，含有编码核酸分子的载体将包含原核复制子，即一种DNA序列，其具有引导重组DNA分子在其转化的原核宿主细胞(如细菌宿主细胞)中染色体外自主复制和保持的能力。这些复制子在本领域众所周知。另外，含有原核复制子的载体也可包含其表达提供检测标记(如抗药性)的基因。典型的细菌抗药性基因是引起氨苄青霉素或四环素抗性的基因。
含有原核复制子的载体能进一步包含能引导编码基因序列在细菌宿主细胞(如大肠杆菌)中表达(转录和翻译)的原核或噬菌体启动子。启动子是由一种DNA序列形成的表达控制元件，它允许发生RNA聚合酶的结合和转录。适用于细菌宿主的启动子序列一般在含有便于插入本发明DNA片段的限制位点的质粒载体中提供。这些载体质粒的例子有pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories)、pPL和pKK23(Pharmacia)。任何合适的原核宿主都能用来表达编码本发明的蛋白质的重组DNA分子。
适用于真核细胞，优选地适用于脊椎动物细胞的表达载体也能用来形成含有编码序列的rDNA分子。真核细胞表达载体在本领域众所周知，可从几个商业来源获得。这些载体一般含有便于插入希望的DNA片段的限制位点。这些载体的例子有pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1、pML2d(International Biotechnologies)、pTDT1(ATCC 31255)等真核表达载体。
用于构建本发明的rDNA分子的真核细胞表达载体可进一步含有在真核细胞中有效的选择性标记，优选地是抗药性选择标记。一种优选的抗药性标记是其表达导致新霉素抗性的基因，即新霉素磷酸转移酶(neo)基因。(Southern等人，(1982)J.Mol.Anal.Genet.1，327-341)。或者，选择性标记也能存在于不同的质粒上，通过宿主细胞共转染导入的两种载体上，以及通过在适于选择性标记的药物中培养筛选的转染子中。E.含有外源编码核酸分子的宿主细胞本发明还提供用编码本发明的蛋白质的核酸分子转化的宿主细胞。此宿主细胞可以是原核或真核的。可用于表达本发明的蛋白质的真核细胞没有限制，只要该细胞系适合细胞培养方法，并且适合表达载体的繁殖和基因产物的表达。优选的真核宿主细胞包括但不限于酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选地是脊椎动物细胞，如来自小鼠、大鼠、猴或人细胞系的细胞。有用的真核宿主细胞的例子包括可从ATCC以CCL61获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、可从ATCC以CRL1658获得的NIH Swiss小鼠胚胎细胞NIH-3T3、幼仓鼠肾细胞(BHK)等真核组织培养细胞系。
用本发明的rDNA分子转化合适的细胞宿主通过众所周知的方法完成，方法一般取决于所用的载体和宿主系统的类型。对于原核宿主细胞的转化，能使用电穿孔和盐处理法(参见，例如，Sambrook等人，(1989)《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版社；Cohen等人，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110-2114)。对于用含有rDNA的载体转化脊椎动物细胞，能使用电穿孔、阳离子脂或盐处理法(参见，例如，Graham等人，(1973)Virology 52，456-467；Wigler等人，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，1373-1376)。
成功转化的细胞，即含有本发明的rDNA分子的细胞，能用众所周知的技术鉴定，包括根据选择性标记筛选。例如，能克隆由导入本发明的rDNA产生的细胞，产生单菌落。能收获来自这些菌落的细胞，裂解，利用如Southern，(1975)J.Mol.Biol.98，503-517所述的方法检查其DNA内含物是否含有该rDNA，或者通过免疫学方法测定细胞产生的蛋白质。F.利用rDNA分子产生重组蛋白本发明还提供利用此处所述核酸分子产生本发明的蛋白质的方法。概括起来，重组形式蛋白质的产生一般包括下列步骤首先，获得编码本发明的蛋白质的核酸分子，如SEQ ID NO1、3、7、9、11、13、15、17和19所示的核酸分子或SEQ ID NO1的核苷酸166-1584和SEQ ID NO3的核苷酸178-1596。如果编码序列不被内含子隔断，它直接适于在任何宿主中表达。
然后优选地将核酸分子与如上所述的合适的控制序列可操作地连接，形成含有蛋白质开放阅读框的表达单元。该表达单元用来转化合适的宿主，转化的宿主在允许产生重组蛋白的条件下培养。任选地，该重组蛋白从培养基或从细胞中分离；在可容许一些杂质的某些情况中，蛋白质的回收和纯化可能不是必需的。
上述每一个步骤能都以多种方式进行。例如，希望的编码序列可以由基因组片段获得，在适当宿主中直接应用。在多种宿主中有效的表达载体的构建利用如上所述的合适的复制子和控制序列完成。控制序列、表达载体和转化方法取决于用来表达基因的宿主细胞的类型，在较早前已详述。如果不能正常获得，合适的限制位点能添加到编码序列末端，以便为插入这些载体中提供可酶切的基因。熟练技术人员能容易地修改本领域所知的任何宿主/表达系统，供本发明的核酸分子使用，用来产生重组蛋白。G.鉴定结合配偶体的方法本发明提供用于分离和鉴定本发明蛋白质的结合配偶体的方法。在一些实施方案中，本发明的蛋白质与一种可能的结合配偶体或细胞提取物或级分在允许可能的结合配偶体与本发明蛋白质结合的条件下混合。混合后，从混合物中分离与本发明的蛋白质结合的肽、多肽、蛋白质或其它分子。然后能分离出与本发明的蛋白质结合的结合配偶体，进一步分析。为了鉴定和分离结合配偶体，能使用完整的蛋白质，如SEQ ID NO2或4的完整Nogo受体蛋白或SEQ ID NO6的完整Nogo蛋白。或者，也能使用蛋白质片段。有用的Nogo受体蛋白片段的一个例子是缺乏跨膜域的可溶性Nogo受体多肽(图7)。
在此使用时，细胞提取物是指由裂解的或破裂的细胞制成的制品或级分。细胞提取物的优选来源是来自人脑或脊髓组织(如人大脑组织)的细胞。此外，细胞提取物也可以由任何来源的神经元组织或可获得的神经元细胞系，特别是少突胶质细胞衍生的细胞系制备。
能利用多种方法获得细胞提取物。能用物理或化学破碎方法破碎细胞。物理破碎法的例子包括但不限于超声处理和机械剪切。化学裂解法的例子包括但不限于去污剂裂解和酶裂解。熟练技术人员能容易地修改制备细胞提取物的方法，以便获得供本方法使用的提取物。
一旦制备细胞提取物，该提取物即与本发明的蛋白质在该蛋白质能与结合配偶体结合的条件下混合。能使用多种条件，最优选的是与人细胞质中发现的条件极类似的条件。为了优化蛋白质与结合配偶体的结合，能改变所使用的细胞提取物的特征，如摩尔渗透压浓度、pH、温度和浓度。
在适当条件下混合后，从混合物中分离结合复合物。能利用多种技术分离混合物。例如，能利用对本发明的蛋白质特异的抗体免疫沉淀结合配偶体复合物。此外也能使用标准化学分离技术，如层析和密度沉降离心。
在除去提取物中未结合的细胞组分后，能利用常规方法从复合物中解离下结合配偶体。例如，能通过改变混合物的盐浓度或pH实现解离。
为了帮助从混合提取物中分离结合的结合配偶对，本发明的蛋白质能固定于固体载体上。例如，蛋白质能附着于硝酸纤维素基质或丙烯酸珠上。蛋白质附着于固体载体上有助于将肽-结合的配偶体对与提取物中的其它组分分离。鉴定的结合配偶体可以是一种蛋白质或由两种或多种蛋白质组成的复合物。此外也可以利用下列方法鉴定结合配偶体根据Flanagan和Vanderhaeghen，(1998)Annu.Rev.Neurosci.21，309-345或Takahashi等人，(1999)Cell 99，59-69的步骤的碱性磷酸酶融合试验；根据Takayama等人，(1997)Methods Mol.Biol.69，171-184或Sauder等人，J.Gen.Virol.(1996)77，991-996的步骤的Far-Western试验；或利用表位标记的蛋白质或GST融合蛋白鉴定。
此外，本发明的核酸分子也能用于酵母双杂交系统。酵母双杂交系统已经用来鉴定其它蛋白质配偶体对，并且能容易地改动以使用此处所述的核酸分子(参见Stratagene Hybrizap双杂交系统)。H.鉴定调节表达的试剂的方法本发明提供鉴定可调节编码Nogo受体蛋白的核酸表达的试剂的方法。本发明也提供鉴定可调节编码Nogo蛋白的核酸表达的试剂的方法。这些试验可以利用监测本发明的核酸表达水平改变的任何可用方法。在此使用时，如果一种试剂能上调或下调本发明的核酸(如编码具有SEQ IDNO2、4或6的序列的蛋白质的核酸)在细胞中的表达，则认为该试剂可调节该核酸的表达。
在一种测定形式中，可以制备含有报道基因融合物的细胞系，它们是SEQ ID NO1的核苷酸166-1584或SEQ ID NO3的核苷酸178-1596或SEQ ID NO5的核苷酸135-3713所限定的开放阅读框与任何可测定的融合配偶体之间的融合物。大量可测定的融合配偶体已知，并且易于获得，包括荧火虫萤光素酶基因和编码氯霉素乙酰转移酶的基因(Alam等人，(1990)Anal.Biochem.188，245-254)。含有报道基因融合物的细胞系然后在合适的条件和时间下暴露于待测试剂。暴露于试剂的样品与对照样品之间报道基因的不同表达鉴定出调节编码具有SEQ ID NO2、4或6之序列的蛋白质的核酸表达的试剂。
可以用其它测定形式监测该试剂调节编码本发明的Nogo受体蛋白如具有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的Nogo蛋白的核酸表达的能力。例如，可以通过与本发明的核酸杂交直接监测mRNA表达。细胞系在合适的条件和时间下暴露于待测试剂，总RNA或mRNA通过标准方法分离，如Sambrook等人，(1989)《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版社所公开的。
用来检测暴露于试剂的细胞与对照细胞之间RNA表达水平的差异的探针可以由本发明的核酸制备。设计在高严格条件下只与靶核酸杂交的探针是优选的，但不是必需的。在高严格条件下只形成高度互补的核酸杂合体。因此，试验条件的严格性决定了为形成杂合体，两种核酸链之间应当存在的互补性的量。应当选择严格性，使探针靶杂合体与可能的探针非靶杂合体之间的稳定性差异最大。
可以利用本领域周知的方法由本发明的核酸设计探针。例如，探针的G+C含量和探针长度能影响探针与其靶序列的结合。优化探针特异性的方法一般能在下列文献中获得Sambrook等人，(1989)《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版社，或者，Ausubel等人，(1995)《现代分子生物学方法》，Greene Publishing。
按每种探针所需要的，利用周知的方法修改杂交条件，如Sambrook等人，(1989)和Ausubel等人，(1995)所述。总细胞RNA或为polyA+RNA富集的RNA的杂交能以任何可利用的形式完成。例如，总细胞RNA或为polyA+RNA富集的RNA能固定到固体载体上，固体载体在探针将特异杂交的条件下暴露于至少一种探针，该探针含有至少一种本发明的序列或其部分。或者，含有至少一种本发明的序列或其部分的核酸片段能固定到固体载体上，如基于硅的晶片或多孔玻璃晶片上。该晶片然后能在固定序列将特异杂交的条件下暴露于来自样品的总细胞RNA或polyA+RNA。这些晶片和杂交方法可以广泛获得，例如，Beattie，(1995)WO9511755所述。通过检查特定探针与来自未处理的细胞群体和来自暴露于试剂的细胞群体的RNA样品特异杂交的能力，鉴定可上调或下调编码具有SEQ IDNO2或4序列的Nogo受体蛋白的核酸表达的试剂。
用于mRNA定性和定量分析的杂交也可以利用RNase保护试验(即，RPA，参见Ma等人，Methods(1996)10，273-238)进行。简言之，含有编码基因产物的cDNA和噬菌体特异性DNA依赖的RNA聚合酶启动子(例如T7、T3或SP6 RNA聚合酶)的一种表达载体在cDNA分子的3’端、噬菌体启动子的下游线性化，这种线性化分子随后作为模板，用于通过体外转录合成cDNA的标记的反义转录物。标记的转录物然后通过在含有80％甲酰胺、40mM Pipes，pH6.4、0.4M NaCl和1mM EDTA的缓冲液中45℃温育过夜，与分离的RNA(即总mRNA或分级分离的mRNA)的混合物杂交。产生的杂合体在含有40μg/ml核糖核酸酶A和2μg/ml核糖核酸酶的缓冲液中消化。在钝化和抽提出外源蛋白质后，将样品加于尿素-聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。
在另一种测定形式中，首先鉴定影响基因产物表达的试剂，生理表达该基因产物的细胞或细胞系。这样鉴定的细胞和细胞系预期含有必要的细胞机器，以便对于试剂与合适的表面转导机制和胞质级联的外源接触，保持转录装置调节的保真度。进而，用表达载体(例如质粒或病毒载体)转导或转染这些细胞或细胞系，这些含有编码该基因产物的结构基因含可操作的非翻译5’-启动子的末端，其与一个或多个这些基因产物特有的抗原片段融合，其中该片段处于该启动子的转录控制下，表达为分子量与自然存在的多肽不同的多肽，或者可能进一步含有一种免疫学上不同的标签。这种方法在本领域众所周知(参见，Sambrook等人，(1989)《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版社)。
如上所述转导或转染的细胞或细胞系然后在适当条件下接触试剂；例如，试剂含有药学可接受的赋形剂，在水性生理缓冲液(如生理pH的磷酸缓冲盐溶液(PBS)、生理pH的Eagles平衡盐溶液(BSS)、含血清的PBS或BSS，或含PBS或BSS和血清的条件培养基，37℃温育)中接触细胞。当本领域技术人员认为必要时，可以调整这些条件。细胞与试剂接触之后，破碎细胞，并分级分离破碎物的多肽，以合并多肽级分并接触抗体，用免疫学试验(例如ELISA、免疫沉淀或Western印迹)进一步处理。从“接触试剂的”样品中分离的蛋白质合并物与只有赋形剂接触细胞的对照样品比较，利用“接触试剂的”样品免疫学产生的信号相对于对照的升高或降低判别试剂的效能。I.鉴定调节活性的试剂的方法本发明提供鉴定可调节Nogo受体蛋白至少一种活性的试剂的方法。本发明也提供鉴定可调节Nogo蛋白至少一种活性的试剂的方法。这些方法或试验可以应用监测或检测希望的活性的任何方法。
在一种形式中，可以测定暴露于待测试剂的细胞群体与未暴露的对照细胞群体之间，标准化为标准单位的Nogo受体蛋白或Nogo蛋白的比活性。细胞系或群体在合适的条件和时间下暴露于待测试剂。可以由暴露的细胞系或群体和对照、未暴露的细胞系或群体制备细胞裂解物。然后用探针分析细胞裂解物。
能应用适当的免疫方案，通过用Nogo受体蛋白、Nogo蛋白、Nogo受体肽试剂或上述任何一个的含抗原片段免疫合适的哺乳动物宿主，制备抗体探针。为了提高免疫原性，这些蛋白质或片段能与合适的载体偶联。用载体如BSA、KLH或其它载体蛋白制备免疫原偶联物的方法在本领域众所周知。在一些情况下，例如利用碳二亚胺试剂直接偶联可能是有效的；在其它情况下，为了提供半抗原的可接近性，如Pierce ChemicalCo.提供的连接试剂可能是希望的。例如，半抗原肽能在氨基或羧基端延长一个半胱氨酸残基或散布半胱氨酸残基，便于与载体连接。免疫原的施用通常通过在适当时间内和利用适当佐剂注射进行，如本领域所公知的。在免疫程序中，用抗体效价确定抗体形成的充分性。
尽管这样产生的多克隆抗血清可能满足某些用途，但是对于药用组合物，优选使用单克隆制品。分泌希望的单克隆抗体的无限增殖细胞系可以用标准方法制备，参见，例如，Kohler和Milstein，(1992)Biotechnology 24，524-526，或者如公知的实现淋巴细胞或脾细胞无限增殖化的变更方法。分泌希望的抗体的无限增殖细胞系能用免疫测定筛选，其中抗原是肽半抗原、多肽或蛋白质。当鉴定分泌希望的抗体的适当无限增殖细胞培养物时，细胞能在体外培养或在腹水中产生。
可以从培养上清液或从腹水上清液中回收希望的单克隆抗体。含有免疫学重要部分的完整抗-Nogo或抗-Nogo受体抗体或其片段能用作例如Nogo(配体)与Nogo受体结合的拮抗剂。免疫反应性片段如F(ab’)2片段的Fab、Fab’的使用通常是优选的，特别是在治疗用途中，因为这些片段通常比整个免疫球蛋白免疫原性更低。
抗体或片段也可以用现有技术通过重组方法产生。与希望的蛋白质区特异结合的抗体区也能以有多种物种来源的嵌合体的形式产生。
与希望的蛋白质区特异结合的抗体区也能以有多种物种来源的嵌合体的形式产生，例如，人源化抗体。因此该抗体可以是人源化抗体或人类抗体，如美国专利5,585,089或Riechmann等人，(1988)Nature332，323-327所述。
能随机选择或合理选择或设计用以上方法测定的试剂。在此使用时，当随机选择一种试剂，而不考虑参与本发明的蛋白质独自或与其结合底物、结合配偶体等结合的特定序列时，称随机选择该试剂。随机选择的试剂的一个实例是使用化学文库或肽组合文库，或一种生物的生长培养液。
在此使用时，当考虑靶位点序列或与试剂作用有关的构象，非随机地选择一种试剂时，称合理选择或设计该试剂。能利用组成这些位点的肽序列合理选择或合理设计试剂。例如，合理选择的肽试剂可以是这样一种肽其氨基酸序列相同于与Nogo受体相互作用的Nogo的结合域(SEQ IDNO20)。或者，也可以是该结合域的片段，例如SEQ ID NO8、10、12、14、16和18。
本发明的试剂可以是，例如肽、抗体、抗体片段、小分子、维生素衍生物以及碳水化合物。本发明的肽试剂能用如本领域所知的标准固相(或溶液相)肽合成法制备。另外，编码这些肽的DNA也可以用商品获得的寡核苷酸合成仪器合成，以及用标准重组生产系统重组产生。如果包含非基因编码的氨基酸，利用固相肽合成产生是必需的。
本发明的另一类试剂是可与Nogo蛋白或Nogo受体蛋白结合的抗体或其片段。抗体试剂能如下获得用含有将被抗体靶向的蛋白质部分作为抗原区的肽免疫合适的哺乳动物。
J.高通量试验高通量筛选的功能是用来寻找能与Nogo受体蛋白相互作用的新的化合物。关于高通量筛选的一般信息(例如Devlin，(1998)《高通量筛选》，Marcel Dekker；美国专利5,763,263)。高通量试验利用一种或多种不同的测定技术。
免疫诊断和免疫测定。有一组技术可用于测定复杂混合物(如生物流体)中的特异性生化物质(通常浓度较低)，这依赖于适当制备和选择的抗体对于其互补抗原所显示的特异性和高亲和性。将要测定的物质必须是抗原性的——免疫原性大分子或半抗原小分子。向每个样品中加入已知的、有限量的特异性抗体，用放射性同位素(放射免疫测定)、荧光分子(荧光免疫测定)、稳定自由基(自旋免疫测定)、酶(酶免疫测定)或其它易于辨别的标记物标记的抗原形式作为指示剂，估计与特异性抗体结合的抗原的分数，通常表示为结合游离比。
抗体能用多种方法标记，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)；放射免疫测定(RIA)；荧光免疫测定(FIA)；化学发光免疫测定(CLIA)；用胶体金颗粒(免疫金)标记抗体。
常用的测定形式包括夹心测定、竞争性或竞争测定、乳胶凝聚测定、均相测定、微孔板形式和基于微粒的测定。
酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA是一种避免放射性化学试剂危害和荧光检测系统花费的免疫化学技术。该测定使用酶作为指示剂。ELISA是一种定量免疫测定形式，基于使用与不可溶载体表面连接的抗体(或抗原)，然后用来“捕获”待测溶液中的相关抗原(或抗体)。然后通过测定已经与抗原(或抗体)共价连接的适当酶的活性，检测抗原-抗体复合物。
关于ELISA技术的信息，参见，例如，Crowther，(1995)《ELISA——理论与实践(分子生物学方法)》，Human Press；Challacombe和Kemeny，(1998)《ELISA与其它固相免疫测定——理论与实践》，JohnWiley；Kemeny，(1991)《ELISA应用指南》，Pergamon Press；Ishikawa，(1991)《超灵敏且快速的酶免疫测定(生物化学和分子生物学实验室技术)》，Elsevier。
酶的比色测定。比色法是这样的任一种定量化学分析方法例如使用比色计或分光光度计，通过比较试剂与标准和待测含量的化合物反应产生的颜色，确定该化合物的浓度或含量。
β-半乳糖苷酶活性的标准比色测定为本领域技术人员所周知(参见，例如，Norton等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5，281-290)。在β-半乳糖苷酶标准比色测定中，能利用邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG，Sigma)作为底物，对全细胞裂解物进行比色测定(Sambrook等人，(1989)《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室出版社)。自动比色测定也可用于β-半乳糖苷酶活性的检测(参见，例如美国专利5,733,720)。
免疫荧光测定。免疫荧光或免疫荧光显微术是这样一种技术抗原或抗体通过与荧光染料结合成为荧光性的，然后使之与组织切片或涂片中的互补抗体或抗原反应。然后在紫外光下利用显微术观察荧光，确定抗原或抗体的位置。
关于免疫荧光技术的一般信息，参见，例如，Knapp等人，(1978)《免疫荧光与相关染色技术》，Elsevier；Allan，(1999)《利用荧光显微术的蛋白质定位——应用方法(应用方法系列)》，牛津大学出版社；Caul，(1993)《诊断微生物学中的免疫荧光抗原检测技术》，剑桥大学出版社。关于适用于本发明的免疫荧光技术的详细说明，参见美国专利5,912,176；美国专利5,869,264；美国专利5,866,319；美国专利5,861,259。K.调节活性的试剂的应用如实施例所述，Nogo和Nogo受体蛋白和核酸，如具有SEQ ID NO2、4或6的氨基酸序列的蛋白质，在来自轴突和树突的髓鞘质中表达。调节或上调或下调Nogo或Nogo受体蛋白表达的试剂，或者Nogo或Nogo受体蛋白至少一种活性的激动剂或拮抗剂等试剂，可用来调节与蛋白质功能和活性有关的生物学和病理过程。本发明特别可用于人类患者的治疗。
病理过程是指产生有害作用的一类生物学过程。例如，本发明的蛋白质的表达可能与颅、脑或脊髓创伤、中风或脱髓鞘疾病后轴突再生的抑制有关。这些脱髓鞘疾病包括但不限于多发性硬化症、单相脱髓鞘、脑脊髓炎、多灶性白质脑病、全脑炎、马-比病、脑桥髓鞘破坏、肾上腺脑白质营养不良、佩-梅病、海绵状变性、亚力山大病、卡纳万病、异染性脑白质营养不良和克拉伯病。在此使用时，当一种试剂降低病理过程的程度或严重性时，称该试剂调节(modulate)该过程。例如，施用能以一定方式降低、促进或调节本发明的蛋白质的表达或至少一种活性的试剂，可以预防脱髓鞘疾病，或调节疾病的进展。
在一个实例中，施用SEQ ID NO8、10、12、14、16、18和20所示的Nogo肽试剂能用来治疗与Nogo或Nogo受体蛋白相关的脱髓鞘疾病。在另一个实例中，可以将表达本发明的肽试剂的细胞移植到脊髓损伤部位，促进整个损伤部位的轴突生长。这些移植的细胞将为损伤或创伤后恢复脊髓功能提供可能。
在另一个实例中，施用能结合Nogo的可溶性Nogo受体蛋白能用来治疗与Nogo或Nogo受体蛋白相关的脱髓鞘疾病。该试剂能用来预防Nogo与细胞结合的Nogo受体的结合，并作为Nogo的拮抗剂。可溶性受体已经用来结合细胞因子或其它配体，来调节其功能(Thomson，(1998)《细胞因子手册》，Academic Press)。可溶性受体存在于溶液中，或膜外。因为没有跨膜或与膜结合的分子片段，故可能存在可溶性受体。这种片段在本领域中通常称作基因的跨膜域，或者蛋白质的膜结合片段。因此，在本发明的一些实施方案中，可溶性受体包括膜结合受体的片段或类似物。优选地，该片段包含至少6个(例如10、15、20、25、30、40、50、60或70个)氨基酸，只要它保留希望的活性。
在本发明的其它实施方案中，修饰与膜结合的片段的结构(例如，DNA序列多态性或基因突变)，使得受体不能插入膜中，或者受体能够插入但不能保留在膜内。因此，与相应的膜结合形式不同，可溶性受体在对于与膜结合而言至关重要的基因或受体蛋白的一个或多个片段上不同。
本发明的试剂能够单独提供，或者与可调节特定病理过程的其它试剂组合或顺序组合提供。例如，在中风后，本发明的试剂能与消炎剂组合施用，作为阻断进一步神经元损伤和轴突再生抑制的方法。在此使用时，当两种试剂同时施用或以两种试剂同时作用的方式独立施用时，称这两种试剂为组合施用。
本发明的试剂能通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、经皮或口腔途径施用。例如，试剂可以通过微量输注局部施用于损伤部位。典型部位包括但不限于损伤引起的脊髓损伤区或中风引起的脑损伤部位。作为替代，或者同时，可以通过经口途径施用。施用的剂量将取决于受体的年龄、健康和体重，同时治疗的种类(如果有的话)，治疗频率和希望的作用性质。
本发明进一步提供含有一种或多种调节本发明蛋白质的表达或至少一种活性的试剂的组合物。个体需要不同时，确定每种成分的最佳有效含量属于本领域的现有技术范围。一般剂量为1pg/kg-100mg/kg体重。全身施用的优选剂量为100ng/kg-100mg/kg体重。通过微量输注向部位直接施用的优选剂量为1ng/kg-1μg/kg体重。
除了药理学活性剂以外，本发明的组合物中还可含有合适的药学可接受的载体，包括赋形剂和助剂，它们使活性化合物易于加工成能作为药物向作用部位应用的制剂。适用于肠胃外施用的制剂包括水溶形式的活性化合物(例如水溶性盐)的水溶液。另外也可以施用活性化合物的悬液，如适当的油状注射悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的物质，包括，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和葡聚糖。任选地，悬液中也可以含有稳定剂。也能用脂质体包封试剂，用于向细胞内输送。
用于全身施用的根据本发明的药物制剂可以根据肠、肠胃外或局部施用配制。实际上，所有这三种类型的制剂可以同时应用，以实现活性成分的系统施用。适用于经口施用的制剂包括硬或软胶囊、丸剂、片剂(包括包衣的片剂)、酏剂、悬液、糖浆或其吸入和控释形式。
在实施本发明的方法的过程中，本发明的试剂可以单独或组合应用，或与其它治疗或诊断剂组合应用。在某些优选实施方案中，本发明的化合物可以与其它化合物同时施用，这些化合物一般是根据公认的医疗实践为这些病症所开具的，如消炎剂、抗凝剂、抗血栓形成剂，包括血小板凝集抑制剂，组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、尿激酶原、链激酶、阿司匹林和肝素。本发明的化合物能在体内使用，通常是在哺乳动物内，如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠，或在体外使用。L.拟肽本发明也包括模拟Nogo的三维结构并阻断Nogo与Nogo受体结合的拟肽(peptide mimetics)。这些拟肽与自然存在的肽相比可能具有明显的优点，包括，例如生产更经济，更高的化学稳定性、提高的药理学性质(半寿期、吸收、效能等)、改变的特异性(例如广谱生物活性)、降低的抗原性等。
一种形式的拟肽是模拟蛋白质二级结构元件的含肽分子(参见，例如，Johnson等人，(1993)肽转变为拟肽，《生物技术与药剂学》，Pezzuto等人(编写)Chapman and Hall)。应用拟肽的基本原理是，蛋白质的肽骨架主要是定向氨基酸侧链，这样便于分子的相互作用，如抗体和抗原的相互作用。预计拟肽能允许类似于自然分子的分子相互作用。
另一种形式是，肽类似物通常在制药工业中用作性质类似于模板肽的非肽药物。这些类型的非肽化合物也称作“拟肽”(peptide mimetics或peptidomimetics)(Fauchere，(1986)Adv.Drug Res.15，29-69；Veber和Freidinger，(1985)Trends Neurosci.8，392-396；Evans等人，(1987)J.Med.Chem.30，1229-1239，在此引用作为参考)，通常借助于计算机分子模拟研制。
结构上类似于治疗上有用的肽的拟肽可以用来产生相当的治疗或预防作用。拟肽一般在结构上类似于模式多肽(即，具有生化性质或药理学活性的多肽)，如Nogo的胞外域，但其一个或多个肽键任选地被替换为选自下列的键-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-，这利用本领域所知且在下列参考文献中进一步描述的方法实现Weinstein，(1983)氨基酸的化学与生物化学，《肽与蛋白质》，Marcel Dekker；Morley，(1980)Trends Pharmacol.Sci.1，463-468(综述)；Hudson等人，(1979)Int.J.Pept.Protein Res.14，177-185(-CH2NH-、CH2CH2-)；Spatola等人，(1986)Life Sci.38，1243-1249(-CH2-S)；Hann，(1982)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，307-314(-CH-CH-，顺式和反式)；Almquist等人，(1980)J.Med.Chem.23，1392-1398(-COCH2-)；Jennings-White等人，(1982)TetrahedronLett.23，2533(-COCH2-)；Holladay等人，(1983)Tetrahedron Lett.24，4401-4404(-C(OH)CH2-)；Hruby，(1982)Life Sci.31，189-199(-CH2S-)；均在此引用作为参考。
拟肽的标记一般包括一种或多种标记物直接或通过间隔区(例如酰胺基)与拟肽上的非干扰位点共价结合，这些位点根据定量结构-活性数据和分子模建预测。这些非干扰位点通常是与拟肽与之结合产生治疗作用的大分子不形成直接接触的位点(例如，不是Nogo-Nogo受体复合物中的接触点)。拟肽的衍生化(例如标记)应当基本上不干扰拟肽的希望的生物学或药理学活性。
Nogo拟肽能根据基于结构的药物设计，通过将氨基酸替换为有机部分构建(参见，例如，Hughes，(1980)Philos.Trans.R.Soc.Lond.290，387-394；Hodgson，(1991)Biotechnol.9，19-21；Suckling，(1991)Sci.Prog.75，323-359)。
利用组合化学产生药物文库能加强拟肽的利用。鉴定增强或减弱Nogo与Nogo受体结合的氨基酸突变能有助于拟肽的设计。可以使用的方法包括酵母双杂交法(参见Chien等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，9578-9582)和利用噬菌体展示法。双杂交法在酵母中检测蛋白质-蛋白质相互作用(Fields等人，(1989)Nature 340，245-246)。噬菌体展示法检测固定的蛋白质与在噬菌体(如λ和M13)表面表达的蛋白质的相互作用(Amberg等人，(1993)Strategies 6，2-4；Hogrefe等人，(1993)Gene 128，119-126)。这些方法允许对蛋白质-蛋白质相互作用进行正选择和负选择以及鉴定决定这些相互作用的序列。
关于肽合成和拟肽的一般信息，参见，例如Jones，(1992)《氨基酸与肽合成》，牛津大学出版社；Jung，(1997)《组合肽和非肽文库手册》，John Wiley；Bodanszky等人，(1993)《肽化学-实用手册》，Springer Verlag。M.转基因动物术语“动物”在此使用时包括除人之外的所有脊椎动物。也包括处于所有发育阶段，包括胚胎和胎儿阶段的个体动物。“转基因动物”是含有一个或多个携带遗传信息的细胞的动物，这些遗传信息通过亚细胞水平的精密遗传操作，如通过显微注射或重组病毒感染，直接或间接获得。这种导入的DNA分子可以整合到染色体中，或者可以是染色体外复制的DNA。术语“生殖细胞系转基因动物”是指一种转基因动物，其中遗传信息导入种系细胞中，由此赋予将该信息传递给后代的能力。如果这些后代实际上具有某些或全部该信息，则它们也是转基因动物。本发明包括含有突变、敲除、修饰的基因或基因结构，从而过量表达或条件表达与SEQ ID NO1或3的cDNA序列或有关序列相应的基因的转基因动物。
这种信息可能是受体所属的动物的种外源的，只是特定个体受体外源的，或者是受体已经具有的遗传信息。在最后一种情况中，导入的基因可能与自然内源基因不同地表达。这些基因的获得方法包括从基因组来源中分离，由分离的RNA模板制备cDNA，定向合成，或它们的某种组合。
为了能够表达，基因应当与调节区可操作地连接。调节区，如启动子，可以用来增强、减弱、调节基因表达或指明特定组织或特定发育阶段基因表达。启动子不必是自然存在的启动子。本发明的“转基因非人类动物”通过向非人类动物的种系中导入“转基因”产生。能将DNA导入细胞中的方法一般是可以利用的，并且在本领域中众所周知。能够使用不同的导入转基因的方法。一般而言，合子是显微注射的最佳靶标。在小鼠中，雄性原核达到直径接近20微米的大小，这使得可重复注射1-2皮升DNA溶液。合子用作基因转移的靶标具有重要的优点。在大多数情况中，注射的DNA将在第一次分裂前掺入宿主基因中(Brinster等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，4438-4442)。因此，转基因非人类动物的几乎所有细胞将携带掺入的转基因。这通常也导致转基因向起始者的后代有效传递，因为50％的生殖细胞将携带该转基因。在实施本发明的过程中，合子显微注射是导入转基因的一种优选方法。
也能利用逆转录病毒感染向非人类动物中导入转基因。发育中的非人类胚胎能在体外培养至胚泡期。在这期间，卵裂球可能是逆转录病毒感染的靶标。利用酶处理除去透明带实现卵裂球的有效感染。用来导入转基因的病毒载体系统一般是携带该转基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，6927-6931；Vander Putten等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，6148-6152)。通过在产病毒细胞单层上培养卵裂球能容易且有效地实现转染(Van derPutten等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，6148-6152；Stewart等人，(1987)EMBO J.6，383-388)。此外也能在后期进行感染。病毒或产病毒细胞能注射到囊胚腔中(Jahner等人，(1982)Nature298，623-628)。大多数起始动物将是转基因嵌合的，因为只在形成转基因非人类动物的细胞亚群中才发生掺入。而且，起始动物可能在基因组的许多位置含有逆转录病毒插入的转基因；它们在后代中通常分离。另外，也能通过子宫内逆转录病毒感染妊娠中期胚胎，向种系中导入转基因，尽管效率较低(Jahner等人，(1982)Nature 298，623-628)。
用于转基因导入的第三种靶细胞类型是胚胎干细胞(ES)。ES细胞从离体培养的植入前胚胎中获得(Evans等人，(1981)Nature292，154-156；Bradley等人，(1984)Nature 309，255-256；Gossler等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，9065-9069)。能利用DNA转染或逆转录病毒介导的转导将转基因有效导入ES细胞中。产生的转化ES细胞之后能与非人类动物的胚泡结合。ES细胞在胚胎中集聚，提供产生的嵌合动物的种系。
评估导入DNA存在与否以及其表达的方法易于获得，并且在本领域中众所周知。这些方法包括但不限于检测外源DNA的DNA(Southern)杂交、聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和检测DNA、RNA和蛋白质的Western印迹。这些方法包括用于检测Nogo受体基因表达的免疫学和组织化学技术。
在此使用时，“转基因”是指通过人为干涉，如通过以下所述实施例的方法，向非人类动物的种系中导入的一种DNA序列。对于SEQ ID NO1或3的形式，转基因的核酸序列可以整合到通常不会发现该特定核酸序列的基因组基因座处或转基因的正常基因座处。转基因可以由来自与靶动物种相同或不同种的基因组的核酸序列组成。例如，能将缺乏Nogo的小鼠中的轴突再生与缺乏MAG或缺乏MAG和Nogo两者的小鼠比较。为了确定抗-Nogo抗体的作用是否是由于Nogo阻断，能在缺乏Nogo表达的动物中研究抗体的作用。
如上所述，本发明的核酸能利用载体转染宿主细胞。优选的载体是质粒和病毒载体，如逆转录病毒。病毒载体可用来产生根据本发明的转基因动物。优选地，病毒载体是复制缺陷型，即，在靶细胞内不能自主复制。在本发明范围内使用的复制缺陷型病毒载体的基因组一般至少缺少一个为病毒在感染细胞中复制所必需的区域。这些区域可能被删除(整个或部分地)，或者利用本领域技术人员所知的任何技术使其失去功能。这些技术包括完整去除、置换(为其它序列，特别是插入的核酸)、部分删除或向(复制)必需区添加一个或多个碱基。这些技术可以在体外(对分离的DNA)或原位进行，利用遗传操作技术或通过用诱变剂处理。
优选地，复制缺陷型病毒保留包封病毒颗粒所必需的基因组序列。逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。逆转录病毒基因组包括两个LTR、一个包壳序列和三个编码区(gag、pol和env)。重组逆转录病毒载体的构建已经描述(参见，例如，Bernstein等人，(1985)Genet.Eng.7，235；McCormick，(1985)Biotechnol.3，689-691)。在重组逆转录病毒载体中，gag、pol和env基因通常完全或部分缺失，并且被替换为目的异源核酸序列。这些载体能由不同类型的逆转录病毒构建，如HIV、MoMuLV(鼠莫洛尼白血病毒)、MSV(鼠莫洛尼肉瘤毒)、HaSV(哈维肉瘤病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)和弗罗德病毒。
通常，为了构建含有核酸序列的重组逆转录病毒，可构建含有LTR、包壳序列和编码序列的质粒。该结构用来转染一种包装细胞系，该细胞系能反式提供质粒中缺陷的逆转录病毒功能。因此包装细胞系一般能表达gag、pol和env基因。这些包装细胞系在现有技术中已有描述，特别是细胞系PA317(美国专利4,861,719)；PsiCRIP细胞系(WO9002806)和GP+envAm-12细胞系(WO8907150)。另外，重组逆转录病毒载体也能含有LTR内的修饰(用于抑制转录活性)，以及可包含一部分gag基因的广泛包壳序列(Bender等人，(1978)J.Virol.61，1639-1646)。重组逆转录病毒载体利用本领域技术人员所知的标准技术纯化。
一方面，核酸编码反义RNA分子。在该实施方案中，核酸与能使核酸序列表达的适当调节区(以上所述)可操作地连接，并(优选地利用重组载体结构)导入细胞中，该结构将在载体导入细胞后表达反义核酸。合适的载体的例子包括质粒、腺病毒、腺伴随病毒(参见，例如，美国专利4,797,368、美国专利5,139,941)、逆转录病毒(见上文)和疱疹病毒。对于治疗基因的输送，载体优选地是一种腺伴随病毒。
腺病毒是真核DNA病毒，其能被修饰，以向多种细胞类型有效运送本发明的核酸。腺病毒存在多种血清型。在这些血清型中，在本发明范围内，优先使用2型或5型人类腺病毒(Ad 2或Ad 5)或动物来源的腺病毒(参见WO9426914)。能在本发明范围内使用的动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠、绵羊、猪、鸟和猿来源的腺病毒。
根据本发明的复制缺陷型重组腺病毒能用本领域技术人员所知的任何技术制备。特别是，能通过腺病毒与携带目的DNA序列的质粒之间的同源重组制备。通过用腺病毒和质粒共转染适当的细胞系实现同源重组。应用的细胞系应当优选地(i)可被该元件转化，(ii)含有能补充复制缺陷型腺病毒基因组部分的序列，优选地为整合形式，以避免重组的危险。重组腺病毒用标准分子生物学技术回收、纯化，这些技术为本领域技术人员所周知。
已经生产了大量重组或转基因小鼠，包括表达活化癌基因序列的(美国专利4,736,866)；表达猿SV40 T-抗原的(美国专利5,728,915)；缺乏干扰素调节因子1(IRF-1)表达的(美国专利5,731,490)；显示多巴胺能功能障碍的(美国专利5,723,719)；表达至少一种参与血压控制的人类基因的(美国专利5,731,489)；与自然存在的阿尔茨海默氏病的病症显示较高相似性的(美国专利5,720,936)；介导细胞粘附的能力降低的(美国专利5,602,307)；具有牛生长激素基因(Clutter等人，(1996)Genetics143，1753-1760)或者能够产生完全人体抗体应答的(Zou等人，(1993)Science 262，1271-1274)。
尽管小鼠和大鼠仍是大多数转基因实验中选择的动物，但在某些情况中，优选地乃至必须使用其它动物种。转基因方法已经在多种非鼠类动物中成功应用，包括绵羊、山羊、鸡、仓鼠、兔、母牛和豚鼠(参见Aigner等人，(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.257，843-850；Castro等人，(1999)Genet.Anal.15，179-187；Brink等人，(2000)Theriogenology 53，139-148；Colman，(1999)Genet.Anal.15，167-173；Eyestone，(1999)Theriogenology 51，509-517；Baguisi等人，(1999)Nat.Biotechnol.17，456-461；Prather等人，(1999)Theriogenology51，487-498；Pain等人，(1999)Cells Tissues Organs 165，212-219；Fernandez等人，(1999)Indian J.Exp.Biol.37，1085-1092；美国专利5,908,969；美国专利5,792,902；美国专利5,892,070；美国专利6,025,540)。N.诊断方法一种利用本发明的核酸分子或蛋白质诊断脱髓鞘疾病的方法包括从活体中获得组织样品。对于组织，如中枢神经系统的组织，从活体来源中获得组织样品是个问题。在患有脱髓鞘疾病的患者中，可以利用侵入性较低的方法获得用于诊断方法的组织样品。例如，可以从全血和血清中获得样品。
分子生物学手段的应用在法医技术中已经成为常规。例如，核酸探针可以用来检查含有SEQ ID NO1的全部或至少部分序列的核酸分子在法医病理标本中的表达。此外，也可以利用进行转录分布分析的任何方法进行核酸试验。除了核酸分析外，本发明的法医方法可以针对SEQ ID NO1编码的蛋白质，用来测定基因的上调或下调(Shiverick等人，(1975)Biochim.Biophys.Acta 393，124-133)。
本发明的方法可包括用胶原酶或其它蛋白酶处理组织，使组织遭受细胞裂解(Semenov等人，(1987)Biull.Eksp.Biol.Med.104，113-116)。此外也能从脑的不同区域获得活检样品进行分析。
检测本发明的核酸或蛋白质的试验可以采用任何可利用的形式。典型的核酸分子测定包括基于杂交或PCR的形式。检测本发明的蛋白质、多肽或肽的典型试验包括以任何可用的形式应用抗体探针，如原位结合试验等。参见Harlow和Lane，(1988)《抗体实验室手册》，冷泉港实验室出版社。在优选实施方案中，用合适的对照进行试验。
可以认为，不用进一步描述，本领域技术人员能利用前面的描述和下面的说明性实施例，制备和应用本发明的化合物，并实施要求保护的方法。因此，下列实施例具体说明了本发明的优选实施方案，不应被视为以任何方式限制其余的公开内容。
Nogo由少突胶质细胞表达，而施万细胞不表达，并且主要与内质网结合。Nogo的66个氨基酸的腔-胞外域(SEQ ID NO20)抑制轴突延伸，破坏背根神经节生长锥。少突胶质细胞不表达其它Reticulon蛋白，其它Reticulon蛋白的66氨基酸腔-胞外域不抑制轴突再生。这些数据为评估Nogo对成年CNS中轴突再生失败的作用提供了分子基础。
为了重组Nogo-A的表达和蛋白质纯化，Kazusa DNA研究所慷慨提供了全长序列(KIAA0886)。通过聚合酶链反应(PCR)扩增全长编码序列，与载体pCDNA3.1-MycHis(Invitrogen)连接，产生一种质粒，其编码在羧基端与Myc表位融合的Nogo-A(Nogo-A-Myc)。作为替代，也利用编码紧接第一个残基氨基端和羧基端终止密码子的框内Myc表位(Myc-Nogo-A)的引物，扩增该编码序列。Nogo-C-MycHis和Rtn1C-MycHis表达载体以相同方式产生，不同之处在于用成年大鼠脑cDNA文库作为PCR反应的模板，引物基于Nogo-C或Trn1C序列(Van de Velde等人，(1994)J.Cell.Sci.107，2403-2416)。这些质粒通过Lipofectamine(Gibco-BRL)或FuGENE 6(Boerhinger Mannheim)法转染COS-7或HEK293T。
PCR扩增编码Nogo-A的66氨基酸腔-胞外片段的Nogo-A部分，与pGEX-2T质粒连接，产生GST-Nogo融合蛋白的原核表达载体。Rtn1、Rtn2和Rtn3的类似区利用成年大鼠脑cDNA文库作为模板，通过巢式PCR扩增，并与pGEX-2T连接。这些质粒转化的大肠杆菌用IPTG诱导。可溶性天然GST融合蛋白用谷胱甘肽-树脂纯化，含有约75％的GST和25％的全长GST-Nogo或GST-Rtn蛋白。大多数GST-Nogo蛋白在非变性条件下无法提取，但是对PBS透析的8M尿素提取物含有纯度超过98％的GST-Nogo。
Myc免疫反应性在还原条件下检测为225kDa左右的表观大小(数据未显示)。因此，该cDNA指导具有适当电泳迁移率和称作人Nogo-A(hNogo-A)的氨基酸序列的蛋白质表达。
Rtn家族蛋白质的保守羧基尾含有由66氨基酸残基亲水片段隔开的两个疏水域。这些序列都不含信号肽。预测的这些蛋白质的拓扑学是，氨基端和羧基端位于细胞溶液中，保守区与脂双层结合。对于Rtn1-A，有实验证据证明该多肽行为象整合膜蛋白，保守域的疏水片段负责此行为(Van de Velde等人，(1994)J.Cell.Sci.107，2403-2416)。Myc-标记的Nogo也与颗粒部分结合，可用离子强度不高的去污剂提取(数据未显示)。
当在肾细胞中过量表达时，Rtn1蛋白主要以细小颗粒形式位于内质网(ER)中，因此称为Reticulon(Van de Velde等人，(1994)J.Cell.Sci.107，2403-2416)。在Nogo和大多数Rtn蛋白的羧基端有一个双赖氨酸ER保留基序(Van de Velde等人，(1994)J.Cell.Sci.107，2403-2416；Jackson等人，(1991)EMBO J.9，3153-3162)。在神经元中，Rtnl在整个突起中表达，并浓缩于生长锥中(Senden等人，(1996)Eur.J.Cell.Biol.69，197-213)。它在转染肾细胞中的定位导致提出Rtnl可调节蛋白质分类或ER功能的其它方面(Van de Velde等人，(1994)J.Cell.Sci.107，2403-2416)。Nogo的A和C剪接形式当在COS-7细胞中表达时显示网状分布，类似于Rtn1-C。实施例2-抗Nogo的多克隆抗体预测的Nogo两个疏水域的膜内拓扑学表明，这些片段之间的66个氨基酸残基位于膜的腔/胞外面。为了进一步研究，产生了抗该66氨基酸域的抗血清。
为了抗体的产生和免疫组织学，如Takahashi等人，(1998)NatureNeurosci.1，487-493和Takahashi等人，(1999)Cell 99，59-69所述，应用9E10抗体进行抗-Myc免疫印迹和免疫组织学。GST-Nogo融合蛋白作为免疫原用来产生抗-Nogo兔血清。亲和纯化抗体，并以3μg/ml用于免疫组织学，1μg/ml用于免疫印迹。为了估计抗血清的特异性，在0.1mg/ml GST-Nogo蛋白存在下进行染色。对于活细胞染色，细胞与一级抗体稀释液在含0.05％ BSA和20mM Na-Hepes(pH 7.3)的Hanks平衡盐溶液中4℃温育1小时。待固定后，通过与荧光标记的二级抗体温育检测结合的抗体。
该抗体检测该表位的低水平表面表达，而位于表达的Nogo羧基端的Myc表位无法检测，除非细胞被渗透。这种表面染色归因于与质膜而不是ER膜结合的少数Nogo蛋白。此数据支持如下拓扑模型蛋白质的氨基端和羧基端位于细胞质中，蛋白质的66个氨基酸从ER或质膜的腔-胞外侧突出。实施例3-Nogo在中枢神经系统中的表达如果Nogo是CNS髓鞘质(与PNS髓鞘质相比)的轴突突起抑制特性的主要原因(Caroni和Schwab，(1988)J.Cell Biol.106，1281-1288；Spillmann等人，(1998)J.Biol.Chem.73，19283-19293；Bregman等人，(1995)Nature 378，498-501)，则Nogo应当在成年CNS髓鞘质中表达，而不在PNS髓鞘质中表达。利用由cDNA的5’Nogo-A/B-特异区和3’Nogo共同区衍生的探针进行Nogo表达的Northern印迹分析。利用5’探针在成年大鼠视神经总DNA样品中检测到约4.1kb的一条带，但在坐骨神经样品中未检测到。结果表明，Nogo-A克隆是一条全长cDNA，与Nogo作为CNS-髓鞘质特异性轴突突起抑制剂的作用一致。应用3’探针的Northern印迹分析显示，视神经表达高水平的Nogo-A mRNA和较低水平的Nogo-B和Nogo-C。全脑表达Nogo-A和Nogo-B两者，但是大量周围组织(包括坐骨神经)表达很少的Nogo或不表达。Nogo-C/Rtn4-C的表达已经在骨骼肌和脂肪细胞以及脑中得到证明(Morris等人，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1450，68-76)。在Rtn家族内，视神经表达似乎是Nogo选择性的，Rtn1或Rtn3的表达不可检测。Rtn2未检测。
原位杂交显示了成年大鼠视神经和锥体束中具有少突胶质细胞形态学的细胞中的Nogo mRNA。在脑中，Nogo表达也在某些神经元群体中检测到。与Nogo相反，Rtn1和Rtn3在视神经中不表达，但在某些神经元群体中检测到mRNA。利用抗-Nogo抗体和少突胶质细胞特异性O4单克隆抗体，在用PDGF和低血清处理以诱导少突胶质细胞分化的脊髓培养物中分析了Nogo蛋白的定位。在活细胞中，在少突胶质细胞表面检测到Nogo的腔-胞外66氨基酸环和O4抗原。这些培养物中有接近一半的O4阳性细胞显示Nogo表面染色。实施例4-Nogo介导的生长锥破坏涉及细胞培养的所有实验均使用下列方法。培养鸡胚E10和E12背根神经节外植体和解离的神经元使用对于E7背根神经节培养所述的方法(Takahashi等人，(1998)Nature Neurosci.1，487-493；Takahashi等人，(1999)Cell 99，59-69；Goshima等人，(1995)Nature 376，509-514；Jin和Strittmatter，(1997)J.Neurosci.7，6256-6263)。NGF-分化的PC12细胞如述培养(Strittmatter等人，(1994)J.Neurosci.14，2327-2338)。胚胎脊髓外植体(大鼠E10或鸡E5)在PDGF-AA存在下培养7-14天，以诱导一些细胞分化为成熟的少突胶质细胞(Vartanian等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，731-735)。生长锥破坏试验的程序与Sema3A诱导的生长锥破坏的分析程序相同(Takahashi等人，(1998)Nature Neurosci.1，487-493；Takahashi等人，(1999)Cell99，59-69；Goshima等人，(1995)Nature 376，509-514；Jin和Strittmatter，(1997)J.Neurosci.7，6256-6263)。总神经突突起的分析方法也有描述(Goshima等人，(1995)Nature 376，509-514；Jin和Strittmatter，(1997)J.Neurosci.7，6256-6263；Strittmatter等人，(1994)J.Neurosci.14，2327-2338)。在突起试验中，在平板接种1小时后加入蛋白质和肽，以使对粘附细胞总数的任何影响减到最小。为了测试底物结合的GST或GST-Nogo的作用，蛋白质溶液在聚-L-赖氨酸包被的玻璃上干燥，洗涤，然后用层粘连蛋白包被。对于E12培养物，用抗神经丝抗体(2H3，发育研究杂交瘤库)染色，证实细胞的神经元同一性，并且在突起中观察F-肌动蛋白的罗丹明-鬼笔环肽染色，示踪神经突。
重组Nogo在HEK293T细胞中的表达允许精确检测该蛋白质是否具有轴突生长抑制作用。向鸡E12背根神经节外植体培养物中加入洗涤的载体-或hNogo-A-Myc-转染的HEK293T细胞的膜级分。在37℃下温育30分钟后，通过固定和罗丹明-鬼笔环肽染色评价生长锥的形态学。
对照HEK膜对生长锥形态学没有可检测到的影响。含Nogo-A的膜级分诱导大多数背根神经节生长锥的破坏。这种生长锥破坏表明了轴突突起的抑制活性，Nogo对轴突延伸的抑制也可以证明(见下文)。Nogo-C形式也显示破坏活性，表明包含疏水节段和66氨基酸腔-胞外域的蛋白质的共有羧基端含有功能上重要的残基。这些研究不排除Nogo-A氨基端区的其它抑制活性。来自E10鸡胚或来自E15大鼠胚胎的未成熟外植体培养物的敏感性(数据未显示)大大降低。敏感性的发育调节与利用部分纯化的Nogo的实验一致(Bandtlow等人，(1997)Eur.J.Neurosci.9，2743-2752)。
在破坏生长锥的Nogo-C蛋白内，亲水性66腔-胞外域似乎比膜包埋的疏水域更可能与背根神经节神经元的表面相互作用。为了检测这一假设，hNogo的66氨基酸区在大肠杆菌中表达，并纯化。大多数GST-Nogo融合蛋白在包涵体中积累，但能通过尿素提取回收。Nogo的这种限制区对鸡E12背根神经节神经元有强烈的(EC50＝50nM)生长锥破坏活性(数据未显示)。尿素提取的蛋白质制品可能只存在一小部分具有活性构象的Nogo序列。因此，利用谷胱甘肽-Sepharose树脂纯化在大肠杆菌中可溶的10％的GST-Nogo。该制品作为破坏因子甚至比尿素提取的蛋白质更有效，在低到1nM的浓度时还能明显改变生长锥的形态学。
纳摩尔的效能等同于大多数已知的轴突引导生理调节剂。这种可溶性GST-Nogo蛋白在nM级的浓度时也阻断轴突从背根神经节神经元和NGF-分化的PC12细胞突起(数据未显示)。当GST-Nogo与底物表面结合时，轴突从背根神经节神经元或PC12细胞的突起降至检测不到的水平。这对轴突突起而不是细胞存活有选择性影响，因为GST-Nogo既不减少神经丝阳性粘附细胞的数量(137±24％的GST处理的培养物)，也不显著改变凋亡的核的数量(对照培养物为4.0±1.7％，GST-Nogo处理的标本为5.2±1.1％)，凋亡的核通过DAPI染色确定。
少突胶质细胞似乎在Rtn蛋白中选择性表达Nogo。为了研究Nogo在抑制轴突再生中的作用的选择性，考虑其它Rtn蛋白的轴突突起抑制活性。预测的Rtn1、Rtn2和Rtn3的腔-胞外66氨基酸片段表达为GST融合蛋白，并纯化为天然形式。在Nogo片段破坏大多数E12背根神经节生长锥的浓度时，其它Rtn蛋白不改变生长锥的形态学(数据未显示)。因此，轴突再生的抑制活性对于Rtn家族中的Nogo是特异性的。实施例5-Nogo受体肽试剂为了进一步确定Nogo的活性域，合成了对应于66氨基酸序列的片段的25氨基酸残基肽。该肽对应于Nogo胞外片段的残基31-55，在4μM的浓度时显示生长锥破坏(图2)和突起抑制(数据未显示)活性。该序列可以提供抑制域的核心，但是66氨基酸片段对于全部能力无疑是必需的。有趣的是，66氨基酸域内的区域与其它Rtn蛋白有最低的相似性，与作为轴突再生抑制剂无活性的其它家族成员一致。实际上，Rtn 31-55氨基酸腔-胞外肽没有生长锥破坏活性(数据未显示)。
上述实验数据确定Nogo为Rtn家族的少突胶质细胞特异的成员，并且证明Nogo的不连续域能抑制轴突突起。其它Rtn蛋白不具有这种活性。因此，Nogo在少突胶质细胞而不在施万细胞中表达导致在成年哺乳动物CNS中轴突再生的失败(与成年PNS相比)。与其它CNS髓鞘质成分相比，Nogo对CNS白质的非随意(non-permissive)性质的相对作用现在能在分子水平上进行表征。
尽管当前的实验数据与病理损伤后Nogo阻断成年CNS轴突再生的作用相一致，但这也可能与Nogo在非病理状态时的生理作用有关。根据定位研究，认为其它Rtn蛋白在ER功能中起一定作用(Van de Velde等人，(1994)J.Cell.Sci.107，2403-2416)。大多数Nogo以网状模型分布于COS-7细胞中，只有一小部分似乎可达细胞表面。实施例6-Nogo活性的抑制以上实施例显示，接近Nogo羧基端的66氨基酸区抑制轴突突起，并且在细胞表面表达。该结构域的较短的25氨基酸片段作为突起抑制剂是无活性的，或者有相当低的能力(GrandPre等人，(2000)Nature403，439-444)。该66氨基酸片段的31-55区具有较弱的生长锥破坏和轴突突起抑制活性。为了阻断Nogo的体内作用，可与同一受体位点结合但其本身不发挥生物学作用的Nogo的竞争性拮抗剂是十分希望的。66氨基酸区的各种不同片段检测为Nogo介导的轴突生长抑制的阻断剂。两种试验用于该目的。第一种是生长锥破坏试验，第二种是结合试验。
在生长锥破坏试验中，在不同潜在拮抗肽存在下测定对Nogo的应答。来自66氨基酸区的3种25氨基酸肽(1-25、11-35和21-45)在μM级的浓度时具有阻断活性(图2)。所有3种肽的组合在基本条件下不改变生长锥的形态学，但是完全阻止15nM GST-Nogo的破坏。相同的肽混合物也能阻断低剂量的CNS髓鞘质诱导的生长锥破坏。这种阻断支持了Nogo是CNS髓鞘质的主要抑制成分的假说。而且，这种阻断还具有竞争性拮抗所预期的特性，在高剂量CNS髓鞘质时无效。
为了发展一种具有较高特异性和效能的拮抗剂，检测了Nogo的较长片段。优选地，这种肽本身没有轴突突起抑制活性，尽管它竞争性阻断Nogo的作用。Nogo的2-41片段在羧基端乙酰化，在氨基端酰胺化，是迄今为止确定的最有效的Nogo阻断剂。Pep2-41消除GST-Nogo诱导的生长锥破坏，在结合试验中显示150nM的表观Ki(图3)。2-41片段也阻断纯化的Nogo-66蛋白和粗CNS髓鞘质在培养的神经元中抑制神经突突起的能力(图4)。实施例7-Nogo受体的鉴定发展了一种Nogo结合试验，其中应用在检查semaphorin和ephrin轴突引导功能中广泛使用的方法(Flanagan和Vanderhaeghen(1998)Annu.Rev.Neurosci.21，309-345；Takahashi等人，(1999)Cell99，59-69)。它包括将分泌的胎盘碱性磷酸酯(AP)部分与所述配体融合，以产生能用极其敏感的比色试验检测的生物活性受体结合剂。对于Nogo，构建一种表达载体，其编码信号肽、用于纯化的His6标签、AP和Nogo的66氨基酸活性域。该融合蛋白能从转染细胞的条件培养基中以毫克量纯化(图5)。该蛋白质作为生长锥破坏剂有生物学活性，EC50为1nM。AP-Nogo实际上略强于GST-Nogo，这也许是因为该蛋白质是在真核细胞而不是在原核细胞中合成的。最初的研究揭示了轴突上可饱和的高亲和性位点。结合被GST-Nogo和拮抗性25氨基酸肽阻断，这与竞争性结合神经元受体位点的结果一致。由于在破坏试验中这些位点的表观Kd(3nM)接近AP-Nogo的EC50，这些位点可能是生理相关的Nogo受体。
该试验用于Nogo受体的表达克隆。用含有250 000个独立克隆的小鼠成年脑cDNA表达文库的集合体转染非神经元COS-7细胞。未转染的COS-7细胞不结合AP-Nogo，但是用5 000个克隆的两个集合体转染显示有强烈AP-Nogo结合的少量细胞。编码Nogo结合位点的单个cDNA克隆通过同胞选择从两个阳性集合体的每一个中分离。两个独立分离的克隆除了一个克隆中5’非翻译区有100bp的延伸外彼此相同。这些克隆转染COS-7细胞产生结合位点，它对AP-Nogo的亲和力与在E13背根神经节神经元中观察到的相同；结合的Kd约为3nM(图6)。单独的AP不能以任何可检测到的亲和力与这些转染细胞结合，表明此亲和力是由于Nogo的66个氨基酸。而且，GST-Nogo可代替这些位点的AP-Nogo。
该cDNA编码新的473个氨基酸的蛋白质。在GenBank中没有报道的cDNA与之具有显著同源性。预测的蛋白质含有信号肽，随后是8个富含亮氨酸的重复片段区、独特域和预测的GPI锚定位点(图7)。鉴定了鼠cDNA的一种人同源物，它们有89％的氨基酸同一性。根据鼠cDNA的结构和GenBank存放的作为人类测序计划的一部分的人类基因组序列的分析，预测该cDNA的存在。人cDNA的外显子分布于35kb上，该cDNA以前在基因组序列中未被确认。其蛋白质结构与能结合Nogo的细胞表面蛋白一致。该蛋白质的GPI-连接性质提示，可能具有横跨质膜并介导Nogo信号传导的第二个受体亚基。实施例8-Nogo受体的组织分布该Nogo受体的mRNA分布与该蛋白质调节轴突再生的作用和在成年CNS中可塑性相一致。Northern分析显示在成年脑中有一条2.3kb的带，表明分离的Nogo受体克隆是全长的(图8)。在心脏和肾脏中观察到低水平的mRNA，而在其它周围组织中没有发现。在脑中，表达广泛分布，灰质含量最多的区域表达最高水平的mRNA。实施例9-不同Nogo域的生物学作用Nogo-A功能的测定包括生长锥破坏、神经突突起和成纤维细胞扩散，应用基质结合的和可溶性的蛋白质制品(Caroni和Schwab，(1988)J.Cell Biol.106，1281-1288；GrandPre等人，(2000)Nature403，439-444；Chen等人，(2000)Nature 403，434-439；Prinjha等人，(2000)Nature 403，483-484)。在3T3成纤维细胞形态学的测定中，基质结合的Nogo-66不抑制扩散(图1b，e)。由于NI250制品和全长Nogo-A不允许3T3扩散，必须考虑Nogo的不同域是否可以提高这种体外活性。为了便于比较不同的Nogo-A域，酸性氨基端1040氨基酸片段(氨基-Nogo(Amino-Nogo))在HEK293T细胞中表达为Myc-His标记的蛋白质(图1d)。Nogo蛋白存在于胞质级分中。纯化的氨基-Nogo蛋白包被的表面不支持3T3成纤维细胞扩散(图1b，e)。对于肾衍生的细胞系COS-7观察到类似的结果(图1f)。因此，氨基端域似乎是全长Nogo-A对成纤维细胞的作用的原因。Nogo-66域是神经元特异性的；它不影响非神经元细胞。
背根神经节培养物也暴露于氨基-Nogo蛋白(图1c，g-i)。至于3T3成纤维细胞，背根神经节培养物中的成纤维细胞样细胞在该基质上不扩散。而且，在氨基-Nogo包被的表面上轴突突起降至低水平。因此，尽管Nogo-66作用是神经特异的，但氨基-Nogo域的抑制作用比较普遍。当以可溶形式以100nM存在时，Nogo-66多肽破坏鸡E12背根神经节生长锥，几乎阻止轴突延伸，如前所述(GrandPre等人，(2000)Nature403，439-444)。明显不同的是，可溶性氨基-Nogo蛋白似乎无活性，并且不能明显调节背根神经节生长锥的形态学或背根神经节轴突延伸或非神经元细胞的扩散(图1c，g-i)。
在Walsh及其同事的实验中(Prinjha等人，(2000)Nature403，483-484)研究了小脑颗粒神经元，可溶性氨基-Nogo作为Fc融合蛋白，可能为二体形式。因此，必须考虑这些差异是否可以解释可溶性氨基-Nogo的无活性。小鼠P4小脑颗粒神经元是以与鸡E13背根神经节神经元没有区别的方式响应Nogo制品(图1i)。用抗-Myc抗体二聚化的氨基-Nogo抑制3T3和COS-7的扩散(图1e，f)，并且倾向于减少小脑轴突突起(图1i)。当加入抗小鼠IgG抗体进一步凝集时，氨基-Nogo明显降低背根神经节和小脑轴突突起(图1h，i)。尽管氨基-Nogo蛋白酸性极强，但是只是静电荷不能说明其抑制作用，因为poly-Asp不改变细胞扩散或轴突突起(图1e，f，h)。因此，Nogo-66域是一种神经元特异的强抑制剂，而胞内氨基-Nogo域抑制多种细胞类型，似乎只在凝集状态时起作用。实施例10-Nogo受体的定位为了进一步表征Nogo-66受体蛋白的表达，制备了抗GST-Nogo受体融合蛋白的抗血清。该抗血清在表达Nogo-66受体的HEK293T细胞中(图9a)选择性检测85kDa的蛋白质并特异地染色表达Nogo-66受体的COS-7(图9b)。对鸡胚脊髓培养物的免疫组织染色将该蛋白质定位于轴突，这与Nogo-66诱导的轴突突起抑制的介导一致。在表达Nogo-66的O4阳性少突胶质细胞中没有发现Nogo-66受体的表达。免疫反应性85kDa蛋白质在鸡E13背根神经节的Nogo-66反应性神经元制品中表达，但在鸡E7背根神经节和鸡E7视网膜的弱反应性组织中表达水平相当低(图9a)。Nogo-66表达模式与蛋白质介导的Nogo-66轴突抑制大体上一致。
这种抗体也可有效地定位组织切片中的Nogo-66受体蛋白(图9c)。由原位杂交研究清楚地看出，该蛋白质在多种神经元中表达，但免疫组织学显示在CNS白质中有高水平的蛋白质，分布图与轴突一致。在神经元体和神经纤维网中可检测到较低水平的蛋白质。这进一步支持了提出的该蛋白质介导与少突胶质细胞相互作用的功能。实施例11-Nogo受体介导Nogo-66应答Nogo-66受体蛋白是Nogo-66作用所必需的，不只是一个具有与轴突突起抑制无关的功能的结合位点。第一个预测是，用磷酸肌醇特异的磷脂酶(PI-PLC)处理从神经元表面除去糖磷脂酰肌醇(GPI)连接的蛋白质将使神经元对Nogo-66不敏感。这一预测对于鸡E13背根神经节神经元是事实；PI-PLC处理消除了AP-Nogo结合和GST-Nogo-66诱导的生长锥破坏(图10a-c)。作为对照，PI-PLC处理不改变平行培养物中的Sema3A应答。当然，预期PI-PLC处理将从轴突表面除去大量蛋白质，因此该结果仍未解决其它GPI连接的蛋白质在未处理的培养物中介导Nogo-66应答的可能性。
为了证明Nogo-66受体能介导Nogo-66对轴突突起的抑制，在缺乏Nogo-66应答的神经元中表达该蛋白质。检查了来自E7鸡胚的背根神经节和视网膜神经元。来自该发育阶段的背根神经节神经元的Nogo应答较弱，但在某些培养物中能检测到轻微的应答(数据未显示)。E7视网膜神经节细胞生长锥对Nogo-66诱导的生长锥破坏均不敏感(图10e)，不能结合AP-Nogo(数据未显示)，不显示85kDa的抗Nogo-66受体免疫反应性蛋白(图9a)。由于重组HSV制品感染引起的NgR在这些神经元中的表达使视网膜神经节细胞轴突生长锥对Nogo-66诱导的破坏敏感。感染表达对照PlexinA1的对照HSV制品不改变Nogo应答。总之，这些数据表明此处鉴定的Nogo受体参与了Nogo-66对轴突再生的抑制。实施例12-Nogo-66受体的结构分析为了确定哪种区域介导Nogo-66结合，检查了Nogo-66受体的结构。将该蛋白质简单地分为富含亮氨酸重复片段和不富含亮氨酸重复片段区。缺失分析清楚地显示，富含亮氨酸重复片段是Nogo-66结合所必需的，而该蛋白质的其余部分不是必需的(图11)。在富含亮氨酸重复片段域内，两个域分别缺失。预测将保持总体富含亮氨酸重复片段域结构，一种类似的方法已经用于leutropin受体。显然Nogo-66结合需要所有8个富含亮氨酸重复片段，提示富含亮氨酸重复片段的线性β片层产生重要的平面片段。位于富含亮氨酸重复片段每一端的富含亮氨酸重复片段-氨基端和富含亮氨酸重复片段-羧基端保守的富含半胱氨酸区也是Nogo-66结合所必需的，推测它们是产生合适的富含亮氨酸重复片段构象是必要的。实施例13-可溶性Nogo受体胞外域蛋白对Nogo的阻断一种阻断从Nogo-66结合Nogo受体开始的信号传导级联的方法是提供过量的可溶性受体胞外域。分泌的Nogo受体蛋白片段已经在HEK293T细胞中产生。编码鼠Nogo受体氨基酸残基1-348的cDNA连接到真核表达载体中，用该DNA转染HEK293T细胞。应用抗-NgR抗体的免疫印迹证明，这些细胞的条件培养基含有高水平的这种Nogo受体片段(NgR-ecto)。条件培养基中每升含有约1mg NgR-ecto蛋白。在对表达全长Nogo受体的COS-7细胞或对背根神经节神经元的AP-Nogo结合试验中，加入NgR-ecto条件培养基使0.5nM AP-Nogo-66的结合降低80％。可溶性NgR-ecto与Nogo-66之间复合物的形成阻止了与细胞表面受体的结合。
对于一些受体系统，这些可溶性受体配体复合物通过产生无效的相互作用能阻断信号传导。例如，Trk的可溶性胞外域足以阻断神经营养蛋白的信号传导，已经广泛用于此用途(Shelton等人，(1995)J.Neurosci.15，477-491)。或者，Nogo-66/NgR-ecto可溶性复合物可以结合并刺激推测的第二种跨膜Nogo受体亚基。根据对GDNF家族受体的研究，这种作用类型优先(Cacalano等人，(1998)Neuron 21，53-62)。Nogo-66/NgR-ecto复合物在缺乏Nogo-66受体但含有Nogo信号传导途径其它组分的神经元(鸡E7视网膜神经节细胞)中不引起生长锥破坏。这表明NgR-ecto作为Nogo-66信号传导的阻断剂起作用。
在直接检测中，NgR-ecto蛋白保护轴突免遭Nogo-66的抑制作用。NgR-ecto阻止Nogo-66诱导的生长锥破坏，并且阻断Nogo-66诱导的对鸡E13 DRG神经元神经突突起的抑制(图12)。此外，NgR-ecto蛋白的存在也阻断CNS髓鞘质体外抑制轴突突起的能力(图12)。这些数据证明，NgR-ecto蛋白能促进轴突的体内再生。
尽管已经参照以上实施例详述了本发明，但是应当理解，能在不违反本发明精神的情况下进行多种修改。因此，本发明只受下列权利要求书限制。在本申请书中提及的所有专利和公开文本都在此完整引用作为参考。此处公开的实验部分结果已经在美国临时申请60/175,707(本申请要求它的优先权)的申请日之后发表(GrandPré等人，(2000)Nature403,439-444)，该文在此完整引用作为参考。
序列表序列表<110>Strittmatter，Stephen M.<120>Nogo受体介导的对轴突生长的阻断<130>44574-5073-WO<140><141><150>US 60/175,707<151>2000-01-12<150>US 60/207,366<151>2000-05-26<150>US 60/236,378<151>2000-09-29<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1719<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(166)..(1584)<223>预测的人Nogo受体基因<400>1agcccagcca gagccgggcg gagcggagcg cgccgagcct cgtcccgcgg ccgggccggg 60gccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gacccggccg cggggagacg ggcgcccgcc 120ccgaaacgac tttcagtccc cgacgcgccc cgcccaaccc ctacg atg aag agg gcg 177Met Lys Arg Ala1tcc gct gga ggg agc cgg ctg ctg gca tgg gtg ctg tgg ctg cag gcc 225Ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu Trp Leu Gln Ala5 10 15 20tgg cag gtg gca gcc cca tgc cca ggt gcc tgc gta tgc tac aat gag 273Trp Gln Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val Cys Tyr Asn Glu25 30 35ccc aag gtg acg aca agc tgc ccc cag cag ggc ctg cag gct gtg ccc 321Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu Gln Ala Val Pro40 45 50gtg ggc atc cct gct gcc agc cag cgc atc ttc ctg cac ggc aac cgc 369Val Gly Ile Pro Ala Ala Ser Gln Arg Ile Phe Leu His Gly Asn Arg55 60 65atc tcg cat gtg cca gct gcc agc ttc cgt gcc tgc cgc aac ctc acc 417Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys Arg Asn Leu Thr70 75 80atc ctg tgg ctg cac tcg aat gtg ctg gcc cga att gat gcg gct gcc 465Ile Leu Trp Leu His Ser Ash Val Leu Ala Arg Ile Asp Ala Ala Ala85 90 95 100ttc act ggc ctg gcc ctc ctg gag cag ctg gac ctc agc gat aat gca 513Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu Ser Asp Asn Ala105 110 115cag ctc cgg tct gtg gac cct gcc aca ttc cac ggc ctg ggc cgc cta 561Gln Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr Phe His Gly Leu Gly Arg Leu120 125 130cac acg ctg cac ctg gac cgc tgc ggc ctg cag gag ctg ggc ccg ggg 609His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gln Glu Leu Gly Pro Gly135 140 145ctg ttc cgc ggc ctg gct gcc ctg cag tac ctc tac ctg cag gac aac 657Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr Leu Gln Asp Asn150 155 160gcg ctg cag gca ctg cct gat gac acc ttc cgc gac ctg ggc aac crc 705Ala Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp Leu Gly Asn Leu165 170 175 180aca cac ctc ttc ctg cac ggc aac cgc atc tcc agc gtg ccc gag cgc 753Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser Ser Val Pro Glu Arg185 190 195gcc ttc cgt ggg ctg cac agc ctc gac cgt ctc cta ctg cac cag aac 801Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu Leu His Gln Asn200 205 210cgc gtg gcc cat gtg cac ccg cat gcc ttc cgt gac ctt ggc cgc ctc 849Arg Val Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp Leu Gly Arg Leu215 220 225atg aca ctc tat ctg ttt gcc aac aat cta tca gcg ctg ccc act gag 897Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Ala Leu Pro Thr Glu230 235 240gcc ctg gcc ccc ctg cgt gcc ctg cag tac ctg agg ctc aac gac aac 945Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gln Tyr Leu Arg Leu Asn Asp Asn245 250 255 260ccc tgg gtg tgt gac tgc cgg gca cgc cca ctc tgg gcc tgg ctg cag 993Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp Ala Trp Leu Gln265 270 275aag ttc cgc ggc tcc tcc tcc gag gtg ccc tgc agc ctc ccg caa cgc 1041Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser Leu Pro Gln Arg280 285 290ctg gct ggc cgt gac ctc aaa cgc cta gct gcc aat gac ctg cag ggc 1089Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn Asp Leu Gln Gly295 300 305tgc gct gtg gcc acc ggc cct tac cat ccc atc tgg acc ggc agg gcc 1137Cys Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro Ile Trp Thr Gly Arg Ala310 315 320acc gat gag gag ccg ctg ggg ctt ccc aag tgc tgc cag cca gat gcc 1185Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys Gln Pro Asp Ala325 330 335 340gct gac aag gcc tca gta ctg gag cct gga aga cca gct tcg gca ggc 1233Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro Ala Ser Ala Gly345 350 355aat gcg ctg aag gga cgc gtg ccg ccc ggt gac agc ccg ccg ggc aac 1281Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Ser Pro Pro Gly Asn360 365 370ggc tct ggc cca cgg cac atc aat gac tca ccc ttt ggg act ctg cct 1329Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe Gly Thr Leu Pro375 380 385ggc tct gct gag ccc ccg ctc act gca gtg cgg ccc gag ggc tcc gag 1377Gly Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Val Arg Pro Glu Gly Ser Glu390 395 400cca cca ggg ttc ccc acc tcg ggc cct cgc cgg agg cca ggc tgt tca 1425Pro Pro Gly Phe Pro Thr Ser Gly Pro Arg Arg Arg Pro Gly Cys Ser405 410 415 420cgc aag aac cgc acc cgc agc cac tgc cgt ctg ggc cag gca ggc agc 1473Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly Gln Ala Gly Ser425 430 435ggg ggt ggc ggg act ggt gac tca gaa ggc tca ggt gcc cta ccc agc 1521Gly Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Glu Gly Ser Gly Ala Leu Pro Ser440 445 450ctc acc tgc agc ctc acc ccc ctg ggc ctg gcg ctg gtg ctg tgg aca 1569Leu Thr Cys Ser Leu Thr Pro Leu Gly Leu Ala Leu Val Leu Trp Thr455 460 465gtg ctt ggg ccc tgc tgacccccag cggacacaag agcgtgctca gcagccaggt 1624Val Leu Gly Pro Cys470gtgtgtacat acggggtctc tctccacgcc gccaagccag ccgggcggcc gacccgtggg1684gcaggccagg ccaggtcctc cctgatggac gcctg 1719<210>2<211>473<212>PRT<213>人<400>2Met Lys Arg Ala Ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu1 5 10 15Trp Leu Gln Ala Trp Gln Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val20 25 30Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu35 40 45Gln Ala Val Pro Val Gly Ile Pro Ala Ala Ser Gln Arg Ile Phe Leu50 55 60His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys65 70 75 80Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Val Leu Ala Arg Ile85 90 95Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu100 105 110Ser Asp Asn Ala Gln Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr Phe His Gly115 120 125Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gln Glu130 135 140Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr145 150 155 160Leu Gln Asp Asn Ala Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp165 170 175Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser Ser180 185 190Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu195 200 205Leu His Gln Asn Arg Val Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp210 215 220Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Ala225 230 235 240Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gln Tyr Leu Arg245 250 255Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp260 265 270Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser275 280 285Leu Pro Gln Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn290 295 300Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro Ile Trp305 310 315 320Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys325 330 335Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro340 345 350Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Ser355 360 365Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe370 375 380Gly Thr Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Val Arg Pro385 390 395 400Glu Gly Ser Glu Pro Pro Gly Phe Pro Thr Ser Gly Pro Arg Arg Arg405 410 415Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly420 425 430Gln Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Glu Gly Ser Gly435 440 445Ala Leu Pro Ser Leu Thr Cys Ser Leu Thr Pro Leu Gly Leu Ala Leu450 455 460Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys465 470<210>3<211>1866<212>DNA<213>台湾鼷鼠<220><221>CDS<222>(178)..(1596)<223>鼠Nogo受体cDNA<400>3agccgcagcc cgcgagccca gcccggcccg gtagagcgga gcgccggagc ctcgtcccgc 60ggccgggccg ggaccgggcc ggagcagcgg cgcctggatg cggacccggc cgcgcgcaga 120cgggcgcccg ccccgaagcc gcttccagtg cccgacgcgc cccgctcgac cccgaag 177atg aag agg gcg tcc tcc gga gga agc agg ctg ctg gca tgg gtg tta 225Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu1 5 10 15tgg cta cag gcc tgg agg gta gca aca cca tgc cct ggt gct tgt gtg 273Trp Leu Gln Ala Trp Arg Val Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val20 25 30tgc tac aat gag ccc aag gta aca aca agc tgc ccc cag cag ggt ctg 321Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu35 40 45cag gct gtg ccc act ggc ate cca gcc tct agc cag cga atc ttc ctg 369Gln Ala Val Pro Thr Gly Ile Pro Ala Ser Ser Gln Arg Ile Phe Leu50 55 60cat ggc aac cga atc tct cac gtg cca gct gcg agc ttc cag tca tgc 417His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Gln Ser Cys65 70 75 80cga aat ctc act atc ctg tgg ctg cac tct aat gcg ctg gct cgg atc 465Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Arg Ile85 90 95gat gct gct gcc ttc act ggt ctg acc ctc ctg gag caa cta gat ctt 513Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu100 105 110agt gat aat gca cag ctt cat gtc gtg gac cct acc acg ttc cac ggc 561Ser Asp Asn Ala Gln Leu His Val Val Asp Pro Thr Thr Phe His Gly115 120 125ctg ggc cac ctg cac aca ctg cac cta gac cga tgt ggc ctg cgg gag 609Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Arg Glu130 135 140ctg ggt ccc ggc cta ttc cgt gga cta gca gct ctg cag tac ctc tac 657Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr145 150 155 160cta caa gac aac aat ctg cag gca ctc cct gac aac acc ttt cga gac 705Leu Gln Asp Asn Asn Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asn Thr Phe Arg Asp165 170 175ctg ggc aac ctc acg cat ctc ttt ctg cat ggc aac cgt atc ccc agt 753Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Pro Ser180 185 190gtg cct gag cac gct ttc cgt ggc ctg cac agt ctt gac cgc ctc ctc 801Val Pro Glu His Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu195 200 205ttg cac cag aac cat gtg gct cgt gtg cac cca cat gcc ttc cgg gac 849Leu His Gln Asn His Val Ala Arg Val His Pro His Ala Phe Arg Asp
210 215 220ctt ggc cgc ctc atg acc ccc tac ctg ttt gcc aac aac ctc tcc atg 897Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met225 230 235 240ctg cct gca gag gtc cta atg ccc ctg agg tct ctg cag tac ctg cga 945Leu Pro Ala Glu Val Leu Met Pro Leu Arg Ser Leu Gln Tyr Leu Arg245 250 255ctc aat gac aac ccc tgg gtg tgt gac tgc cgg gca cgt cca ctc tgg 993Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp260 265 270gcc tgg ctg cag aag ttc cga ggt tcc tca tca gag gtg ccc tgc aac 1041Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Asn275 280 285ctg ccc caa cgc ctg gca gac cgt gat ctt aag cgc ctc gct gcc agt 1089Leu Pro Gln Arg Leu Ala Asp Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Ser290 295 300gac cta gag ggc tgt gct gcg gct tca gga ccc ttc cgt ccc atc cag 1137Asp Leu Glu Gly Cys Ala Val Ala Ser Gly Pro Phe Arg Pro Ile Gln305 310 315 320acc agt cag ctc act gat gag gag ctg ctg agc ctc ccc aag tgc tgc 1185Thr Ser Gln Leu Thr Asp Glu Glu Leu Leu Ser Leu Pro Lys Cys Cys325 330 335cag cca gat gct gca gac aaa gcc tca gta ctg gaa ccc ggg agg cca 1233Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro340 345 350gct tct gcc gga aac gcc ctc aag gga cgt gtg cct ccc ggt gac act 1281Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Thr355 360 365cca cca ggc aat ggc tca ggc cct cgg cac atc aat gac tct cca ttt 1329Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe370 375 380gga act ttg ccc agc tct gca gag ccc cca ctg act gcc ctg cgg cct 1377Gly Thr Leu Pro Ser Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Leu Arg Pro385 390 395 400ggg ggt tcc gag cca cca gga ctt ccc acc act ggt ccc cgc agg agg 1425Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Leu Pro Thr Thr Gly Pro Arg Arg Arg405 410 415cca ggt tgt tcc cgg aag aat cgc acc cgc agc cac tgc cgt ctg ggc 1473Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly420 425 430cag gcg gga agt ggg gcc agt gga aca ggg gac gca gag ggt tca ggg 1521Gln Ala Gly Ser Gly Ala Ser Gly Thr Gly Asp Ala Glu Gly Ser Gly
435 440 445gct ctg cct gct ctg gcc tgc agc ctt gct cct ctg ggc ctt gca ctg 1569Ala Leu Pro Ala Leu Ala Cys Ser Leu Ala Pro Leu Gly Leu Ala Leu450 455 460gta ctt tgg aca gtg ctt ggg ccc tgc tgaccagcca ccagccacca1616Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys465 470ggtgtgtgta catatggggt ctccctccac gccgccagcc agagccaggg acaggctctg1676aggggcaggc caggccctcc ctgacagatg cctccccacc agcccacccc catctccacc1736ccatcatgtt tacagggttc cgggggtggc ggttggttca caaccccaac ttccacccgg1796atcgcggcat atagacatat gaaatttatt ttacttgcgt aaaatatcgg atgacgtgga1856ataaacagct 1866<210>4<211>473<212>PRT<213>台湾鼷鼠<400>4Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu1 5 10 15Trp Leu Gln Ala Trp Arg Val Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val20 25 30Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu35 40 45Gln Ala Val Pro Thr Gly Ile Pro Ala Ser Ser Gln Arg Ile Phe Leu50 55 60His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Gln Ser Cys65 70 75 80Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Arg Ile85 90 95Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu100 105 110Ser Asp Asn Ala Gln Leu His Val Val Asp Pro Thr Thr Phe His Gly115 120 125Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Arg Glu130 135 140Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr145 150 155 160Leu Gln Asp Asn Asn Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asn Thr Phe Arg Asp165 170 175Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Pro Ser180 185 190Val Pro Glu His Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu195 200 205Leu His Gln Asn His Val Ala Arg Val His Pro His Ala Phe Arg Asp210 215 220Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met225 230 235 240Leu Pro Ala Glu Val Leu Met Pro Leu Arg Ser Leu Gln Tyr Leu Arg245 250 255Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp260 265 270Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Asn275 280 285Leu Pro Gln Arg Leu Ala Asp Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Ser290 295 300Asp Leu Glu Gly Cys Ala Val Ala Ser Gly Pro Phe Arg Pro Ile Gln305 310 315 320Thr Ser Gln Leu Thr Asp Glu Glu Leu Leu Ser Leu Pro Lys Cys Cys325 330 335Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro340 345 350Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Thr355 360 365Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe370 375 380Gly Thr Leu Pro Ser Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Leu Arg Pro385 390 395 400Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Leu Pro Thr Thr Gly Pro Arg Arg Arg405 410 415Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly420 425 430Gln Ala Gly Ser Gly Ala Ser Gly Thr Gly Asp Ala Glu Gly Ser Gly435 440 445Ala Leu Pro Ala Leu Ala Cys Ser Leu Ala Pro Leu Gly Leu Ala Leu450 455 460Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys465 470<210>5<2ll>4053<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(135)..(3710)<223>人Nogo蛋白mRNA(KIAA0886，GenBank编号AB020693)<400>5caccacagta ggtccctcgg ctcagtcggc ccagcccctc tcagtcctcc ccaaccccca 60caaccgcccg cggctctgag acgcggcccc ggcggcggcg gcagcagctg cagcatcatc 120tccaccctcc agcc atg gaa gac ctg gac cag tct cct ctg gtc tcg tcc 170Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser1 5 10tcg gac agc cca ccc cgg ccg cag ccc gcg ttc aag tac cag ttc gtg 218Ser Asp Ser Pro Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val15 20 25agg gag ccc gag gac gag gag gaa gaa gag gag gag gaa gag gag gac 266Arg Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp30 35 40gag gac gaa gac ctg gag gag ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc gcc 314Glu Asp Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala45 50 55 60gcc ggg ctg tcc gcg gcc cca gtg ccc acc gcc cct gcc gcc ggc gcg 362Ala Gly Leu Ser Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala65 70 75ccc ctg atg gac ttc gga aat gac ttc gtg ccg ccg gcg ccc cgg gga 410Pro Leu Met Asp Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly80 85 90ccc ctg ccg gcc gct ccc ccc gtc gcc ccg gag cgg cag ccg tct tgg 458Pro Leu Pro Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp95 100 105gac ccg agc ccg gtg tcg tcg acc gtg ccc gcg cca tcc ccg ctg tct 506Asp Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser110 115 120gct gcc gca gtc tcg ccc tcc aag ctc cct gag gac gac gag cct ccg 554Ala Ala Ala Val Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro125 130 135 140gcc cgg cct ccc cct cct ccc ccg gcc agc gtg agc ccc cag gca gag 602Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu145 150 155ccc gtg tgg acc ccg cca gcc ccg gct ccc gcc gcg ccc ccc tcc acc 650Pro Val Trp Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr160 165 170ccg gcc gcg ccc aag cgc agg ggc tcc tcg ggc tca gtg gat gag acc 698Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr175 180 185ctt ttt gct ctt cct gct gca tct gag cct gtg ata cgc tcc tct gca 746Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala190 195 200gaa aat atg gac ttg aag gag cag cca ggt aac act att tcg gct ggt 794Glu Asn Met Asp Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly205 210 215 220caa gag gat ttc cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gct tct ctt cct 842Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro225 230 235tct ctg tct cct crc tca gcc gct tct ttc aaa gaa cat gaa tac ctt 890Ser Leu Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu240 245 250ggt aat ttg tca aca gta tta ccc act gaa gga aca ctt caa gaa aat 938Gly Asn Leu Ser Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn255 260 265gtc agt gaa gct tct aaa gag gtc tca gag aag gca aaa act cta ctc 986Val Ser Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu270 275 280ata gat aga gat tta aca gag ttt tca gaa tta gaa tac tca gaa atg 1034Ile Asp Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met285 290 295 300gga tca tcg ttc agt gtc tct cca aaa gca gaa tct gcc gta ata gta 1082Gly Ser Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val305 310 315gca aat cct agg gaa gaa ata atc gtg aaa aat aaa gat gaa gaa gag 1130Ala Asn Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu320 325 330aag tta gtt agt aat aac atc 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Gln Lys Iyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys35 40 45Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp50 55 60Ser Leu6权利要求
1.分离的核酸分子，其选自(a)编码SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列的分离的核酸分子；(b)编码SEQ IDNO2、4、8、10、12、14、16、18或20的至少6个氨基酸的片段的分离的核酸分子；(c)在高严格条件下可与含有SEQ ID NO1、3、7、9、11、13、15、17或19之互补序列的核酸分子杂交的分离的核酸分子；和(d)与SEQ ID NO1、3、7、9、11、13、15、17或19有至少75％序列同源性的分离的核酸分子。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子含有SEQ ID NO1的第166-1584位核苷酸或SEQ ID NO3的第178-1596位核苷酸。
3.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子与一个或多个表达控制元件可操作地连接。
4.载体，其含有权利要求1、2或3的分离的核酸分子。
5.转化的宿主细胞，其含有权利要求1、2或3的核酸分子。
6.宿主细胞，其含有权利要求4的载体。
7.产生多肽的方法，其包括在权利要求1、2或3的核酸分子所编码的蛋白质表达的条件下，培养该核酸分子转化的宿主细胞的步骤。
8.由权利要求7的方法产生的分离的多肽。
9.分离的多肽，其选自(a)含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列的分离的多肽；(b)含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的至少6个氨基酸的片段的分离的多肽；(c)含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列，具有1个或多个保守氨基酸置换的分离的多肽；(d)含有SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20的氨基酸序列，具有1个或多个自然存在的氨基酸序列置换的分离的多肽；和(e)与SEQ ID NO2、4、8、10、12、14、16、18或20有至少75％的氨基酸同源性的分离的多肽。
10.嵌合多肽，其含有权利要求8的任一种多肽。
11.药用组合物，其含有至少一种权利要求8的多肽。
12.可与权利要求8的多肽结合的抗体。
13.权利要求12的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
14.权利要求12的抗体，其中该抗体是多克隆抗体。
15.权利要求12的抗体，其中该抗体被人源化。
16.非人类转基因动物，其含有权利要求1、2或3的核酸分子。
17.鉴定可调节Nogo蛋白表达或Nogo受体蛋白表达的试剂的方法，其包括下列步骤(a)提供表达Nogo蛋白或Nogo受体蛋白的细胞；(b)使该细胞接触候选试剂；和(c)检测在候选试剂存在下Nogo蛋白表达或Nogo受体蛋白表达的水平相对于无候选试剂时Nogo蛋白或Nogo受体蛋白表达水平的提高或降低。
18.鉴定可调节Nogo蛋白或Nogo受体蛋白至少一种活性的试剂的方法，其包括下列步骤(a)提供表达Nogo蛋白或Nogo受体蛋白的细胞；(b)使该细胞接触候选试剂；和(c)检测在候选试剂存在下Nogo蛋白活性或Nogo受体蛋白活性的水平相对于无候选试剂时Nogo蛋白或Nogo受体蛋白活性水平的提高或降低。
19.权利要求18的方法，其中所述活性是生长锥运动。
20.权利要求18的方法，其中该试剂选自Nogo蛋白片段、抗-Nogo抗体和抗-Nogo受体抗体。
21.鉴定Nogo受体蛋白的结合配偶体的方法，其包括下列步骤(a)提供Nogo受体蛋白；(b)使该Nogo受体蛋白接触候选结合配偶体；和(c)检测候选结合配偶体与Nogo受体蛋白的结合。
22.权利要求21的方法，其中所述结合配偶体选自Nogo蛋白片段、抗-Nogo受体抗体、抗-Nogo受体抗体的片段和人源化抗-Nogo受体抗体。
23.治疗哺乳动物中枢神经系统疾病的方法，其包括施用有效量的调节Nogo蛋白或Nogo受体蛋白表达的试剂的步骤。
24.权利要求23的方法，其中所述表达降低。
25.权利要求23的方法，其中所述表达增强。
26.治疗中枢神经系统疾病的方法，其包括施用有效量的调节Nogo蛋白或Nogo受体蛋白至少一种活性的试剂的步骤。
27.权利要求26的方法，其中所述活性是轴突生长的抑制。
28.权利要求27的方法，其中轴突生长位于生长锥。
29.权利要求28的方法，其中活性降低。
30.权利要求26的方法，其中该试剂是选自SEQ ID NO8、10、12和18的多肽。
31.权利要求26的方法，其中该试剂选自Nogo蛋白片段、抗-Nogo受体抗体、抗-Nogo受体抗体的片段和人源化抗-Nogo受体抗体。
32.权利要求26的方法，其中该试剂是可溶性Nogo受体蛋白。
33.权利要求32的方法，其中可溶性Nogo受体蛋白选自含有SEQID NO2或4的氨基酸序列的可溶性受体蛋白；含有SEQ ID NO2或4的至少6个氨基酸的片段的可溶性受体蛋白；含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列，具有一个或多个保守氨基酸置换的可溶性受体蛋白；含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列，具有一个或多个自然存在的氨基酸序列置换的可溶性受体蛋白；与SEQ ID NO2或4有至少75％的氨基酸同源性的可溶性受体蛋白。
34.权利要求26的方法，其中活性提高。
35.权利要求34的方法，其中该试剂是选自SEQ ID NO14、16和20的多肽。
36.权利要求23或26的方法，其中中枢神经系统疾病是颅或脑创伤、脊髓损伤、中风或脱髓鞘疾病的结果。
37.权利要求36的方法，其中脱髓鞘疾病选自多发性硬化症、单相脱髓鞘、脑脊髓炎、多灶性白质脑病、全脑炎、马-比病、脑桥髓鞘破坏、肾上腺脑白质营养不良、佩-梅病、海绵状变性、亚力山大病、卡纳万病、异染性脑白质营养不良和克拉伯病。
38.可与Nogo受体蛋白特异结合的分离的肽，其中该肽与Nogo受体蛋白的特异结合至少具有下列作用之一(a)抑制Nogo蛋白与Nogo受体蛋白的结合，(b)阻断Nogo介导的轴突生长的抑制，(c)调节Nogo蛋白表达，或(d)调节Nogo受体蛋白表达。
39.权利要求38的分离的肽，其中该分离的肽的氨基酸序列选自SEQID NO8、10、12、14、16、18和20。
全文摘要
公开了Nogo受体蛋白和生物活性Nogo(配体)蛋白片段。也公开了调节Nogo和Nogo受体蛋白表达或活性的组合物和方法。也公开了阻断Nogo介导的轴突延伸抑制的肽。本发明的组合物和方法可用于颅或脑创伤、脊髓损伤、中风或脱髓鞘疾病的治疗。
文档编号C07K19/00GK1404488SQ01804940
公开日2003年3月19日 申请日期2001年1月12日 优先权日2000年1月12日
发明者S·M·斯特里特玛特 申请人:耶鲁大学