表皮生长因子受体阻断剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表皮生长因子受体阻断剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用，所述表皮生长因子受体阻断剂为吉非替尼或厄洛替尼；本发明所述吉非替尼/壳聚糖微球分散良好、表面光滑，具有缓释药物的性能，具有小鼠关节腔生物相容性，有效缓解小鼠骨性关节炎，促进小鼠骨性关节炎膝关节胶原Ⅱ的表达和抑制MMP-13的表达；此外，吉非替尼是一种临床用药，被广泛的用于非小细胞肺癌的治疗并取得了很好的临床疗效，减少了药物研发所需要的昂贵的经济代价和漫长的研发周期；缓释给药的给药途径，可以在提高局部药物浓度的同时减少全身用药产生相应的副作用，具有临床应用前景。
【专利说明】表皮生长因子受体阻断剂在制备治疗骨性关节炎药物中的 应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表皮生长因子受体阻断剂的应用，特别涉及表皮生长因子受体阻 断剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 骨性关节炎（osteoarthritis, 0A)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为 特征的慢性关节病。本病在中年以后多发。国内的初步调查显示，骨性关节炎的总患病率 约为15%，40岁人群的患病率为10% -17%，60岁以上则达50%。而在75岁以上人群中， 80%患有骨性关节炎。该病的最终致残率为53%。临床上以关节肿痛、骨质增生及活动受 限最为常见。骨性关节炎的发病无地域及种族差异。年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传因素可 能与本病的发生有关。
[0003] 根据美国膝关节骨关节炎治疗指南，目前可以用于骨性关节炎的药物有皮质类固 醇激素，对乙酰氨基酚和环氧化物酶-2抑剂。这些药物都是针对骨性关节炎的症状进行 治疗。究其原因在于我们对于骨性关节炎的病理生理认识不足，随着近年来分子生物学和 转化医学的发展，对骨性关节炎的发病发病机制有了深入的认识，尤其是参与骨性关节炎 主要信号通路的阻断剂。TGF-0，PI3K-mT0R，Wnt和炎症因子等相关信号通路的阻断剂广 泛用于骨性关节炎的治疗，但仅仅限于基础实验阶段，离最终的临床应用比较远，即使最终 可以用于临床，也需要付出巨大的经济代价，而且这些信号通路对骨性关节炎的调节都是 单向的，即主要是阻断破坏软骨的因素。近年来，发现表皮生长因子受体（EGFR，Epid ermal Growth Factor Receptor)信号通路参与了软骨发育和骨性关节炎的发生，该受体在动物 和人的0A样本中表达升高；同时EGFR受体的配体TGF-a抑制胶原II的合成和增加MMP-13 的分泌。因此，可以认为激活状态的受体参在0A的发生发展中起重要作用。而阻断该受体 既可以保护现存软骨又可以促进其进行自我修复。
[0004] 吉非替尼在非小细胞肺癌中可以有效阻断EGFR受体从而提高癌症病人的存活 率，由于该药物是化疗药物，其是否可以用于骨软骨相关疾病的治疗成为关注的焦点。基础 研究表明，给予SD大鼠灌胃7天可以使生长板软骨的厚度增加一倍；吉非替尼的类似物厄 洛替尼可以有效阻断类风湿性关节的滑膜炎症；吉非替尼参与软骨下骨的骨重建，上述研 究表明吉非替尼可以用于骨软骨相关疾病的治疗。吉非替尼全身用药会产生相应的副作 用，因此改善其用药途径和方式，不仅可以减少副作用的发生，而且可以提高疗效。壳聚糖 是甲壳素的脱乙酰基产物，它能被人体吸收利用与人体组织器官及细胞有良好的生物相容 性，无毒，具有生物降解性，降解过程中产生的壳寡糖在体内不积累，几乎无免疫原性，因此 在生物医药方面应用广泛是良好的药物缓释材料。由于壳聚糖缓释微球的各种优点，制备 吉非替尼/壳聚糖缓释微球可以有效用于骨性关节炎的治疗。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种表皮生长因子受体阻断剂的新应用，即表皮生长因子受体 阻断剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。本发明以EGFR的酪氨酸激酶抑制剂吉非替 尼为例，提供吉非替尼/壳聚糖微球的制备方法，并明确了吉非替尼/壳聚糖微球在小鼠骨 性关节炎中的作用。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种表皮生长因子受体阻断剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用， 所述表皮生长因子受体阻断剂为吉非替尼或厄洛替尼。
[0008] 进一步，所述表皮生长因子受体阻断剂以表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微球 的形式应用。
[0009] 进一步，所述表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微球按如下方法制备：（1)壳聚 糖溶液：用冰乙酸水溶液溶解壳聚糖，配制成壳聚糖溶液；(2)乳化体系：向壳聚糖溶液中 加入表皮生长因子受体阻断剂，混合均匀，在40°C恒温水浴、800-1000r/min条件下搅拌乳 化，形成乳化体系；所述壳聚糖溶液的用量以壳聚糖质量计，所述壳聚糖与表皮生长因子受 体阻断剂质量比为1〇〇: 1-800:1(优选400:1) ; (3)微球：向乳化体系中加入戊二醛，保持 40°C，搅拌交联，反应结束后，静置30min，待完全分层后除去上层液，下层颗粒分别用石油 醚和异丙醇洗涤，然后冷冻干燥，即得表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微球。
[0010] 进一步，所述冰乙酸水溶液的体积浓度为2%。
[0011] 进一步，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为〇. 〇1-〇. lg/ml (优选0. 02g/ml)。
[0012] 进一步，所述冷冻干燥是在-109 °C下冻干。
[0013] 进一步，所述戊二醛的体积加入量以步骤（2)壳聚糖溶液中壳聚糖的质量计为 2. 0_15ml/g (优选 12. 5ml/g)。
[0014] 此外，本发明还提供一种表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微球，所述表皮生 长因子受体阻断剂/壳聚糖微球按如下方法制备：（1)壳聚糖溶液：用体积浓度为2%的 冰乙酸水溶液溶解壳聚糖，配制成0. 01-0. lg/ml的壳聚糖溶液（优选0. 02g/ml) ; (2) 乳化体系：向壳聚糖溶液中加入表皮生长因子受体阻断剂，混合均匀，在40°C恒温水浴、 800-1000r/min条件下搅拌乳化，形成乳化体系；所述壳聚糖溶液的用量以壳聚糖质量计， 所述壳聚糖与表皮生长因子受体阻断剂质量比为100:1-800:1(优选400:1);所述表皮 生长因子受体阻断剂为吉非替尼或厄洛替尼；（3)微球：向乳化体系中加入戊二醛，保持 40°C，搅拌交联，反应结束后，静置30min，待完全分层后除去上层液，下层颗粒分别用石油 醚和异丙醇洗涤，然后冷冻干燥，即得表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微球；所述戊二醛 的体积加入量以步骤（2)壳聚糖溶液中壳聚糖的质量计为2. 0-15ml/g(优选12. 5ml/g)。 [0015] 本发明所述表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微球质量用量为 0? 88-7. 04X lO^ng/Kg体重（优选3. 52X lO^ng/Kg)，即表皮生长因子受体阻断剂质量用量 为 2. 2-17. 6 X 10_4mg/Kg 体重（优选 8. 8 X 10_4mg/Kg)。
[0016] 本发明所述表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微球（优选吉非替尼/壳聚糖微 球）以小鼠膝关节前交叉韧带切除所致骨性关节炎模型验证其对骨性关节炎的干预作用。
[0017] 本发明所述吉非替尼化学名称为：N-(3-氯-4-氟苯基）-7_甲氧基-6-(3-吗啉 丙氧基）喹唑啉-4-胺，分子式为：C 22H24C1FN403,分子量为：446. 90。
[0018] 本发明所述厄洛替尼化学名称：N-(3-乙炔苯基）-6,7_双（2-甲氧乙氧基）-4_喹 啉胺盐酸盐，分子式：C22H23N30 4 ? HC1，分子量：429. 90。
[0019] 目前，针对骨性关节炎治疗的临床药物大多集中在改善患者的症状，而对骨性关 节炎具有干预作用的临床前药物主要是抑制其炎症过程或者是抑制破坏性酶的分泌。随着 基础研究者在骨性关节炎机制研究中形成共识，骨性关节炎的发病过程中涉及细胞外基质 合成抑制和降解酶的异常高表达，本发明从吉非替尼、厄洛替尼对骨性关节炎形成过程中 胶原II的合成和MMP-13的分泌入手，首先建立小鼠膝关节前交叉韧带切除骨性关节炎模 型，通过对关节腔注射吉非替尼/壳聚糖微球后小鼠膝关节病理组织学观察并进行相应的 组织学评分，观察小鼠软骨组织的破坏程度，以及胶原II和MMP-13的表达情况，并通过空 白组，模型组和吉非替尼/壳聚糖微球用药组的比较，来研究吉非替尼/壳聚糖微球关节腔 注射对小鼠骨性关节炎的防治作用，探讨吉非替尼对骨性关节炎转归机制的影响，表明吉 非替尼可通过促进胶原II的合成和抑制MMP-13的分泌来抑制骨性关节炎的病理过程，从 而为该药物的进一步临床应用提供实验依据。
[0020] 国内外运用壳聚糖作为缓释载体已取得具有应用价值的结果，主要表现为壳聚糖 微球具有良好的生物相容性和良好的缓释效应从而明显减少药物的用量和提高了治疗效 果。壳聚糖微球为本发明实验研究提供了必要的条件。
[0021] C57BL/6J小鼠24只抽取18只切除小鼠膝关节的前交叉韧带进行骨性关节炎造 模，造模后分为骨性关节炎组，壳聚糖微球组，吉非替尼/壳聚糖微球组，剩余小鼠为假手 术组。骨性关节炎组6只左右腿造模后不做任何处理，壳聚糖微球组6只左右腿造模1周 后开始关节腔注射不含药物的壳聚糖微球，每3天一次，吉非替尼/壳聚糖微球组6只左右 腿造模1周后开始关节腔注射吉非替尼/壳聚糖微球，每3天一次，实验8周后处死所有小 鼠，观察各组小鼠膝关节病理组织学改变并进行相应的组织学评分。结果表明：吉非替尼 /壳聚糖微球分散良好、表面光滑，具有缓释药物的性能，具有小鼠关节腔生物相容性，有效 缓解小鼠骨性关节炎，促进小鼠骨性关节炎膝关节胶原II的表达和抑制MMP-13的表达。
[0022] 本发明有益效果主要体现在：本发明所述表皮生长因子阻断剂/壳聚糖微球分散 良好、表面光滑，具有缓释药物的性能，具有小鼠关节腔生物相容性，有效缓解小鼠骨性关 节炎，促进小鼠骨性关节炎膝关节胶原II的表达和抑制MMP-13的表达；此外，吉非替尼、厄 洛替尼是一种临床用药，被广泛的用于非小细胞肺癌的治疗并取得了很好的临床疗效，减 少了药物研发所需要的昂贵的经济代价和漫长的研发周期；缓释给药的给药途径，可以在 提高局部药物浓度的同时减少全身用药产生相应的副作用，具有临床应用前景。 (四）【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为壳聚糖微球扫描电镜表征图。
[0024] 图2为吉非替尼/壳聚糖微球扫描电镜表征图。
[0025] 图3为吉非替尼/壳聚糖微球体外缓释曲线图。
[0026] 图4为厄洛替尼/壳聚糖微球扫描电镜表征图。
[0027] 图5为厄洛替尼/壳聚糖微球体外缓释曲线图。
[0028] 图6为关节腔滑膜组织的HE染色图，A为假手术组，B为骨性关节炎组，C为壳聚 糖缓释微球组，D为吉非替尼/壳聚糖微球组。
[0029] 图7为假手术组，骨性关节炎组，壳聚糖缓释微球组和吉非替尼/壳聚糖微球体组 关节腔滑膜组织的炎症评分。
[0030] 图8为软骨组织切片p-EGFR免疫组化染色图，A为假手术组，B为骨性关节炎组， C为壳聚糖缓释微球组，D为吉非替尼/壳聚糖微球组。
[0031] 图9为软骨组织切片的番红-阿辛蓝染色图，A为假手术组，B为骨性关节炎组，C 为壳聚糖缓释微球组，D为吉非替尼/壳聚糖微球中剂量组，E为吉非替尼/壳聚糖微球低 剂量组，F为吉非替尼/壳聚糖微球高剂量组。
[0032] 图10为假手术组，骨性关节炎组，壳聚糖微球组和吉非替尼/壳聚糖微球组软 骨组织的国际骨关节炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International， OARSI)评分。
[0033] 图11为软骨组织切片胶原II免疫组化染色图，A为假手术组，B为骨性关节炎组， C为壳聚糖缓释微球组，D为吉非替尼/壳聚糖微球组。
[0034] 图12为软骨组织切片MMP-13免疫组化染色图，A为假手术组，B为骨性关节炎组， C为壳聚糖缓释微球组，D为吉非替尼/壳聚糖微球组。
[0035] 图13为细胞的胶原II表达情况。
[0036] 图14为细胞的MMP-13表达情况。 (五）【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0038] 本发明实施例所用实验材料：
[0039] 实验动物：雌性4周龄C57BL/6J小鼠24只SPF级浙江大学动物实验中心提供。
[0040] 实验药品：
[0041] 吉非替尼（易瑞沙，Iressa):英国阿斯利康制药有限公司批号：J20070047
[0042] 壳聚糖：上海伯奥生物科技有限公司批号：050106
[0043] 主要试剂：
[0044]
【权利要求】
1. 一种表皮生长因子受体阻断剂在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述表皮生长因子受体阻断剂为吉非替尼或 厄洛替尼。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述表皮生长因子受体阻断剂以表皮生长因 子受体阻断剂/壳聚糖微球的形式应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微 球按如下方法制备：（1)壳聚糖溶液：用冰乙酸水溶液溶解壳聚糖，配制成壳聚糖溶液；（2) 乳化体系：向壳聚糖溶液中加入表皮生长因子受体阻断剂，混合均匀，在40°C恒温水浴、 800-1000r/min条件下搅拌乳化，形成乳化体系；所述壳聚糖溶液的用量以壳聚糖质量计， 所述壳聚糖与表皮生长因子受体阻断剂质量比为100:1-800:1 ;(3)微球：向乳化体系中加 入戊二醛，保持40°C，搅拌交联，反应结束后，静置30min，待完全分层后除去上层液，下层 颗粒分别用石油醚和异丙醇洗涤，然后冷冻干燥，即得表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖 微球。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述冰乙酸水溶液的体积浓度为2%。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为 0· 01-0. lg/ml。
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述冷冻干燥是在-109°C下冻干。
8. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述戊二醛的体积加入量以步骤（2)壳聚糖 溶液中壳聚糖的质量计为2. 0-15ml/g。
9. 一种表皮生长因子受体阻断剂/壳聚糖微球，其特征在于所述表皮生长因子受体阻 断剂/壳聚糖微球按如下方法制备：（1)壳聚糖溶液：用体积浓度为2%的冰乙酸水溶液溶 解壳聚糖，配制成〇. 01-0. lg/ml的壳聚糖溶液；（2)乳化体系：向壳聚糖溶液中加入表皮生 长因子受体阻断剂，混合均匀，在40°C恒温水浴、800-1000r/min条件下搅拌乳化，形成乳 化体系；所述壳聚糖溶液的用量以壳聚糖质量计，所述壳聚糖与表皮生长因子受体阻断剂 质量比为100:1-800:1 ;所述表皮生长因子受体阻断剂为吉非替尼或厄洛替尼；（3)微球： 向乳化体系中加入戊二醛，保持40°C，搅拌交联，反应结束后，静置30min，待完全分层后除 去上层液，下层颗粒分别用石油醚和异丙醇洗涤，然后冷冻干燥，即得表皮生长因子受体阻 断剂/壳聚糖微球；所述戊二醛的体积加入量以步骤（2)壳聚糖溶液中壳聚糖的质量计为
2.〇-15ml/g〇
【文档编号】A61K31/517GK104257659SQ201410414758
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】欧阳宏伟, 吴岩, 熊思, 王俊娟, 邹晓辉 申请人:浙江大学