专利名称：预防和治疗仔猪黄痢的受体阻断剂、制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂-受体阻断剂，特别涉及一种预防和治疗仔猪黄痢 的受体阻断剂以及应用。
背景技术：
在本发明之前，针对仔猪黄痢的预防和治疗是主要采用抗生素或(和)产肠 毒素大肠杆菌(ETEC) K88和K99二价基因工程苗用于预防和临床治疗，在一 定程度上降低了初生仔猪和断奶仔猪腹泻率，但长期和大量复合抗生素的使用， 导致多种耐药性ETEC不断产生和水平传播扩散，并造成抗生素低效和在动物体 内的畜积，也会导致动物胃肠道正常菌群紊乱，消化不良，引发胃肠道和机体抵 抗力下降，易继发或并发多种疾病；K88和K99 二价基因工程苗仅局限使用在 免疫怀孕母猪产生母源抗体，仔猪在吃到含4^高母源抗体的初乳后，在一定时间 内产生被动免疫力，能抵抗、中和体内已侵袭感染的ETEC病原菌，保护仔猪不 发病，但免疫期较短，且长期使用，免疫压力选择下不断增加产生优势血清型致 病性菌林，而原有的疫苗对这种致病性菌林感染免疫效力不佳。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种受体阻断剂及制备方法。 本发明的技术是
预防和治疗仔猪黄痢的受体阻断剂，其主要技术特征在于受体阻断剂是益生 素重組菌组合系列，该益生素重组菌系列为2种猪源优势益生素菌林，其中1 种为猪源优势大肠杆菌益生素重组菌EPl,第2种为猪源优势乳酸杆菌益生素菌 林LP1,猪源优势大肠杆菌益生素重组菌内含表达987P和K88粘附素的重组 pBR322载体，其中粘附素987P是由987P产肠毒素大肠杆菌染色体基因组和野 生型53kb大质粒DNA共同编码，由FasA、 B、 C、 D、 E、 F、 G基因组成，FasH 则是它的调节基因，仅存在于染色体基因组上，粘附素K88是由K88产肠毒素 大肠杆菌野生型大质粒DNA编码，由faeA到faeJ共10个基因参与其菌毛粘附 素的生物合成，其中faeA和faeB为调节基因，其余都为粘附素K88操纵子结构 基因。
本发明的另一技术方案是
所述的受体阻断剂的制备方法，其主要技术步骤如下
(1)猪源优势大肠杆菌益生素抹载体菌EP1和猪源优势乳酸杆菌益生素菌 LP1分离自仔猪正常小肠粘膜，按常规细菌法分离、鉴定，符合大肠杆菌 和乳酸杆菌形态、培养和生物学的一般特性，进一步通过仔猪小肠上皮细 胞体外粘附试验和体内口服后仔猪肠道定植、增殖试验细菌数检测，筛选 出对小肠上皮细胞粘附能力强、易能在仔猪肠道定植、定居和增殖的EP1 和LP1 二种细菌并保存；
(2 )选取猪源优势大肠杆菌益生素抹栽体菌EP1,按大肠杆菌常规细菌培养和 增殖，选取猪源优势乳酸杆菌益生素菌LP1,按乳酸杆菌常规培养和增殖；
(3)鉴定、克隆编码大肠杆菌987P、 K88完整操纵子结构基因根据上述二 种完整操纵子基因已知的发表序列，采用长距离PCR法扩增粘附素完整 结构基因，核酸分子杂交检测，经特定的限制性内切酶EcoRI或Pstl分 别酶切消化，结合核苷酸序列分析而最后获得粘附素完整操纵子结构基 因，987P粘附素结构基因含FasA、 B、 C、 D、 E、 F、 G7个亚单位基因， 约9Kb大小，K88粘附素结构基因含FaeC、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J 8个 亚单位基因，约8Kb大小；
(4) 表达987P和K88粘附素完整操纵子结构基因的pBR322重组载体系统构 建按常规DNA重组技术操作，将编码大肠杆菌987P、 K88粘附素完整 操纵子结构基因DNA和表达载体pBR322 DM分别经特定限制性内切酶 BamHI和HindIII酶切消化、连接后，分别转化工程菌DH5a感受态细菌， 从筛选的培养菌液中提取含目的片段的阳性质粒DNA,结合细菌粘附素 凝集反应阳性结果，筛选到能功能性展呈表达987P和K88粘附素的 pBR322重组栽体；
(5) 鉴定、克隆编码大肠杆菌染色体上的天门冬氨酸半醛脱氢酶管家基因即 ASD完整编码基因根据上述基因已知的发表序列，以工程菌DH5&染 色体DNA为才莫板，采用长距离PCR法扩增ASD完整基因，核酸分子杂 交;f企测，经特定的限制性内切酶Pstl酶切消化结合核苷酸序列分析而最后 获得ASD完整编码基因，约2Kb大小；
(6 )表达987P、 K88粘附素完整操纵子结构基因和ASD编码基因的pBR322 重组栽体系统构建表达987P和K88粘附素完整操纵子基因的pBR322 重组载体，经重组DNA技术操作，插入ASD编码基因于上述表达987P和 K88粘附素完整操纵子结构基因的pBR322重组栽体的多克隆位点区域， 失活了原pBR322载体上的抗性基因活性，筛选出含表达ASD编码基因， 上述表达987P和K88粘附素完整操纵子结构基因的pBR322重组载体以 ASD存在为筛选标志替代抗生素抗性基因筛选标志，且祛除了原pBR322 载体上的氨卞青霉素和四环素抗性基因筛选标志；
(7 )猪源优势大肠杆菌益生素EP1重组菌构建和筛选:提取含表达987P、 K88 粘附素完整操纵子结构基因和ASD编码基因的pBR322重组质粒载体 DNA，经DNA转化法分别导入猪源优势大肠杆菌益生素ASD缺失突变 林载体菌内，从筛选的培养菌液中提取含目的片段的阳性重组质粒DNA， 结合细菌粘附素凝集反应、仔猪小肠上皮细胞体外粘附试验和仔猪肠道定 植试验细菌数检测阳性结果，'拜选出能将987P和K88两种粘附素有效和 功能性展呈表达在仔猪肠道上皮细胞的猪源优势大肠杆菌益生素ASD缺 失突变抹EPl ASD重组菌；
(8 )受体阻断剂产品制备挑取步骤(7 )中猪源优势大肠杆菌益生素EP1重 组菌和猪源优势乳酸杆菌LP1单个菌落，在37'C过夜培养18小时菌液作 为种子液，再分别扩大培养、增殖16 18小时，经常规细菌菌落计数， 以菌落形成单位cfo度量，浓度达2 6 x lo9cfu,混合配置而成益生素重组 菌系列。 本发明的又一技术方案是
所述的受体阻断剂作为预防和治疗仔猪黄痢药物的应用，其主要技术特征在
于
1)猪源优势大肠杆菌益生素林载体菌EP1，经DNA遗传修饰，即利用X噬菌 体Red重组酶系统和同源重组技术，缺失其菌林染色体上的天门冬氨酸半醛 脱氢酶管家基因即ASD编码基因，构建出猪源优势大肠杆菌益生素林载体菌EP1 ASD缺失突变抹； 2 )表达987P和K88粘附素完整操纵子基因的pBR322重组载体，经重组DM 技术操作，插入ASD编码基因于上述pBR322重组载体的多克隆位点区域， 失活了原pBR322栽体上的抗性基因活性，筛选出含表达ASD编码基因，上 述表达987P和K88粘附素完整操纵子基因的pBR322重组载体以ASD存在 为筛选标志替代抗生素抗性基因筛选标志，且祛除了原pBR322载体上的氨 卞青霉素和四环素抗性基因筛选标志；
3 )猪源优势大肠杆菌益生素EP1重组菌基于ASD非抗生素抗性为选择压力的
染色体一一质粒致死平衡系统的载体菌林构建；
4 )猪源优势乳酸杆菌益生素菌林能有效促进猪源优势大肠杆菌益生素EP1重组
菌和其ASD缺失突变4朱EP1 ASD重组菌在仔猪肠道的定植、定居和增殖；
5 )受体阻断剂产品用于一 日龄仔猪，口服2ml 4小时后能在仔猪肠道定植、定 居、增殖。
本发明的优点和效果在于组合细菌染色体DNA大分子重组技术、病原菌受 体和其粘附素结合和检测技术、粘附素受体封闭/阻断技术、粘附素操纵子体外
表达技术和畜禽益生素多年的研究工作基础，研制出的一种受体阻断剂，它是基 于猪源优势通用性益生素抹载体菌重组菌抹组合，仔猪口服后能在肠道很快定 植、定居、增殖，且在肠道上皮细胞表面功能性展呈表达987P和K88粘附素， 该粘附素优先和仔猪肠道上皮细胞受体结合，从而封闭了肠道上皮细胞与987P 和K88粘附素介导的ETEC病原菌的结合靶位点，即使外界污染有大量病原菌， 由于失去了结合仔猪肠道上皮细胞的能力，而不能感染易感仔猪。本发明的最大 优点在于该种受体阻断剂与常Mi元生素药物和疫苗的功效作用阶^:完全不同，后 者是抵抗、抑制、中和体内已侵袭感染的ETEC病原菌，保护仔猪不发病，而前 者则是阻止外界病原菌不能进入动物体内，两者比较，后者能最直接、最有效地 封闭/阻止仔猪肠道上皮细胞表面受体靶位点与987P和K88粘附素介导的产肠 毒素大肠杆菌病原菌的结合，在临床上用于抗987P和K88产肠毒素大肠杆菌感 染的高效防治，且见效很快。事实上，我们已将此受体阻断剂用于通常都发生仔 猪黄痢一些猪场，几小时(最早4小时)产生明显保护效果，对987P和K88产 肠毒素大肠杆菌病原菌感染的预防效果很好，使用方法为仔猪口服，非常简单， 很易于推广应用。它是一种全新的、广谱的、非抗生素预防和治疗仔猪黄痢高科 技生物制剂。该受体阻断剂高科技生物制剂本身不带有任何抗生素抗性基因筛选 标志，因而不会造成任何抗生素耐药基因在病原菌和动物机体的存在和传播。
本发明的其它优点和效果将在下面继续描述。
图1 — _体外优化表达系统功能性展呈表达987P完整菌毛粘附素x13500。 图2—一体外优化表达系统功能性展呈表达K88完整菌毛粘附素x46000。
图3—_PCR检测猪源优势益生素载体菌抹EP1 AASD缺失突变抹。 M: DM分子量DL2000; 1: PCR扩增检测EP1菌抹染色体ASD基因；
2和3: PCR扩增检测一次同源重组菌EP1AASD中ASD基因缺失； 4和5: PCR扩增检测二次同源重组菌EP1AASD中氯霉素基因缺失； 图4 ——猪源优势益生素抹栽体菌林EP1功能性展呈表达987P(4a)和 K88(4b)和仔猪肠道上皮细胞表面受体的结合示意图x1000。
具体实施例方式
如图1、图2、图3、图4所示
受体阻断剂是有效和功能性表达987P和K88粘附素的益生素重组菌组合 系列，其制备为
1. 首先，自仔猪正常小肠粘膜材料分离、鉴定猪源大肠杆菌益生素抹载体菌和猪 源优势乳酸杆菌益生素菌，进一步通过仔猪小肠上皮细胞体外粘附试验和体内 口服后仔猪肠道定植、增殖试验细菌数检测，筛选出对小肠上皮细胞粘附性能 强、易在仔猪肠道定植、定居和增殖的猪源优势大肠杆菌益生素菌，代号为 EP1，和猪源优势乳酸杆菌益生素菌林，代号为LP1，并分别保存；
2. 选取猪源优势大肠杆菌益生素株载体菌EP1,按大肠杆菌常规细菌培养和增 殖；选取猪源优势乳酸杆菌益生素菌LP1，按乳酸杆菌常规培养和增殖；
3. 猪源优势大肠杆菌益生素抹载体菌EP1染色体ASD缺失突变林构建。经DNA 遗传修饰，即利用X噬菌体Red重组酶系统和同源重组技术，缺失其菌林染色 体上的天hl冬氨酸半醛脱氢酶管家基因即ASD编码基因，构建出猪源优势大 肠杆菌益生素抹栽体菌ASD缺失突变抹，代号为EP1AASD,经体外生长特 性，仔猪肠道定植、定居和增殖试验细菌数检测和比较，EP1和缺失突变林 EP1AASD在体外生长特性，仔猪肠道定植、定居和增殖特性上基本一致；
4. 鉴定、克隆编码大肠杆菌987P、 K88粘附素完整操纵子结构基因。根据上述 基因已知的发表序列，采用长模板PCR法扩增粘附素完整基因，核酸分子杂 交检测，经特定的限制性内切酶EcoRI或Pstl酶切消化结合核苦酸序列分析 而最后获得粘附素完整操纵子结构完整基因，987P粘附素结构基因含FasA、 B、 C、 D、 E、 F、 G7个亚单位基因，约9Kb大小，K88粘附素结构基因含 FaeC、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J8个亚单位基因，约8Kb大小；
5. 表达987P和K88粘附素完整操纵子结构基因的pBR322重组栽体系统构建。 按常规DNA重组技术操作，将编码大肠杆菌987P、 K88粘附素完整操纵子 结构基因DNA和表达载体pBR322 DNA分别经限制性内切酶BamHI和 HindIII酶切消化、连接后，分别转化工程菌DH5A感受态细菌，从筛选的培 养菌液中提取含目的片段的阳性重组质粒DNA,结合细菌粘附素凝集反应阳 性结果，筛选到能功能性展呈表达987P和K88粘附素的pBR322重组载体；
6. 鉴定、克隆编码大肠杆菌染色体上的天门冬氨酸半醛脱氢酶管家基因即ASD 完整编码基因。根据上述基因已知的发表序列，以工程菌DH5i染色体DNA 为模板，采用长模板PCR法扩增ASD完整基因，核酸分子杂交检测，经特 定的限制性内切酶Pstl酶切消化结合核普酸序列分析而最后获得ASD完整编 码基因，约2Kb大小；
7. 表达987P、 K88粘附素完整操纵子结构基因和ASD编码基因的pBR322重 组载体系统构建。上述表达987P和K88粘附素完整操纵子基因的pBR322 重組载体，经重组DM技术操作，插入ASD编码基因于上述pBR322重组载 体的多克隆位点区域，失活了原pBR322载体上的抗性基因活性，筛选出含 表达ASD编码基因，上述表达987P、 K88粘附素完整#:纵子结构基因的 pBR322重组栽体以ASD存在为筛选标志替代抗生素抗性基因筛选标志，且 祛除了 pBR322原载体上的氨卞青霉素和四环素抗性基因筛选标志；
8. 猪源优势大肠杆菌益生素抹载体菌ASD缺失突变林构建。经DNA遗传修饰， 即利用X噬菌体Red重组酶系统和同源重组技术，缺失其菌林染色体上的天 门冬氨酸半醛脱氢酶管家基因即ASD编码基因，构建出猪源优势大肠杆菌益
生素林栽体菌ASD缺失突变林，经体外生长特性，仔猪肠道定植、定居和增 殖试验检测和比较，ASD缺失突变林EP1 △ ASD和猪源优势大肠杆菌益生 素林EP1在上述特性上基本一致；
9. 大肠杆菌优势益生素ASD缺失突变林重组菌构建和筛选。提取表达987P、 K88粘附素完整操纵子结构基因和ASD编码基因的pBR322重组质粒载体 DNA,经DNA转化法分别导入猪源优势大肠杆菌益生素ASD缺失突变林载 体菌内，从筛选的培养菌液中提取含目的片段的阳性重组质粒DNA,结合细 菌粘附素凝集反应、仔猪小肠上皮细胞体外粘附试验和仔猪肠道定植试验细 菌数检测阳性结果，筛选出能将987P和K88两种粘附素有效和功能性展呈 表达在仔猪肠道上皮细胞的大肠杆菌优势益生素ASD缺失突变抹EPIAASD 重组菌；
10. 猪源优势乳酸杆菌益生素菌林能有效促进猪源优势大肠杆菌益生素重组菌 和其ASD缺失突变林重组菌在仔猪肠道的定植、定居和增殖试验。分别选取 EP1， EP1厶ASD, EPl和LPl, EP1AASD和LP1共四组益生素重组菌組 合，分别用于一日龄仔猪口服，经仔猪肠道定植试验和细菌数检测比较，猪 源优势乳酸杆菌益生素菌抹LP1能有效促进猪源优势大肠杆菌益生素重组菌 EP1和EP1 AASD缺失突变林在仔猪肠道的定植、定居和增殖；
11. 受体阻断剂终产品制备。挑取猪源优势大肠杆菌益生素重组菌EP1 AASD 和猪源优势乳酸杆菌LP1单个菌落在普通LB肉汤或常规M17培养基3rC过 夜培养18小时菌液作为种子液，再分别扩大培养、增殖16 18小时，经常 规细菌菌落计数，以菌落形成单位cfii度量，浓度达2 6 x 109cfU， EP1 △ ASD重組菌和LP1扩大培养菌液混合配置而成益生素ASD缺失突变株重组 菌系列。
得到的受体阻断剂产品是益生素重组菌组合系列，该益生素重组菌组合系列 为2种猪源优势益生素菌林，包括1种猪源优势大肠杆菌益生素重组菌和1种猪 源优势乳酸杆菌益生素菌林。猪源优势大肠杆菌益生素重组菌内含表达987P和 K88粘附素，其中粘附素987P是由987P产肠毒素大肠杆菌染色体基因组和野生 型53kb大质粒DNA共同编码，与FasA、 B、 C、 D、 E、 F、 G基因組成，而FasH 则是它的调节基因，4又存在于染色体基因組上；粘附素K88是由K88产肠毒素 大肠杆菌野生型大质粒DNA编码，由faeA到faeJ共10个基因参与其菌毛的生 物合成，其中faeA和faeB为调节基因，其余都为粘附素K88操纵子结构基因。
经血清学凝集反应检测，研制成的受体阻断剂能分别凝集兔或鼠抗987P和 K88粘附素抗体，玻片凝集反应效价达l: IOO以上，经仔猪小肠上皮细胞体外粘 附试验检测，受体阻断剂具有对小肠上皮细胞粘附能力强，动物体内粘附试验检 观'J,用于一日龄仔猪，口服后能在肠道最早4小时定植、定居、增殖，继而在仔猪 肠道上皮细胞表面功能性展呈表达987P和K88粘附素。由于粘附素能特异性结 合存在于仔猪小肠上皮细胞表面的大分子受体，当受体阻断剂定植、增殖在仔猪 小肠上皮细胞并进一步在其表面功能性展呈表达987P和K88粘附素后，该二种 功能性表达粘附素其作用首先优先和仔猪肠道上皮细胞表面受体结合，从而封闭 了肠道上皮细胞表面大分子受体与987P和K88粘附素介导的ETEC病原菌结合 的同样乾位点，从而失去了 987P和K88产肠毒素大肠杆菌病原菌感染机体的第 一步也是最最重要一步的可能性，即失去病原菌其感染性粘附素和宿主细胞表面 相应的特异性受体靶位点结合。在上述受体阻断剂封闭了肠道上皮细胞表面大分子受体情况下的仔猪，等同于体内不存在或失去987P ETEC和K88 ETEC 二种 病原菌的特异受体，即使外界污染有大量病原菌，由于病原菌失去了感染动物的 作用耙位点，不再会发生感染，即使仔猪体质弱、抵抗力差，也不会感染发病。 本发明中，受体阻断剂的制备方法由于采用了对小肠上皮细胞粘附能力强、 易能在仔猪肠道定植、定居和增殖的猪源优势益生素菌林组合系列，其功能性展 呈表达987P和K88粘附素能长时间逗留在仔猪肠道，优先并能长时间和仔猪肠 道上皮细胞表面受体结合，抗感染作用持久。由于受体阻断剂的制备方法中含有 987P和K88粘附素是阻止外界病原菌不能进入动物体内，与常规抗生素药物和 疫苗的功效作用阶段完全不同，后者是抵抗、抑制、中和体内已侵袭感染的ETEC 病原菌，保护仔猪不发病，两者比较，受体阻断剂能最直接、最有效地封闭/阻 止仔猪肠道上皮细胞受体与987P和K88粘附素介导的产肠毒素大肠杆菌病原 菌的耙位点结合，在临床上用于抗987P和K88产肠毒素大肠杆菌感染的直接、 高效防治。受体阻断剂最早可用于一日龄仔猪，口服后能在仔猪肠道最早4小时 定植、定居、增殖和封闭仔猪肠道上皮细胞受体与987P和K88粘附素介导的产 肠毒素大肠杆菌病原菌的结合，使产下仔猪在很短时间内由于口服受体阻断剂而 成为非易感仔猪，应用在实际生产中，因而能显著提高预防和治疗仔猪黄痢效果。 受体阻断剂作为预防和治疗仔猪黄痢药物的应用 1)上述优势猪源通用性益生素林栽体菌，经DNA遗传修饰，其菌抹染色体上 的天门冬氨酸半醛脱氲酶管家基因(ASD编码基因)缺失，构建出猪源优势大 肠杆菌益生素林载体菌ASD缺失突变抹，经体外生长特性，仔猪肠道定植、 定居和增殖试验4企测和比较，ASD缺失突变林和猪源优势大肠杆菌益生素 林在上述特性上基本一致； 2 )上述表达987P和K88粘附素完整操纵子基因的pBR322重组载体，经重 组DM技术操作，插入ASD编码基因于上述pBR322重组载体的多克隆位 点区域，失活了原pBR322栽体上的抗性基因活性，筛选出含表达ASD编 码基因，以上述ASD存在为筛选标志替代抗生素抗性基因筛选标志，且祛 除了 pBR322原栽体上的氨卞青霉素和四环素抗性基因筛选标志； 3)上述益生素重组菌基于非抗生素抗性(ASD编码基因)为选择压力的染色体 一一质粒致死平衡系统的载体菌株构建，本身不带有任何抗生素抗性基因 筛选标志，因而不会造成任何抗生素耐药基因在病原菌和动物机体的存在 和传播。
4)猪源优势乳酸杆菌益生素菌抹能有效促进猪源优势大肠杆菌益生素和 ASD缺失突变林重组菌在仔猪肠道的定植、定居和增殖，能在仔猪肠道很 快定植、定居、增殖。
5 )上述受体阻断剂最早可用于一 日龄仔猪，口服2ml后能在仔猪肠道最早4 小时定植、定居、增殖，有效预防和治疗仔猪黄痢。
一日龄仔猪10只口服使用本发明的2ml受体阻断剂12小时后，用987P和 K88产肠毒素大肠杆菌病原菌人工感染，没有一只仔猪发病和出现黄痢症状，攻 毒保护率达IOO、选择原先每窝仔猪通常都发生仔猪黄痢的3个猪场，使用本 发明的受体阻断剂后，不再发生仔猪黄痢。原患有黄痢疾病仔猪，即使采用常规 治疗方法即口服或注射复合抗生素，疗程3 5天， 一般治疗效果不佳，大多呈 急性败血型死亡，耐过治愈的仔猪，引发胃肠道和机体抵抗力下降，易继发或并 发多种疾病，生长较慢，饲料报酬较高，生产性能也会影响，因而生产效益明显
降低。将本发明的受体阻断剂使用在原先患有黄痢仔猪，在使用过猪场的试验结 果表明，能很快终止仔猪黄痢的病程发展， 一些患病仔猪很快恢复。由于本发明 的受体阻断剂是一种全新的、非抗生素治疗和预防仔猪黄痢策略和途径，而使用 本发明受体阻断剂后，可望在该病的治疗和预防上大大减少或不需要抗生素使 用，也预期着本发明的受体阻断剂替代基因工程苗和常规疫苗使用。
权利要求
1.预防和治疗仔猪黄痢的受体阻断剂，其特征在于受体阻断剂是益生素重组菌组合系列，该益生素重组菌系列为2种猪源优势益生素菌株，其中1种为猪源优势大肠杆菌益生素重组菌EP1，第2种为猪源优势乳酸杆菌益生素菌株LP1，猪源优势大肠杆菌益生素重组菌内含表达987P和K88粘附素的重组pBR322载体，其中粘附素987P是由987P产肠毒素大肠杆菌染色体基因组和野生型53kb大质粒DNA共同编码，由FasA、B、C、D、E、F、G基因组成，FasH则是它的调节基因，仅存在于染色体基因组上，粘附素K88是由K88产肠毒素大肠杆菌野生型大质粒DNA编码，由faeA到faeJ共10个基因参与其菌毛粘附素的生物合成，其中faeA和faeB为调节基因，其余都为粘附素K88操纵子结构基因。
2. 根据权利要求1所述的受体阻断剂的制备方法，其步骤如下(1)猪源优势大肠杆菌益生素林载体菌EP1和猪源优势乳酸杆菌益生素菌 LP1分离自仔猪正常小肠粘膜，按常规细菌法分离、鉴定，符合大肠杆菌 和乳酸杆菌形态、培养和生物学的一般特性，进一步通过仔猪小肠上皮细 胞体外粘附试验和体内口服后仔猪肠道定植、增殖试验细菌数检测，筛选 出对小肠上皮细胞粘附能力强、易能在仔猪肠道定植、定居和增殖的EP1 和LP1 二种细菌并保存；(2 )选取猪源优势大肠杆菌益生素抹载体菌EP1,按大肠杆菌常规细菌培养和 增殖，选取猪源优势乳酸杆菌益生素菌LP1，按乳酸杆菌常规培养和增殖；(3) 鉴定、克隆编码大肠杆菌987P、 K88完整操纵子结构基因根据上述二 种完整操纵子基因已知的发表序列，采用长距离PCR法扩增粘附素完整 基因，核酸分子杂交检测，经特定的限制性内切酶EcoRI或Pstl分别酶 切消化，结合核苦酸序列分析而最后获得粘附素完整操纵子结构基因， 987P粘附素结构基因含FasA、 B、 C、 D、 E、 F、 G7个亚单位基因，约 9Kb大小，K88粘附素结构基因含FaeC、 D、 E、 F、 G、 H、 I、 J 8个亚 单位基因，约8Kb大小；(4) 表达987P和K88粘附素完整操纵子结构基因的pBR322重组载体系统构 建按常规DNA重组技术操作，将编码大肠杆菌987P、 K88粘附素完整 操纵子结构基因DNA和表达栽体pBR322 DNA分别经特定限制性内切酶 BamHI和HindIII酶切消化、连接后，分别转化工程菌DH5A感受态细菌， 从篩选的培养菌液中提取含目的片段的阳性质粒DNA，结合细菌粘附素 凝集反应阳性结果，筛选到能功能性展呈表达987P和K88粘附素的 pBR322重组栽体；(5) 鉴定、克隆编码大肠杆菌染色体上的天门冬氨酸半醛脱氢酶管家基因即 ASD完整编码基因根据上述基因已知的发表序列，以工程菌DH5&染 色体DNA为模板，采用长距离PCR法扩增ASD完整基因，核酸分子杂 交检测，经特定的限制性内切酶Pstl酶切消化结合核苷酸序列分析而最后 获得ASD完整编码基因，约2Kb大小；(6) 表达987P和K88粘附素完整操纵子结构基因和ASD编码基因的pBR322 重组栽体系统构建表达987P和K88粘附素完整^:纵子基因的pBR322 重组载体，经重组DNA技术操作，插入ASD编码基因于上述表达987P和 K88粘附素完整操纵子结构基因的pBR322重组栽体的多克隆位点区域， 失活了原pBR322栽体上的抗性基因活性，筛选出含表达ASD编码基因， 上述表达987P和K88粘附素完整操纵子结构基因的pBR322重组载体以 ASD存在为筛选标志替代抗生素抗性基因篩选标志，且祛除了原pBR322 载体上的氨卞青霉素和四环素抗性基因筛选标志； (7 )猪源优势大肠杆菌益生素EP1重组菌构建和筛选,提取含表达987P、 K88 粘附素完整操纵子结构基因和ASD编码基因的pBR322重组质粒载体 DNA，经DNA转化法分别导入猪源优势大肠杆菌益生素ASD缺失突变 林载体菌内，从筛选的培养菌液中提取含目的片段的阳性重组质粒DNA, 结合细菌粘附素凝集反应、仔猪小肠上皮细胞体外粘附试验和仔猪肠道定 植试验细菌数检测阳性结果，筛选出能将987P和K88两种粘附素有效和 功能性展呈表达在仔猪肠道上皮细胞的猪源优势大肠杆菌益生素ASD缺 失突变林重组菌；(8 )受体阻断剂产品制备挑取步骤(7 )中猪源优势大肠杆菌益生素EP1重 组菌和猪源优势乳酸杆菌LP1单个菌落，在37'C过夜培养18小时菌液作 为种子液，再分别扩大培养、增殖16 18小时，经常MJB菌菌落计数， 以菌落形成单位cfu度量，浓度达2 6 x 109cfo，混合配置而成益生素重 组菌系列。
3.根据权利要求1所述的受体阻断剂作为预防和治疗仔猪黄痢药物的应用，其 特征在于1)猪源优势大肠杆菌益生素林载体菌EP1,经DNA遗传修饰，即利用？i噬菌 体Red重组酶系统和同源重组技术，缺失其菌林染色体上的天门冬氨酸半醛 脱氢酶管家基因即ASD编码基因，构建出猪源优势大肠杆菌益生素抹载体 菌EP1 ASD缺失突变林； 2 )表达987P和K88粘附素完整操纵子基因的pBR322重组栽体，经重组DNA 技术操作，插入ASD编码基因于上述pBR322重组栽体的多克隆位点区域， 失活了原pBR322载体上的抗性基因活性，筛选出含表达ASD编码基因，上 述表达987P和K88粘附素完整操纵子基因的pBR322重组载体以ASD存在 为筛选标志替代抗生素抗性基因筛选标志，且祛除了原pBR322栽体上的氨 卞青霉素和四环素抗性基因筛选标志；3) 猪源优势大肠杆菌益生素EP1重组菌基于ASD非抗生素抗性为选择压力的 染色体一一质粒致死平衡系统的栽体菌抹构建；4) 猪源优势乳酸杆菌益生素菌林能有效促进猪源优势大肠杆菌益生素重组菌和 其ASD缺失突变林重组菌在仔猪肠道的定植、定居和增殖；5) 受体阻断剂产品用于一日龄仔猪，口服2ml4小时后能在仔猪肠道定植、定 居、增殖。
全文摘要
本发明涉及预防和治疗仔猪黄痢的受体阻断剂、制备及应用。本发明组合细菌染色体DNA大分子重组技术、病原菌受体和其粘附素结合和检测技术、粘附素受体封闭/阻断技术、粘附素操纵子体外表达技术的一种受体阻断剂，仔猪口服后能在肠道很快定植、定居、增殖，在肠道上皮细胞表面功能性展呈表达987P和K88粘附素，与仔猪肠道上皮细胞受体结合，从而封闭了肠道上皮细胞与987P和K88粘附素介导的ETEC病原菌的结合靶位点。解决了使用复合抗生素导致耐药性，导致动物胃肠道正常菌群紊乱，消化不良，机体抵抗力下降等缺陷。本发明优点在于阻止外界病原菌进入动物体内，直接封闭仔猪肠道上皮细胞表面受体靶位点与987P和K88粘附素介导的产肠毒素大肠杆菌病原菌的结合。
文档编号A61K35/66GK101204404SQ20071019146
公开日2008年6月25日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者何素芬, 刘俊斌, 刘振华, 原志伟, 朱国强, 朱春红, 朱晓芳, 王建业, 董国雄 申请人:扬州大学