专利名称：调节涉及黑素生成的肾上腺素受体基因表达的筛选方法
技术领域：
本发明涉及基因的组和基因组转录表达谱来源的生物标记，还涉及用于确定和评价从转录上调控涉及黑素合成(黑素生成)的基因，尤其是肾上腺素受体基因，和调节人类皮肤中的老年斑的方法。
背景技术：
皮肤老化是由内在因素(例如，实足年龄老化的天然过程的效应)和外在因素(例如，环境毒素/污染物和吸烟)共同驱动的多因子的过程。皮肤具体包括角质细胞、黑素细胞和神经细胞、成纤维细胞、朗格汉斯细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等等，参见图1，角质细胞和黑素细胞存在于表皮中。黑素细胞位于表皮的基底层，并且它们组成了黑素生成的位点。由于它们与角质细胞紧密接触，黑素细胞将新合成的黑素以黑素体的形式转移至角质细胞，从而赋予皮肤颜色。尽管黑素细胞实际上产生色素反应，角质细胞生产了肾上腺素一一种被报道触发黑素细胞生产色素的儿茶酚胺。通过儿茶酚胺(例如肾上腺素)触发黑素被称为儿茶酚胺生物合成，这将被描述于下文中。因此，这两种细胞类型共生地一起作用，以调节色素沉着。角质细胞中分布的黑素的类型和量决定了皮肤的基本颜色。参见图2，黑素生成，或黑素合成，是以L-酪氨酸氨基酸的羟基化开始的生物学现象，L-酪氨酸产生自L-二羟苯基-丙氨酸(L-多巴)的形成，其继而通过特异性黑素细胞相关的酶酪氨酸酶的作用被转化为多巴-色素。连续的还原和氧化反应导致多巴-色素至黑素的转化。酪氨酸酶的生产及其活性部分地决定了生产的黑素的量。转移至角质细胞的黑素的量和类型，就它们的部分而言决定了人类皮肤的视觉上色素沉着的程度。皮肤老化或皮肤老化的外观随黑素生成而变化。皮肤老化或老年斑被视作皮肤色调的反差。如本文所用，“老年斑”一般是指与皮肤上与老化相关的斑点，并且可以包括日光性着色斑、雀斑、黄褐斑、脂溢性角化病、炎症后色素沉着过度等等。如本文所用，“色调”一般是指平滑和均匀的有色表面的视觉感知。皮肤老化影响质感和色素沉着，在面部造成反差，这种反差可以是由皱纹或者由老年斑导致的颜色变化导致的阴影的结果。在年轻的皮肤中，黑素是均匀分布的，并且黑素细胞活性低，仅限于产生组成型的色素沉着。日光中的紫外线辐射瞬时地活化黑素细胞，以产生均匀分布的黑素，如棕褐色肤色。在老化的皮肤中，一些黑素细胞可以被累积的紫外线曝露损伤，导致它们被持续地“开启”和过度生产黑素。这种过度的黑素生成能够最终造成永久性局部变色，这种局部变色具有足够表现为老年斑(雀斑)或表现为弥散性色素沉着过度的尺寸和反差。随着皮肤的更新随年龄增长而降低，极微小的黑素小点(“黑素尘埃”)能够变得被局限在表皮和角质层中，导致阴暗的外观。黑素的不均匀分布使得其自身表现为老年斑和色素沉着过度。老年斑组织中的色素沉着过度涉及下列已知的因素中的一种或多种:较高的酪氨酸酶(上文所述的一种黑素细胞的酶)活性，和较多的成熟黑素体以及黑素/黑素体在被合成后在黑素细胞或角质细胞中较高的保留比率。
一般来讲，紫外线辐射诱导的色素沉着过度被认为部分地导致了阿黑皮素原来源的肽的作用和通过提高胞内cAMP作用于黑素细胞黑皮质素-1受体的黑素细胞刺激性激素。在阿黑皮素原缺陷型小鼠和在具有无功能的黑皮质素-1受体的动物中的研究显示，它们依然能够响应于毛喉素而产生黑素，表明替代性的cAMP依赖的途径也诱导了黑素生成。—种此类替代性的cAMP依赖的途径涉及肾上腺素受体，其在药理学上被分为两组:a和P。肾上腺素受体是鸟嘌呤核苷酸结合调控蛋白偶联的受体的原型家族，其介导激素肾上腺素和神经递质去甲肾上腺素的生理效应。有3种类型的P肾上腺素受体:ADRP 1、ADR^ 2和ADRP 3，亚型的分型是基于对儿茶酚胺和特异性拮抗剂的不同药理学反应以及蛋白质序列的差异。此外，有a肾上腺素受体的多种亚型:ADRa 1A、ADRa IB、ADR a ID、ADR a 2A、ADR a 2B 和 ADR a 2C。根据 Schallreuter, K.U.等人，The induction of the a -1-adrenoreceptorsignal transduction system on human melanocytes,Experimental Dermatology 1996 ；第5卷，第I期，第20-23页，人类黑素细胞不受胞外刺激时不表达al、￠1或P 2肾上腺素受体。去甲肾上腺素的引入导致a I受体的时间依赖的诱导；然而，对黑素生成没有影响。与此相比，黑素细胞中的￠-肾上腺素受体不被去甲肾上腺素刺激诱导，因此由黑素细胞合成的去甲肾上腺素似乎不介导色素沉着/黑素生成。与此相反，在角质细胞中去甲肾上腺素生物合成的诱导与ADRP 2受体的升高相关。Schallreuter进行了涉及在表皮内的ADRP 2信号途径和儿茶酚胺合成网络的研究。角质细胞和黑素细胞均表达ADRP 2，并且这两种细胞类型均具有用于儿茶酚胺生物合成，具体地是去甲肾上腺素合成的酶学机制，尽管仅角质细胞是已知合成肾上腺素的。肾上腺素从角质细胞的分泌刺激了黑素细胞上的P肾上腺素受体，这使胞内cAMP升高，并从而提闻了黑素生成。Sivamani 等人，An Epinephrine-Dependent Mechanism for the Control ofUV-1nduced Pigmentation, Journal of Investigative Dermatology (2009),第 129 卷，第784-786页公开了角质细 胞响应于紫外线辐射分泌肾上腺素，而肾上腺素刺激黑素细胞上的P肾上腺素受体，以提高黑素合成。因此，Sivamani确立了应激、紫外线辐射和色素沉着之间的联系。此外，Sivamani确认了 Schallreuter也提供了的一般共识,即a I受体对黑素生成没有影响。Grando,Adrenergic and Cholinergic Control in the Biology of Epidermis:Physiological and Clinical Significance, Journal of Investigative Dermatology,第126卷，第1948-1965页(2006)教导了表皮的肾上腺素信号控制钙稳态，并且提出色素沉着可以通过P 2和a I肾上腺素受体被控制；然而，Grando的例子集中在ADRP 2与黑素生成的关系。Grando还声称黑素细胞仅表达ADRP 2受体，而ADRP I受体被认为是缺乏的。对负责老化的生物化学过程，例如上文所述的机制的更好的理解，已刺激了化妆品工业，并导致了新的一类有时被称为“药妆品”的美容活性物质的出现。所声称的效果，包括但不限于抗氧化剂、抗炎剂和自由基清除效果，来源于基础科学。本发明人认识到与针对美容功能效应对已知的美容剂的评价相关联的不足，和与对实际上实现基于理论的效应以向皮肤提供真实的、可验证的抗衰老有益效果的试剂的鉴定相关联的不足。相应地，本发明人认识到对用于鉴定在减小老化相关的皮肤斑点中有效的试剂(具体地是通过调节黑素的生产)的可靠的和有效的体外方法的持续需求。尽管文献已一般地确立了 ADRii 2受体和黑素生成之间的联系，但在老年斑中肾上腺素受体和黑素生成之间的联系还没有被很好地建立，并且仍然存在对鉴定更多的在老年斑中调节黑素生成的肾上腺素受体的需求。
发明内容
本发明的实施例指向用于开发调节黑素生产以减少老年斑和改善皮肤色调的试剂的基因组学和蛋白质组学技术的应用。全基因表达谱提供了用于鉴定皮肤老化过程的关键方面的有用方法，并且提供了允许本发明的皮肤技术的开发的信息。能够通过应用基因组学和蛋白质组学处理的皮肤老化的重要方面是皮肤中的老年斑或色素沉着过度的减少。使用这种转录分析方法，检测响应于化合物的对黑素合成的影响是可能的。基因微阵列是用于了解皮肤老化过程中在转录水平发生的变化的新工具。本发明人收集了基因表达数据并应用了先进的生物信息学来鉴定受老化影响的特定途径。具体地，通过利用如下文所述的现代基因组学分析和SiRNA敲除技术，本发明人发现了 ADRii I受体和ADRii 3受体与黑素生成之间的联系，并且还认识到调节ADRi^ I受体和ADRii 3受体控制了老年斑中黑素的产生。为了证明这种联系，下文提供的对老年斑的基因组学分析显示了与未涉及的皮肤相比，在老年斑中ADRii I基因的显著过表达。与此相反，尽管与未涉及的皮肤相比，ADRP I基因在老年斑中展示了高得多的表达，来自通常与黑素合成相关的基因(例如酪氨酸酶，和酪氨酸酶相关蛋白I)的转录物没有展示在老年斑中相对于未涉及的皮肤的表达水平的任何显著变化。
基于这些具有创造性的发现，本发明提供了用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法。所述方法包括使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRP I受体；以及基于所述受试试剂与所述ADRii I受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的有效的ADRii I受体拮抗剂，其中当所述受试试剂具有小于约IOOOppm的半数抑制浓度时，所述受试试剂被认为是有效的ADRii I受体拮抗剂。根据进一步的实施例，本发明提供了用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的另外的筛选方法。所述方法包括使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRP 3受体；以及基于所述受试试剂与所述ADRii 3受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的ADRii 3受体激动剂。根据另外的实施例，附加的筛选方法指向确定作为ADRa IB受体拮抗剂或ADRa 2C受体拮抗剂有效的适合用于改变有色皮肤的外观的受试试剂。另外的实施例涉及混入了在人类皮肤中调节黑素的产生的这些试剂的美容剂。本发明的多种实施例的特征和有益效果将从下文的描述中变得明显，这些描述包括旨在提供对本发明的广泛表示的图表和具体实施例的实施例。从这些描述和从本发明的实施，多种修正形式对于本领域的技术人员将显而易见。本发明的范围并不旨在限于所公开的具体形式，并且本发明涵盖了属于本发明的精神和范围内的全部修正形式、等同物和供选择的替代方案，如权利要求所规定的。
当结合下列附图阅读时，可最好地理解本公开具体实施例的下列详述:图1是黑素合成途径的示意图。图2是黑素合成途径的另一示意图。图3是描绘通过ADR @ I和ADRP 2受体的黑素合成途径的交叉点的示意图。图4是描绘ADRP I和ADRP 2受体激动剂和拮抗剂对黑素合成的影响的图示例证。图5是描绘多巴酚丁胺对人类皮肤移植组织的影响的图示例证。图6是关于B16黑素合成检测的SiRNA敲除数据的图示例证，其中肾上腺素受体是基于％敲除度量值比较的。图7是关于B16黑素合成检测的SiRNA敲除数据的图示例证，其中肾上腺素受体是基于在肾上腺素存在的情况下的倍数变化比较的。图8是比较性图示例证，显示了当人类受试者施用含有ADRP I受体拮抗剂十一碳烯酰基苯丙氨酸(可以以商品名Sepiwhiteli'商购获得)的护肤产品相对于不含ADRP I受体 抑制剂的护肤产品时斑点部分(％)的减少。
具体实施例方式本发明的实施例涉及通过调节肾上腺素受体使老年斑的产生最小化，具体而言是^肾上腺素受体，例如ADR P I和ADR P 3，和a肾上腺素受体，例如ADR a 2C和ADR a IB。就@肾上腺素受体而言，对信号转导途径的审查表明，ADR^ I和ADRP 2受体共享导致提高的胞内cAMP生产的相似转导途径，这最终导致对酪氨酸酶表达的刺激。该信号转导途径与黑皮质素I受体(MClR)的信号转导途径(已知的促色素沉着途径)相交，如图3中所示。如上所述并且如图3中所示，ADRP I和ADRP 2受体的触发导致提高的cAMP水平，这驱动酪氨酸酶的产生，因此与已知的驱动色素沉着的途径相交。具体地，如图所示，ADRP I和ADRP 2受体与Gs G蛋白相交，其活化腺苷环化酶，催化环腺苷一磷酸盐(cAMP)的形成。提高的cAMP水平刺激小眼相关转录因子(MITF)的表达提高，继而在下游导致酪氨酸酶的上调。MITF帮助控制黑素细胞的发育和功能(S卩，控制皮肤中产生的黑素的水平)。由于ADRM和ADR^ 2受体共享相似的色素沉着途径，预期ADRP I和ADRP 2基因在具有过量的黑素的老年斑中都将是过表达的；然而，实际情况并非如此。通过基因组学研究，本发明人出人意料地发现，ADRP I基因在老年斑中是高度上调的，而ADR ￠2基因在老年斑中不是高度上调的。如本文所用，高度上调意指基因在老年斑中展示了至少2的倍数变化值和小于0.05的p值。参见下文的表2，本发明人使用AfTy芯片，在具有老年斑和不具有老年斑(S卩，未涉及的皮肤)的活组织检查皮肤样品上进行了比较性实验基因组学研究。所述基因组学研究使用了广泛用于分子生物学和基因组学研究的技术——微阵列。微阵列包括核酸寡核苷酸的排列的系列，每种包含针对靶基因的探针。探针是靶基因(或其他靶DNA)的短的部分，其被设计为与靶cDNA或cRNA样品杂交。杂交在此后通过本领域中熟知的方法(其可以包括荧光标记的靶标)被检测和定量，以确定特定序列在样品中的相对丰度。一种阵列可以包含数以千计的探针，而“全”阵列被理解为包含针对一个物种中已知基因的整个群体的探针。一般地，探针通过连接化学反应与固体基质例如玻璃或硅芯片相连。通俗地说，当采用Affymetrix 品牌芯片时，这些被称为Affy芯片。此类微阵列也被称为基因芯片。本文预期了许多其他的微阵列平台或检测体系。本发明的一个实施例预期了靶向特定的基因的组的杂交寡核苷酸的特定集合，然而，这允许了，特别是，本发明的方法的实施。在对所述眼睛中获得的活组织检查皮肤样品的统计学分析中，ADRii 2基因被发现在老年斑(例如，日光性着色斑)中与在未涉及的皮肤中相比是显著上调的，如通过老年斑对未涉及的皮肤14.5的倍数变化所展示的。同时，ADRii 2和ADRii 3的表达水平在老年斑中与在未涉及的皮肤中相比不是显著不同的。表I
权利要求
1.一种用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法，所述方法包括: 使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADR β I受体；以及 基于所述受试试剂与所述ADRii I受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的有效的ADRii I受体拮抗剂，其中当所述受试试剂具有小于约lOOOppm、或优选小于约lOOppm、或最优选小于约50ppm的半数抑制浓度时,所述受试试剂被认为是有效的ADRii I受体拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其中被翻译为所述ADRiiI受体拮抗剂的ADR β I基因表现出上调，所述上调通过统计分析展示为具有至少2的倍数变化值和小于0.05的P值。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其中所述ADRiiI受体拮抗剂还作为所述ADRβ 2受体的拮抗剂起作用。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，还包括使第二种细胞、第二种细胞培养物、或第二组大量细胞与所述受试试剂接触，并且如果所述受试试剂是所述ADRii 2受体的拮抗剂，确定所述受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，还包括将所述ADRiiI受体拮抗剂调节黑素的生产并从而减少人类皮肤中老年斑外观的能力与所述ADRii I受体拮抗剂的拮抗活性相关联。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，还包括在选自Β16细胞分析的黑素合成分析或皮肤模型中评价所述受试试剂。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其中在ADRβ I受体拮抗剂和ADR β I受体之间结合相互作用时产生发冷光的信号。
8.—种被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物，包含至少一种通过权利要求1的方法被鉴定为ADR β I受体拮抗剂的受试试剂。
9.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其中所述ADRiiI受体拮抗剂选自palGQPR、palGHK、acetylGHK、acetylGQPR、去氧苯比妥、^ 碳烯酰基苯丙氨酸、以及它们的组合。
10.一种用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法，所述方法包括: 使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADR β 3受体；以及 基于所述受试试剂与所述ADRii 3受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的ADRii 3受体激动剂。
11.一种被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物，包含通过权利要求10的方法被鉴定为ADRii 3受体激动剂的受试试剂。
12.根据权利要求11所述的化妆品组合物，其中所述ADRii3受体激动剂包含一种或多种选自下列的化合物:ZD7114、阿米贝隆、索拉贝隆、L-796568、CL-316243、LY-368842、以及它们的组合。
13.一种用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法，所述方法包括:使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRa IB受体、ADRa 2C受体、或二者； 基于所述受试试剂与所述ADRa IB受体、ADRa 2C受体、或二者的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的ADRa IB受体拮抗剂和/或ADRa 2C受体拮抗剂。
14.一种被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物，包含通过权利要求13的方法被鉴定为ADR a IB受体拮抗剂的受试试剂，任选地其中所述ADR a IB拮抗剂选自多沙唑嗪、哌唑嗪、卡维地洛、以及它们的组合。
15.一种被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物，包含通过权利要求13的方法被鉴定为ADR a 2C受体拮抗剂的受试试剂，任选地其中所述ADR a 2C拮抗剂选自育亨宾、螺沙群、卡维地洛、以及它们的组合。`
全文摘要
本发明提供了用于确定受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法的实施例。所述筛选方法可以包括下列步骤使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRβ1受体；以及基于所述受试试剂与所述ADRβ1受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的有效的ADRβ1受体拮抗剂，其中当所述受试试剂具有小于约1000ppm的半数抑制浓度时，所述受试试剂被认为是有效的ADRβ1受体拮抗剂。
文档编号G01N33/94GK103201625SQ201180050544
公开日2013年7月10日 申请日期2011年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者L·T·劳林二世, 箱崎智洋, W·赵, 汪家珍, J·C·柏曼 申请人:宝洁公司