人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法
【专利摘要】一种人表皮生长因子受体2定量测定试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括HER-2磁分离试剂，试剂1，试剂2，稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底物溶液；所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物的纳米磁性微球；所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体；所述的试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液；所述稀释液是含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液。其目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的人表皮生长因子受体2定量测定试剂盒及其检测方法。
【专利说明】人表皮生长因子受体2 (Her-2)定量测定试剂盒及其检测 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是人表皮生长因子受体 2 (HER-2)定量测定试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体（epidermal growth Tactor receptor，缩写 EGFR)是 ErbB 家 族成员之一，具有酪氨酸激酶活性，是一种重要的跨膜受体。EGFR被配体激活后，启动胞内 信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细 胞迁移、黏附、增殖、分化、凋亡，且与肿瘤的形成和恶化密切相关。
[0003] 目前乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤，也是常见的女性肿瘤死亡原因之一。 大约有20%?30%的乳腺癌患者册1?-2/1^11高表达，册1?-2/1^11高表达与患者的不良预后 密切相关。HER-2/neu基因是人表皮生长因子家族的第2位成员。定位于染色体17q21，其 编码一种分子量为185ku的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，结构上分为膜外配体结合 域、跨膜区和膜内酪氨酸激酶的活性域。HER-2/neu蛋白的胞外部分可以从细胞的表面脱落 至血液中，形成分子量大约为l〇5ku的可溶性蛋白HER-ZE⑶。HER-ZE⑶的裂解启动了细胞 膜上的受体磷酸化，从而激活了细胞核内her-2并导致基因转录、细胞增殖；或ECD裂解后， 截短的细胞内酪氨酸激酶保持信号传导能力，相应的实验结果认为ECD的裂解会使细胞膜 上的P95发生磷酸化，从而导致肿瘤细胞的增殖。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式 简便，检测结果准确可靠的人表皮生长因子受体2 (Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法。
[0005] 本发明的人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒，包括HER-2磁分离试 齐IJ，试剂1，试剂2,稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底物 溶液；所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物 的纳米磁性微球：所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体；所述的试 齐IJ2是含有三羟甲基氨基甲烷（TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液；所述稀释液是含有牛 血清白蛋白（BSA)的溶液；所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER-2抗原的牛 血清白蛋白（BSA)溶液；所述清洗浓缩液是含有吐温-20(TWEE\-20)和Proclin-300的缓 冲液。
[0006] 本发明的人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒，其中所述HER-2磁分 离试剂采用如下步骤制成：
[0007] (1)、称取7g三羟甲基氨基甲烷（TRIS)、lg似队和68甲基纤维素于容器中，称取 4g吐温20 (TWEEN-20)，加适量水使吐温20 (TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；
[0008] (2)、用移液器将Proclin-300量取0. 2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒 入上述容器中，然后在容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；
[0009] (3)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7. 95-8. 05之间；
[0010] (4)、称取牛血清白蛋白（BSA)3g，四环素0.04g，硫酸新霉素 lg，全部倒入上述容 器中，充分混匀；
[0011] (5)、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml,用0. 2 μ μπι滤器过滤，得到 免疫磁珠缓冲液，备用；
[0012] (6)、将l.Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜（DMS0)中，备用；取 2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为lml，获得一级抗体溶液， 用移液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜（DMS0)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，加入到所述抗体 溶液中，置室温90min，获得二级抗体溶液；
[0013] (7)、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机 中，在3000g下离心30min，浓缩至0. 5ml，获得三级抗体溶液；
[0014] (8)、取0. 5ml免疫磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后，吸取上清，然后 加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中，保持 混匀状态，室温反应4小时，获得已经标记的免疫磁珠；
[0015] (9)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液室温反应30分钟，然后加入1.5ml PH7. 2 0. lmol/LPB清洗已经标记的免疫磁珠，混匀30秒；
[0016] (10)、用10ml PH7. 2 0· lmol/L PB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃 瓶；
[0017] (11)、将1. 5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠 的保存液中，加入到步骤10中的玻璃瓶中，混匀反应2小时，再加入5ml PH7. 2 0. lmol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠，并混匀30秒；
[0018] (12)、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶，配制得免疫磁珠浓度为 0. 05 %的标准浓度磁珠使用液；
[0019] (13)、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1 : 1的体积比 例混匀，即得所述HER-2磁分离试剂（其使用浓度为0· 025% );
[0020] 所述试剂1采用如下步骤制成：
[0021] (1)、取 Tris6. 06g、NaC113. 0g、Zncl20. 05g、Proclin-300 0· 2ml 和 MgCl20. 05g 于 烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使其中的固体完全溶解；
[0022] (2)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7. 35-7. 45范围内；
[0023] (3)、称取牛血清白蛋白（BSA)3g倒入上述烧杯中；
[0024] (4)、最后用纯化水定容至1000ml,用0. 2 μ μ m滤器过滤,得试剂1稀释液，备 用；
[0025] (5)、取10mg碱性磷酸酶（ALP)，加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM 尚心20分钟，浓缩至1晕升，获得浓缩液；
[0026] (6)、向步骤5获得浓缩液中加入0. 2ml的0. 1M Nal04溶液，室温下避光搅拌20分 钟，然后装入透析袋中，用ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，收集保留液；
[0027] (7)、向步骤6获得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9. 0,然 后立即加入2. 5mg抗HER-2单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0. lml的4mg/ml NaBH4溶液， 混匀，置4°C下2小时；
[0028] (8)、将步骤7获得溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保 留液；
[0029] (9)、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C 1小时，然后 3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4的PBS中，获得溶液；
[0030] (10)、将步骤9获得的溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB缓冲液透析5个 小时，去除铵离子，收集保留液后10, OOOrpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积 比为1体积的上清液：100体积的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶（ALP) 与抗HER-2单克隆抗体的偶联物，将收集到的碱性磷酸酶（ALP)与抗HER-2单克降抗体的 偶联物，用上述步骤4获得的试剂1稀释液，以1体积的偶联物：1000体积的试剂1稀释液 的体积比混合均匀，即得试剂1。
[0031] 所述试剂2采用如下步骤制成：
[0032] (1)、取TRIS1. 56g、NaC14. 23g和0. 5g甲基纤维素，全部加入容器中，取0. 2ml Proclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入容器中；
[0033] (2)、取800ml纯化水加入步骤1容器中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调 PH 在 7. 35-7. 45 之间；
[0034] (3)、根据Mak33的浓度量取最终量为0· 9g的Mak33,称取牛γ球蛋白（lgG)20g， 羊血清4ml，马血清5ml加入步骤2容器中；最后用纯化水定容至1000ml，完全溶解后，用 〇.2μπι滤器过滤，即得试剂2;
[0035] 所述稀释液采用如下步骤制成：
[0036] (1)、称取 NaC19. Og 和 BSA60g，加入容器中；
[0037] (2)、取(λ 5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，加入步骤1容器中；
[0038] (3)、最后加纯化水定容1000ml,完全溶解后，用0. 2 μ m滤器过滤，即得稀释液；所 述清洗浓缩液采用如下步骤制成：
[0039] (1)、取 TRIS12. 54g 和 NaC1325. 6g，加入容器中；
[0040] ⑵、取5g Tween-20,加20ml水使其完全溶解后，加入步骤1容器中；
[0041] (3)、取0· 2ml Proclin-300,用10ml纯化水完全溶解后，加入步骤2容器中；
[0042] (4)、取800ml纯化水加入步骤3容器中，充分搅拌，直至其中的固体物完全溶解；
[0043] (5)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调PH，控制其范围在7. 35-7. 45之间；
[0044] (6)、最后用纯化水定容1000ml,用0. 2 μ μ m滤器过滤，即得清洗浓缩液；
[0045] 所述酶促化学发光底物溶液采用如下步骤制成：
[0046] (1)、取 TRIS2. 35g、NaC16. 41g、Na2S030 . 00 2g、光泽精 0· 002g 和 Proclin-300 0. 2ml，加入烧杯中；
[0047] (2)、加入600ml纯化水于烧杯中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH在 7. 95-8. 05 之间；
[0048] (3)、向烧杯中加入250ml Lumi-PHos480,用纯化水定容至1000ml，混匀后用 0. 2 μ m滤器过滤，即得酶促化学发光底物溶液。
[0049] 本发明的人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒，其中所述HER-2校准 品中HER-2抗原的浓度分别为0、15、45、90、180、350ng/ml ;所述HER-2质控品中HER-2抗 原的浓度分别为15、180ng/ml。
[0050] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒，其中所述室温反应 的温度为20°C -24°C。
[0051] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法，包括如 下步骤：
[0052] 1)、向试管架上的每一试管中分别加入30 μ 1 HER-2标准品、质控品和待测标本；
[0053] 2)、向每一试管中加入45 μ 1试剂1 ;
[0054] 3)、向每一试管中加入45 μ 1试剂2 ;
[0055] 4)、向每一试管中加入30 μ 1 HER-2磁分离试剂；
[0056] 5)、用多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，将试管架连同全部试管置于水浴箱 中，温浴45分钟；
[0057] 6)、将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触， 沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸 上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；
[0058] 7)、将清洗浓缩液按照1体积的清洗浓缩液：7体积纯化水的比例添加纯化水，得 到清洗液，向每一试管中加 200 μ 1清洗液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒；加样时应 避免加样力度过大而导致磁珠溅出；
[0059] 8)、再次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面 接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在 吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；
[0060] 9)、再次向每一试管中加200 μ 1清洗浓缩液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30 秒；加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出；
[0061] 10)、第3次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表 面接触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放 在吸水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴；
[0062] 11)、加 200 μ 1酶促化学发光底物溶液至试管中，混匀5秒，迅速用准备好的发光 检测仪进行检测，即可得到相关数据。
[0063] 本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法，其中所 述待测标本为高值HOOK样本时，使用稀释液对标本进行稀释。
[0064] 本发明的人表皮生长因子受体2 (Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法，其试剂 盒包括HER-2磁分离试剂，试剂1，试剂2,稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩 液以及酶促化学发光底物溶液；实验表明，本发明的人表皮生长因子受体2也即癌胚抗原 (HER-2)定量测定试剂盒及其检测方法，具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结 果的时间和更简便的操作方式。
[0065] 下面对本发明的人表皮生长因子受体2(Her-2)定量测定试剂盒及其检测方法作 进一步详细说明。
【具体实施方式】
[0066] 本发明的人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒，包括HER-2磁分离试 齐?，试剂1，试剂2,稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底物 溶液；所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合物 的纳米磁性微球；所述的试剂1是含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克降抗体；所述的试 齐IJ2是含有三羟甲基氨基甲烷（TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液；所述稀释液是含有牛 血清白蛋白（BSA)的溶液；所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER-2抗原的牛 血清白蛋白（BSA)溶液；所述消洗浓缩液是含有吐温-20(TWEEN-20)和Proclin-300的缓 冲液。
[0067] 上述HER-2磁分尚试剂米用如下步骤制成：
[0068] (1)、称取7g三轻甲基氨基甲烧（TRIS)、lg NaN3和6g甲基纤维素于容器中，称取 4g吐温20 (TWEEN-20)，加适量水使吐温20 (TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；
[0069] (2)、用移液器将Proclin-300量取0. 2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒 入上述容器中，然后在容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；
[0070] (3)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7. 95-8. 05之间；
[0071] (4)、称取牛血清白蛋白（BSA)3g，四环素0.04g，硫酸新霉素 lg，全部倒入上述容 器中，充分混匀；
[0072] (5)、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml,用0. 2 μ μπι滤器过滤，得到 免疫磁珠缓冲液，备用；
[0073] (6)、将l.Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜（DMS0)中，备用；取 2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为lml，获得一级抗体溶液， 用移液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜（DMS0)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，加入到所述抗体 溶液中，置室温90min，获得二级抗体溶液；
[0074] (7)、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机 中，在3000g下离心30min，浓缩至0. 5ml，获得三级抗体溶液；
[0075] (8)、取0. 5ml免疫磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后，吸取上清，然后 加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中，保持 混匀状态，室温反应4小时，获得已经标记的免疫磁珠；
[0076] (9)、加入0.3ml lmol/L的TRIS溶液室温反应30分钟，然后加入1.5ml PH7. 2 0. lmol/LPB清洗已经标记的免疫磁珠，混匀30秒；
[0077] (10)、用10ml PH7. 2 0· lmol/L PB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃 瓶；
[0078] (11)、将1. 5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠 的保存液中，加入到步骤10中的玻璃瓶中，混匀反应2小时，再加入5ml PH7. 2 0. lmol/L PB清洗已经标记的免疫磁珠，并混匀30秒；
[0079] (12)、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶，配制得免疫磁珠浓度为 0. 05 %的标准浓度磁珠使用液；
[0080] (13)、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1 : 1的体积比 例混匀，即得所述HER-2磁分离试剂（其使用浓度为0· 025% );
[0081] 所述试剂1采用如下步骤制成：
[0082] (1)、取 Tris6. 0 6 g、NaC113. 0g、Zncl20. 05g、Proclin-300 0· 2ml 和 MgCl2 0· 05g 于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使其中的固体完仝溶解：
[0083] (2)、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7. 35-7. 45范围内：
[0084] (3)、称取牛血清白蛋白（BSA)3g倒入上述烧杯中；
[0085] (4)、最后用纯化水定容至1000ml，用0. 2 μ μ m滤器过滤，得试剂1稀释液，备 用：
[0086] (5)、取10mg碱性磷酸酶（ALP)，加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM 尚心20分钟，浓缩至1晕升，获得浓缩液；
[0087] (6)、向步骤5获得浓缩液中加入0. 2ml的0. 1M Nal04溶液，室温下避光搅拌20分 钟，然后装入透析袋中，用ImM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，收集保留液：
[0088] (7)、向步骤6获得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9. 0,然 后立即加入2. 5mg抗HER-2单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0. lml的4mg/mlNaBH ;溶液， 混匀，置4°C下2小时：
[0089] (8)、将步骤7获得溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保 留液；
[0090] (9)、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C 1小时，然后 3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4的PBS中，获得溶液；
[0091] (10)、将步骤9获得的溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB缓冲液透析5个 小时，去除铵离子，收集保留液后10, OOOrpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积 比为1体积的上清液：100体积的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即的碱性磷酸酶（ALP) 与抗HER-2单克隆抗体的偶联物，将收集到的碱性磷酸酶（ALP)与抗HER-2单克隆抗体的 偶联物，用上述步骤4获得的试剂1稀释液，以1体积的偶联物：1000体积的试剂1稀释液 的体积比混合均匀，即得试剂1。
[0092] 所述试剂2采用如下步骤制成：
[0093] (1)、取TRIS1. 56g、NaCl 4. 23g和0· 5g甲基纤维素，全部加入容器中，取 0. 2mlProclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入容器中；
[0094] (2)、取800ml纯化水加入步骤1容器中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调 PH 在 7. 35-7. 45 之间；
[0095] (3)、根据Mak33的浓度量取最终量为0.9g的Mak33,称取牛球蛋白（lgG)20g， 羊血清4ml，马血清5ml加入步骤2容器中；最后用纯化水定容至1000ml，完全溶解后，用 〇.2μπι滤器过滤，即得试剂2:
[0096] 所述稀释液采用如下步骤制成：
[0097] (1)、称取 NaC19. Og 和 BSA60g，加入容器中：
[0098] (2)、取0· 5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，加入步骤1容器中；
[0099] (3)、最后加纯化水定容1000ml，完全溶解后，用0. 2 μ m滤器过滤，即得稀释液：
[0100] 所述清洗浓缩液采用如下步骤制成：
[0101] (1)、取 TRlS12.54g 和 NaC1325.6g，加入容器中；
[0102] (2)、取5gTween-20,加 20ml水使其完全溶解后，加入步骤1容器中；
【权利要求】
1. 人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒，其特征在于：包括HER-2磁分离 试剂，试剂1，试剂2,稀释液，HER-2标准品，HER-2质控品，清洗浓缩液以及酶促化学发光底 物溶液；所述的HER-2磁分离试剂含有兔抗小鼠2抗和小鼠抗人HER-2的单克隆抗体复合 物的纳米磁性微球；所述的试剂1匙含有碱性磷酸酶标记的抗HER-2单克隆抗体；所述的 试剂2是含有三羟甲基氨基甲烷（TRIS)、MAK33和甲基纤维素的缓冲液；所述稀释液是含有 牛血清白蛋白（BSA)的溶液；所述的HER-2标准品和HER-2质控品分别是含HER2抗原的牛 血清白蛋白（BSA)溶液；所述清洗浓缩液是含有吐温-20(TWEE\-20)和Proclin-300的缓 冲液。
2. 按照权利要求1所述的人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒，其特征在 于：所述HER-2磁分离试剂采用如下步骤制成： (1) 、称取7g三羟甲基氨基甲烷（TRIS)、lg似队和68甲基纤维素于容器中，称取4g吐 温20 (TWEEN-20)，加适量水使吐温20 (TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中； (2) 、用移液器将Procl in-300量取0. 2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上 述容器中，然后在容器中加入800ml纯化水，充分搅拌； (3) 、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7. 95-8. 05之间； (4) 、称取牛血清白蛋白（BSA)3g，四环素0. 04g，硫酸新霉素 lg，全部倒入上述容器中， 充分混匀； (5) 、最后用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml,用0. 2 μ μπι滤器过滤，得到免疫 磁珠缓冲液，备用； (6) 、将1. Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul二甲基亚砜（DMS0)中，备用；取2mg兔 抗小鼠抗体溶于PH9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为lml，获得一级抗体溶液，用移 液枪吸取溶于50ul二甲基亚砜（DMS0)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，加入到所述抗体溶液 中，置室温90min，获得二级抗体溶液； (7) 、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中， 在3000g下离心30min，浓缩至0. 5ml，获得三级抗体溶液； (8) 、取0. 5ml免疫磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后，吸取上清，然后加入 1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB，混匀30秒，然后加入步骤7获得的三级抗体溶液中，保持混匀 状态，室温反应4小时，获得已经标记的免疫磁珠； (9) 、加入0. 3mllmol/L的TRIS溶液室温反应30分钟，然后加入1.5ml PH7. 2 0. lmol/ L PB清洗已经标记的免疫磁珠，混匀30秒； (10) 、用10ml PH7. 20. lmol/LPB将步骤9获得的已经标记的免疫磁珠转入玻璃瓶； (11) 、将1. 5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的免疫磁珠的保 存液中，加入到步骤10中的玻璃瓶中，混匀反应2小时，再加入5ml PH7. 2 0. lmol/L PB清 洗已经标记的免疫磁珠，并混匀30秒； (12) 、用50ml免疫磁珠保存液将免疫磁珠转入玻璃瓶，配制得免疫磁珠浓度为0. 05% 的标准浓度磁珠使用液； (13) 、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫磁珠缓冲液按照1 : 1的体积比例混 匀，即得所述HER-2磁分离试剂（其使用浓度为0· 025% ); 所述试剂1采用如下步骤制成： (1) 、取 Tris6. 06g、NaC113. 0g、Zncl2、0. 05g、Proclin-300 0· 2ml 和 MgCl2 0· 05g 于烧 瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使其中的固体完全溶解； (2) 、加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7. 35-7. 45范围内； (3) 、称取牛血清白蛋白（BSA)3g倒入上述烧杯中； (4) 、最后用纯化水定容至1000ml,用0. 2μ μ m滤器过滤,得试剂1稀释液,备用； (5) 、取10mg碱性磷酸酶（ALP)，加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心 20分钟，浓缩至1毫升，获得浓缩液； (6) 、向步骤5获得浓缩液中加入0. 2ml的0. 1M Nal04溶液，室温下避光搅拌20分钟， 然后装入透析袋中，用ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，收集保留液； (7) 、向步骤6获得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9. 0,然后立 即加入2. 5mg抗HER-2单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0. lml的4mg/ml NaBHi溶液，混匀， 置4°C下2小时； (8) 、将步骤7获得溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7.4PBS透析，4°C过夜，收集保留液： (9) 、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C 1小时，然后3000rpm 离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0. 15M PH7. 4 的PBS中，获得溶液； (10) 、将步骤9获得的溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB缓冲液透析5个小时， 去除铵离了，收集保留液后10, OOOOrpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1体积的上清液：1〇〇体积的MgCl2的比例，添加1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶（ALP)与 抗HER-2单克隆抗体的偶联物，将收集到的碱性磷酸酶（ALP)与抗HER-2单克隆抗体的偶 联物，用上述步骤4获得的试剂1稀释液，以1体积的偶联物：1000体积的试剂1稀释液的 体积比混合均匀，即得试剂1。 所述试剂2采用如下步骤制成： (1) 、取TRIS1.56g、NaC14. 23g和0. 5g甲基纤维素，全部加入容器中，取0. 2ml Proclin-300于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入容器中； (2) 、取800ml纯化水加入步骤1容器中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH 在 7. 35-7. 45 之间； (3) 、根据Mak33的浓度量取最终量为0.9g的Mak33,称取牛γ -球蛋白（lgG)20g， 羊血清4ml，马血清5ml加入步骤2容器中；最后用纯化水定容至1000ml，完全溶解后，用 〇.2μπι滤器过滤，即得试剂2 ; 所述稀释液采用如下步骤制成： (1) 、称取NaC19. 0g和BSA60g，加入容器中； (2) 、取0· 5ml Proclin-300加10ml纯化水溶解，加入步骤1容器中； (3) 、最后加纯化水定容1000ml，完全溶解后，用0. 2 μ m滤器过滤，即得稀释液； 所述清洗浓缩液采用如下步骤制成： (1) 、取 TRIS12. 54g 和 NaC1325. 6g，加入容器中； (2) 、取5gTween-20,加20ml水使其完全溶解后，加入步骤1容器中； (3) 、取0. 2ml Proclin-300,用10ml纯化水完全溶解后，加入步骤2容器中； (4) 、取800ml纯化水加入步骤3容器中，充分搅拌，直至其中的固体物完全溶解； (5) 、加入盐酸或氢氧化钠溶液调PH，控制其范围在7. 35-7. 45之间； (6) 、最后用纯化水定容1000ml,用0. 2 μ μ m滤器过滤，即得清洗浓缩液： 所述酶促化学发光底物溶液采用如下步骤制成： (1) 、取 TRIS2. 35g、NaC16. 41g、Na2S030 . 00 2g、光泽精 0· 002g 和 Proclin-300 0· 2ml， 加入烧杯中； (2) 、加入600ml纯化水于烧杯中，充分搅拌直至其中的固体物完全溶解，调PH在 7. 95-8. 05 之间； (3) 、向烧杯中加入250ml Lumi-PHos480，用纯化水定容至1000ml，混匀后用0. 2 μ m滤 器过滤，即得酶促化学发光底物溶液。
3. 按照权利要求2所述的人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒，其特征在 于：所述HER-2校准品中HER-2抗原的浓度分别为0、15、45、90、180、350ng/ml ;所述HER-2 质控品中HER-2抗原的浓度分别为15、180ng/ml。
4. 按照权利要求3所述的人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒，其特征在 于：所述室温反应的温度为20°C -24°C。
5. 人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如 下步骤： 1) 、向试管架上的每一试管中分别加入30 μ 1 HER-2标准品、质控品和待测标本； 2) 、向每一试管中加入45 μ 1试剂1 ; 3) 、向每一试管中加入45 μ 1试剂2 ; 4) 、向每一试管中加入30 μ 1 HER-2磁分离试剂； 5) 、用多管混匀器轻轻振荡试管架30秒后，将试管架连同全部试管置于水浴箱中，温 浴45分钟； 6) 、将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀 1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸上，用 力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴； 7) 、将清洗浓缩液按照1体积的清洗浓缩液：7体积纯化水的比例添加纯化水，得到清 洗液，向每一试管中加200 μ 1清洗液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30秒；加样时应避免 加样力度过大而导致磁珠溅出； 8) 、再次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触， 沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸水纸 上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴； 9) 、再次向每一试管中加200 μ 1清洗浓缩液，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30杪；力口 样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出； 10) 、第3次将试管架连同全部试管放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接 触，沉淀1分钟，然后快速倒转分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在吸 水纸上，用力拍击分离器底部，以除去粘在试管内壁上的所有液滴； 11) 、加200 μ 1酶促化学发光底物溶液至试管中，混匀5秒，迅速用准备好的发光检测 仪进行检测，即可得到相关数据。
6. 按照权利要求5所述的人表皮生长因子受体2 (Her-2)的定量测定试剂盒的检测方 法，其特征在于：所述待测标本为高值HOOK样本时，使用稀释液对标本进行稀释。
【文档编号】G01N21/76GK104122394SQ201310140596
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月23日 优先权日:2013年4月23日
【发明者】鄢盛恺 申请人:北京豪迈生物工程有限公司