一种可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体及其应用，所述表达载体克隆区上游包含人类游离脂肪酸结合蛋白(FABP6)的编码序列，下游为人类表皮生长因子的编码序列，两个基因的编码区之间包含一段柔性接头编码序列，FABP6的氨基端包含His?Tag标签蛋白编码序列。本发明提供了一种可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体，其特点是：1)可溶性蛋白与包涵体蛋白的比值大于50％；2)容易借助组氨酸标签(His?Tag)亲和纯化获得目标蛋白。
【专利说明】
一种可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种可溶性蛋白表达技术，尤其是涉及一种可溶性表皮生长因子融合 蛋白表达载体及其应用，属于分子生物学基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 1962年美国Stanley Cohen博士首次从小鼠的颂下腺里发现了53个氨基酸的寡 肽。由于该短肽具有广泛的促细胞生长活性，因而得名表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)。经过其后的进一步研究，弄清了EGF的蛋白质序列和结构。上世纪70年代时， 发现人类具有同样功能的和结构类似的EGF(hEGF)。随后的研究发现它具有强大的促进细 胞生长的功能，它的功能是通过细胞膜上的EGF受体(EGFR)而得以实现，活化的受体通过 EGF-EGFR信号通路激活细胞核里的促有丝分裂相关基因，从而引起DNA复制和细胞生长、分 裂出新生细胞，EGF主要促进内皮和表皮细胞的增殖和新生。极微量的EGF涂于表皮，即可产 生明显表皮新生变年轻现象，因而生物学界称其为"美丽因子"。
[0003] 1986年，Dr. Stanley Cohen因为发现了表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF) 而荣获诺贝尔生理学和医学奖。
[0004] 现已清楚，EGF是一种广泛存在于人和动物体内的、可以促进和抑制多种细胞生长 的小分子蛋白。其成熟肽含有53个氨基酸，分子量约6kD左右，含有3个二硫键，天然EGF的生 物活性高达1000万U/mg以上。由于EGF具有广泛促进上皮细胞生长的作用，促进了其在创面 修复和美容嫩肤领域的应用研究和需求，市场对EGF的需求增加。
[0005] 既往所采用的基因工程表达EGF的技术包括酵母细胞表达、大肠杆菌表达。毕赤酵 母的分泌型表达常常需要数日，容易降解。大肠杆菌表达虽然省时、经济，但是表达产物几 乎全部是无天然结构的包涵体，需要"变性一脱盐一人工体外复性"等复杂操作过程，并且 体外复性不完全、容易错配，导致人工体外复性产生的EGF常常达不到医药级活性（多50万 U/mg EGF)。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上问题，本发明的目的在于提供一种可溶性表皮生长因子融合蛋白及其编 码基因。
[0007]本发明的另一目的在于提供上述融合蛋白表达载体，以提尚可溶性EGF的表达广 量。
[0008] 本发明的又一目的在于提供上述表达载体的应用。
[0009] 本发明通过以下技术方案得以实现：
[0010] -种可溶性表皮生长因子融合蛋白，是如下⑴或⑵的蛋白质：
[0011] (1)由脂肪酸结合蛋白FABP和表皮生长因子EGF蛋白融合得到的融合蛋白；
[0012] 所述的脂肪酸结合蛋白FABP是FABP1~FABP9中的任意一种或亚种，所述FABP1~ FABP9的氨基酸序列如下所示：
[0013] 所述的FABP1为氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白质；
[0014] 所述的FABP1-1为氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示的蛋白质；
[0015] 所述的FABP1-2为氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的蛋白质；
[0016] 所述的FABP2为氨基酸序列如SEQIDN0:4所示的蛋白质；
[0017] 所述的FABP3为氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示的蛋白质；
[0018] 所述的FABP4为氨基酸序列如SEQIDN0:6所示的蛋白质；
[0019] 所述的FABP5为氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示的蛋白质；
[0020] 所述的FABP6为氨基酸序列是SEQ ID N0:8第2~127位氨基酸残基所示的蛋白质； [0021] 所述的FABP7为氨基酸序列如SEQIDN0:9所示的蛋白质；
[0022] 所述的FABP8为氨基酸序列如SEQIDN0:10所示的蛋白质；
[0023] 所述的FABP9为氨基酸序列如SEQIDN0:11所示的蛋白质；
[0024]或者，为将SEQ ID NO: 1~11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
[0025]所述表皮生长因子EGF蛋白为氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示的蛋白质，或者为 将SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
[0026] 所述的脂肪酸结合蛋白FABP和表皮生长因子EGF蛋白通过柔性接头连接；
[0027] (2)将(1)的N端连接组氨酸标签得到带标签融合蛋白。
[0028]作为一种优选技术方案，所述的脂肪酸结合蛋白FABP优选为人类FABP6。
[0029] 上述的柔性接头优选为6~30个氨基酸，进一步优选为15~20个氨基酸，更进一步 优选的所述柔性接头的序列如SEQ ID N0:15所示;所述组氨酸标签包含5-8个His，优选6个 His，更进一步优选的，所述组氨酸标签的序列如SEQ ID N0:13所示。
[0030] 更进一步优选的，所述的可溶性表皮生长因子融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :16所示。
[0031 ]上述可溶性表皮生长因子融合蛋白的编码基因。
[0032] 作为一种优选技术方案，上述可溶性表皮生长因子融合蛋白编码基因的核苷酸序 列如SEQ ID N0:17所示。
[0033] 含有上述编码基因的表达载体、转基因细胞系和表达工程菌。
[0034] -种可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体，其在于该表达载体是将上述融合蛋 白的编码基因插入到原核细胞表达质粒的Ncol/Xhol酶切位点之间得到;优选的：所述融合 蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示;所述的原核细胞表达质粒为pET28a。
[0035] -种制备可溶性表皮生长因子融合蛋白的方法，将上述的表达载体转化感受态表 达菌株获得表达工程菌，并进行培养得到可溶性表皮生长因子融合蛋白。
[0036] 上述可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体在表达可溶性表皮生长因子融合蛋 白中的应用。
[0037]本发明最优选的可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体FABP6-EGF的详细制备过 程：
[0038] 1)基于多聚酶链式反应(PCR)的全基因人工合成方法，合成人游离脂肪酸结合蛋 白6(FABP6)与人EGF的融合蛋白FABP6-EGF(SEQIDN0:16)的DNA编码序列（SEQIDN0 : 17)。
[0039] 2)将上述融合蛋白FABP6-EGF的编码DNA经过Ncol/Xhol DNA内切酶消化，琼脂糖 凝胶电泳分离纯化，得到插入片段。
[0040] 3)经过内切酶Ncol/Xhol双酶切并琼脂糖凝胶电泳分离纯化原核细胞表达质粒 pET28a，但不限于该表达质粒。
[00411 4)用T4DNA连接酶将载体pET28a与融合蛋白FABP6-EGF编码DNA的插入片段相连 接，转化感受态菌DH5a，获得正确序列的阳性克隆PFABP6-EGF，作为工程质粒(SEQ ID N0: 34)0
[0042] 5)将pFABP6-EGF质粒转化BL21(DE3)感受态表达菌株，卡那霉素存在下筛选与诱 导表达测试，获得表达工程菌株BL21 (DE3) /pFABP6-EGF。
[0043] 本发明所述的FABP优选人类FABP，本发明采用人类FABP6，但不限于FABP6，可以是 FABP1 ~FABP9的任何一种（SEQ ID N0:1 ~11)。
[0044] 所述的FABP优选置于EGF上游，在FABP与EGF之间优选放置柔性接头DNA编码序列， 优选编码6~30个氨基酸，进一步优选编码15~20个氨基酸。
[0045]所述的FABP编码序列上游包含组氨酸标签，所述的组氨酸标签5-8个His密码子不 等，优选6个。所述的组氨酸编码序列位于起始密码子ATP的下游。
[0046]本发明所述的pFABP-EGF表达载体在表达目标蛋白中具有如下优点：
[0047] 1)可溶性蛋白与包涵体蛋白的比值大于50% ;
[0048] 2)容易借助组氨酸标签(His-Tag)亲和纯化获得目标蛋白。
【附图说明】
[0049] 图1、FABP-EGF融合蛋白示意图
[0050] 图2、pFABP6-EGF表达载体物理图
【具体实施方式】
[0051] 下面通过具体实施例对本发明的应用进行说明，所举的实施例仅是对本发明的应 用作概括性例示，有助于更好地理解本发明的用途，但并不会限制本发明应用范围。下述实 施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和材料，如无特殊说明，均可 从商业途径获得。
[0052] 实施例1
[0053] 一种可溶性表皮生长因子融合蛋白FABP6-EGF表达载体的构建方法，包括以下步 骤：
[0054] 步骤一、人类FABP与人类EGF的编码DNA的人工合成和优化，本实施例以人类FABP6 为例（SEQ ID N0:8)，人类EGF以53个氨基酸的成熟肽为例（SEQ ID N0:12):
[0055] (1)将His-Tag氨基酸序列（SEQ ID NO: 13)、去除起始甲硫氨酸的FABP6氨基酸序 列（SEQ ID N0:14)、柔性接头氨基酸序列（SEQ ID N0:15)、EGF氨基酸序列（SEQ ID N0:12) 按次序合并为"His-Tag-FABP6-柔性接头一EGF" (SEQ ID NO: 16)，但不限于此序列，以蛋 白质氨基酸序列同源性等于或大于85 %为限。
[0056] (2)将该编码序列（SEQ ID从):16)输入从^1软件0熟￥〇冰8(￥3.2.3):
[0057] ①获得逆翻译的并且密码子优化了的DNA编码序列（SEQ ID NO: 17);
[0058] ②获得用于PCR方法全基因合成的引物(SEQ ID NO: 18~33);
[0059] ③在第一个引物的起始密码5'-端添加 Ncol内切酶位点和四个保护碱基（SEQ ID N0：18)；
[0060] ④在最后一个引物的终止密码的5'-端添加 Xhol内切酶位点和四个保护碱基(SEQ ID NO:33)。
[0061] (3)多聚酶链式反应(PCR)法合成全长编码DNA序列第一步：
[0062] ①将引物用无菌去离子水分别稀释至ΙΟμΜοΙθ浓度；
[0063]②从每管引物分别取lyL加入1支200yL PCR管；
[0064] ③然后依次加入dNTP 4yL，10x PCR Buffer 5yL，无菌去离子水加至50yL;
[0065] ④最后加入高保真DNA聚合酶0.25yL;
[0066] ⑤PCR参数：预变性95°C/3min;变性94°C/30sec,退火58°C/30sec,延伸72°C/ 2min,20个循环;补全延伸72°C/5min。
[0067] (4)多聚酶链式反应(PCR)法合成全长编码DNA序列第二步：
[0068] ①取第一步PCR扩增产物lyL加入到200yL新的PCR管；
[0069] ②分别加入第一个引物（SEQIDN0:18)和最后一个引物（SEQIDN0:33)各2μL; [0070] ③然后依次加入dNTP 4yL，10x PCR Buffer 5yL,无菌去离子水加至50yL;
[0071] ④最后加入高保真DNA聚合酶0.25yL;
[0072] ⑤PCR参数：预变性95°C/3min;变性94°C/30sec,退火60°C/30sec,延伸72°C/ 2min, 35个循环;补全延伸72°C/5min。
[0073] (5)PCR产物的纯化与酶切:PCR产物经微型硅胶柱离心纯化，Nco I/Xho I限制性 内切酶双酶切过夜。
[0074] (6)酶切DNA产物的纯化:采用0.8%琼脂糖凝胶电泳回收获得两端分别是Nco I和 Xho I的粘性接头的插入片段。
[0075] 步骤二、载体DNA制备：
[0076] 制备表达载体pET28a，但不限于该表达载体：
[0077] (1)取pET28a载体2yg，用限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切。
[0078] (2)琼脂糖凝胶电泳分离、纯化线性化后的pET28a载体。
[0079]步骤三、连接与转化
[0080] (1)用T4DNA连接酶将包含FABP6-EGF序列的插入片段和步骤二制备好的pET28a表 达载体连接。
[0081 ] (2)转化大肠杆菌感受态菌株DH5a，含卡那霉素(Kan)抗生素的琼脂培养皿培养过 夜，然后挑取单菌落，常规PCR法鉴定阳性克隆。
[0082] (3)将阳性克隆送交DNA序列分析，选取和保留序列正确的克隆，常规制备DNA质 粒。
[0083] (4)获得的工程载体质粒命名为pFABP6-EGF(SEQ ID N0:34)
[0084]实施例2载体的表达测试：
[0085] (1)将得到的pFABP6-EGF载体DNA质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细 胞，获得卡那霉素 (Kan)抗性的菌落。
[0086] (2)挑取单菌落数个，LB培养基培养，IPTG诱导4-12小时，收集菌液lmL，离心收集 菌体，1 X PBS洗涤一次，再悬浮于0.5mL 1 X PBS，超声破碎菌体，离心去沉淀。
[0087] (3)取适量20yL上清与SDS-PAGE上样缓冲液混合，95°C加热变性10分钟，离心收集 至管底，置于冰上。
[0088] (4)取10yL上样，12%聚丙烯酰胺电泳，考马斯亮蓝染色、脱色，观察蛋白质条带和 FABP6-EGF蛋白的表达情况。
[0089] (5)重组FABP6-EGF，包括N-HisTag、柔性接头、多克隆区，共209aa，分子量 17.2kDaDFABP6-EGF占菌体总蛋白的20-25%，可溶性蛋白占50-60%，包涵体占40-50 %，优 于既往文献记载的EGF裸露表达几乎全部为包涵体的表达载体。
【主权项】
1. 一种可溶性表皮生长因子融合蛋白，其特征在于是如下（1)或(2)的蛋白质： (1) 由脂肪酸结合蛋白FABP和表皮生长因子EGF蛋白融合得到的融合蛋白； 所述的脂肪酸结合蛋白FABP是FABP1~FABP9中的任意一种或亚种，所述FABP1~FABP9 的氨基酸序列如下所示： 所述的FABP1为氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白质； 所述的FABP1-1为氨基酸序列如SEQIDN0:2所示的蛋白质； 所述的FABP1-2为氨基酸序列如SEQIDN0:3所示的蛋白质； 所述的FABP2为氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的蛋白质； 所述的FABP3为氨基酸序列如SEQIDN0:5所示的蛋白质； 所述的FABP4为氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示的蛋白质； 所述的FABP5为氨基酸序列如SEQIDN0:7所示的蛋白质； 所述的FABP6为氨基酸序列是SEQ ID NO:8第2~127位氨基酸残基所示的蛋白质； 所述的FABP7为氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白质； 所述的FABP8为氨基酸序列如SEQIDN0:10所示的蛋白质； 所述的FABP9为氨基酸序列如SEQIDN0 :11所示的蛋白质； 或者，为将SEQ ID NO: 1~11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质； 所述表皮生长因子EGF蛋白为氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示的蛋白质，或者为将SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具 有相同功能的由其衍生的蛋白质； 所述的脂肪酸结合蛋白FABP和表皮生长因子EGF蛋白通过柔性接头连接； (2) 将(1)的N端连接组氨酸标签得到带标签融合蛋白。2. 根据权利要求1所述的可溶性表皮生长因子融合蛋白，其特征在于所述的脂肪酸结 合蛋白FABP优选为人类FABP6。3. 根据权利要求1所述的可溶性表皮生长因子融合蛋白，其特征在于所述的柔性接头 优选为6~30个氨基酸，进一步优选为15~20个氨基酸，更进一步优选的所述柔性接头的序 列如SEQ ID NO: 15所示;所述组氨酸标签包含5-8个His，优选6个His，更进一步优选的，所 述组氨酸标签的序列如SEQ ID NO: 13所示。4. 根据权利要求3所述的可溶性表皮生长因子融合蛋白，其特征在于该融合蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。5. 权利要求1~4中任意一项所述可溶性表皮生长因子融合蛋白的编码基因。6. 根据权利要求5所述可溶性表皮生长因子融合蛋白的编码基因，其特征在于该编码 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。7. 含有权利要求5或6所述编码基因的表达载体、转基因细胞系和表达工程菌。8. -种可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体，其特征在于该表达载体是将权利要求 1-4中任意一项所述融合蛋白的编码基因插入到原核细胞表达质粒的Ncol/Xhol酶切位点 之间得到;优选的：所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:17所示;所述的原 核细胞表达质粒为pET28a。9. 一种制备可溶性表皮生长因子融合蛋白的方法，其特征在于将权利要求8所述的表 达载体转化感受态表达菌株获得表达工程菌，并进行培养得到可溶性表皮生长因子融合蛋 白。10.权利要求8所述可溶性表皮生长因子融合蛋白表达载体在表达可溶性表皮生长因 子融合蛋白中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK106084066SQ201610404986
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】李万波, 陕婧婧, 卢婵
【申请人】盘古基因生物工程(南京)股份有限公司