专利名称：：具有表皮生长因子活性的肽及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有表皮生长因子活性的肽及其用途。
背景技术：
：斯坦利*科恩博士首次从小鼠下颌下腺中分离出由53个氨基酸残基组成的人表皮生长因子并且阐明其在早熟新生小鼠中加速眼睑开放(Cohen，S.(1962)/.肠丄C/e瓜237，1555-1562)。1986年，斯坦利，科恩博士凭借EGF研究被授予诺贝尔医学奖(Novelmedicalprize)。EGF，含有3个二硫键的多肽(Savage，C丄，Jr.etal.，(1973)/肠丄Oe瓜248，7669-7672;Savage,C.R.,Jr.etal.，(1972)/C力e瓜247，7612-7621)，经由EGF受体触发信号转导级联从而诱导哺乳动物细胞(特别是上皮和皮肤细胞)的生长和分裂，从而促进上皮细胞的生长(Sporn，M.B.etal.，(1985)淑,rZo油/^313，745-747;SpornM.B.etal.，(1980)W~丄/躯303，878-880)。此外，已报道，EGF在伤口愈合的分子调控中起关键作用(Buckley,A.etal.，(1985)尸roc.^cadSc丄USA.82，7340—7344)。EGF在如唾液、尿液、乳液、泪液和血液的各种体液中以高水平存在。在受伤时，通过血流向受伤部位提供的EGF有助于伤口愈合而不留伤疤。此外，EGF与FSH(促卵泡激素)一起参与子宫中的受精卵的成熟并且EGF是使由于没有血管而容易退化的角膜再生的原因。而且，EFG通过以下各种作用在皮肤再生中起非常重要的作用促进上皮和内皮细胞的增殖；促进成纤维细胞的增殖以在真皮中合成胶原；在受伤部位促进血管发生；诱导参与再生的因子的分泌；以及促进纤连蛋白的生物合成以形成皮肤组织的网络化。人体应答创伤的发生并且向受伤组织供给EGF来治愈。然而，在体内的EFG供给不足的情况下，应提供外源EGF以回到正常和健康状态。在这点上，EGF被认为具有大量应用。例如，EGF可用于糖尿病脚溃疡、灼伤、创伤、角膜损伤、剖腹手术、整容剥离(cosmeticpeeling)和皮肤老化。除上皮细胞增殖能力以外，已提出，人EGF(hEGF)通过阻止胃酸的分泌而有效用于治疗胃溃疡(Gregory，H.，(1985)/6WUci.Su卯l.3，11-17)。5Srarkey博士于1975年纯化了尿液中的人EGF并描述了它的特性；其后，已经进行了更多的努力以更高的产率和量来制备人EGF(Starkey，R.H.etal.，(1975)5"cj.e/7ce189，800;Cohen.S.etal.，(1975)尸roc.7Vat丄」cad5"ci.USA72，1317)。几个实验室已经报道了成功克隆了人EGF基因(Smith,J.etal.，(1982)M/c2eicTfes.10，4467—4482;Urdea，M.S.etal.，(1983)/^roc.JcadSci.USA80，7461—7465;0ka，T，etal.，(1985)7°rac.7Vat丄Jcad5"c丄USA82，7212-7216)。然而，通过基因重组技术制备的人EGF还没有用于工业领域的大量和高活性的生产。大多数血液和组织中存在的多肽生长因子具有短至几分钟的体内半寿期。很可能，EGF显示出差的结构稳定性。另外，因为EGF是生物学不稳定的和生理化学异质的，所以它可能显示降低的治疗功效。其皮肤渗透性极差。因此，依旧需要开发出具有改善的稳定性和皮肤渗透能力并且具有EGF固有活性的新物质。贯穿本申请，各种专利和出版物作为参考并且在括号内给出引用出处。为了更加全面地描述本发明以及本发明所属
技术领域：
的状况，在此通过引用方式将这些专利和出版物的公开内容全部并入本申请。
发明内容为了开发出与天然产生的人表皮生长因子具有相同作用且与天然产生的EGF相比具有更加提高的稳定性和皮肤渗透性的肽，本发明人已经制备和筛选了大量的人EGF衍生的肽。结果，我们最终开发出了具有上述优异特性的肽。因此，本发明的一个目的是提供一种具有表皮生长因子(EGF)活性的肽。本发明的另一个目的是提供一种预防或治疗表皮生长因子有效的紊乱或状态的组合物。连同所附权利要求书和附图，从以下详述的说明中，本发明的其他目的和优点将变得明显。在本发明的一个方面中，提供一种具有表皮生长因子(EGF)活性的肽，该肽包含下式1所示的氨基酸序列Cys-Met-Tyr-lie-Glu-连接体-Arg-Gly-Asp(1)。在本发明的另一个方面中，提供一种预防或治疗表皮生长因子有效的紊乱或状态的组合物，该组合物包含本发明的具有表皮生长因子(EGF)活性的肽作为活性成份。为了开发出与天然产生的人表皮生长因子具有相同作用且与天然产生的EGF相比具有更加提高的稳定性和皮肤渗透性的肽，本发明人已经制备和筛选了大量的人EGF衍生的肽。结果，我们最终发现了具有上述优异特性的肽。本发明人的开发策略如下首先，将本发明的肽设计包含两个区域，EGF衍生的序列(即EGF活性区域)和细胞附着区域。EGF活性区域选自天然产生的EGF氨基酸序列中。为了提高本发明的肽的EGF活性，细胞附着区域选自细胞外基质蛋白之一的纤连蛋白。最终选择的EGF活性区域包含氨基酸序列"Cys-Met-Tyr-Ile-Glu"而最终选择的细胞附着区域包含氨基酸序列"Arg-Gly-Asp"。此外，本发明人已发现，与直接连接相比，优选经由连接体间接连接两个区域。根据开发策略，制备出了下式1所示的EGF模拟肽。使EGF活性区域和细胞附着区域互相连接的连接体包括本领域技术人员可利用的任何连接体。优选地，所述连接体包含多个氨基酸。在Huston,等人，i/7^7zjzzo2^7，203:46-88(1991)和Whitlow,等人，/^rotej'"^W，6:989(1993)中査到了肽连接体的详细资料，其教导的内容在此通过引用方式并入。本发明中适合的连接体包含具有不带电侧链的氨基酸，优选为Gly或者Gly或Ser。优选地，所述连接体的长度为218个氨基酸残基。更优选地，所述连接体包含210个Gly残基。由氨基酸残基(特别是Gly残基)组成的连接体有助于本发明的肽的稳定性。即使本发明的肽本身比天然产生的EGF具有更高的稳定性，对其的修饰能使其具有高得多的稳定性。优选地，本发明的肽在其N-末端或C-末端具有选自由乙酰基、荷基甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基。保护基也是本发明的肽具有稳定性的原因。或者，式1所示的肽的C-末端被修饰具有氨基，这样提高了肽的稳定性。本文所用的术语"稳定性"指体内稳定性和贮藏稳定性(例如，在室温下的贮藏稳定性)。上述的保护基保护肽免受体内蛋白酶的攻击。7根据优选的实施方式，位于肽的C-末端的Asp残基另外连接到作为保护基的Ala或Gly残基(更优选为Gly残基)上。根据最优选的实施方式，所述肽包含下式2所述的氨基酸序列Cys—Met-Tyr—Ile—Glu—Gly(n)—Arg—Gly—Asp—Gly(2)其中，n为28的整数。典型的肽的氨基酸序列如SEQIDNO:l所述。本发明的肽包含式l所示的氨基酸序列。优选地，所述肽基本由式l所示的氨基酸序列组成。最优选地，所述肽由式l所示的氨基酸序列组成。本文所用的术语"肽"指通过肽键连接氨基酸残基形成的线型分子。本发明的肽可通过本领域技术人员已知的常规化学合成方法，尤其是，固相合成技术(Merrifield，/.6Te瓜Soc.85:2149-54(1963);Stewart,etal.，SolidPhasePeptideSynthesis,2nd.ed.，PierceChem.Co.:Rockford，111(1984))来制备。形成本发明的肽的结构的基本原则是连接EGF衍生的序列和纤连蛋白衍生的细胞附着序列。因此，对本领域技术人员来说，将是显而易见的是，描述式l以通过更加方便的方式来说明本发明的肽，并且落入本发明实质的式1的修饰或改变也包括在本发明的范围内。例如，EGF衍生的序列和纤连蛋白衍生的细胞附着序列位置相反的肽，即"Arg-Gly-Asp-连接体-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu"，落入本发明的范围内。此外，包含向EGF衍生的序列和/或纤连蛋白衍生的细胞附着序列附加的氨基酸残基(例如，12个氨基酸残基)的肽落入本发明的范围内。例如，在将细胞附着序列Arg-Gly-Asp的C-末端修饰成进一步含有Ser残基的情况下，该肽落入本发明的范围内。本发明的肽具有天然产生的人EGF活性并且对如酸和碱的生理化学因子显示出较高的稳定性。本发明的具有显著的长期贮藏稳定性的肽可以有利地用于需要长期贮藏的产品中，例如药物、准药、化妆品和牙齿/口腔清洁或护理产品。在本发明的另一个方面中，提供一种预防或治疗表皮生长因子有效的紊乱或状态的组合物，该组合物包含本发明的具有表皮生长因子(EGF)活性的肽作为活性成份。在本发明的又一个方面中，提供一种预防或治疗表皮生长因子有效的紊乱或状态的方法，该方法包括向被试者施用包含本发明的肽的组合物。8在本发明的还一个方面中，提供一种本发明的肽用于制备预防或治疗表皮生长因子有效的紊乱或状态的组合物的用途。因为本组合物包含本发明的肽作为上述活性成份，所以省略它们之间的一般说明从而避免过度冗余而导致本说明书太复杂。在本组合物中包含的作为活性成份的本发明的肽具有EGF活性并且显示出与天然产生的EGF相同或相似的体内功能和功效。本文所用的术语"EGF活性"指本领域技术人员已知的天然产生的EGF的任一和全部活性，例如，包括促进细胞增殖和分裂。因为制备了本发明的肽以模拟天然产生的EGF的作用，所以其能够发挥天然产生的EGF的全部体内活性。由于本发明的肽具有与天然产生的EGF相同或相似的功能和作用并且显示出比天然产生的EGF更高的生物活性，所以其能够有利地用于预防或治疗EGF有效的紊乱或状态。本文所用术语"EGF有效的紊乱或状态"指通过天然产生的EGF能够预防或治疗的紊乱或状态。根据优选的实施方式，本发明的组合物具有促进细胞生长和分裂，上皮细胞活性，血管发生，神经元再生，伤口愈合，血栓形成治疗，动脉粥样硬化治疗，胶原、弹性蛋白、层粘连蛋白和和透明质酸的生物合成，治疗牙周疾病或改善皮肤状态的功效或活性。在将本组合物应用于牙周疾病治疗时，可将其配制成牙膏或者牙齿和口腔清洁或护理的组合物。本文的术语"治疗牙周疾病的组合物"可与其它术语"牙齿和口腔护理的组合物"和"牙齿和口腔清洁的组合物"交替使用。本发明的肽促进齿龈组织中存在的上皮细胞的生物活性并且愈合齿龈伤口以使受损的齿龈组织再生，从而治疗或预防牙周疾病。更优选地，本发明的组合物具有改善皮肤状态的功效。尤其是，由于其低分子量，本组合物中用作活性成分的肽显示出极好的皮肤渗透性。因此，在将本组合物局部应用于皮肤时，很明显地，显著改善了皮肤状态。还更优选地，本组合物对皮肤状态的改善包括改善铍纹或皮肤弹性、预防皮肤老化、预防脱发、促进毛发生长、改善皮肤湿度、去除暗斑、治疗痤疮、伤口愈合和皮肤再生，最优选地，包括改善皱纹或皮肤弹性和预防皮肤老化、伤口愈合以及皮肤再生。例如，在本组合物中用作活性成分的肽能够促进角质细胞的增殖，诱导原胶原和纤连蛋白的生物合成以及诱导天然产生的EGF(—种皮肤生长物质)9的自分泌产生而使角质细胞层、表皮和真皮再生，从而致使改善皱纹、皮肤弹性和皮肤湿度、预防皮肤老化、伤口愈合和皮肤再生。可将本组合物制备成药物或化妆品组合物。根据优选的实施方式，所述组合物为包含(a)药用有效量的本发明的肽;和(b)可药用载体的药物组合物。本文所用的术语"药用有效量"指足够显示和实现本发明的肽的功效和活性的量。在本发明的药物组合物中包含的通常在药物制剂中使用的可药用载体包括但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶(rubberarable)、磷酸钾、精氨酸盐(arginate)、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。根据本发明的药物组合物可进一步包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂。适合的可药用载体和配方的详细资料可在雷明顿氏制药科学We啦'y^t朋、尸力a擺固".ca"ci墜es(19thed.，1995))中找到，将其通过引用方式并入本申请。根据本发明的药物组合物可经口或肠胃外给药，并且优选经肠胃外施用，例如，通过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、经皮或局部施用。本发明的药物组合物的适合的剂量可根据药物配制方法，给药方法，患者的年龄、体重、性别、发病状态、饮食，给药时间，给药途径，排泄率及对所用药物组合物的敏感性而变化。优选地，本发明的药物组合物可以每日0.0001100ug的剂量施用。根据本领域技术人员己知的常规技术，可用如上所述的可药用载体和/或赋形剂配制根据本发明的药物组合物，最终提供几种形式的单剂量型和多剂量型。所述制剂的非限定性实例包括但不限于在油或水介质中的溶液剂、混悬剂或乳剂，浸膏剂，酏剂，粉剂，颗粒剂，片剂和胶囊剂，并且可进一步包含分散剂或稳定剂。根据优选的实施方式，所述组合物为包含(a)美容有效量的本发明的肽;和(b)化妆品可用载体的化妆品组合物。本文所用的术语"美容有效量"指足够实现如上所述的改善皮肤状态的功效的量。可将本发明的化妆品组合物配制成很多种形式，例如，包括溶液、混悬剂、乳剂、糊剂、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、皂剂、包含表面活性剂的清洁剂、油、粉状底霜、乳状底霜、蜡状底霜和喷雾剂。具体地，可将本发明的化妆品组合物配制成柔肤剂、滋养液、滋养霜、按摩霜、精华素、眼霜、清洁霜、清洁泡沬、清洁水、美容涂敷剂(pack)、喷雾剂或粉剂的形式。在化妆品组合物为糊剂、霜剂或凝胶的形式时，其可包含动物和植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧垸、皂土、硅石、滑石、氧化锌或这些物质的混合物。在粉剂或喷雾剂的配方中，其可包含乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末和这些物质的混合物。喷雾剂可另外包含常规推进剂，例如，含氯氟烃、丙垸/丁烷或二甲醚。溶液和乳剂的配方可包含溶剂、增溶剂和乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇、油、甘油脂肪酯、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯。混悬剂的配方可包含液体稀释剂，例如水、乙醇或丙二醇；混悬剂，例如乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、皂土、琼脂及西黄蓍胶；或者这些物质的混合物。含有表面活性剂的清洁组合物的配方可包含脂族醇硫酸酯、脂族醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯(sulfosucinnatemonoester)、异硫代硫酸酯(isothinate)、咪唑鎗盐衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸酯(sarcocinate)、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰氨基甜菜碱、脂族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧化甘油脂肪酸酯或这些成分的混合物。此外，本发明的化妆品组合物可包含助剂与作为活性成分的肽及载体。助剂的非限制性实例包括防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、着色剂、气味改进剂或这些物质的混合物。将本发明的特征和优点总结如下(i)本发明的EGF模拟肽具有与天然产生的人EGF相同的功能或活性；(ii)本发明的肽能够促进细胞中产生自分泌EGF;(iii)本发明的肽具有比天然产生的EGF更高的稳定性和皮肤渗透能力；ii(iv)因此，含有该肽的组合物对需要EGF活性的疾病或状态显示出极好的治疗和预防功效；以及(v)可将本发明的肽有利地应用于药物组合物、准药和化妆品中。图1表示实施例中制备的十三肽的HPLC(高效液相色谱法)分析的结果。图2表示本发明的十三肽的稳定性的分析结果。"肽"和"rhEGF"分别表示十三肽和重组EGF。图3为证明十三肽促进人角质细胞生长的效果的显微镜图像。图A表示未处理的对照，而图B表示处理组。图4为证明十三肽以剂量依赖性方式促进人角质细胞生长的图。图5为证明十三肽增强人角质细胞的粘附的显微镜图像。图6为表示用十三肽处理的NIH3T3细胞的运动性增强的显微镜图像。图7表示用十三肽培养的细胞产生较高水平的自分泌EGF。图8表示在用十三肽培养细胞时显示透明质酸水平增加的图。图9为显示施用含有十三肽的化妆品的BalbC小鼠的皮肤厚度变化的显微镜图像。具体实施例方式现将通过实施例进一步详细描述本发明。对本领域技术人员显而易见的是，这些实施例是用来更具体地阐述本发明的并且如所附权利要求书提出的本发明的范围不限于实施例或受实施例的限制。实施例实施例1:NH2-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Gly(n)-Arg-Gly-Asp-Gly-0H的合成向反应器中加入700mg氯三苯甲基氯树脂(CTL树脂，NovaBiochem，目录号01-64-0021)，向该反应器中加入10ml二氯甲垸(MC)，接着搅拌3分钟。除去溶液后，向生成物中加入10ml二甲基甲酰胺(DMF)，然后搅拌3分钟，之后除去溶剂。向该反应器中加入IOml二氯甲烷溶液，然后向反应器中加入200國1Fmoc-Gly-0HTyr(tBu)-OH(NovaBiochem，美国)和400mmolDIEA(N,N，-二异丙基乙胺)，之后通过搅拌溶解该混合物，然后搅拌的12同时进行反应l小时。洗涤后，使溶于MC中的甲醇和DIEA(2:1)与树脂反应IO分钟，然后用过量的DCM/DMF(1:1)洗涤该生成物。除去溶液后，向生成物中加入IOmlDMF并搅拌3分钟，随后除去溶剂。向反应器中加入10ml脱保护溶液(20%哌啶/DMF)且在室温下搅拌IO分钟，接着除去溶液。加入相同体积的脱保护溶液后，进行反应10分钟并且除去溶液，随后依次用DMF、MC和画F洗涤以制得Gly-CTL树脂。向新的反应器中加入10mlDMF溶液，然后力口入200,1Fmoc-Asp(tBu)-OH(NovaBiochem，美国)、200画lHoBt和200腿olBop，随后搅拌溶解。向该反应器中加入400隱olDIEA并且进行搅拌以溶解全部固体含有物。将溶解的氨基酸溶液引入容纳脱保护树脂的反应器中并且在室温下在搅拌的同时进行反应1小时。在除去反应溶液后，用DMF溶液搅拌生成物3次以除去未反应的残余物。取反应后的树脂通过茚三酮试验评价反应程度。使用脱保护溶液，以与上述相同的方式进行2次脱保护以制得Asp(tBu)-Gly-CTL树脂。用DMF和MC洗涤后，进行茚三酮试验然后如上所述进行氨基酸的顺序连接。基于本发明人设计的氨基酸序列，将Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(pbf)、Fmoc-Gly(n个)、Fmoc-Glu(tBu)、Fmoc-Ile、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Met和Fmoc-Cys(trt)依次连接到树脂上。设置在肽的中间部分的Gly残基的数目可以通过用Fmoc-Gly进行28次反应而变化，产生7种类型的肽基树脂。用匿F、MC和甲醇分别洗涤所制备的肽基树脂三次并且在氮气气氛下干燥，之后在PA下通过真空干燥。在室温下间歇搅拌下使干燥的树脂与30ml离去溶液[包含81.5。/。三氟乙酸(TFA)、5%蒸馏水、5%苯硫基甲烷、5%苯酚、2.5%EDT和1%TIS]反应2小时。过滤并用少量TFA溶液洗涤该树脂，之后将滤出液与母液合并。在减压下蒸馏以减小至总体积的一半后，使用50ml冷醚诱导沉淀并且通过离心法收集形成的沉淀，随后用冷醚洗涤2次。除去母液后，在氮气气氛下干燥该生成物以制得未纯化的7种类型的肽，NH厂Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Gly(n)-Arg-Gly-Asp-Gly-0H。在它们中，由NH2-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Gly-0H组成的肽(在下文中称为十三肽)产量为0.82g并且使用分子量分析器(Pers印tivePioneerDE-STRABI，美国)测定的分子量为1272.0。图1表示所合成的肽的HPLC分析结果。为了HPLC分析，使用Gilson泵(KoreaAnalyticalInstrumentsCo.,Ltd.，韩国)禾口C184.6x250mm柱。溶剂体系包含A溶剂(0.1%TFA)和B溶剂(0.1%MeCN)。本发明合成的十三肽分析具有大约20分钟的保留时间，说明所制得的肽具有适合的纯度。使用十三肽进行以下实验。实施例2:十三肽的稳定性的评价为了评价实施例1所合成和纯化的十三肽的稳定性，在50mMTris-HCl(pH8.0)中溶解十三肽至浓度为10ug/ml。将在大肠杆菌中产生的重组EGF蛋白(Sigma-Aldrich)以相同缓冲液至浓度为1ug/ml而制成对照。将该制备的溶液引入玻璃瓶中并在37t:静置。而后，将该溶液在第0、1、10、25、50、75和100天取出并使用NIH-3T3细胞(KoreanCellLineBank)进行MTT分析(Scudiero,D.A.，etal.C朋cerTfes.48:4827-4833(1988))来确定肽和EGF的剩余活性(图2)。结果给出与第0天取出的样品的活性(100%)的相对值。如图2中所示，随着时间的流逝，重组EGF蛋白的活性急剧下降。相反，本发明的十三肽的活性显示其不随时间过去而降低。这些结果使我们推出本发明的EGF肽与具有全长氨基酸残基的EGF蛋白相比具有显著提高的稳定性。实施例3:纳米肽的制备在500ml蒸馏水中溶解50mg在实施例1中合成的十三肽。将该肽溶液与5g卵磷脂、0.3ml油酸钠、50mL乙醇和少量的油混合并用蒸馏水将其体积调节至1L。该生成的溶液在高压下经微流化床装置以进行乳化，从而提供大小为100nm的纳米体(nanosome)。该纳米体被制成最终浓度约为50ppm并且用作化妆品的成分。配方实施例l:柔肤剂按照下列成分配制包含实施例3中制备的含有十三肽的纳米体的柔肤剂表l成分含量(wt%)十三肽0.0011，3-丁二醇6.0甘油4.0PEG:15001.0透明质酸钠1.0聚山梨醇酯200.5乙醇8.014防腐剂、颜料适量二苯甲酮-90.05芳香剂微量蒸馏水余量口kl100配方实施例2:滋养霜按照下列成分配制包含实施例3中制备的含有十三肽的纳米体的滋养霜表2成分含w阔十三肽0.绣线菊油(Meadowf()amoil)3.()棕榈醇(Cetearylalcohol)1.5硬脂酸:i.5硬脂酸甘油酯1.5液体石蜡10.0蜡2.0聚山梨醇酯600.6失水山梨糖醇倍半油酸酯2.5角烷3.()1，3-丁二:醇3.0甘油5.0二乙醇胺0.5醋酸维生素E0.5防腐剂、颜料二；且迫凰芳番剂、二:p曰.迫s蒸馏水余量a;卜口VI100配方实施例3:滋养液按照下列成分配制包含实施例3中制备的含有十三肽的纳米体的滋养液表3成分含量(wt%)卜三肽()0021,3-丁二醇4.0甘油4.0棕榈醉0.815<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>配方实施例4:精华素按照下列成分配制包含实施例3中制备的含有十三肽的纳米体的精华素表4<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例4:肽对HaCaT角质细胞生长影响的分析为了分析本发明的肽对角质细胞增殖的影响，根据Rizzino等人的方法(Rizzino，etal.C朋cer/fes.，48:4266(1988))，使用HaCaT角质细胞进行SRB(磺酰罗丹明B(SulforhodamineB))比色分析。在含有添加了100%FBS(月台牛血清)的EMEM(Eagle'sminimalessentialmedia,Gibco，美国)的250mL烧瓶中培养HaCaT角质细胞(TheKoreanCellLineBank)。用0.25%胰蛋白酶溶液处理培养的HaCaT角质细胞以从培养瓶底部分离细胞并且离心分离收集细胞粒。在不含FBS的EMEM中重悬该细胞，将其等分试样(4X103个细胞)加入到96孔板的每个孔中，并且在37°C、7%C02下培养24小时。培养24小时后，用不含血清的新鲜培养基更换该培养基并且在如上所述的相同条件下与溶于10%DMSO的人EGF或十三肽(IOng/ml或1，000ng/ml)温育72小时。除去上层清液后，使用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗涤细胞l次并且与SRB溶液(Sigma-Aldrich)温育。用PBS洗涤细胞并且在显微镜下观察细胞活力(图3)。另外，测量590nm的吸光度以分析细胞增殖(图4)。使用未处理的培养皿和肽预先处理的培养皿测对试培养皿的细胞粘附。在培养皿上覆盖人角质细胞而后温育24小时，随后在显微镜下观察。如图5中所示，观察到，粘附到用本发明的肽处理过的培养皿的细胞数与粘附到未处理的培养皿的细胞数相比大约多3倍。我们分析了细胞运动性来进一步验证细胞增殖能力。在60mm培养皿上覆盖NIH3T3细胞并培养至适当流度(fluency)。使用移液管刮培养皿的底面并与1ug/ml的本发明的肽温育，随后观察细胞运动性。在图6中，图A和B显示未用肽处理的细胞样品而图C和D显示用1ug/ml的肽处理的细胞样品。A和C的图像取自l天处理后，而B和D的图像取自3天处理后。为了检验自分泌作用，将HaCat细胞系与本发明的十三肽(lPg/ml)温育6天而后使用ELISA试剂盒(R&D，美国)测量培养物中的EGF水平。我们发现，本发明的十三肽对EGF具有显著高的自分泌作用(图7)。此外，将HaCat细胞系与5微摩尔的本发明的十三肽温育72小时而后使用透明质酸ELISA试剂盒(EchelonBiosciencesInc，美国)测量作为表示皮肤皱纹改善标记的透明质酸的水平(图8)。如图3、4和5中所示，本发明的肽对细胞生长、细胞活力和粘附具有非常高的能力。此外，本发明的肽显示促进细胞运动性。如图7中所示，用本发明的肽处理HaCaT角质细胞还诱导细胞内EFG水平大量提高。本发明的肽的处理极大提高了透明质酸的水平(图8)。总而言之，可以理解的是，本发明的肽对改善皮肤状态具有明显提高的效果。实施例5:肽对皮肤厚度的影响分析为了评价本发明的肽对化妆品的适用性和体内功效，将在配方实施例2中配制的滋养霜涂敷到小鼠皮肤上。6周龄BalbC雄性小鼠(CentralLab.Animal,Inc.，韩国)进行1周的适应性饲养并用含巯基乙酸的霜剂部分去除其背部的毛发。将小鼠分成2组；对其中一组局部施用包含含有十三肽的纳米体的霜剂而对另一组局部施用不含纳米体的霜剂。每天早上(A.M.8:30)及晚上(P.M.6:30)以100mg的剂量施用霜剂达5天。施用后，颈部脱位处死小鼠并将其皮肤组织包蜡。用切片机将包蜡的组织切片至厚度为8Pm并用苏木精/曙红着色，然后在光学显微镜下观察(图9)。如图9中所示，包含本发明的十三肽的纳米体化妆品可促进角质细胞层和表皮层的形成和生长。因此，发现含有本发明的肽的化妆品发挥改善皮肤皱纹和弹性的作用。本发明的EGF模拟肽具有天然产生的人EGF的活性且促进细胞中产生自分泌EGF。而且，本发明的肽与天然产生的bFGF相比呈现出更优异的功效和好得多的稳定性和皮肤渗透性。就此而论，可以理解的是，含有本发明的肽的组合物对需要EGF活性的疾病或状态的治疗、预防和改善能够显示极好的功效。另外，本发明的肽能够有利地应用于药物组合物、准药、化妆品和美容品(cosmeceutics)中。已经描述了本发明的优选实施方案，应该理解的是，落入本发明实质内的变形和修改对于本领域技术人员是显而易见的，并且本发明的范围由所附权利要求及其等效技术方案所确定。权利要求1、一种具有表皮生长因子(EGF)活性的肽，该肽包含下式1所示的氨基酸序列Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-连接体-Arg-Gly-Asp(1)。2、根据权利要求l所述的肽，其中，所述连接体包含多个氨基酸残基。3、根据权利要求1所述的肽，其中，所述连接体包含210个Gly残基。4、根据权利要求1所述的肽，其中，所述肽在其N-末端或C-末端具有选自由乙酰基、芴基甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基或聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基。5、根据权利要求l所述的肽，其中，位于所述肽的C-末端的Asp残基另外连接到作为保护基的Ala或Gly残基上。6、根据权利要求5所述的肽，其中，所述肽包含下式2所示的氨基酸序列Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Gly(n)_Arg_Gly_Asp-Gly(2)其中，n为28的整数。7、一种预防或治疗表皮生长因子有效的紊乱或状态的组合物，该组合物包含权利要求16中任一项所述的具有表皮生长因子(EGF)活性的肽作为活性成份。8、根据权利要求7所述的组合物，其中，所述组合物为包含(a)药用有效量的权利要求16中任一项所述的肽；和(b)可药用载体的药物组合物。9、根据权利要求7所述的组合物，其中，所述组合物为包含(a)美容有效量的权利要求16中任一项所述的肽；和(b)化妆品可用载体的化妆品组合物。10、根据权利要求7所述的组合物，其中，所述组合物通过促进天然产生的EFG的产生而具有促进细胞生长和分裂，上皮细胞活性，血管发生，神经元再生，伤口愈合，血栓形成治疗，动脉粥样硬化治疗，胶原、弹性蛋白和层粘连蛋白的生物合成，治疗牙周疾病或改善皮肤状态的功效或活性。11、根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物具有改善皮肤状态的功效。12、根据权利要求10所述的组合物，其中，所述改善皮肤状态为改善皱纹或皮肤弹性、预防皮肤老化、预防脱发、促进毛发生长、治疗特异反应性、改善皮肤湿度、去除暗斑或治疗痤疮。13、一种预防或治疗表皮生长因子有效的紊乱或状态的方法，该方法包括向被试者施用包含权利要求16中任一项所述的具有表皮生长因子(EGF)活性的肽作为活性成份的组合物。14、根据权利要求13所述的方法，其中，所述组合物为包含(a)药用有效量的权利要求16中任一项所述的肽；和(b)可药用载体的药物组合物。15、根据权利要求13所述的方法，其中，所述组合物为包含(a)美容有效量的权利要求16中任一项所述的肽；和(b)化妆品可用载体的化妆品组合物。16、根据权利要求13所述的方法，其中，所述组合物通过促进天然产生的EFG的产生而具有促进细胞生长和分裂，上皮细胞活性，血管发生，祌经元再生，伤口愈合，血栓形成治疗，动脉粥样硬化治疗，胶原、弹性蛋白和层粘连蛋白的生物合成，治疗牙周疾病或改善皮肤状态的功效或活性。17、根据权利要求16所述的方法，其中，所述组合物具有改善皮肤状态的功效。18、根据权利要求17所述的方法，其中，所述改善皮肤状态为改善皱纹或皮肤弹性、预防皮肤老化、预防脱发、促进毛发生长、治疗特异反应性、改善皮肤湿度、去除暗斑或治疗痤疮。19、权利要求16中任一项所述的肽用于制备预防或治疗表皮生长因子有效的紊乱或状态的组合物的用途。20、根据权利要求19所述的用途，其中，所述肽通过促进天然产生的EFG的产生而具有促进细胞生长和分裂，上皮细胞活性，血管发生，神经元再生，伤口愈合，血栓形成治疗，动脉粥样硬化治疗，胶原、弹性蛋白和层粘连蛋白的生物合成，治疗牙周疾病或改善皮肤状态的功效或活性。21、根据权利要求20所述的用途，其中，所述肽具有改善皮肤状态的功效。22、根据权利要求21所述的用途，其中，所述改善皮肤状态为改善皱纹或皮肤弹性、预防皮肤老化、预防脱发、促进毛发生长、治疗特异反应性、改善皮肤湿度、去除暗斑或治疗痤疮。全文摘要本发明涉及包含下式1所示的氨基酸序列并具有表皮生长因子活性的肽及其用途Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-连接体-Arg-Gly-Asp(1)。本发明的EGF模拟肽具有与天然产生的人EGF相同的功能或活性并且能够促进细胞中产生自分泌EGF。此外，本发明的肽比天然产生的EGF具有更高的稳定性和皮肤渗透能力。因此，含有该肽的组合物对需要EGF活性的疾病或状态显示出极好的治疗和预防功效，并且能够有利地应用于药物组合物、准药和化妆品中。文档编号C07K14/485GK101522708SQ200780037799公开日2009年9月2日申请日期2007年10月8日优先权日2006年10月10日发明者宋尚洙,崔俊英,郑镕池,金荣德,金银美申请人:凯尔杰有限公司