癌症的预防和/或治疗剂的制作方法

专利名称：癌症的预防和/或治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对Nectin-2的单克隆抗体及其用途，具体地涉及癌症的预防和/或治疗剂或诊断试剂、癌细胞的凋亡促进剂、癌细胞的增殖抑制剂、利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞毒剂等。

背景技术：
在癌症方面，已经预见到可以用基因的微阵列序型分析(profiling)数据来评价其疾病状态，实际上，有报导称在白血病方面，根据基因表达序型((profile)来对白血病进行分类已经成为可能。此外，可以认为明确各个癌组织的基因表达序型、综合其分类结果，就能够预测对指定癌治疗方法的反应性，或者发现针对指定癌症的新的药物研发靶标蛋白质。具体地，当确定某种癌中某种蛋白质表达亢进时，可以重新对诊断为抗原阳性的患者采取下述方法来诱导抗肿瘤活性(i)降低该蛋白质的表达量、(ii)抑制该蛋白质的功能、(iii)是针对该蛋白质的宿主免疫应答显现出来(显在化)等。与此同时，对于诊断为抗原阴性的患者，也能够迅速地采取措施更换为其它治疗方法，这就消除了给患者带来不必要负担的可能。可以预期，诸如上述的表达序型解析会对癌症的分子诊断和分子靶标治疗药物的开发做出大贡献。
Nectin-2α基因(RefSeq登录号.NM 002856)和Nectin-2δ基因(EMBL登录号.X80038)是从人白血病细胞株TF-1来源的cDNA克隆化的基因，其分别编码由479个氨基酸和538个氨基酸构成的蛋白质(RefSeq登录号.NP 002847和EMBL登录号.CAA56342)。Nectin-2δ基因是Nectin-2α基因的剪辑变体，Nectin-2δ基因编码的蛋白质具有相当于Nectin-2α基因编码的蛋白质的第1位～第350位的氨基酸序列的氨基酸序列，但第351位起C末端侧的氨基酸序列有不同。而且，已经从小鼠ES细胞来源的文库中克隆出与Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因显示出同源性的小鼠基因(GenBank登录号.BC009088和RefSeq登录号.NM_008990)，它们分别编码由467个氨基酸和530个氨基酸构成的蛋白质(GenBank登录号.AAH09088和RefSeq登录号.NP_033016)。这些小鼠Nectin-2基因与人Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因在碱基序列水平上分别具有约72％和约72％、在氨基酸序列水平上分别具有约69％和约73％的同源性。Nectin-2α和Nectin-2δ(以下也统称Nectin-2)是具有PVRL2、PRR2、PVRR2、HveB、CD112等不同称谓的蛋白分子，属于由Nectin-1、Nectin-2、Nectin-3、和Nectin-4这4个成员构成的Nectin家族。Nectin家族以下也将它们统称为Nectin。此外，作为具有Nectin样结构的膜蛋白质，已知有Nec1-1、Nec1-2、Nec1-3、Nec1-4和Nec1-5(J.Biol.Chem.(2004)，279(17)，p18015-p18025)。
Nectin属于免疫球蛋白超家族，其为细胞外区具有3个免疫球蛋白样突环的一次跨膜型糖蛋白质。可以认为Nectin分子在细胞膜上形成顺式二聚体，相邻细胞的细胞膜上的顺式二聚体之间通过反式结合以与Ca2+浓度无关的形式调控上皮细胞之间、或者支持细胞与精子细胞之间的细胞间连接(蛋白质核酸酶(2003)，48(2)，p 105-p112；Curr.Biol.(2002)，12，p1145-p1150)。此外，有报导称Nectin-1与Nectin-3通过反式结合影响神经突触形成(J.Cell Biol.(2002)，156，p555-p565)。Nectin的反式结合是在相同分子间亲同种地形成的，但也已知在诸如Nectin-1与Nectin-3、Nectin-1与Nectin-4、Nectin-2与Nectin-3以及Nectin-3与Nec1-5之间也会形成亲异种的反式结合(J.Biol.Chem.(2002)，277(30)，p27006-p27013)。此外，已知Nectin用处于细胞内的C末端区与胞黏蛋白结合，通过该分子连接于肌动蛋白细胞骨架(J.Cell Sci.(2003)，116(1)，p17-p27)。
作为细胞连接以外的Nectin的生理功能，例如，有报导称Nectin-1作为针对在疱疹病毒上表达的糖蛋白D的受体发挥作用，并作为疱疹病毒侵入细胞时的锚地发挥功能(J.Cell Sci.(2003)，116(1)，p17-p27)。此外，Nectin-2是在自然杀伤细胞上表达的DNAM-1(CD226)的配体之一，可以认为表达DNAM-1的自然杀伤细胞以靶标细胞上表达的Nectin-2为锚地来发挥细胞毒性(J.Exp.Med.(2003)，198(4)，p557-p567)。此外，还有报导称Nectin-2是抑癌基因p53途径相关基因之一(WO 02/99040号公报)，与对血管新生疾病、癌、病毒感染的治疗有用的蛋白质Nectin-3结合的蛋白质(WO 02/28902号公报)、病毒感染相关受体(WO 99/63063号公报)，对乳腺癌、卵巢癌的诊断和治疗有用的基因之一(WO 02/00677号公报)，在各种癌中表达亢进、有望作为抗肿瘤性抗体药物的靶标的16种基因之一(WO03/088808号公报)，以及在癌组织中表达亢进、有望用于癌症的诊断、预防的基因之一(WO 04/030615号公报)。有报导称作为癌组织中表达显著增加的基因发现了Nectin-2基因，该基因的反义寡核苷酸促进癌细胞的凋亡(WO2005/097204号公报)。
作为针对Nectin-2的单克隆抗体，已经报导了针对人Nectin-2的小鼠或大鼠单克隆抗体(Blood(1998)，92(12)，p4602-p4611；J.Virol.(2000)74(3)p1267-p1274；Intl.Immunol.(2004)16(4)，p533-p538；Mol.Immunol.(2005)42，p463-p469；JEM(2003)198(4)，p557-p567；Virol.(1998)246，p179-p189；J.Virol.(2001)75(2)p11185-p11195；FEBS(2005)579，p2243-p2249)、针对小鼠Nectin-2的单克隆抗体(J.Virol.(2001)75(2)p11185-p11195；JBC(2001)276，p48350-p48355；Oncogene(1999)18，p1609-p1617；JCB(1999)145，p539-p549；Exp.Cell Res.(1997)235，p374-p384)，但关于这些抗体的癌细胞增殖抑制活性没有任何记载。


发明内容
现在使用的抗癌剂具有副作用，热切希望在医疗过程中特异地作用于癌细胞、对正常组织的影响尽可能少、仅诱导癌细胞的增殖抑制的安全药物。
本发明人等为解决上述问题进行了潜心研究，结果发现作为在癌组织中表达显著增加的基因，发现了Nectin-2基因，该基因的反义寡核苷酸促进癌细胞的凋亡。而且，成功制备了针对Nectin-2的单克隆抗体，发现该单克隆抗体具有良好的癌细胞增殖抑制活性等。本发明人等基于上述认识进行了深入研究，结果完成了本发明。
即，本发明为 〔1〕针对含有与序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐的单克隆抗体； 〔2〕上述〔1〕所述的抗体，其为针对含有序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐的单克隆抗体； 〔3〕上述〔1〕所述的抗体，其为人单克隆抗体； 〔4〕上述〔1〕所述的抗体，其为嵌合单克隆抗体； 〔5〕上述〔1〕所述的抗体，其为人化单克隆抗体； 〔6〕上述〔1〕所述的抗体，其中，其为抗体的恒定区属于人IgG1亚类的单克隆抗体； 〔7〕上述〔1〕所述的抗体，其具有癌细胞增殖抑制活性； 〔8〕上述〔1〕所述的抗体，其具有抗体依赖性细胞毒性(ADCCAntibody-dependent cellular cytotoxicity)； 〔9〕上述〔1〕所述的抗体，其具有Nectin-2/Nectin-3或Nectin-2/Nectin-2反式结合抑制活性； 〔10〕上述〔1〕所述的抗体，其为识别序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的1-350位(细胞外区)的氨基酸序列中存在的表位的单克隆抗体； 〔11〕上述〔1〕所述的抗体，其为识别序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的47-142位(第1IG样域)或175-240位(第2IG样域)的氨基酸序列中存在的表位的单克隆抗体； 〔12〕上述〔1〕所述的抗体，其为识别序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的、包含第75，76，77，78，95，137，145，173，184，186和212位中的至少1个氨基酸残基的氨基酸序列的单克隆抗体； 〔13〕上述〔1〕所述的抗体，其与Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔14〕上述〔1〕所述的抗体，其识别与Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体所识别的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列； 〔15〕产生上述〔1〕所述的抗体的杂交瘤细胞； 〔16〕Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的上述〔15〕所述的杂交瘤细胞； 〔17〕上述〔16〕所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体； 〔18〕上述〔1〕所述的抗体，其为重组型单克隆抗体； 〔19〕上述〔1〕所述的抗体，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与选自(i)序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的1种序列号、选自(ii)序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的1种序列号和选自(iii)序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的1种序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔19a〕上述〔19〕所述的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号184、序列号185和序列号186所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔19b〕上述〔19〕所述的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号200、序列号201和序列号202所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔19c〕上述〔19〕所述的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号216、序列号217和序列号218所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔19d〕上述〔19〕所述的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号232、序列号233和序列号234所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔19e〕上述〔19〕所述的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号248、序列号249和序列号250所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔19f〕上述〔19〕所述的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号264、序列号265和序列号266所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔19g〕上述〔19〕所述的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号280、序列号281和序列号282所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔19h〕上述〔19〕所述的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号296、序列号297和序列号298所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20〕上述〔1〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与选自(iv)序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的1种序列号、选自(v)序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的1种序列号和选自(vi)序列号194，210，226，242，258，274，290和306中的1种序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20a〕上述〔20〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号192、序列号193和序列号194所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20b〕上述〔20〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号208、序列号209和序列号210所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20c〕上述〔20〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号224、序列号225和序列号226所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20d〕上述〔20〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号240、序列号241和序列号242所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20e〕上述〔20〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号256、序列号257和序列号258所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20f〕上述〔20〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号272、序列号273和序列号274所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20g〕上述〔20〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号288、序列号289和序列号290所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔20h〕上述〔20〕所述的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与序列号304、序列号305和序列号306所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔21〕含有下述单克隆抗体的诊断剂，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔22〕上述〔21〕所述的诊断剂，其为癌症的诊断剂； 〔23〕含有下述单克隆抗体的药物，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔24〕上述〔23〕所述的药物，其为癌症的预防和/或治疗剂； 〔25〕上述〔23〕所述的药物，其为癌细胞的凋亡促进剂； 〔26〕上述〔23〕所述的药物，其为癌细胞的增殖抑制剂； 〔27〕上述〔23〕所述的药物，其为利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞毒剂； 〔28〕一种癌症的预防和/或治疗方法，其特征在于对哺乳动物施用有效量的下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔29〕一种癌细胞的凋亡促进方法，其特征在于对哺乳动物施用有效量的下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔30〕一种癌细胞的增殖抑制方法，其特征在于对哺乳动物施用有效量的下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔31〕一种利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞损伤方法，其特征在于对哺乳动物施用有效量的下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔32〕下述单克隆抗体在制造癌症的预防和/或治疗剂中的用途，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔33〕下述单克隆抗体在制造癌细胞的凋亡促进剂中的用途，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔34〕下述单克隆抗体在制造癌细胞的增殖抑制剂中的用途，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔35〕下述单克隆抗体在制造利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞毒剂中的用途，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐； 〔36〕一种乳腺癌的预防或治疗剂，其含有Nec1-803-2(FERMBP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体； 〔37〕一种乳腺癌的预防或治疗剂，其含有与Nec1-803-2(FERMBP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合Nectin-2的单克隆抗体； 〔38〕上述〔37〕所述的乳腺癌的预防或治疗剂，其中，与Nec1-554-1(FERM BP-10681)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合Nectin-2的单克隆抗体为Nec1-1044-4(FERM BP-10805)或Nec1-1302-2(FERM BP-10684)； 〔39〕上述〔37〕所述的乳腺癌的预防或治疗剂，其中，与Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合Nectin-2的单克隆抗体为Nec8-3704-7(FERM BP-10807)或Nec8-3517-11(FERM BP-10806)； 〔40〕上述〔36〕或〔37〕所述的乳腺癌的预防或治疗剂，其利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制； 〔41〕一种包含下述抗体的乳腺癌的预防或治疗剂，所述抗体的抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与选自(i)序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、选自(ii)序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的序列号和选自(iii)序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔42〕一种包含下述抗体的乳腺癌的预防或治疗剂，所述抗体的抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与选自(iv)序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、选自(v)序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和选自(vi)序列号194，210，226，242，258，274，290和306中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔43〕一种包含下述抗体的乳腺癌的预防或治疗剂，所述抗体包含抗体重链可变区、抗体轻链可变区和抗体恒定区，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与选自(i)序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、选自(ii)序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的序列号和选自(iii)序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与选自(iv)序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、选自(v)序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和选自(vi)序列号194，210，226，242，258，274，290和306中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列； 〔44〕Nec1-1044-4(FERM BP-10805)、Nec8-3517-11(FERM BP-10806)或Nec8-3704-7(FERM BP-10807)所表示的杂交瘤细胞； 〔45〕上述〔44〕所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体； 〔46〕与Nec1-1044-4(FERM BP-10805)、Nec8-3517-11(FERM BP-10806)或Nec8-3704-7(FERM BP-10807)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合的单克隆抗体； 〔47〕一种乳腺癌的预防或治疗剂，其含有上述〔45〕或〔46〕所述的单克隆抗体； 〔48〕一种乳腺癌的预防或治疗剂，其含有与下述抗体(所述抗体的抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含选自(i)序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、选自(ii)序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的序列号和选自(iii)序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列)竞争性结合的抗体； 〔49〕一种乳腺癌的预防或治疗剂，其含有与下述抗体(抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含选自(iv)序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、选自(v)序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和选自(vi)序列号194，210，226，242，258，274，290和306中的序列号所表示的氨基酸序列)竞争性结合的抗体； 〔50〕一种乳腺癌的预防或治疗剂，其含有与下述抗体(所述抗体包含抗体重链可变区、抗体轻链可变区和抗体恒定区，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含选自(i)序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、选自(ii)序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的序列号和选自(iii)序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别含有选自(iv)序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、选自(v)序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和选自(vi)序列号194，210，226，242，258，274，290和306中的序列号所表示的氨基酸序列)竞争性结合的抗体。
针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质、其部分肽或其盐的单克隆抗体可以作为例如癌(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、精巢癌、甲状腺癌、胰癌、脑肿瘤、血液肿瘤等)的预防和/或治疗剂(优选乳腺癌、肺癌、大肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰癌等的预防和/或治疗剂)、癌细胞的凋亡促进剂、癌细胞的增殖抑制剂、癌细胞细胞周期变化的诱发剂、利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞毒剂、抗体依赖性癌细胞毒剂等，安全地使用。



图1显示了实施例1所得的本发明的抗体的H链可变区的氨基酸序列(序列号187、203、219、235、251、267、283和299)和L链可变区的氨基酸序列(序列号195、211、227、243、259、275、291和307)。
图2显示了实施例1所得的本发明的抗体的H链可变区的碱基序列(序列号191、207、223、239、255、271、287和303)。
图3显示了实施例1所得的本发明的抗体的L链可变区的碱基序列(序列号199、215、231、247、263、279、295和311)。
图4显示了实施例23中癌细胞株移植后的肿瘤体积平均值的时间性变化。
发明的
具体实施例方式 含有与序列号1所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质(以下简记为Nectin-2α)或含有与序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质(以下简记为Nectin-2δ)(以下将两者合称为Nectin-2或本发明的蛋白质)可以是人或恒温动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、猪、绵羊、牛、猴等)的细胞(例如肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰脏β细胞、骨髓细胞、血管系膜细胞、朗格汉斯细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、肝细胞或间质细胞，或者这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等)或者上述细胞所存在的任何组织例如脑、脑的各部位(例如嗅球、杏仁核、大脑基底球、海马、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、脑垂体、胃、胰脏、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾脏、下颌下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等来源的蛋白质，也可以是合成蛋白质。
作为与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可以列举出与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列具有约50％以上、优选约60％以上、更优选约70％以上、更优选约80％以上、更优选约90％以上、特别优选约95％以上的同源性的氨基酸序列等。
作为含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的蛋白质，优选例如含有上述的与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列、并且具有与含有序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质基本上实质相同的活性的蛋白质等。
氨基酸序列的同源性可以采用同源性计算算法NCBI BLAST(NationalCenter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，按照以下条件(期望值＝10；允许空位；矩阵＝BLOSUM62；过滤＝OFF)进行计算。
基本上实质相同是指它们的性质在性质上(例如生理学的、或药理学的)是本质相同的。因此，本发明的蛋白质的活性优选是等同(例如约0.01～100倍、优选约0.1～10倍、更优选0.5～2倍)的，它们的活性水平也可以因蛋白质的分子量等量的因素而存在差异。
此外，作为Nectin-2，还包括突变蛋白，例如下述蛋白质等，所述蛋白质包含(i)序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列中的1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5)个)氨基酸缺失而得到的氨基酸序列，(ii)序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列中增加1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸而得的氨基酸序列，(iii)序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列中插入1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸而得的氨基酸序列，(iv)序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列中的1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸被其它氨基酸取代而得的氨基酸序列，或(v)组合上述而得的氨基酸序列。
当如上述那样氨基酸序列被插入、缺失或取代时，对于插入、缺失或取代的位置没有特殊限制。
按表记肽的惯例，本说明书中的蛋白质的左端为N末端(氨基末端)，右端为C末端(羧基末端)。以含有序列号1所表示的氨基酸序列的蛋白质为代表的、可用于本发明的蛋白质的C末端可以是羧基(-COOH)、羧酸根(-COO-)、酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
此处，作为酯中的R，可以使用例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等C1-6烷基，例如环戊基、环己基等C3-8环烷基，例如苯基、α-萘基等C6-12芳基，例如苯甲基、苯乙基等苯基-C1-2烷基或α-萘基甲基等α-萘基-C1-2烷基，特戊酰氧基甲基等。
当Nectin-2中除C末端以外还具有羧基(或羧酸根)时，该羧基被酰胺化或酯化的Nectin-2也包含在本发明中使用的Nectin-2中。作为这种情况下的酯，可以使用例如上述的C末端的酯等。
而且，Nectin-2中还包括下述蛋白N末端的氨基酸残基(例如甲硫氨酸残基)的氨基被保护基(例如甲酰基、乙酰基等C1-6烷酰基等C1-6酰基等)保护起来的Nectin-2、因在生物体内被切割而生成的N末端的谷氨酸残基发生了焦谷氨酸化的Nectin-2、分子内氨基酸的侧链上的取代基(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被合适的保护基(例如甲酰基、乙酰基等C1-6烷酰基等C1-6酰基等)保护起来的Nectin-2、或者与糖链结合而形成的糖蛋白质等复合蛋白质，等等。
作为Nectin-2的具体例子，可以列举出例如含有序列号1所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2α)、含有序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2δ)等。
作为Nectin-2的部分肽，只要是上述的Nectin-2的部分肽、且优选具有与上述Nectin-2等同的性质即可，可以是任意的。
可以使用例如具有Nectin-2的构成氨基酸序列中的至少20个以上、优选50个以上、更优选70个以上、更优选100个以上、最优选200个以上的氨基酸序列的肽等。
此外，本发明中使用的Nectin-2的部分肽，其氨基酸序列中可以缺失1或2个以上(优选1～20个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸，或者其氨基酸序列中可以增加1或2个以上(优选1～20个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸，或者其氨基酸序列中可以插入1或2个以上(优选1～20个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸，或者其氨基酸序列中的1或2个以上(优选1～20个左右、更优选1～10个左右、更优选数个、更优选1～5个左右)的氨基酸可以被其它氨基酸取代。
此外，Nectin-2的部分肽的C末端可以是羧基(-COOH)、羧酸根(-COO-)、酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
而且，与上述Nectin-2的情况相似，Nectin-2的部分肽还包括在C末端以外具有羧基(或羧酸根)的Nectin-2部分肽，N末端的氨基酸残基(例如甲硫氨酸残基)的氨基被保护基保护起来的Nectin-2部分肽，N端侧在生物体内被切割而生成的谷氨酸残基发生了焦谷氨酸化的Nectin-2部分肽，分子内氨基酸侧链上的取代基被合适的保护基保护起来的Nectin-2部分肽，或者与糖链结合而形成的糖肽等复合肽，等等。
作为Nectin-2或其部分肽的盐，可以使用与生理学可接受的酸(例如无机酸、有机酸)、碱(例如碱金属盐)等形成的盐，特别优选与生理学可接受的酸形成的盐(酸付加塩)。作为这样的盐，可以使用例如与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)的盐、或者与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺酸)的盐等。
针对本发明的Nectin-2或者其部分肽或其盐的单克隆抗体(以下简记为“本发明的抗体”)只要是能够识别Nectin-2或者其部分肽或其盐的抗体即可，可以是任何的单克隆抗体。这其中，优选使用人单克隆抗体。
此外，作为本发明的抗体，优选针对Nectin-2δ、或者其部分肽或其盐的单克隆抗体(特别是人单克隆抗体)。
而且，作为本发明的抗体，优选使用具有以下(1)～(8)的特征中的至少1个的抗体。
(1)具有癌细胞(例如人癌细胞OV-90)的增殖抑制活性。
(2)具有抗体依赖性细胞毒性(ADCCAntibody-dependent cellularcytotoxicity)。
(3)具有Nectin-2的顺式结合抑制活性。具体地， (i)抑制Nectin-2α的同源性(ホモな)顺式结合、 (ii)抑制Nectin-2δ的同源性顺式结合、或 (iii)抑制Nectin-2α与Nectin-2δ之间的异源性(ヘテロな)顺式结合。
(4)具有Nectin-2/Nectin-3或Nectin-2/Nectin-2的反式结合抑制活性。具体地， (i)抑制Nectin-2α的同源性顺式二聚体、与Nectin-2α的同源性顺式二聚体之间的反式结合、 (ii)抑制Nectin-2α的同源性顺式二聚体、与Nectin-2δ的同源性顺式二聚体之间的反式结合、 (iii)抑制Nectin-2α的同源性顺式二聚体、与Nectin-2α和Nectin-2δ的异源性顺式二聚体之间的反式结合、 (iv)抑制Nectin-2α的同源性顺式二聚体、与Nectin-3的同源性顺式二聚体之间的反式结合、 (v)抑制Nectin-2δ的同源性顺式二聚体、与Nectin-2δ的同源性顺式二聚体之间的反式结合、 (vi)抑制Nectin-2δ的同源性顺式二聚体、与Nectin-2α和Nectin-2δ的异源性顺式二聚体之间的反式结合、 (vii)抑制Nectin-2δ的同源性顺式二聚体、与Nectin-3的同源性顺式二聚体之间的反式结合、 (viii)抑制Nectin-2α和Nectin-2δ的异源性顺式二聚体、与Nectin-3的同源性顺式二聚体之间的反式结合、 (ix)抑制Nectin-2α和Nectin-2δ的异源性顺式二聚体、与Nectin-2α和Nectin-2δ的异源性顺式二聚体之间的反式结合。
(5)属于实施例4所示的表位组(グル一プ)I～VII或实施例18所示的表位亚组。优选属于实施例4的表位组IV、VI或VII。更优选属于实施例18的表位亚组IVb、VIb或VIIa。
(6)识别下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与 Nec1-803-2(FERM BP-10417)、 Nec1-244-3(FERM BP-10423)、 Nec1-530-1(FERM BP-10424)、 Nec1-903-1(FERM BP-10425)、 Nec1-520-1(FERM BP-10426)、 Nec1-845-2(FERM BP-10427)、 Nec1-834-1(FERM BP-10428) Nec1-964-1(FERM BP-10683) Nec1-1302-2(FERM BP-10684) Nec1-554-1(FERM BP-10681) Nec1-769-2(FERM BP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685) 所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体(属于表4的表位组I、IV、V、VI、VII的抗体)所识别的氨基酸序列相同或实质上相同。
这里，“与Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685))所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体(属于表4的表位I、IV、V、VI、VII的抗体)所识别的氨基酸序列(以下简记为“表位部位”)相同或实质上相同的氨基酸序列”中的“表位部位实质上相同的氨基酸序列”可以列举出(i)在相应表位部位的氨基酸序列中缺失1或2个以上(例如1～10个左右、优选数个(1～5个))氨基酸而得到的氨基酸序列、(ii)在相应表位部位的氨基酸序列中增加1或2个以上(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸而得到的氨基酸序列、(iii)在相应表位部位的氨基酸序列中插入1或2个以上(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸而得到的氨基酸序列、(iv)相应表位部位的氨基酸序列中的1或2个以上(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸被其它氨基酸取代而得到的氨基酸序列、或(v)组合上述(i)～(iv)而得到的氨基酸序列，等等。对于上述的氨基酸序列的插入、增加、缺失或取代的位置，没有特殊限制。
更具体地，作为“与表位部位实质上相同的氨基酸序列”，可以列举出表位部位附近的氨基酸序列，可以列举出例如(i)在表位部分的N末端侧增加1或2个以上(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸而得到的氨基酸序列、(ii)在表位部分的C末端侧增加1或2个以上(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸而得到的氨基酸序列、(iii)表位部分的N末端侧的氨基酸序列(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸序列中增加1或2个以上(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸而得到的氨基酸序列、(iv)在表位部分的C末端侧的氨基酸序列(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸序列中增加1或2个以上(例如1～10个左右、更优选数个(1～5个))的氨基酸而得到的氨基酸序列，等等。
例如，可以认为Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERMBP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685))所表示的杂交瘤细胞产生的各单克隆抗体、以及属于与该单克隆抗体所属的组相同的组的其它单克隆抗体，识别与该单克隆抗体相同或实质上相同的氨基酸序列。
(7)与Nec1-803-2(FERM BP-10417)、 Nec1-244-3(FERM BP-10423)、 Nec1-530-1(FERM BP-10424)、 Nec1-903-1(FERM BP-10425)、 Nec1-520-1(FERM BP-10426)、 Nec1-845-2(FERM BP-10427)、 Nec1-834-1(FERM BP-10428)、 Nec1-964-1(FERM BP-10683)、 Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、 Nec1-554-1(FERM BP-10681)、 Nec1-769-2(FERM BP-10682)或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685) 所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合Nectin-2α或Nectin-2δ。
此处，“与各杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合Nectin-2α或Nectin-2δ的抗体”，是指能够竞争性地抑制因过量添加上述12种抗体中的任一种引起的对于Nectin-2α或Nectin-2δ的结合的抗体，具体地，例如下述抗体当相对于所述抗体以50倍摩尔量添加上述12种抗体中的任一种时，该抗体显示出约50～100％的结合抑制率。
(8)含有与 Nec1-803-2(FERM BP-10417)、 Nec1-244-3(FERM BP-10423)、 Nec1-530-1(FERM BP-10424)、 Nec1-903-1(FERM BP-10425)、 Nec1-520-1(FERM BP-10426)、 Nec1-845-2(FERM BP-10427)、 Nec1-834-1(FERM BP-10428)、 Nec1-964-1(FERM BP-10683)、 Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、 Nec1-554-1(FERM BP-10681)、 Nec1-769-2(FERM BP-10682)、或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685) 所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的单克隆抗体。
此处，作为与上述单克隆抗体的氨基酸序列(以下称为“氨基酸序列A”)相同或者实质上相同的氨基酸序列，可以列举出与氨基酸序列A具有约50％以上、优选约60％以上、更优选约70％以上、更优选约80％以上、更优选约90％以上、特别优选约95％以上的同源性的氨基酸序列，等等。
作为含有与氨基酸序列A实质上相同的氨基酸序列的抗体，优选例如含有与上述氨基酸序列A实质上相同的氨基酸序列、并且具有与含有氨基酸序列A的蛋白质基本上实质相同的活性的抗体，等等。
氨基酸序列的同源性可以采用同源性计算算法NCBI BLAST(NationalCenter for Biotechnology Information Basic Local Aligmment Search Tool)，按照以下的条件(期望值＝10；允许空位；矩阵＝BLOSUM62；过滤＝OFF)来计算。
基本上实质相同是指它们的性质在性质上(例如生理学的或药理学的)是本质相同的。因此，优选抗体的活性为等同(例如约0.01～100倍、优选约0.1～10倍、更优选0.5～2倍)，这些活性的程度也可以因蛋白质的分子量等量的因素而异。
此外，作为含有与氨基酸序列A相同或者实质上相同的氨基酸序列的单克隆抗体，其还包含含有例如下述氨基酸序列的抗体等(i)氨基酸序列A中缺失1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸而得到的氨基酸序列、(ii)氨基酸序列A中增加1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸而得到的氨基酸序列、(iii)氨基酸序列A中插入1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸而得到的氨基酸序列、(iv)氨基酸序列A中的1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5个))氨基酸被其它氨基酸取代而得到的氨基酸序列、或(v)组合以上而得到的氨基酸序列。
而且，本发明的抗体包括嵌合抗体、人化抗体、人抗体和抗体片段。“嵌合抗体”是指具有异种抗体来源的可变区与人抗体恒定区的抗体(参照例如欧州专利公开公报EP0125023等)。“人化抗体”是指对小鼠等不同于人的物种的抗体进行修饰，将除H链和L链的互补性决定部分以外的一级结构更换为人抗体的对应一级结构而得到的抗体。“人抗体”是指使用导入了人抗体基因的转基因动物制备的单克隆抗体(参照欧州专利公开公报EP0546073)、和使用将人抗体基因展示在噬菌体、大肠杆菌、酵母、动物细胞等的细胞表面或核糖体上而得到的文库、即抗体展示技术制备的单克隆抗体(Nature Biotechnology 23，1105(2005))、和由产生抗Nectin-2的抗体的人B细胞通过细胞融合法、噬菌体展示法等技术分离获得的单克隆抗体。
在本发明中，“抗体片段”是指完整抗体的一部分，一般包含抗原结合区或可变区。抗体片段包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二硫键稳定化抗体(dsFv)等。
本发明的优选实施方式的抗体识别序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的、存在于第1-350位(细胞外区)的氨基酸序列中的表位；序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的、存在于第47-142位(第1IG样域)或第175-240位(第2IG样域)的氨基酸序列中的表位；或者，序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的、包含第75，76，77，78，95，137，145，173，184，186，212位中的至少1个氨基酸残基的氨基酸序列。
此外，本发明提供含有特定的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的单克隆抗体。而且，本发明还提供含有特定的CDR氨基酸序列的单克隆抗体轻链或其片段、单克隆抗体重链或其片段。
抗体的重链和轻链的N末端侧存在可变区，它们分别称为重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。可变区内存在互补决定区(complementaritydetermining region；CDR)，该部分负责抗原识别的特异性。可变区的CDR以外的部分具有保持CDR结构的作用，称为框架区(FR)。重链和轻链的C末端侧存在恒定区，它们分别称为重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)。重链可变区中存在第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)这3个互补决定区。重链可变区中的3个互补决定区合称重链互补决定区。相似地，轻链可变区中也存在第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)这3个互补决定区。轻链可变区中的3个互补决定区合称轻链互补决定区。
具体地，本发明的优选实施方式的抗体的抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与选自(i)序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、选自(ii)序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的序列号和选自(iii)序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列。
此外，本发明的其它优选实施方式的抗体的抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与选自(iv)序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、选自(v)序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和选自(vi)序列号194，210，226，242，258，274，290和306中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列。
关于本发明的抗体的CDR序列，并非限定，但作为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列的优选组合、作为VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3的氨基酸序列的优选组合示于后述的表21和22。对于CDR以外的氨基酸序列没有特殊限制，CDR以外的氨基酸序列为其它抗体、特别是其它物种的抗体来源的抗体即CDR移植抗体包括在本发明的抗体中。优选CDR以外的氨基酸序列为人来源的氨基酸序列，视需要，可以伴有框架区(FR)中的1至数个氨基酸残基的增加、缺失、取代和/或插入。
而且，本发明的抗体可变区的氨基酸序列和碱基序列优选如表25所述。
本发明的抗体即含有特定CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的单克隆抗体的制备，可以采用公知方法进行。
本发明的抗体的抗体恒定区属于优选人抗体、更优选人IgG、更优选人IgG1亚类的单克隆抗体。
针对Nectin-2或者其部分肽或它们的盐(以下，在抗体的说明中有时将它们简记为Nectin-2)的抗体，可以采用本身公知的抗体或抗血清制造方法来制造。
以下，对本发明抗体的抗原的制备方法、和该抗体的制备方法进行说明。
(1)抗原制备 作为在本发明抗体的制备中使用的抗原，可以使用例如下述中的任一种含有序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2)或者其部分肽或它们的盐；天然或人工高表达含有序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2)的细胞株或其膜级分；Nectin-2的细胞外区蛋白质与其它蛋白质或肽的融合蛋白质或其盐；或者，具有1种或2种以上与Nectin-2相同的抗原决定簇的(合成)肽，等等(以下，将它们简称为本发明的抗原)。
作为本发明的抗原的具体例子，优选使用天然或人工高表达Nectin-2的细胞株或其膜级分、Nectin-2的细胞外区蛋白质或其盐、Nectin-2的细胞外区与其它蛋白质或肽的融合蛋白质、或者与Nectin-2具有1种或2种以上相同抗原决定簇的(合成)肽，等等。
作为其它蛋白质或肽，可以列举出例如FLAG标签，His标签，Myc标签，V5标签，GST标签，S标签，T7标签，人抗体、小鼠抗体等的Fc区，等等。
所述(合成)肽的长度只要使得具有免疫原性即可，对其没有特殊限制，可以列举出例如具有6个、优选10个、更优选12个连续氨基酸残基的(合成)肽。
Nectin-2或者其部分肽或其盐可以从前述的人或恒温动物的细胞或组织中采用本身公知的蛋白质纯化方法、或者基于该方法的方法来制造；也可以通过培养含有编码蛋白质的DNA的转化体来制造。此外，还可以依据后述的肽合成方法来制造。此外，Nectin-2的细胞外区与其它蛋白质或肽的融合蛋白质，可以通过培养含有编码该融合蛋白质的DNA的转化体来制造。
(a)当从人或恒温动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、猪、绵羊、牛、猴等)的组织或细胞制备本发明的抗原或它们的盐时，可以在对该组织或细胞进行匀浆后，将粗分级物(例如膜级分、可溶性级分)直接用作抗原。或者，可以用酸、表面活性剂或醇等进行抽提，通过组合使用盐析、透析、凝胶过滤、反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱等色谱，对该抽提液进行纯化分离。
(b)当使用含有DNA的转化体来制造Nectin-2、或者Nectin-2的细胞外区与其它蛋白质(肽)的融合蛋白质或其盐时，该DNA可以按照公知的克隆方法〔例如Molecular Cloning(2nd ed.；J.Sambrook et al.，Cold Spring HarborLab.Press，1989)所述的方法等〕来制作。
作为完整地编码Nectin-2或其部分肽(以下，在对于编码它们的DNA的克隆和表达的说明中，有时将它们简记作Nectin-2)的DNA的克隆化方法，可以这样进行使用具有编码Nectin-2的碱基序列的一部分的合成DNA引物、通过PCR法来进行扩增，或者，通过与使用编码Nectin-2的一部分或者全部的DNA片段或合成DNA进行了标记了的制品杂交、来对组入适当载体的DNA进行筛选鉴别。作为用于PCR的模板多核苷酸，只要其含有编码Nectin-2的碱基序列即可，可以是任何多核苷酸。此外，可以是基因组DNA、基因组DNA文库、上述细胞/组织来源的cDNA、上述细胞·组织来源的cDNA文库或合成DNA。杂交的方法可以按照例如MolecularCloning2nd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)所述的方法等进行。此外，当使用市售的文库时，可以按照附带的使用说明书所述的方法进行。更优选在严格条件下进行。
严格条件是指例如钠浓度为约19～40mM、优选约19～20mM，温度为约50～70℃、优选约60～65℃的条件。特最优选钠浓度为约19mM、温度为约65℃的条件。
更具体地，作为(i)编码含有序列号1所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2α)的DNA，可以使用含有序列号2所表示的碱基序列的DNA等；而作为(ii)编码含有序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2δ)的DNA，可以使用含有序列号4所表示的碱基序列的DNA等。
DNA的碱基序列变换可以使用PCR、公知的试剂盒例如、MutanTM-super Express Km(宝酒造(株))、MutanTM-K(宝酒造(株))等，按照ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等本身公知的方法或者基于这些方法的方法来进行。
克隆化的编码Nectin-2的DNA，根据目的可以直接使用，也可以根据需要用限制性酶消化、或增加接头来使用。该DNA可以在其5’末端侧具有作为翻译起始密码子的ATG，而在其3’末端侧具有作为翻译终止密码子的TAA、TGA或TAG。这些翻译起始密码子或翻译终止密码子，可以使用适当的合成DNA适体来添加。当获得编码Nectin-2细胞外区与其它蛋白质(肽)的融合蛋白质或其盐的DNA时，可以按照与上述相同的方法进行克隆化，或者采用本身公知的方法或者基于这些方法的方法将合成的编码Nectin-2细胞外区的DNA与编码其它蛋白质(肽)的DNA相连接。
Nectin-2的表达载体可以这样制造，例如(1)从编码Nectin-2的DNA中切出目的DNA片段，(2)将该DNA片段连接到适当的表达载体中的启动子的下游。
作为载体，可以使用大肠杆菌来源的质粒(例如pBR322，pBR325，pUC12，pUC13)，枯草杆菌来源的质粒(例如pUB110，pTP5，pC194)，酵母来源的质粒(例如pSH19，pSH15)，λ噬菌体等的噬菌体，反转录病毒、牛痘病毒等动物病毒，杆状病毒等昆虫病毒等，还可以使用pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
作为本发明中使用的启动子，只要是与用于基因表达的宿主相对应的合适的启动子即可，可以是任何启动子。例如，当使用动物细胞作为宿主时，可以列举出SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、HSV-TK启动子等。
这其中，优选使用CMV启动子、SRα启动子等。当宿主是埃希氏属细菌时，优选trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等；当宿主是杆菌属细菌时，优选SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等；当宿主是酵母时，优选PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。当宿主是昆虫细胞时，优选polyhedrin启动子、P10启动子等。
在表达载体中，可以使用除了上述以外，还根据需要含有增强子、剪辑信号、加多聚A信号、选择标记、SV40复制起点(以下，也简称为SV40ori)等的表达载体。作为选择标记，可以列举出例如二氢叶酸还原酶(以下，也简称为dhfr)基因〔甲氨喋呤(MTX)抗性〕、氨苄西林抗性基因(以下，也简称为Ampr)、新霉素抗性基因(以下，也简称为Neor、G418抗性)等。特别是，当使用dhff基因缺陷中国仓鼠细胞且将dhff基因用作选择标记时，可以通过不含胸苷的培养基来选择目的基因。
此外，视需要，可以在Nectin-2的N端末侧添加与宿主匹配的信号序列。当宿主为埃希氏属细菌时，可以利用PhoA信号序列、OmpA信号序列等；当宿主是杆菌属细菌时，可以利用α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等；当宿主为酵母时，可以利用MFα信号序列、SUC2信号序列等；当宿主是动物细胞时，胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
使用这样构建的含有编码Nectin-2的DNA的载体，可以制造转化体。
作为宿主，可以使用例如埃希氏属细菌、杆菌属细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫、动物细胞等。
作为埃希氏属细菌的具体例子，可以使用例如大肠杆菌(Escherichiacoli)K12·DH1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60卷，160(1968)〕，JM103〔NucleicAcids Research，9卷，309(1981)〕，JA221〔Journal of Molecular Biology，120卷，517(1978)〕，HB101〔Journal of Molecular Biology，41卷，459(1969)〕，C600〔Genetics，39卷，440(1954)〕等。
作为杆菌属细菌，可以使用例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)MI114〔Gene，24卷，255(1983)〕，207-21〔Journal of Biochemistry，95卷，87(1984)〕等。
作为酵母，可以使用例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、粟酒酵母(Schizosaccharomycespombe)NCYC 1913，NCYC2036、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71等。
作为昆虫细胞，例如，当病毒为AcNPV时，可以使用草地贪夜蛾幼虫来源的株化细胞(Spodoptera frugiperda cell；Sf细胞)、甘兰尺蠖(Trichoplusiani)中肠来源的MG1细胞、甘兰尺蠖卵来源的High FiveTM细胞、油菜夜蛾(Mamestra brassicae)来源的细胞或盐泽灯蛾(Estigmena acrea)来源的细胞等。当病毒为BmNPV时，可以使用蚕来源的株化细胞(Bombyx mori N细胞；BmN细胞)等。作为该Sf细胞，可以使用例如Sf9细胞(ATCC CRL1711)、Sf21细胞(以上。Vaughn，J.L.等，In Vivo，13，213-217，(1977))等。
作为昆虫，可以使用例如蚕的幼虫等〔前田等，Nature，315卷，592(1985)〕。
作为动物细胞，可以使用例如猴COS-7细胞、Vero细胞、中国仓鼠CHO细胞(以下简记为CHO细胞)、dhfr基因缺陷中国仓鼠CHO细胞(以下以下简记为CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、小鼠ATDC5细胞、小鼠NS0细胞、小鼠FM3A细胞、大鼠GH3细胞、人FL细胞、人胚胎HEK293细胞、人胚胎细胞293F细胞、等。
在转化埃希氏属细菌时，可以按照例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69卷，2110(1972)及Gene，17卷，107(1982)等所述的方法进行。
在转化杆菌属细菌时，可以按照例如Molecular & General Genetics，168卷，111(1979)等所述的方法进行。
在转化酵母时，可以按照例如Methods in Enzymology，194卷，182-187(1991)、Procc.Natl.Acad.Sci.USA，75卷，1929(1978)等所述的方法进行。
在转化昆虫细胞或昆虫时，可以按照例如Bio/Technology，6，47-55(1988)等所述的方法进行。
在转化动物细胞时，可以按照例如Saibo Kogaku(Cell Engineering)，extra issue 8，Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol(New Cell EngineeringExperimental Protocol)，263-267(1995)(published by Shujunsha)，或Virology，52卷，456(1973)所述的方法进行。
这样一来，可以得到用含有编码Nectin-2的DNA的表达载体转化的转化体。
当培养宿主为埃希氏属细菌、杆菌属细菌的转化体时，作为用于培养的培养基，液体培养基是合适的，这其中除了该转化体的生长繁育所必要的碳源、氮源、无机物以外，还可以含有其它物质。作为碳源，可以列举出例如葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等；作为氮源，可以列举出例如铵盐类、硝酸盐类、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉提取物、大豆粕、马铃薯抽提液等无机或有机物质；作为无机物，可以列举出例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。此外，还可以添加酵母提取物、维生素类、促生长因子(growthpromoting factors)等。培养基的pH优选为约5～8。
作为培养埃希氏属细菌时的培养基，优选例如含有葡萄糖、水解酪蛋白氨基酸的M9培养基〔Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York 1972〕。其中，根据需要，还可以添加诸如3β-吲哚基丙烯酸这样的试剂，以提高启动子的效率。
当宿主为埃希氏属细菌时，培养通常在约15～43℃、进行约3～24小时，根据需要，还可以施加通气或搅拌。
当宿主为杆菌属细菌时，培养通常在约30～40℃、进行约6～24小时，根据需要，还可以施加通气或搅拌。
在培养宿主为酵母的转化体时，作为培养基，可以列举出例如Burkholder基本培养基〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77卷，4505(1980)〕或含有0.5％水解酪蛋白氨基酸的SD培养基〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81卷，5330(1984)〕。培养基的pH优选调整为约5～8。培养通常在约20℃～35℃、进行约24～72小时，视需要施加通气或搅拌。
当培养宿主为昆虫细胞或昆虫的转化体时，作为培养基，可以使用在Grace′s Insect Medium(Nature，195，788(1962))中适宜灭活的10％牛血清等添加物而得到的培养基等。培养基的pH优选调整为约6.2～6.4。培养通常在约27℃、进行约3～5日，视需要施加通气或搅拌。
当培养宿主为动物细胞的转化体时，作为培养基，可以使用例如含约5～20％小牛血清的MEM培养基〔Science，122卷，501(1952)〕，DMEM培养基〔Virology，8卷，396(1959)〕，RPMI 1640培养基〔The Journal of theAmerican Medical Association，199卷，519(1967)〕，199培养基〔Proceedingofthe Society for the Biological Medicine，73卷，1(1950)〕等。pH优选为约6～8。培养通常在约30～40℃、进行约15～60小时，视需要施加通气或搅拌。
这样一来，可以在转化体的细胞内、细胞膜或细胞外产生Nectin-2。
为了从上述培养物中分离纯化Nectin-2，例如可以按照下述方法进行。
在从培养菌体或者细胞中抽提Nectin-2时，可以适宜采用下述方法培养后，采用公知方法收集菌体或者细胞，将其悬浮于适当的缓冲液，通过超声波、溶菌酶和/或冻融等破坏菌体或者细胞，通过离心分离或过滤得到蛋白质的粗抽提液。缓冲液中可以包含尿素、盐酸胍等蛋白质变性剂，TritonX-100TM等表面活性剂。当Nectin-2分泌到培养液中时，在培养结束后，采用本身公知的方法分离菌体或者细胞与上清，并收集上清。
这样得到的培养上清或者抽提液中所含的Nectin-2的纯化，可以通过组合本身公知的分离/纯化方法来进行。作为这些公知的分离、纯化方法，可以使用盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法，透析法，超滤法、和凝胶过滤法等主要利用分子量差异的方法，离子交换色谱等利用电荷差异的方法，亲和色谱等利用特异亲和性的方法，疏水相互作用色谱、反相色谱等利用疏水性差异的方法、色谱聚焦等利用等电点差异的方法，等等。
当如此得到的Nectin-2是以游离体的形式得到时，可以采用本身公知的方法或者基于这些方法的方法将其转换成盐，相反地，当以盐的形式得到时，可以采用本身公知的方法或者基于这些方法的方法，将其转变为游离体或其它盐。
而且，对于重组体所产生的Nectin-2，可以在纯化前或纯化后通过适当的蛋白质修饰酶的作用，对其施加任意修饰，或者切除多肽的一部分。作为蛋白质修饰酶，可以使用例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
这样生成的Nectin-2的存在，可以通过使用特异抗体的酶免疫测定、western印迹等来测定。
(c)表达Nectin-2的哺乳动物细胞本身可以作为本发明的抗原直接使用。作为哺乳动物细胞，可以使用诸如上述(a)项所述的天然细胞、用诸如上述(b)项所述的方法转化的细胞，等等。作为用于转化的宿主，可以是从人、猴、大鼠、小鼠、仓鼠等采集的任何细胞，优选使用HEK293细胞、COS7细胞、CHO-K1细胞、NIH3T3细胞、Balb3T3细胞、FM3A细胞、L929细胞、SP2/0细胞、P3U1细胞、NS0细胞、B16细胞、或P388细胞等。
(d)具有1种或者2种以上与Nectin-2相同的抗原决定簇的(合成)肽或其盐，可以按照本身公知的肽合成方法制造，或者通过用适当的肽酶切割Nectin-2来制造。作为肽的合成方法，可以是例如固相合成法、液相合成法中的任何方法。即，可以这样制造目的肽使能够构成该肽的部分肽或者氨基酸与其余部分进行缩合，当生成物具有保护基时，脱去保护基。作为公知的缩合方法或保护基的脱离，可以列举出例如以下的(i)～(v)记载的方法。
(i)M.Bodanszky和M.A.Ondetti、肽·合成(Peptide Synthesis)，Interscience Publishers，New York(1966年) (ii)Schroeder和Luebke、肽(The Peptide)，Academic Press，New York(1965年) (iii)泉屋信夫等、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)(1975年) (iv)矢島治明和榊原俊平、生化学実験講座1、蛋白質の化学IV、205、(1977年) (v)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14卷、ペプチド合成、广川书店 此外，反应后，可以组合使用通常的纯化方法、例如溶剂抽提·蒸馏·柱色谱·液体色谱·重结晶等，纯化分离本发明中使用的部分肽。当采用上述方法所得的部分肽是游离体时，可以通过公知方法或者基于这些方法的方法将其转换为适当的盐；相反地，当以盐的形式得到时，可以通过公知方法或者基于这些方法的方法，将其转换为游离体或其它盐。
(2)单克隆抗体的制作 (a)采用杂交瘤法制作单克隆抗体产生细胞 本发明的抗原施用于恒温动物。作为免疫方法，可以是任何能够促进抗体产生的方法，优选使用静脉内注射、腹腔内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、或足垫注射等。
表达本发明蛋白质的天然哺乳动物细胞或转化哺乳动物细胞，可以以悬浮于可用于组织培养的培养基(例如RPMI1640)或缓冲液(例如Hanks平衡盐溶液(Hanks’Balanced Salt Solution))的状态注射给免疫动物。
本发明的抗原，可以直接用不溶化制品进行免疫。此外，也可以用将本发明的抗原结合或吸附在适当载体上而得的复合体进行免疫。该载体(担体，キヤリア一)与本发明抗原(半抗原)的混合比，只要抗体针对结合或者吸附在载体上的本发明抗原的效率好，可以以任何比例结合或者吸附任何制品，通常使用将天然或者合成高分子载体以重量比相对于半抗原1份为0.1～100的比例进行结合或者吸附而得到的制品，其中，所述天然或者合成高分子载体是在针对半抗原抗原的抗体的制作中常用的。作为天然高分子载体，可以使用例如牛、兔、人等哺乳动物的血清白蛋白，或例如牛、兔等哺乳动物的甲状腺球蛋白，或例如牛、兔、人、绵羊等哺乳动物的血红蛋白，钥孔血蓝蛋白，等等。作为合成高分子载体，可以使用例如多聚氨基酸类、聚苯乙烯类、聚丙烯酸类、聚乙烯类、聚丙烯类等聚合物或共聚物等各种乳胶等。
此外，半抗原与载体的联结，可以使用各种缩合剂。例如对酪氨酸、组氨酸、色氨酸进行交联的双重氮联苯胺等重氮化合物，对氨基之间进行交联的戊二醛等二醛化合物、甲苯-2，4-二异氰酸酯等二异氰酸酯化合物，对巯基之间进行交联的N，N’-o-次苯基二马来酰亚胺等二马来酰亚胺化合物，对氨基和巯基进行交联的马来酰亚胺活性酯化合物，对氨基和羧基进行交联的碳二亚胺化合物等，这些都是适合使用的。此外，在对氨基之间进行交联时，也可以这样进行使一方的氨基与具有二硫吡啶基的活性酯试剂(例如N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(3-(2-ピリジルジチオ)丙酸N-スクシンイミジル)(SPDP)等)进行反应，然后进行还原，从而导入巯基，在另一方的氨基上通过马来酰亚胺活性酯试剂导入马来酰亚胺基，然后使上述两者反应。
在施用本发明的抗原时，为了提高免疫动物的抗体产生能力，可以将本发明的免疫原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂、Alum、Ribi佐剂等佐剂混合或者制备成乳液，来施用给该动物。施用通常为每2～6周1次、总计进行2～10次左右。此外，制作本发明的单克隆抗体时，可以利用DNA免疫法(参照例如Nature、356卷、152页-154页)。作为可用的恒温动物，可以列举出例如猴、兔、犬、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、骆驼、美洲驼(ラマ)、鸡，优选使用小鼠和大鼠。这些恒温动物可以是野生型的，也可以是KO动物，其中为了获得更强的针对抗原的免疫反应，敲除了抗原蛋白质的该恒温动物直向同源基因。为了制作人单克隆抗体，可以使用敲除了恒温动物的抗体基因而导入了人抗体基因的转基因动物(参照欧州专利公开公报EP0546073)、敲入(ノツクイン)动物(WO 02/098217号公报、WO 03/020743号公报)等。
在制作单克隆抗体产生细胞时，可以这样进行从经抗原免疫的恒温动物例如小鼠选择确认了抗体效价的个体，在最终免疫2～5日后取脾脏或淋巴结，将其中所含的抗体产生B细胞与同种或异种动物的骨髓瘤细胞融合，从而制备单克隆抗体产生杂交瘤。抗血清中抗体效价的测定，可以采用能够对与抗原特异性结合的抗体的量进行定量的任何方法。例如，可以如下述地测定抗体效价使固相化的蛋白质抗原或抗原表达细胞株与抗血清反应，然后，利用标记抗免疫球蛋白抗体检测其上结合的抗体量。融合操作可以采用已知方法、例如Koehler和Milstein的方法〔Nature、256、495(1975)〕来实施。作为融合促进剂，可以列举出例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选使用PEG。
作为骨髓瘤细胞，可以列举出例如NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等恒温动物的骨髓瘤细胞，优选使用SP2/0或P3U1。所用的抗体产生细胞(脾脏细胞)数与骨髓瘤细胞数的优选比例为1∶1-20∶1左右，以10-80％左右的浓度添加PEG(优选PEG1000-PEG6000)，在20-40℃优选30-37℃温育1-10分钟，这样可以更有效率地实施细胞融合。
此外，作为用于单克隆抗体产生细胞制作的细胞融合操作，也可以采用电融合法。
杂交瘤的筛选，可以按照本身公知或者基于这些方法的方法进行。通常可以利用添加了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)的动物细胞用培养基进行。作为筛选和育种用培养基，可以使用任何杂交瘤能够生长的培养基。可以使用例如含有1～20％、优选10～20％的胎牛血清的RPMI 1640培养基，含有1～10％的胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业(株))或者杂交瘤培养用无血清培养基(SFM-101、日水制药(株))等。培养温度通常为20～40℃，优选为约37℃。培养时间通常为5日～3周、优选1周～2周。培养通常在5％二氧化碳气体中进行。
单克隆抗体产生杂交瘤的筛选可以采用各种方法进行，可以列举出例如下述方法将可溶性蛋白质抗原、蛋白质抗原表达细胞直接或与载体一起吸附在固相(例如微板)上，向其中添加杂交瘤培养上清，然后使其与放射性物质、酶、荧光物质等标记的抗免疫球蛋白抗体(例如，当用于细胞融合的脾脏细胞来自小鼠时，可以使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白A反应，来检测结合到固相上的单克隆抗体；或者下述方法将抗免疫球蛋白抗体或蛋白A吸附在固相上，向其中添加杂交瘤培养上清，然后使其与放射性物质、酶、荧光物质等标记的可溶性蛋白质抗原反应，来检测结合到固相上的抗原特异性单克隆抗体；等等。当使用蛋白质抗原表达细胞时，通过向该细胞添加杂交瘤培养上清，然后使之与荧光标记抗免疫球蛋白抗体反应，再利用流式细胞仪等荧光检测装置测定该细胞的荧光强度，可以检测结合于该细胞的膜上的蛋白质抗原的单克隆抗体。
(b)采用其它方法制作单克隆抗体 本发明抗体的制作方法不限于(a)所述的方法，例如还可以采用抗体显示技术，该技术将以人或恒温动物(例如猴、兔、犬、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、骆驼、美洲驼、鸡等)的B淋巴细胞为材料、采用公知方法制作的抗体基因文库展示在噬菌体、大肠杆菌、酵母、动物细胞等细胞表面或核糖体上等〔Nature Biotechnology 23，1105(2005)〕。人或恒温动物可以是未致敏的(ナイ一ブ)，也可以是高表达本发明抗原的癌患者或用本发明抗原按(a)所述的方法免疫过的恒温动物。作为展示在细胞表面的抗体的形态，可以列举出IgG分子、IgM分子、Fab片段、单链Fv(scFv)片段等，但不限于此。
与本发明抗原特异性结合的单克隆抗体(片段)的基因，可以通过这样的操作而得到使上述的承载了抗体基因文库的抗体(片段)展示细胞或者抗体(片段)展示核糖体与本发明的抗原反应一定时间，清洗除去非特异性结合物，然后，洗脱回收与本发明的抗原特异性结合的抗体，采用公知方法对其抗体(片段)展示细胞或者抗体(片段)展示核糖体进行增殖，然后重复相同的方法数次，从最终克隆化的抗体(片段)展示细胞或者抗体(片段)展示核糖体中采用公知方法分离所述基因。通过采用公知方法是这样得到的单克隆抗体片段基因与IgG抗体基因的相关区重组，可以得到单克隆IgG抗体基因。
此外，本发明的抗体还可以这样得到对从人、上述恒温动物分离的抗体产生细胞，利用本发明的抗原，采用本身公知的方法在试管内进行免疫，然后，采用与(a)的记载相同的方法制作杂交瘤。
(c)单克隆抗体的制造 本发明的单克隆抗体可以这样来制造对(a)中所得的单克隆抗体产生杂交瘤，或者人工表达采用公知方法从(a)中所得的单克隆抗体产生杂交瘤分离的抗体基因、或(b)中所得单克隆抗体基因的重组细胞株，进行培养。此外，也可以这样制造采用公知方法将该抗体基因重组到恒温动物、植物的染色体中，在恒温动物的血液、乳汁、卵或植物体、霉菌等中进行生产〔Curr.Opin.Biotevhnol.7，536(1996)、Nature Rev.Genet 4，794(2003)、Appl.Environ.Microbiol.70，2567(2004)〕。作为恒温动物，可以使用例如牛、山羊、绵羊、猪、鸡、小鼠、兔等。此外，作为植物体，可以使用烟草、玉米、马铃薯、浮萍等。
本发明的单克隆抗体，可以从上述含有单克隆抗体原料采用本身公知的方法、例如免疫球蛋白的分离纯化法〔例如盐析法、醇沉淀法、等电点沉淀法、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、反相色谱、凝胶过滤色谱、羟基磷灰石色谱、通过固定化有抗原或者蛋白A、蛋白G等对抗体具有亲和性的物质的载体来仅分离纯化抗体的亲和色谱等各种色谱等〕进行。
(3)含有本发明的抗体的药物 含有上述本发明抗体的药物，可以作为例如癌(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、精巢癌、甲状腺癌、胰癌、脑肿瘤、血液肿瘤等)的预防和/或治疗剂(优选乳腺癌、肺癌、大肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰癌等的预防和/或治疗剂)、癌细胞凋亡促进剂、癌细胞增殖抑制剂、癌细胞细胞周期变化诱发剂、癌转移抑制剂、癌细胞粘着抑制剂、利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞毒剂、抗体依赖性癌细胞毒剂等使用。作为利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞损伤方法，可以列举出基于生物体效应细胞的抗体依赖性细胞毒性(Antibody-DependentCell-mediated Cytotoxicity；ADCC)或补体依赖性细胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity；CDC)，优选可以使用ADCC。
含有本发明抗体的药物是低毒性，可以直接以液体剂的形式、或者作为适当剂型的药物组合物，口服或非口服(例如血管内施用、皮下施用等)施用于人或哺乳动物(例如大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、犬、猴等)。
本发明的抗体，可以施用其本身，也可以适当的药物组合物的形式施用。作为用于施用的药物组合物，可以是包含本发明抗体或其盐以及药理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的制品。这样的药物组合物可以以适于口服或非口服施用的剂形的形式提供。
作为非口服施用的组合物，可以使用例如注射剂、栓剂等。注射剂中可以包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂形。这样的注射剂可以采用公知方法来配制。作为注射剂的配制方法，例如可以这样配制将上述本发明的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于通常用于注射剂的无菌水性液或油性液中。作为注射用水性液，可以使用例如生理食盐水、含葡萄糖或其它辅药的等渗液等，可以组合使用适当的助溶剂例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂〔例如Polysorbate80、HCO-50(聚氧乙烯(50mol)混于(adduct)氢化蓖麻油)〕等。作为油性液，可以使用例如芝麻油、大豆油等，作为助溶剂，可以组合使用安息香酸苯甲酯、苯甲醇等。配制好的注射液优选充填在适当的安瓿中。用于直肠施用的栓剂，可以通过将上述抗体或其盐混合在通常的栓剂用基质(基剂)中来配制。
作为用于口服施用的组合物，可以列举出固体或液体剂形，具体地有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这样的组合物可以采用公知方法来制造，可以含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或者赋形剂。作为片剂用的载体、赋形剂，可以使用例如乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。
上述的非口服用或口服用药物组合物优选配制成适于活性成分施用量的给药单位剂形。作为这样的给药单位剂形，可以列举出例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂。作为抗体的含有量，每给药单位剂形通常为5～500mg，其中，优选注射剂含有5～100mg、其它剂形含有10～250mg的上述抗体。
含有本发明抗体的上述预防和/或治疗剂、调节剂的施用量因施用对象、对象疾病、症状、施用路径等而异，但例如用于成人乳腺癌的治疗·预防时，适宜静脉注射施用本发明的抗体，作为1次施用量，通常为0.01～20mg/kg体重左右、优选为0.1～10mg/kg体重左右、更优选0.1～5mg/kg体重左右，1日施用1～5次左右、优选1日1～3次左右。其它非口服施用和口服施用时，也可以施用以此为基准的量。当症状特别严重时，可以视其症状而增加用量。
本发明的抗体可以以其本身或适当的药物组合物的形式施用。用于上述施用的药物组合物，可以包含上述抗体或其盐以及药理学可接受的载体、稀释剂或者赋形剂。该组合物可以以适于口服或非口服施用(例如血管内注射、皮下注射等)的剂形的形式提供。
而且，上述各组合物中可以含有其它活性成分，只要该活性成分与上述抗体的配合不产生非优选的相互作用。
而且，本发明的抗体还可以与其它药剂例如烷基化剂(例如环磷酰胺、异磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶等)、抗癌性抗生素(例如丝裂霉素、阿霉素等)、植物来源抗癌剂(例如长春新碱、长春花碱酰胺、紫杉醇等)、顺铂、卡铂、依托泊苷、依立替康等组合使用。本发明的抗体和上述药剂可以同时或在不同时间施用于患者。
(4)使用本发明抗体的Nectin-2定量方法 本发明的抗体能够特异性识别Nectin-2，所以其可以用于受检液中的Nectin-2的定量、特别是采用夹心免疫测定法进行的定量等。
即，本发明提供 (i)一种受检液中的Nectin-2的定量方法，其中，使受检液和标记化Nectin-2竞争性地与本发明的抗体反应，并测定结合于该抗体的标记化Nectin-2的比例； (ii)一种受检液中的Nectin-2的定量方法，其中，使受检液同时或者连续地与固定在载体上的本发明的抗体和标记化的本发明的其它抗体反应，然后测定不溶性载体上的标记剂的活性；和 (iii)一种受检液中的Nectin-2的定量方法，其中，使受检液与固定在载体上的本发明的抗体反应，并采用例如表面等离子体共振(SurfacePlasmon Resonance；SPR)等检测方法测定与不溶性载体结合的Nectin-2的量的变化。
在上述(ii)的定量方法中，优选使用具有不同Nectin-2结合部位的抗体。
此外，使用本发明的抗体，除了能够进行Nectin-2的定量之外，还可以进行利用组织染色等的检测。在这些目的中，可以使用抗体分子本身，此外，也可以使用抗体分子的F(ab′)2、Fab′、或者Fab级分。
对于使用本发明抗体的Nectin-2定量方法，没有特殊限制，可以采用任何测定方法，只要该测定方法通过化学或物理方法检测对应于被测定液中的抗原量(例如蛋白质量)的抗体、抗原或者抗体-抗原复合体的量，并且通过利用含有已知量抗原的标准液制作的标准曲线对其进行计算。例如，采用散射比浊法(nephrometry)、竞争法、免疫测定法、SPR法和夹心法是合适的，从灵敏度、特异性来看，特别优选采用后述的夹心法。
作为可用于使用标记物质的测定方法的标记剂，可以使用例如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。作为放射性同位素，例如有〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕等。作为酶，优选稳定且比活性大的酶，可以使用例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等。作为荧光物质，可以使用例如花青荧光染料(例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Biosciences公司制造)等)、荧光胺、异硫氰酸荧光素、Alexa Fluor染料(Invitrogen社)、铕荧光络合物(Perkin Elmer公司)等。作为发光物质，可以使用例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精(ルシゲニン)等。而且，生物素-抗生物素蛋白系统可以用于抗体或者抗原与标记剂的结合。
抗原或者抗体的不溶化(不溶化)可以采用物理吸附，或通常用于蛋白质或酶等的不溶化、固定化的采用化学结合的方法。抗原或者抗体的不溶化可以这样进行，将这些蛋白质用生物素标记，而使链霉菌抗生物素蛋白(抗生物素蛋白)预先结合于不溶化载体。抗体的不溶化可以使蛋白A、蛋白G、抗免疫球蛋白抗体等预先结合于不溶化载体。作为载体，可以列举出琼脂糖、葡聚糖、纤维素等不溶性多糖类，聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、硅酮等合成树脂，或者玻璃等。
在夹心法中，可以这样对受检液中的本发明的蛋白质量进行定量使受检液与不溶化的本发明的抗体反应(1次反应)，再与标记化的其它本发明的抗体反应(2次反应)，然后测定不溶化载体上的标记剂的活性。1次反应和2次反应可以颠倒顺序进行，此外也可以同时进行，还可以隔开一段时间进行。标记化剂和不溶化的方法可以参照上述。此外，在利用夹心法的免疫测定法中，用作固相用抗体或者标记用抗体的抗体可以不是1种，出于提高测定灵敏度等目的，可以使用2种以上抗体的混合物。
在本发明的利用夹心法的Nectin-2测定方法中，用于1次反应和2次反应的本发明的抗体优选使用Nectin-2的结合部位不同的抗体。
本发明的抗体也可以用于夹心法以外的测定系统、例如竞争法、免疫测定法、SPR法或者散射比浊法等。
在竞争法中，使受检液中的抗原与标记抗原针对抗体竞争性地进行反应，然后，将未反应的标记抗原(F)与结合到抗体的标记抗原(B)分离(B/F分离)，测定B、F中任何一种的标记量，来对受检液中的抗原量进行定量。在本反应方法中，可以采用以可溶性抗体作为抗体、用聚乙二醇进行B/F分离、使用针对上述抗体的第2抗体等的液相法；以及，使用固相化抗体作为第1抗体、或者第1抗体使用可溶性抗体而使用固相化抗体作为第2抗体的固相化法。
在免疫测定法中，使受检液中的抗原与固相化抗原针对一定量的标记化抗体进行竞争反应，然后将固相与液相分离；或者，使受检液中的抗原与过剩量的标记化抗体反应，再添加固相化抗原使未反应的标记化抗体结合到固相上，然后将固相和液相分离。然后，测定任何一个相的标记量，来对受检液中的抗原量进行定量。
在SPR法中，将抗体固定在形成于玻璃基板上的金薄膜表面上，在该薄膜上通入受检液，基于表面等离子体共振(SPR)原理(蛋白质核酸酵素，37，2977-2984(1992))对结合于薄膜上的抗体的受检蛋白质的量的变化进行定量。
此外，在散射比浊法中，测定凝胶内或者溶液中作为抗原抗体反应的结果产生的不溶性沉淀物的量。当受检液中的抗原量很少，仅能得到少量沉淀物时，适合采用利用激光散射的激光散射比浊法等。
这些各种免疫学测定方法用于本发明的定量方法时，不必对条件、操作等进行特别设定。可以在各种方法的通常条件、操作方法的基础上结合本领域技术人员的常规技术考虑，来构建Nectin-2的测定体系。关于这些一般技术方法的详细情况，可以参照综述、书籍等。
可以参照例如入江宽编《ラジオイムノアツセイ》(讲谈社、昭和49年发行)、入江宽编《続ラジオイムノアツセイ》(讲谈社、昭和54年发行)、石川荣治等编《酵素免疫測定法》(医学书院、昭和53年发行)、石川荣治等编《酵素免疫測定法》(第2版)(医学书院、昭和57年发行)、石川荣治等编《酵素免疫測定法》(第3版)(医学书院、昭和62年发行)、《Methods in ENZYMOLOGY》Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同书Vol.73(ImmunochemicalTechniques(Part B))、同书Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同书Vol.84(Immunochemical Techniques(Part DSelected Immunoassays))、同书Vol.92(Immunochemical Techniques(Part EMonoclonal Antibodies andGeneral Immunoassay Methods))、同书Vol.121(ImmunochemicalTechniques(Part IHybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上为Academic Press公司发行)等。
像以上那样，通过使用本发明的抗体，可以灵敏度良好地对Nectin-2进行定量。
(5)使用本发明的抗体的诊断剂·诊断方法 而且，在通过使用本发明的抗体对Nectin-2的浓度进行定量、而检测到Nectin-2浓度的增加时，可以诊断为例如癌(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、精巢癌、甲状腺癌、胰癌、脑肿瘤、血液肿瘤等)、或将来罹患的可能性高。
此外，本发明的抗体可以用于检测体液、组织等受检体中存在的Nectin-2。此外，可以用于Nectin-2的纯化中使用的抗体柱的制作、纯化时各级分中所含的Nectin-2的检测、受检细胞内中Nectin-2的行为分析等。
(6)用于本发明的乳腺癌的预防和/或治疗剂的抗体 可以使用Nec1-803-2(FERM BP-10417)、 Nec1-244-3(FERM BP-10423)、 Nec1-530-1(FERM BP-10424)、 Nec1-903-1(FERM BP-10425)、 Nec1-520-1(FERM BP-10426)、 Nec1-845-2(FERM BP-10427)、 Nec1-834-1(FERM BP-10428)、 Nec1-964-1(FERM BP-10683)、 Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、 Nec1-554-1(FERM BP-10681)、 Nec1-769-2(FERM BP-10682)、或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685) 所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体(以下，有时称为用于本发明的抗体)。
此外，用于本发明的抗体包括具有这些杂交瘤所产生的抗体的特定CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的基因工程方法产生的抗体(包括抗体片段)。
抗体的重链和轻链的N末端侧存在可变区，分别称为重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。可变区内存在互补决定区(complementarity determiningregion；CDR)，该部分负责抗原识别的特异性。可变区的CDR以外的部分具有保持CDR结构的作用，称为框架区(FR)。重链和轻链的C末端侧存在恒定区，它们分别称为重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)。重链可变区中存在第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)这3个互补决定区。重链可变区中的3个互补决定区合称重链互补决定区。相似地，轻链可变区中也存在第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)这3个互补决定区。轻链可变区中的3个互补决定区合称轻链互补决定区。
用于本发明的抗体的CDR的氨基酸序列和碱基序列分别示于后述的表21～24。
抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别具有与选自(i)序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、选自(ii)序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的序列号和选自(iii)序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列同一的氨基酸序列。
抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别具有选自(iv)序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、选自(v)序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和选自(vi)序列号194，210，226，242，258，274，290和306中的序列号所表示的氨基酸序列。
在用于本发明的抗体中，对于CDR以外的氨基酸序列没有特殊限制，CDR以外的氨基酸序列为其它抗体、特别是其它物种的抗体来源的抗体即CDR移植抗体包括在本发明的抗体中。优选CDR以外的氨基酸序列为人来源的氨基酸序列，视需要，可以伴有框架区(FR)中的1至数个氨基酸残基的增加、缺失、取代和/或插入。
在用于本发明的抗体中，抗体可变区的氨基酸序列和碱基序列优选如表25所述。用于本发明的抗体的含有特定CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的单克隆抗体可以采用公知方法制作。
(7)与用于本发明的乳腺癌预防和/或治疗剂的抗体竞争性结合Nectin-2的单克隆抗体 与Nec1-803-2(FERM BP-10417)、 Nec1-244-3(FERM BP-10423)、 Nec1-530-1(FERM BP-10424)、 Nec1-903-1(FERM BP-10425)、 Nec1-520-1(FERM BP-10426)、 Nec1-845-2(FERM BP-10427)、 Nec1-834-1(FERM BP-10428)、 Nec1-964-1(FERM BP-10683)、 Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、 Nec1-554-1(FERM BP-10681)、 Nec1-769-2(FERM BP-10682)、或 Nec8-4116-8(FERM BP-10685) 所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体、或、具有这些杂交瘤所产生的抗体的特定CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的基因工程方法产生的抗体(包括抗体片段)竞争性结合Nectin-2的单克隆抗体(以下，也称为与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体)可以如下地获得。
(7)-(i)抗原的制备 作为在与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体的制备中使用的抗原，可以使用例如下述中的任一种含有序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2)或者其部分肽或它们的盐；天然或人工高表达含有序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2)的细胞株或其膜级分；Nectin-2的细胞外区蛋白质与其它蛋白质或肽的融合蛋白质或其盐；具有1种或2种以上与Nectin-2相同的抗原决定簇的(合成)肽；含有序列号2或序列号4所表示的碱基序列或者其部分碱基序列的动物细胞表达载体；等等(以下，将它们简称为用于本发明的抗原)。
作为用于制作与Nectin-2的细胞外区的融合蛋白质的“其它蛋白质或肽”，可以列举出例如FLAG标签，His标签，Myc标签，V5标签，GST标签，S标签，T7标签，人抗体、小鼠抗体等的Fc区，等等。
在与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体的制备中使用的、与Nectin-2具有相同抗原决定簇的肽的长度，只要使得具有免疫原性即可，对其没有特殊限制，可以列举出具有例如6个、优选10个、更优选12个连续氨基酸残基的肽。
作为在与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体的制备中使用的、含有序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质(Nectin-2)或者其部分肽，可以使用具有Nectin-2的构成氨基酸序列中至少20个以上、优选50个以上、更优选70个以上、更优选100个以上、最优选200个以上的氨基酸序列的肽等。
而且，用于本发明的抗体的抗原决定簇在作为本申请的基础申请的PCT/JP2006/320429中已有说明。本发明引用PCT/JP2006/320429的记载。
Nectin-2或者其部分肽或其盐可以从前述的人或恒温动物的细胞或组织中采用本身公知的蛋白质纯化方法、或者基于该方法的方法来制造；也可以通过培养含有编码蛋白质的DNA的转化体来制造。此外，还可以依据后述的肽合成方法来制造。此外，Nectin-2的细胞外区与其它蛋白质或肽的融合蛋白质，可以通过培养含有编码该融合蛋白质的DNA的转化体来制造。
(7)-(ii)单克隆抗体的制作 (a)利用杂交瘤法制作单克隆抗体产生细胞 (2)-(i)所述的抗原可以施用于恒温动物。作为免疫方法，可以是能够促使抗体产生的任何方法，优选使用静脉内注射、腹腔内注射、肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、或足垫注射等。可以直接用不溶化制品进行免疫；此外，也可以用将抗原结合或吸附在适当载体上而得的复合体进行免疫。
在施用用于本发明的抗原时，为了提高免疫动物的抗体产生能力，可以将本发明的免疫原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂、Alum、Ribi佐剂等佐剂混合或者制备成乳液，来施用给该动物。施用通常为每2～6周1次、总计进行2～10次左右。此外，制作本发明的单克隆抗体时，可以利用DNA免疫法(参照例如Nature、356卷、152页-154页)。作为可用的恒温动物，可以列举出例如猴、兔、犬、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、骆驼、美洲驼(ラマ)、鸡，优选使用小鼠和大鼠。这些恒温动物可以是野生型的，也可以是KO动物，其中为了获得更强的针对抗原的免疫反应，敲除了抗原蛋白质的该恒温动物直向同源基因。为了制作人单克隆抗体，可以使用敲除了恒温动物的抗体基因而导入了人抗体基因的转基因动物(参照欧州专利公开公报EP0546073)、敲入(ノツクイン)动物(WO 02/098217号公报、WO03/020743号公报)等。
在制作单克隆抗体产生细胞时，可以这样进行从经抗原免疫的恒温动物例如小鼠选择确认了抗体效价的个体，在最终免疫2～5日后取脾脏或淋巴结，将其中所含的抗体产生B细胞与同种或异种动物的骨髓瘤细胞融合，从而制备单克隆抗体产生杂交瘤。作为骨髓瘤细胞，可以列举出例如NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等恒温动物的骨髓瘤细胞，优选使用SP2/0或P3U1。杂交瘤的筛选可以按照本身公知或者基于这些方法的方法进行。
(b)采用其它方法制作单克隆抗体 抗体的制作方法不限于上述方法，例如还可以采用抗体显示技术，该技术将以人或恒温动物(例如猴、兔、犬、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊、骆驼、美洲驼、鸡等)的B淋巴细胞为材料、采用公知方法制作的抗体基因文库展示在噬菌体、大肠杆菌、酵母、动物细胞等细胞表面或核糖体上等〔Nature Biotechnology 23，1105(2005)〕。人或恒温动物可以是未致敏的，也可以是高表达本发明抗原的癌患者或用本发明抗原按(a)所述的方法免疫过的恒温动物。作为展示在细胞表面的抗体的形态，可以列举出IgG分子、IgM分子、Fab片段、单链Fv(scFv)片段等，但不限于此。
与用于本发明的抗原特异性结合的单克隆抗体(片段)的基因，可以通过这样的操作而得到使上述的承载了抗体基因文库的抗体(片段)展示细胞或者抗体(片段)展示核糖体与本发明的抗原反应一定时间，清洗除去非特异性结合物，然后，洗脱回收与本发明的抗原特异性结合的抗体，采用公知方法对其抗体(片段)展示细胞或者抗体(片段)展示核糖体进行增殖，然后重复相同的方法数次，从最终克隆化的抗体(片段)展示细胞或者抗体(片段)展示核糖体中采用公知方法分离所述基因。通过采用公知方法是这样得到的单克隆抗体片段基因与IgG抗体基因的相关区重组，可以得到单克隆IgG抗体基因。
含有与用于本发明的抗体的特定CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的单克隆抗体可以采用基因工程方法得到。
此处，作为与上述用于本发明的抗体的特定CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列(以下称为氨基酸序列A)实质上相同的氨基酸序列，可以列举出与氨基酸序列A具有约50％以上、优选约60％以上、更优选约70％以上、更优选约80％以上、更优选约90％以上、特别优选约95％以上同源性的氨基酸序列等。
氨基酸序列的同源性可以采用同源性计算算法NCBI BLAST(NationalCenter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，按照以下的条件(期望值＝10；允许空位；矩阵＝BLOSUM62；过滤＝OFF)来计算。
此外，作为含有与氨基酸序列A相同或者实质上相同的氨基酸序列的单克隆抗体，其还包含含有例如下述氨基酸序列的抗体等(i)氨基酸序列A中缺失1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5)个)氨基酸而得到的氨基酸序列、(ii)氨基酸序列A中增加1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5)个)氨基酸而得到的氨基酸序列、(iii)氨基酸序列A中插入1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5)个)氨基酸而得到的氨基酸序列、(iv)氨基酸序列A中的1或2个以上(例如1～50个左右、优选1～30个左右、更优选1～10个左右、更优选数个(1～5)个)氨基酸被其它氨基酸取代而得到的氨基酸序列、或(v)组合以上而得到的氨基酸序列。
此外，本发明的抗体还可以这样得到对从人、上述恒温动物分离的抗体产生细胞，利用本发明的抗原，采用本身公知的方法在试管内进行免疫，然后，采用与(a)的记载相同的方法制作杂交瘤。
用于本发明的单克隆抗体可以这样来制造对(a)中所得的单克隆抗体产生杂交瘤，或者人工表达采用公知方法从(a)中所得的单克隆抗体产生杂交瘤分离的抗体基因、或(b)中所得单克隆抗体基因的重组细胞株，进行培养。此外，也可以这样制造采用公知方法将该抗体基因重组到恒温动物、植物的染色体中，在恒温动物的血液、乳汁、卵或植物体、霉菌等中进行生产〔Curr.Opin.Biotevhnol.7，536(1996)、Nature Rev.Genet 4，794(2003)、Appl.Environ.Microbiol.70，2567(2004)〕。作为恒温动物，可以使用例如牛、山羊、绵羊、猪、鸡、小鼠、兔等。此外，作为植物体，可以使用烟草、玉米、马铃薯、浮萍等。
抗体产生杂交瘤的筛选可以采用各种方法进行，可以列举出例如下述方法将可溶性蛋白质抗原、蛋白质抗原表达细胞直接或与载体一起吸附在固相(例如微板)上，向其中添加杂交瘤培养上清，然后使其与放射性物质、酶、荧光物质等标记的抗免疫球蛋白抗体(例如，当用于细胞融合的脾脏细胞来自小鼠时，可以使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白A反应，来检测结合到固相上的单克隆抗体；或者下述方法将抗免疫球蛋白抗体或蛋白A吸附在固相上，向其中添加杂交瘤培养上清，然后使其与放射性物质、酶、荧光物质等标记的可溶性蛋白质抗原反应，来检测结合到固相上的抗原特异性单克隆抗体；等等。当使用蛋白质抗原表达细胞时，通过向该细胞添加杂交瘤培养上清，然后使之与荧光标记抗免疫球蛋白抗体反应，再利用流式细胞仪等荧光检测装置测定该细胞的荧光强度，可以检测结合于该细胞的膜上的蛋白质抗原的单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体，可以从上述含有单克隆抗体原料采用本身公知的方法、例如免疫球蛋白的分离纯化法〔例如盐析法、醇沉淀法、等电点沉淀法、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、反相色谱、凝胶过滤色谱、羟基磷灰石色谱、通过固定化有抗原或者蛋白A、蛋白G等对抗体具有亲和性的物质的载体来仅分离纯化抗体的亲和色谱等各种色谱等〕进行。
(7)-(iii)与本发明的用于乳腺癌预防和/或治疗剂的抗体竞争性结合的抗体的筛选 与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体，可以通过采用测定是否竞争性结合Nectin-2的测定方法进行筛选来得到。
筛选中使用的“Nectin-2”是指序列号1所表示的氨基酸序列(以下简记为Nectin-2α)或序列号3所表示的氨基酸序列(以下简记为Nectin-2δ)(以下将两者合称为Nectin-2或用于本发明的蛋白质)。可以是人或恒温动物细胞或者组织来源的蛋白质，也可以是重组蛋白质。此外，还可以是序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的部分序列所表示的肽，例如可以使用序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的第1-350位(细胞外区)氨基酸序列所表示的肽，序列号1(Nectin-2α)或序列号3(Nectin-2δ)所表示的氨基酸序列的第47-142位(第1IG样域)或第175-240位(第2IG样域)的氨基酸序列所表示的肽，等等。而且，Nectin-2中还包括C末端的羧基被酯化或酰胺化的Nectin-2、N末端的氨基酸残基(例如甲硫氨酸残基)的氨基被保护基保护起来的Nectin-2、N端侧在生物体内被切割而生成的谷氨酸残基发生焦谷氨酸化的Nectin-2、分子内的氨基酸侧链上的取代基被适当保护基保护起来的Nectin-2、或者结合了糖链的糖肽等复合肽等，可以是生理学可接受的酸(例如无机酸、有机酸)或碱(例如碱金属盐)等的盐的形式。
此处，“竞争性结合的抗体”是指竞争性地抑制因过量添加用于本发明的抗体中的任一种而引起的对Nectin-2的结合的抗体。具体地是指下述抗体当将受试抗体用于针对Nectin-2的结合试验时，在相对于该受试抗体添加50倍摩尔量的用于本发明的抗体的情况下，抑制50％以上的该试验抗体针对Nectin-2的结合。
此处，用于本发明的抗体包括嵌合抗体、人化抗体和人抗体。“嵌合抗体”是指具有异种抗体来源的可变区与人抗体恒定区的抗体(参照例如欧州专利公开公报EP0125023等)。“人化抗体”是指对小鼠等不同于人的物种的抗体进行修饰，将除H链和L链的互补性决定部分以外的一级结构更换为人抗体的对应一级结构而得到的抗体。“人抗体”是指使用导入了人抗体基因的转基因动物制备的单克隆抗体(参照欧州专利公开公报EP0546073)、和使用将人抗体基因展示在噬菌体、大肠杆菌、酵母、动物细胞等的细胞表面或核糖体上而得到的文库、即抗体展示技术制备的单克隆抗体(NatureBiotechnology 23，1105(2005))、和由产生抗Nectin-2的抗体的人B细胞通过细胞融合法、噬菌体展示法等技术分离获得的单克隆抗体。用于本发明的抗体为抗体恒定区优选属于人抗体、更优选人IgG、更优选人IgG1亚类的单克隆抗体。
(8)本发明的乳腺癌预防和/或治疗剂 含有上述的用于本发明的抗体或与用于本发明的抗体竞争性地结合Nectin-2的抗体的药物，可以用作乳腺癌的预防和/或治疗剂、利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的乳腺癌预防或治疗剂、抗体依赖性乳腺癌细胞毒剂等。作为利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞损伤方法，可以列举出基于生物体效应细胞的抗体依赖性细胞毒性(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity；ADCC)或补体依赖性细胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity；CDC)，优选可以使用ADCC。
含有用于本发明的抗体或与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体的药物是低毒性的，可以直接以液体剂的形式、或者作为适当剂型的药物组合物，口服或非口服(例如血管内施用、皮下施用等)施用于人或哺乳动物(例如大鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、犬、猴等)。
用于本发明的抗体或与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体，可以施用其本身，也可以适当的药物组合物的形式施用。作为用于施用的药物组合物，可以是包含本发明抗体或其盐以及药理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂的制品。这样的药物组合物可以以适于口服或非口服施用的剂形的形式提供。
作为非口服施用的组合物，可以使用例如注射剂、栓剂等。注射剂中可以包括静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等剂形。这样的注射剂可以采用公知方法来配制。作为注射剂的配制方法，例如可以这样配制将上述本发明的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于通常用于注射剂的无菌水性液或油性液中。作为注射用水性液，可以使用例如生理食盐水、含葡萄糖或其它辅药的等渗液等，可以组合使用适当的助溶剂例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂〔例如Polysorbate80、HCO-50(聚氧乙烯(50mol)混于(adduct)氢化蓖麻油)〕等。作为油性液，可以使用例如芝麻油、大豆油等，作为助溶剂，可以组合使用安息香酸苯甲酯、苯甲醇等。配制好的注射液优选充填在适当的安瓿中。用于直肠施用的栓剂，可以通过将上述抗体或其盐混合在通常的栓剂用基质(基剂)中来配制。
作为用于口服施用的组合物，可以列举出固体或液体剂形，具体地有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片)、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、糖浆剂、乳剂、悬浮剂等。这样的组合物可以采用公知方法来制造，可以含有制剂领域中通常使用的载体、稀释剂或者赋形剂。作为片剂用的载体、赋形剂，可以使用例如乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁。
上述的非口服用或口服用药物组合物优选配制成适于活性成分施用量的给药单位剂形。作为这样的给药单位剂形，可以列举出例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂。作为用于本发明的抗体或与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体的含有量，每给药单位剂形通常为5～500mg，其中，优选注射剂含有5～100mg、其它剂形含有10～250mg的上述抗体。
含有用于本发明的抗体或与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体的上述预防和/或治疗剂、调节剂的施用量因施用对象、对象疾病、症状、施用路径等而异，但例如用于成人乳腺癌的治疗·预防时，适宜静脉注射施用用于本发明的抗体或与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体，作为1次施用量，通常为0.01～20mg/kg体重左右、优选为0.1～10mg/kg体重左右、更优选0.1～5mg/kg体重左右，1日施用1～5次左右、优选1日1～3次左右。其它非口服施用和口服施用时，可以施用以此为基准的量。当症状特别严重时，可以视其症状而增加用量。
用于本发明的抗体或与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体可以以其本身或适当的药物组合物的形式施用。用于上述施用的药物组合物，可以包含上述抗体或其盐以及药理学可接受的载体、稀释剂或者赋形剂。该组合物可以以适于口服或非口服施用(例如血管内注射、皮下注射等)的剂形的形式提供。
而且，上述各组合物中可以含有其它活性成分，只要该活性成分与上述抗体的配合不产生非优选的相互作用。
而且，用于本发明的抗体或与用于本发明的抗体竞争性结合的抗体可以与其它药剂例如烷基化剂(例如环磷酰胺、异磷酰胺等)、代谢拮抗剂(例如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷等)、抗癌性抗生素(例如丝裂霉素、阿霉素等)、植物来源抗癌剂(例如长春新碱、长春花碱酰胺、紫杉醇、多西紫杉醇等)、激素疗法剂(例如他莫昔芬、阿那曲唑、来曲唑等)、铂制剂(例如顺铂、卡铂等)、分子靶标剂(例如赫赛汀、gefitinib、伊马替尼等)、依托泊苷、依立替康等组合使用。用于本发明的抗体和上述药剂可以同时或不同时施用于患者。
(9)本发明还包含以下发明。
即，涉及Nec1-1044-4(FERM BP-10805)、Nec8-3517-11(FERM BP-10806)或Nec8-3704-7(FERM BP-10807)所表示的杂交瘤细胞、Nec1-1044-4(FERMBP-10805)、Nec8-3517-11(FERM BP-10806)或Nec8-3704-7(FERM BP-10807)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体、与Nec1-1044-4(FERM BP-10805)、Nec8-3517-11(FERM BP-10806)或Nec8-3704-7(FERM BP-10807)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合的单克隆抗体、和含有这些单克隆抗体的乳腺癌预防或治疗剂的发明。
这些发明可以按照与上述(6)～(8)记载的实施方式相同的方式实施。
杂交瘤细胞Nec1-1044-4于2007年4月3日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10805。
杂交瘤细胞Nec8-3517-11于2007年4月3日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10806。
杂交瘤细胞Nec8-3704-7于2007年4月3日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10807。
本说明书中，当以省略符号表示碱基或氨基酸等时，其基于IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature的省略符号或者本领域惯用的省略符号，其举例如下。此外，对于氨基酸，当存在光学异性体时，如无特殊说明，为L型。
DNA脱氧核糖核酸 cDNA互补脱氧核糖核酸 A腺嘌呤 T胸腺嘧啶 G鸟嘌呤 C胞嘧啶 RNA核糖核酸 mRNA信使核糖核酸 dATP脱氧腺苷三磷酸 dTTP脱氧胸苷三磷酸 dGTP脱氧鸟苷三磷酸 dCTP脱氧胞苷三磷酸 ATP腺苷三磷酸 EDTA乙二胺四乙酸 SDS十二烷基硫酸钠 Gly甘氨酸 Ala丙氨酸 Val缬氨酸 Leu亮氨酸 Ile异亮氨酸 Ser丝氨酸 Thr苏氨酸 Cys 半胱氨酸 Met甲硫氨酸 Glu谷氨酸酸 Asp天门冬氨酸 Lys赖氨酸 Arg精氨酸 His组氨酸 Phe苯基丙氨酸 Tyr酪氨酸 Trp色氨酸 Pro脯氨酸 Asn天门冬酰胺 Gln谷氨酸 pGlu焦谷氨酸 Sec硒代半胱氨酸(selenocysteine) 本申请说明书序列表的序列号表示以下序列。
〔序列号1〕 Nectin-2α的氨基酸序列。
〔序列号2〕 编码具有序列号1所表示的氨基酸序列的Nectin-2α的DNA的碱基序列。
〔序列号3〕 Nectin-2δ的氨基酸序列。
〔序列号4〕 编码具有序列号3所表示的氨基酸序列的Nectin-2δ的DNA的碱基序列。
〔序列号5〕 Nectin-3的氨基酸序列。
〔序列号6〕 编码具有序列号5所表示的氨基酸序列的Nectin-3的DNA的碱基序列。
〔序列号7〕 参考例1和参考例2中使用的反义寡核苷酸1的碱基序列。
〔序列号8〕 参考例1和参考例2中使用的对照寡核苷酸1的碱基序列。
〔序列号9〕 参考例2中使用的引物1的碱基序列。
〔序列号10〕 参考例2中使用的引物2的碱基序列。
〔序列号11〕 参考例2中使用的TaqMan探针1的碱基序列。
〔序列号12〕 参考例2中使用的引物3的碱基序列。
〔序列号13〕 参考例2中使用的引物4的碱基序列。
〔序列号14〕 参考例2中使用的TaqMan探针2的碱基序列。
〔序列号15〕 参考例3和参考例4中使用的引物5的碱基序列。
〔序列号16〕 参考例3中使用的引物6的碱基序列。
〔序列号17〕 参考例4中使用的引物7的碱基序列。
〔序列号18〕 参考例5中使用的引物8的碱基序列。
〔序列号19〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-1的碱基序列。
〔序列号20〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-1的碱基序列。
〔序列号21〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-2的碱基序列。
〔序列号22〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-2的碱基序列。
〔序列号23〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-3的碱基序列。
〔序列号24〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-3的碱基序列。
〔序列号25〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-4的碱基序列。
〔序列号26〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-4的碱基序列。
〔序列号27〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-5的碱基序列。
〔序列号28〕 参考例5、参考例6和参考例7中使用的siRNA-5的碱基序列。
〔序列号29〕 参考例12中使用的引物33的碱基序列。
〔序列号30〕 参考例12中使用的引物34的碱基序列。
〔序列号31〕 Nectin-2ED-FLAG蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号32〕 编码序列号31所表示的Nectin-2ED-FLAG蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号33〕 参考例15中使用的引物33的碱基序列。
〔序列号34〕 参考例15中使用的引物34的碱基序列。
〔序列号35〕 参考例15中使用的引物35的碱基序列。
〔序列号36〕 参考例15中使用的引物36的碱基序列。
〔序列号37〕 Nectin-2ED-hFc蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号38〕 编码序列号37所表示的Nectin-2ED-hFc蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号39〕 参考例17中使用的肽1的氨基酸序列。
〔序列号40〕 参考例17中使用的肽2的氨基酸序列。
〔序列号41〕 参考例17中使用的肽3的氨基酸序列。
〔序列号42〕 参考例18、和参考例19中使用的引物42的碱基序列。
〔序列号43〕 参考例18、和参考例19中使用的引物43的碱基序列。
〔序列号44〕 参考例18、和参考例19中使用的TaqMan探针3的碱基序列。
〔序列号45〕 参考例21中使用的引物45的碱基序列。
〔序列号46〕 参考例21中使用的引物46的碱基序列。
〔序列号47〕 参考例21中使用的引物47的碱基序列。
〔序列号48〕 参考例21中使用的引物48的碱基序列。
〔序列号49〕 Nectin-3ED-hFc蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号50〕 编码序列号49所表示的Nectin-3ED-hFc蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号51〕 Nectin-3ED-mFc蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号52〕 编码序列号51所表示的Nectin-3ED-mFc蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号53〕 编码参考例25中使用的FLAG蛋白质(FLAG-FSALNOT)的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号54〕 编码参考例25中使用的FLAG蛋白质(FLAG-RSALNOT)的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号55〕 参考例25中使用的引物55的碱基序列。
〔序列号56〕 参考例25中使用的引物56的碱基序列。
〔序列号57〕 Nectin-3ED-FLAG蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号58〕 编码Nectin-3ED-FLAG蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号59〕 参考例29中使用的引物59的碱基序列。
〔序列号60〕 参考例29中使用的引物60的碱基序列。
〔序列号61〕 编码Nectin-1蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号62〕 Nectin-1蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号63〕 参考例29中使用的引物63的碱基序列。
〔序列号64〕 参考例29中使用的引物64的碱基序列。
〔序列号65〕 参考例29中使用的引物65的碱基序列。
〔序列号66〕 参考例29中使用的引物66的碱基序列。
〔序列号67〕 编码Nectin-4蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号68〕 Nectin-4蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号69〕 参考例29中使用的引物69的碱基序列。
〔序列号70〕 参考例29中使用的引物70的碱基序列。
〔序列号71〕 Nec1-5蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号72〕 编码Nec1-5蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号73〕 参考例30中使用的引物73的碱基序列。
〔序列号74〕 参考例30中使用的引物74的碱基序列。
〔序列号75〕 参考例30中使用的引物75的碱基序列。
〔序列号76〕 参考例30中使用的引物76的碱基序列。
〔序列号77〕 参考例30中使用的引物77的碱基序列。
〔序列号78〕 Nectin-2的Ig1域缺陷蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号79〕 编码Nectin-2的Ig1域缺陷蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号80〕 Nectin-2的Ig2域缺陷蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号81〕 编码Nectin-2的Ig2域缺陷蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号82〕 参考例31中使用的引物82的碱基序列。
〔序列号83〕 参考例31中使用的引物83的碱基序列。
〔序列号84〕 参考例31中使用的引物84的碱基序列。
〔序列号85〕 参考例31中使用的引物85的碱基序列。
〔序列号86〕 食蟹猴Nectin-2蛋白质的氨基酸序列。
〔序列号87〕 编码食蟹猴Nectin-2蛋白质的氨基酸序列的DNA的碱基序列。
〔序列号88〕 参考例32中使用的引物88的碱基序列。
〔序列号89〕 参考例32中使用的引物89的碱基序列。
〔序列号90〕 参考例33中使用的引物90的碱基序列。
〔序列号91〕 参考例33中使用的引物91的碱基序列。
〔序列号92〕 参考例33中使用的引物92的碱基序列。
〔序列号93〕 参考例33中使用的引物93的碱基序列。
〔序列号94〕 参考例33中使用的引物94的碱基序列。
〔序列号95〕 参考例33中使用的引物95的碱基序列。
〔序列号96〕 参考例33中使用的引物96的碱基序列。
〔序列号97〕 参考例33中使用的引物97的碱基序列。
〔序列号98〕 参考例34中使用的引物Q37A的碱基序列。
〔序列号99〕 参考例34中使用的引物Q37AR的碱基序列。
〔序列号100〕 参考例34中使用的引物P40G的碱基序列。
〔序列号101〕 参考例34中使用的引物P40GR的碱基序列。
〔序列号102〕 参考例34中使用的引物Q45A的碱基序列。
〔序列号103〕 参考例34中使用的引物Q45AR的碱基序列。
〔序列号104〕 参考例34中使用的引物H55A的碱基序列。
〔序列号105〕 参考例34中使用的引物H55AR的碱基序列。
〔序列号106〕 参考例34中使用的引物V60A的碱基序列。
〔序列号107〕 参考例34中使用的引物V60AR的碱基序列。
〔序列号108〕 参考例34中使用的引物Y64A的碱基序列。
〔序列号109〕 参考例34中使用的引物Y64AR的碱基序列。
〔序列号110〕 参考例34中使用的引物Q71A的碱基序列。
〔序列号111〕 参考例34中使用的引物Q71AR的碱基序列。
〔序列号112〕 参考例34中使用的引物A75G的碱基序列。
〔序列号113〕 参考例34中使用的引物A75GR的碱基序列。
〔序列号114〕 参考例34中使用的引物P76G的碱基序列。
〔序列号115〕 参考例34中使用的引物P76GR的碱基序列。
〔序列号116〕 参考例34中使用的引物A77G的碱基序列。
〔序列号117〕 参考例34中使用的引物A77GR的碱基序列。
〔序列号118〕 参考例34中使用的引物N78A的碱基序列。
〔序列号119〕 参考例34中使用的引物N78AR的碱基序列。
〔序列号120〕 参考例34中使用的引物H79A的碱基序列。
〔序列号121〕 参考例34中使用的引物H79AR的碱基序列。
〔序列号122〕 参考例34中使用的引物Q80A的碱基序列。
〔序列号123〕 参考例34中使用的引物Q80AR的碱基序列。
〔序列号124〕 参考例34中使用的引物N81A的碱基序列。
〔序列号125〕 参考例34中使用的引物N81AR的碱基序列。
〔序列号126〕 参考例34中使用的引物K88A的碱基序列。
〔序列号127〕 参考例34中使用的引物K88AR的碱基序列。
〔序列号128〕 参考例34中使用的引物S95A的碱基序列。
〔序列号129〕 参考例34中使用的引物S95AR的碱基序列。
〔序列号130〕 参考例34中使用的引物K109A的碱基序列。
〔序列号131〕 参考例34中使用的引物K109AR的碱基序列。
〔序列号132〕 参考例34中使用的引物E117A的碱基序列。
〔序列号133〕 参考例34中使用的引物E117AR的碱基序列。
〔序列号134〕 参考例34中使用的引物D122A的碱基序列。
〔序列号135〕 参考例34中使用的引物D122AR的碱基序列。
〔序列号136〕 参考例34中使用的引物H128A的碱基序列。
〔序列号137〕 参考例34中使用的引物H128AR的碱基序列。
〔序列号138〕 参考例34中使用的引物N137A的碱基序列。
〔序列号139〕 参考例34中使用的引物N137AR的碱基序列。
〔序列号140〕 参考例34中使用的引物F145A的碱基序列。
〔序列号141〕 参考例34中使用的引物F145AR的碱基序列。
〔序列号142〕 参考例34中使用的引物K147A的碱基序列。
〔序列号143〕 参考例34中使用的引物K147AR的碱基序列。
〔序列号144〕 参考例34中使用的引物V150A的碱基序列。
〔序列号145〕 参考例34中使用的引物V150AR的碱基序列。
〔序列号146〕 参考例34中使用的引物M153A的碱基序列。
〔序列号147〕 参考例34中使用的引物M153AR的碱基序列。
〔序列号148〕 参考例34中使用的引物T154A的碱基序列。
〔序列号149〕 参考例34中使用的引物T154AR的碱基序列。
〔序列号150〕 参考例35中使用的引物Q165A的碱基序列。
〔序列号151〕 参考例35中使用的引物Q165AR的碱基序列。
〔序列号152〕 参考例35中使用的引物K170A的碱基序列。
〔序列号153〕 参考例35中使用的引物K170AR的碱基序列。
〔序列号154〕 参考例35中使用的引物F173A的碱基序列。
〔序列号155〕 参考例35中使用的引物F173AR的碱基序列。
〔序列号156〕 参考例35中使用的引物P177G的碱基序列。
〔序列号157〕 参考例35中使用的引物P177GR的碱基序列。
〔序列号158〕 参考例35中使用的引物I184A的碱基序列。
〔序列号159〕 参考例35中使用的引物I184AR的碱基序列。
〔序列号160〕 参考例35中使用的引物K186A的碱基序列。
〔序列号161〕 参考例35中使用的引物K186AR的碱基序列。
〔序列号162〕 参考例35中使用的引物L197A的碱基序列。
〔序列号163〕 参考例35中使用的引物L197AR的碱基序列。
〔序列号164〕 参考例35中使用的引物W202A的碱基序列。
〔序列号165〕 参考例35中使用的引物W202AR的碱基序列。
〔序列号166〕 参考例35中使用的引物E206A的碱基序列。
〔序列号167〕 参考例35中使用的引物E206AR的碱基序列。
〔序列号168〕 参考例35中使用的引物T212A的碱基序列。
〔序列号169〕 参考例35中使用的引物T212AR的碱基序列。
〔序列号170〕 参考例35中使用的引物T235A的碱基序列。
〔序列号171〕 参考例35中使用的引物T235AR的碱基序列。
〔序列号172〕 参考例35中使用的引物K239A的碱基序列。
〔序列号173〕 参考例35中使用的引物K239AR的碱基序列。
〔序列号174〕 参考例35中使用的引物A249G的碱基序列。
〔序列号175〕 参考例35中使用的引物A249GR的碱基序列。
〔序列号176〕 实施例19中使用的引物176的碱基序列。
〔序列号177〕 实施例19中使用的引物177的碱基序列。
〔序列号178〕 实施例19中使用的引物178的碱基序列。
〔序列号179〕 实施例19中使用的引物179的碱基序列。
〔序列号180〕 实施例19中使用的引物180的碱基序列。
〔序列号181〕 实施例19中使用的引物181的碱基序列。
〔序列号182〕 实施例19中使用的引物182的碱基序列。
〔序列号183〕 实施例19中使用的引物183的碱基序列。
〔序列号184〕 Nec1-244-3重链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号185〕 Nec1-244-3重链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号186〕 Nec1-244-3重链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号187〕 Nec1-244-3重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号188〕 Nec1-244-3重链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号189〕 Nec1-244-3重链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号190〕 Nec1-244-3重链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号191〕 Nec1-244-3重链可变区的碱基序列。
〔序列号192〕 Nec1-244-3的轻链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号193〕 Nec1-244-3的轻链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号194〕 Nec1-244-3轻链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号195〕 Nec1-244-3的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号196〕 Nec1-244-3轻链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号197〕 Nec1-244-3轻链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号198〕 Nec1-244-3轻链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号199〕 Nec1-244-3的轻链可变区的碱基序列。
〔序列号200〕 Nec1-530-1重链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号201〕 Nec1-530-1重链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号202〕 Nec1-530-1重链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号203〕 Nec1-530-1的重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号204〕 Nec1-530-1重链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号205〕 Nec1-530-1重链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号206〕 Nec1-530-1重链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号207〕 Nec1-530-1的重链可变区的碱基序列。
〔序列号208〕 Nec1-530-1轻链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号209〕 Nec1-530-1轻链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号210〕 Nec1-530-1轻链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号211〕 Nec1-530-1的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号212〕 Nec1-530-1轻链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号213〕 Nec1-530-1轻链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号214〕 Nec1-530-1轻链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号215〕 Nec1-530-1的轻链可变区的碱基序列。
〔序列号216〕 Nec1-554-1重链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号217〕 Nec1-554-1重链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号218〕 Nec1-554-1重链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号219〕 Nec1-554-1的重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号220〕 Nec1-554-1重链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号221〕 Nec1-554-1重链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号222〕 Nec1-554-1重链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号223〕 Nec1-554-1的重链可变区的碱基序列。
〔序列号224〕 Nec1-554-1轻链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号225〕 Nec1-554-1轻链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号226〕 Nec1-554-1轻链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号227〕 Nec1-554-1的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号228〕 Nec1-554-1轻链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号229〕 Nec1-554-1轻链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号230〕 Nec1-554-1轻链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号231〕 Nec1-554-1的轻链可变区的碱基序列。
〔序列号232〕 Nec1-803-2重链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号233〕 Nec1-803-2重链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号234〕 Nec1-803-2重链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号235〕 Nec1-803-2的重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号236〕 Nec1-803-2重链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号237〕 Nec1-803-2重链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号238〕 Nec1-803-2重链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号239〕 Nec1-803-2的重链可变区的碱基序列。
〔序列号240〕 Nec1-803-2轻链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号241〕 Nec1-803-2轻链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号242〕 Nec1-803-2轻链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号243〕 Nec1-803-2的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号244〕 Nec1-803-2轻链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号245〕 Nec1-803-2轻链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号246〕 Nec1-803-2轻链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号247〕 Nec1-803-2的轻链可变区的碱基序列。
〔序列号248〕 Nec1-834-1重链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号249〕 Nec1-834-1重链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号250〕 Nec1-834-1重链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号251〕 Nec1-834-1的重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号252〕 Nec1-834-1重链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号253〕 Nec1-834-1重链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号254〕 Nec1-834-1重链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号255〕 Nec1-834-1的重链可变区的碱基序列。
〔序列号256〕 Nec1-834-1轻链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号257〕 Nec1-834-1轻链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号258〕 Nec1-834-1轻链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号259〕 Nec1-834-1的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号260〕 Nec1-834-1轻链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号261〕 Nec1-834-1轻链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号262〕 Nec1-834-1轻链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号263〕Nec1-834-1的轻链可变区的碱基序列。
〔序列号264〕 Nec1-845-2重链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号265〕 Nec1-845-2重链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号266〕 Nec1-845-2重链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号267〕 Nec1-845-2的重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号268〕 Nec1-845-2重链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号269〕 Nec1-845-2重链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号270〕 Nec1-845-2重链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号271〕 Nec1-845-2的重链可变区的碱基序列。
〔序列号272〕 Nec1-845-2轻链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号273〕 Nec1-845-2轻链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号274〕 Nec1-845-2轻链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号275〕 Nec1-845-2的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号276〕 Nec1-845-2轻链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号277〕 Nec1-845-2轻链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号278〕 Nec1-845-2轻链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号279〕 Nec1-845-2的轻链可变区的碱基序列。
〔序列号280〕 Nec1-903-1重链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号281〕 Nec1-903-1重链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号282〕 Nec1-903-1重链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号283〕 Nec1-903-1的重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号284〕 Nec1-903-1重链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号285〕 Nec1-903-1重链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号286〕 Nec1-903-1重链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号287〕 Nec1-903-1的重链可变区的碱基序列。
〔序列号288〕 Nec1-903-1轻链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号289〕 Nec1-903-1轻链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号290〕 Nec1-903-1轻链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号291〕 Nec1-903-1的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号292〕 Nec1-903-1轻链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号293〕 Nec1-903-1轻链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号294〕 Nec1-903-1轻链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号295〕 Nec1-903-1的轻链可变区的碱基序列。
〔序列号296〕 Nec8-4116-8重链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号297〕 Nec8-4116-8重链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号298〕 Nec8-4116-8重链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号299〕 Nec8-4116-8的重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号300〕 Nec8-4116-8重链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号301〕 Nec8-4116-8重链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号302〕 Nec8-4116-8重链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号303〕 Nec8-4116-8的重链可变区的氨基酸序列。
〔序列号304〕 Nec8-4116-8轻链的CDR1(氨基酸序列)。
〔序列号305〕 Nec8-4116-8轻链的CDR2(氨基酸序列)。
〔序列号306〕 Nec8-4116-8轻链的CDR3(氨基酸序列)。
〔序列号307〕 Nec8-4116-8的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号308〕 Nec8-4116-8轻链的CDR1(碱基序列)。
〔序列号309〕 Nec8-4116-8轻链的CDR2(碱基序列)。
〔序列号310〕 Nec8-4116-8轻链的CDR3(碱基序列)。
〔序列号311〕 Nec8-4116-8的轻链可变区的氨基酸序列。
〔序列号312〕 参考例38中所得的抗体标准品的H链的N末端氨基酸序列。
〔序列号313〕 参考例38中所得的抗体标准品的L链的N末端氨基酸序列。
〔序列号314〕 从与序列号312的氨基酸序列吻合的germline(种系)预测的编码信号序列的N末端的碱基序列。
〔序列号315〕 从与序列号313的氨基酸序列吻合的germline预测的编码信号序列的N末端的碱基序列。
〔序列号316〕 参考例38中使用的引物的碱基序列。
〔序列号317〕 参考例38中使用的引物的碱基序列。
后述实施例1中所得的杂交瘤细胞Nec1-803-2于2005年9月16日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10417。
后述实施例1中所得的杂交瘤细胞Nec1-244-3于2005年10月4日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10423。
后述实施例1中所得的杂交瘤细胞Nec1-530-1于2005年10月4日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10424。
后述实施例1中所得的杂交瘤细胞Nec1-903-1于2005年10月4日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10425。
后述实施例1中所得的杂交瘤细胞Nec1-520-1于2005年10月4日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10426。
后述实施例1中所得的杂交瘤细胞Nec1-845-2于2005年10月4日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10427。
后述实施例1中所得的杂交瘤细胞Nec1-834-1于2005年10月4日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10428。
后述实施例8中所得的杂交瘤细胞Nec1-554-1于2006年9月20日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10681。
后述实施例8中所得的杂交瘤细胞Nec1-769-2于2006年9月20日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10682。
后述实施例8中所得的杂交瘤细胞Nec1-964-1于2006年9月20日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10683。
后述实施例8中所得的杂交瘤细胞Nec1-1302-2于2006年9月20日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10684。
后述实施例8中所得的杂交瘤细胞Nec8-4116-8于2006年9月20日保藏于茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10685。
实施例 以下，通过参考例和实施例对本发明进行更具体的说明，但发明并不受此限定。
参考例1利用Nectin-2α和Nectin-2δ基因的反义寡核苷酸诱导人大肠癌细胞株HT-29的凋亡 设计与Nectin-2α基因的翻译区或者Nectin-2δ基因的内含子区杂交的反义寡核苷酸序列(序列号7)，然后合成硫代磷酸化寡核苷酸，得到了HPLC纯化标准品(以下简称反义寡核苷酸1)。作为对照，同样对具有序列号7所示碱基序列的反向(リバ一ス)序列的寡核苷酸(序列号8)进行硫代磷酸化，得到了HPLC纯化标准品(以下简称对照寡核苷酸1)。
将从American Type Culture Collection(ATCC，美国典型培养物中心)购买的人大肠癌细胞株HT-29悬浮在含有10％胎牛血清(FBS)(JRH公司)的McCoy’s 5A培养基(Invitrogen公司)〔以下有时简称为M5培养基〕中，以每1孔1x104个的细胞密度播种于96孔平底组织培养板(BectonDickinson公司)，在5％二氧化碳气流中于37℃培养一夜。将200ng的反义寡核苷酸1、或200ng的对照寡核苷酸1与Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)0.5μL一起同Opti-MEMI(Invitrogen公司)50μL混合，室温下放置20分钟。将上述HT-29培养细胞的培养上清预先培养基交换成Opti-MEMI50μL，向其中添加全部的上述寡核苷酸混合液，5％二氧化碳气流中37℃继续培养3小时，然后再次培养基交换成M5培养基。再继续培养2日，然后使用Caspase-Glo 3/7 Assay(Promega公司)按附带的规程，测定上述寡核苷酸的凋亡诱导活性。其结果，与对照寡核苷酸1(序列号8)相比，Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的反义寡核苷酸1(序列号7)显示出约1.9倍的凋亡诱导活性，且显示出统计学上显著的差异(P＜0.05)。
参考例2Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的反义寡核苷酸造成人大肠癌细胞株HT-29的Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的mRNA表达量降低 将参考例1所使用的人大肠癌细胞株HT-29悬浮在M5培养基中，以每孔6×104个的细胞密度接种在24孔平底组织培养板(Becton Dickinson公司)上，在5％二氧化碳气流中，在37℃培养一夜，然后按照参考例1的方法将反义寡核苷酸1和对照寡核苷酸1进行转染。但按照细胞接种数的比例将整个添加物量或溶液量放大至6倍。将这些细胞在5％二氧化碳气流中、在37℃下培养24小时，然后使用RNeasy Mini Total RNA Kit(QIAGEN公司)来提取总RNA。以约400ng的总RNA作为模板，使用TaqMan ReverseTranscription Reagents(Applied Biosystems公司)按照附带的规程进行逆转录反应，从而制备cDNA。通过以相当于5ng总RNA的cDNA为模板，加入TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司)7.5μL，引物1(序列号9)和引物2(序列号10)各500nM、FAM标记的TaqMan探针1(序列号11)100nM，反应液量为15μL，然后进行定量PCR，从而测定Nectin-2α基因的表达量。PCR反应如下，即在50℃、2分钟，95℃、10分钟之后，将95℃、15秒，60℃，1分钟的循环重复40次。通过以相当于5ng总RNA的cDNA为模板，加入TaqMan Universal PCR Master Mix7.5μL，引物3(序列号12)和引物4(序列号13)各500nM，FAM标记的TaqMan探针2(序列号14)100nM，反应液量为15μL，与Nectin-2α基因同样地进行定量PCR，从而测定Nectin-2δ基因的表达量。PCR是在50℃、2分钟，95℃、10分钟之后，将95℃、15秒，60℃、1分钟的循环重复40次。使用TaqMan β-actin Control Reagents(Applied Biosystems公司)测定等量的模板cDNA中所含的β-肌动蛋白基因的mRNA表达量，以此作为内标。
在不转染寡核苷酸的情况下，Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的表达量分别为β-肌动蛋白基因表达量的0.15％、0.76％。与此相对，在施用反义寡核苷酸1(序列号7)的组中，Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的表达量分别为β-肌动蛋白基因表达量的0.095％、0.45％，与不转染寡核苷酸的情况相比，确认了统计学上显著(P＜0.01)的表达量低下。另一方面，在作为阴性对照使用的施用对照寡核苷酸1(序列号8)的组中，Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的表达量分别为β-肌动蛋白基因表达量的0.18％、0.76％，与不转染寡核苷酸的情况是等同的。
这些结果与参考例1的结果说明，由于Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的表达量降低而诱发了人大肠癌细胞株HT-29凋亡。
参考例3编码Nectin-2α的cDNA的克隆和碱基序列确定 以人肺癌细胞株A549的Marathon-Ready cDNA(BD Biosciences公司)为模板，使用添加了限制性酶EcoRI的识别序列的引物5(序列号15)、和添加了限制性酶EcoRV的识别序列的引物6(序列号16)来进行PCR。该反应中反应液的组成如下，即上述cDNA 1μL、Pfu Turbo Hotstart DNAPolymerase(STRATAGENE公司)1U、引物5(序列号15)和引物6(序列号16)各1μM、dNTPs 200μM、以及2×GC BufferI(TaKaRa Bio公司)10μL，总计20μL。PCR是在94℃、1分钟之后，将94℃、5秒，72℃、4分钟的循环重复5次，将94℃、5秒，70℃、4分钟的循环重复5次，将94℃、5秒，68℃、4分钟的循环重复35次。接着用PCR Purification Kit(QIAGEN公司)将该PCR产物纯化，然后用限制性酶EcoRI和EcoRV消化。pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)也同样地用限制性酶EcoRI和EcoRV处理，将它们用PCR Purification Kit纯化。将两DNA片段使用DNA LigationKit ver.2(TaKaRa Bio公司)连接，然后导入大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司)，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，结果得到具有编码Nectin-2α蛋白质(序列号1)的cDNA序列(序列号2)的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2α。
参考例4编码Nectin-2δ的cDNA的克隆和碱基序列确定 以人肺癌细胞株A549的Marathon-Ready cDNA(BD Biosciences公司)为模板，使用添加了限制性酶EcoRI的识别序列的引物5(序列号15)、和添加了限制性酶EcoRV的识别序列的引物7(序列号17)来进行PCR。该反应中反应液的组成是使用上述cDNA溶液1μL作为模板、Pfu TurboHotstart DNA Polymerase(STRATAGENE公司)1U、引物5(序列号15)和引物7(序列号17)各1μM、dNTPs 200μM、以及2×GC BufferI(TaKaRaBio公司)10μL，总计20μL。PCR是在94℃、1分钟之后，将94℃、5秒，72℃、4分钟的循环重复5次、将94℃、5秒，70℃、4分钟的循环重复5次，将94℃、5秒，68℃、4分钟的循环重复35次。接着用PCR PurificationKit(QIAGEN公司)将该PCR产物用50μL的水溶解，以此为模板进行PCR反应。该反应中反应液的组成如下，即使用上述PCR产物1μL作为模板，Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 1U、引物5(序列号15)和添加了限制性酶EcoRV的识别序列的引物8(序列号18)各1μM、dNTPs为200μM、并加入2×GC Buffer I 10μL，总计液量为20μL。PCR是在94℃、1分钟之后，将94℃、20秒，60℃、15秒，72℃、2分钟的循环重复25次。接着用PCR Purification Kit将该PCR产物纯化，然后用限制性酶EcoRI和EcoRV消化。同样地，pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)也用限制性酶EcoRI和EcoRV消化。将它们用PCR Purification Kit纯化，将两DNA片段使用DNA LigationKit ver.2(TaKaRa Bio公司)连接，然后导入大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司)，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，结果得到具有编码Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的cDNA序列(序列号4)的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ。
参考例5Nectin-2siRNA造成人大肠癌细胞株HT-29的细胞增殖抑制 将对Nectin-2α基因或Nectin-2δ基因(以下，将它们统称为Nectin-2基因)的mRNA的5种siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、和siRNA-5)等量地混合，从而制作混合物(以下，将该混合物称为Nectin-2-siRNA)。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和siRNA-5是通过分别使2种RNA片段(siRNA-1是使具有序列号19所表示的碱基序列的RNA与具有序列号20所表示的碱基序列的RNA杂交而得的，siRNA-2是使具有序列号21所表示的碱基序列的RNA与具有序列号22所表示的碱基序列的RNA杂交而得的，siRNA-3是使具有序列号23所表示的碱基序列的RNA与具有序列号24所表示的碱基序列的RNA杂交而得的，siRNA-4是使具有序列号25所表示的碱基序列的RNA与具有序列号26所表示的碱基序列的RNA杂交而得的，siRNA-5是使具有序列号27所表示的碱基序列的RNA与具有序列号28所表示的碱基序列的RNA杂交而得)杂交而制作的。作为阴性对照，使用从Dharmacon公司购买的Non-specific Control IX(以下，将它称为non-silencing dsRNA)。
具体地说，将从American Type Culture Collection(ATCC)购买的人大肠癌细胞株HT-29，在含有10％FBS(JRH公司)的M5A培养基中悬浮，以每平板5×105个的细胞密度在10cm组织培养皿(Becton Dickinson公司)上接种。将培养皿在5％二氧化碳气流中、在37℃培养一夜，然后使用胰蛋白酶-EDTA溶液剥离细胞，通过离心分离操作进行回收。将1×106个该HT-29细胞在含有Nectin-2-siRNA 150pmol或non-silencing dsRNA 150pmol的、Cell Line Nucleofector Kit V(Amaxa公司)所附带的solution V 100μL中悬浮，用Nucleofector的程序T-20进行转染，在5％二氧化碳气流中、在37℃培养24小时。将这些细胞在96孔平底组织培养板上以3,000个/孔再次接种，在5％二氧化碳气流中、在37℃培养5天。从各孔除去培养基，然后将板在-80℃冷却5分钟，接下来在室温放置5分钟，从而破坏细胞。接着在各孔中添加含1％PicoGreen(Invitrogen公司)和1％IGEPAL-CA630(ICN公司)的水溶液100μl，在室温放置20分钟，然后使用MultilabelCounter(Perkin Elmer公司)来计算荧光强度(激发波长485nm、发射波长535nm)，从而测定细胞内DNA含量。其结果是，添加Nectin-2-siRNA的组比添加non-silencing dsRNA的组荧光强度降低约38％，两者显示统计学上显著的差异(P＜0.001)。由此明确了，通过添加Nectin-2-siRNA可以显著抑制HT-29细胞株增殖。
参考例6Nectin-2siRNA造成人大肠癌细胞株HT-29的细胞周期变化 将参考例1所使用的人大肠癌细胞株HT-29悬浮在M5A培养基中，以每平板5×105个的细胞密度接种到10cm组织培养皿中。在5％二氧化碳气流中、在37℃培养一夜，然后依据参考例5的方法，转染Nectin-2-siRNA，或者转染non-silencing dsRNA作为阴性对照，在5％二氧化碳气流中、在37℃继续进行24小时培养。将这些细胞在6孔平底组织培养板(BectonDickinson公司)上以2×105个/孔再次接种，在5％二氧化碳气流中、在37℃培养5天。将各孔的培养细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理而进行剥离，然后使用CycleTEST Plus DNA Reagent Kit(Becton Dickinson公司)，通过FACScan(Becton Dickinson公司)分析细胞周期。其结果是，在添加Nectin-2-siRNA的组中，与作为阴性对照使用的添加non-silencing dsRNA的组相比，处于G0/G1期的细胞的比率上升约13％，处于S期的细胞的比率降低约11％。由此说明，Nectin-2-siRNA诱导人大肠癌细胞株HT-29的细胞周期变化。
参考例7Nectin-2siRNA造成人大肠癌细胞株HT-29的Nectin-2mRNA表达量降低 将参考例1所使用的人大肠癌细胞株HT-29悬浮在M5A培养基中，以每平板5×105个的细胞密度接种到10cm组织培养皿中。在5％二氧化碳气流中、在37℃下培养一夜，然后依据参考例5的方法转染Nectin-2-siRNA，或者作为阴性对照转染non-silencing dsRNA，在5％二氧化碳气流中、在37℃培养24小时。将这些细胞进一步使用RNeasy Mini Total RNA Kit(QIAGEN公司)来提取总RNA。以约100ng的总RNA作为模板，使用TaqMan Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems公司)来进行逆转录反应。以相当于10ng总RNA的cDNA作为模板，加入TaqMan UniversalPCR Master Mix(Applied Biosystems公司)5μl，引物1(序列号9)和引物2(序列号10)各500nM、FAM标记的TaqMan探针1(序列号11)100nM，反应液量为10μL，使用定量PCR法，从而测定Nectin-2α基因的mRNA表达量。另一方面，以相当于10ng总RNA的cDNA为模板，加入TaqManUniversal PCR Master Mix 5μL，引物3(序列号12)和引物4(序列号13)各500nM、FAM标记的TaqMan探针2(序列号14)100nM，反应液量为10μL，进行定量PCR，从而测定Nectin-2δ基因的mRNA表达量。PCR是在50℃、2分钟，95℃、10分钟之后，将95℃、15秒，60℃、1分钟的循环重复40次。使用TaqManβ-actin Control Reagents(Applied Biosystems公司)来测定等量的模板cDNA中所含的β-肌动蛋白基因的mRNA表达量，以此作为内标。
在添加Nectin-2-siRNA的组中，与作为阴性对照使用的添加non-silencing dsRNA的组相比，Nectin-2α的mRNA表达量降低69％，Nectin-2δ的mRNA表达量降低73％低下，任一种均可在两者之间发现统计学的显著差异(P＜0.001)。根据这些结果显示，Nectin-2-siRNA诱导Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的mRNA表达量降低。
参考例8人癌组织中Nectin-2mRNA的表达亢进 利用定量PCR法比较研究人癌组织和人正常组织中Nectin-2基因的mRNA表达量。作为PCR的模板，使用cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 1(Cosmo Bio公司)、cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2(Cosmo Bio公司)、Human Colon Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences公司)、Human LungMatched cDNA Pair Panel(BD Biosciences公司)和Human Ovary MatchedcDNA Pair Panel(BD Biosciences公司)。Nectin-2α基因的mRNA表达量的测定是以1μL的cDNA为模板，加入TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems公司)7.5μL，引物1(序列号9)和引物2(序列号10)各500nM，FAM标记的TaqMan探针1(序列号11)100nM，反应液量为15μL。Nectin-2δ基因的mRNA表达量的测定是以1μL的cDNA为模板，加入TaqMan Universal PCR Master Mix 7.5μL，引物3(序列号12)和引物4(序列号13)各500nM，FAM标记的TaqMan探针2(序列号14)100nM，反应液量为15μL。但是，对于cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 1(Cosmo Bio公司)和cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2(Cosmo Bio公司)，模板量为0.2μL。PCR是在50℃、2分钟，95℃、10分钟之后，将95℃、15秒，60℃、1分钟的循环重复40次。另一方面，测定等量的模板cDNA中所含的β-肌动蛋白基因的mRNA表达量，以此为内标。其结果是，人癌组织中Nectin-2α基因的mRNA表达量与人正常组织的表达量相比，在cDNA CeHAT-SDBreast Tumor 1(Cosmo Bio公司)所含的3个供体中分别为1.1倍、10倍、4.3倍，另外在cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2(Cosmo Bio公司)所含的3个供体中分别为12倍、3.5倍、21倍。同样地，Nectin-2α基因的mRNA表达量在Human Colon Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences公司)所含的5个供体的癌组织中分别为正常组织的4.8倍、3.2倍、2.6倍、1.9倍、1.8倍，在Human Lung Matched cDNAPair Panel(BD Biosciences公司)所含的5个供体的癌组织中分别为正常组织的11倍、3.7倍、4.1倍、3.2倍、1.3倍，另外在Human Ovary Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences公司)所含的5个供体中的4人的癌组织中分别为正常组织的1.3倍、1.8倍、2.6倍、2.4倍。癌组织中Nectin-2δ基因的mRNA表达量与正常组织的表达量相比，cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 1(Cosmo Bio公司公司)所含的3个供体中的2人中分别为1.1倍、5.3倍，在cDNA CeHAT-SD Breast Tumor 2(Cosmo Bio公司)所含的3个供体中的2人中分别为2.0倍、2.5倍。同样地，Nectin-2δ基因的mRNA表达量在Human Colon Matched cDNA PairPanel(BD Biosciences公司公司)所含的个供体中的3人的癌组织中分别为正常组织的1.3倍、1.8倍、1.5倍，在Human Lung Matched cDNA Pair Panel(BD Biosciences公司)所含的5个供体中的4人的癌组织中分别为正常组织的4.8倍、3.7倍、1.1倍、1.3倍，另外在Human Ovary Matched cDNA PairPanel(BD Biosciences公司)所含的5个供体中的4人的癌组织中分别为正常组织的4.2倍、2.1倍、2.4倍、4.2倍。根据这些结果可以确认，在癌组织中，与正常组织相比，Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的mRNA表达亢进。
参考例9人癌细胞株中Nectin-2基因的mRNA表达量比较 将骨肉瘤细胞株Saos-2、脑肿瘤细胞株SK-N-MC、SK-N-AS、SK-N-BE、SK-N-DZ、SK-N-FI、SK-N-SH、D341Med、Daoy、DBTRG-05MG、U-118MG、U-87MG、CCF-STTG1、SW 1088、乳腺癌细胞株HCC1937、ZR-75-1、AU565、MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3、BT474、MDA-MB-435s、MDA-MB-436、MDA-MB-468、MDA-MB-175VII、T-47D大肠癌细胞株Caco-2、COLO 201、COLO 205、COLO 320DM、DLD-1、HCT-15、HCT-8、HT-29、LoVo、LS180、LS123、LS174T、NCI-H548、NCI-SNU-C1、SK-CO-1、SW 403、SW 48、SW 480、SW 620、SW 837、SW 948、HCT 116、WiDr、非小细胞肺癌细胞株A549、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H358、NCI-H460、NCI-H522、NCI-H661、NCI-H810、NCI-H1155、NCI-H1299、NCI-H1395、NCI-H1435、NCI-H1581、NCI-H1651、NCI-H1703、NCI-H1793、NCI-H2073、NCI-H2085、NCI-H2106、NCI-H2228、NCI-H2342、NCI-H2347、SK-LU-1、NCI-H2122、SK-MES-1、NCI-H292、小细胞肺癌细胞株NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H889、NCI-H1417、NCI-H1672、NCI-H1836、NCI-H1963、NCI-H2227、NCI-N417、SHP-77、卵巢癌细胞株ES-2、Caov-3、MDAH2774、NIH:OVCAR3、OV-90、SK-OV-3、TOV-112D、TOV-21G、前列腺癌细胞株DU 145、LNCaP、视网膜母细胞瘤细胞株WERI-Rb-1、Y79、精巢癌细胞株Cates-1B(以上从ATCC购买)、大肠癌细胞株COCM1、非小细胞肺癌细胞株VMRC-LCD和前列腺癌细胞株PC3(以上从JapaneseCollection of Research Bioresources(JCRB)购买)，分别按照ATCC或JCRB推荐的培养方法进行培养，使用RNeasy Mini Total RNA Kit(QIAGEN公司)自培养细胞制备总RNA。通过将该总RNA作为模板进行逆转录反应来制备cDNA，然后以该cDNA为模板进行定量的PCR，从而测定Nectin-2基因的mRNA表达量。
以由5ng上述总RNA得到的cDNA为模板，按照参考例2所述的方法将Nectin-2基因的mRNA表达量进行定量。另一方面，测定等量的模板cDNA中所含的β-肌动蛋白基因的mRNA表达量，以此为内标。
各癌细胞株中Nectin-2α基因和Nectin-2δ基因的mRNA表达量以β-肌动蛋白基因的mRNA表达量进行标准化而得的相对表达量示于〔表1〕。明确了，研究的所有癌细胞株中的2株表达大于等于β-肌动蛋白mRNA的1％的Nectin-2αmRNA，另外12株表达大于等于β-肌动蛋白基因的mRNA的1％的Nectin-2δmRNA。
表1 参考例10通过Nectin-2δcDNA免疫来制作兔抗Nectin-2多克隆抗体 委托Genovac公司(日本农产工业(株))，通过使用基因枪的DNA免疫法来制作兔抗Nectin-2多克隆抗体。将重组了编码Nectin-2δ(序列号3)的氨基酸序列的cDNA的动物细胞用表达载体，按照Genovac公司申请的专利文献(WO 00/29442号公报)所述的方法涂布在微粒上，将该微粒使用基因枪免疫2只兔。在确认了通过耳静脉试验采血而得的血清的抗体效价上升之后，在麻醉下进行颈动脉采血，分别得到127mL和115mL的抗血清。
将这些抗血清用PBS2倍稀释，将离心分离的上清液上抗原柱，所述抗原柱是将Nectin-2ED-FLAG蛋白质固定在HiTrap NHS-Activated HP(Amersham Biosciences公司)上而制作的。将该柱用PBS洗涤，然后用含有0.15M NaCl的0.1M Glycine-HCl(pH3)洗脱，将洗脱液迅速用1MTris-HCl(pH8)中和，然后在4℃对PBS透析过夜，从而纯化获得兔抗Nectin-2兔克隆抗体。将这里所得的兔抗Nectin-2多克隆抗体分别命名为N2-R1和N2-R2。
参考例11人癌细胞株中Nectin-2蛋白质的表达量 用流式细胞仪研究人癌细胞中Nectin-2蛋白质的表达量。分别用ATCC推荐的方法培养人癌细胞株、NCI-H1703、HT-29、OV-90、SKBR-3、SK-OV-3、NCI-H2342、TOV-112D、NCI-H2122、NCI-H292、Capan-2、MDA-MB-231、BxPC-3、HCT-8、SK-N-DZ、Caov-3、DU 145、A549、Caco-2、WiDr、ZR-75-1、HCT-15、NCI-H1299、NCI-H2228、BT474(以上，购自ATCC)，使用Stain buffer(BD Biosciences公司)制作细胞悬浮液，使得浓度分别为1×106个/mL。在细胞悬浮液中添加参考例10所制作的兔抗Nectin-2多克隆抗体(N2-R2)，使得其最终浓度为3μg/mL，然后4℃反应1小时。利用同样的方法，添加非免疫兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)，使得其最终浓度为3μg/mL，作为阴性对照。将该细胞悬浮液进行离心分离操作，然后用Stain buffer洗涤，添加Alexa488标记抗兔IgG抗体(Invitrogen公司)，使得其最终浓度为10μg/mL，在4℃反应1小时。将再次用Stain buffer洗涤后的细胞上FACScan(Becton Dickinson公司)，从而测定各细胞的Nectin-2蛋白质表达水平。将N2-R2染色细胞的荧光强度中央值与各细胞株的阴性对照的荧光强度中央值的比示于〔表2〕。由该结果明确了，在来自肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多个癌种的人癌细胞株中，Nectin-2蛋白质高表达。
表2 参考例12重组型Nectin-2细胞外区域-FLAG蛋白质的动物细胞用表达载体的构建 以参考例4所制作的动物细胞用表达载体(pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ)为模板，使用添加了限制性酶EcoRI的识别序列的引物33(序列号29)和添加了限制性酶XhoI的识别序列的引物34(序列号30)来进行PCR。该反应中反应液的组成如下，即pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ10ng、PfuUltra HotstartDNA Polymerase(STRATAGENE公司)2.5U、引物33(序列号29)和引物34(序列号30)各0.2μM、dNTPs 200μM、以及10×Pfu Ultra Buffer(STRATAGENE公司)5μL，总计50μL。PCR是在95℃、2分钟之后，将95℃、30秒，60℃、30秒，72℃、1分15秒的循环重复30次然后进行72℃、10分钟的反应。接着用PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化该PCR产物，然后用限制性酶EcoRI和XhoI消化。同样地，pCMV-Tag4(STRATAGENE公司)也用限制性酶EcoRI和XhoI消化。使用Wizard SV Geland PCR Clean-Up System(Promega公司)纯化各个DNA片段，然后使用Ligation High(TOYOBO公司)使两DNA片段连接。将得到的质粒导入大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司)，在含卡那霉素的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，结果得到了动物细胞用表达载体pCMV-Tag4-Nectin-2ED-FLAG，其具有编码在Nectin-2δ蛋白质的细胞外区(序列号3所表示的Nectin-2δ的氨基酸序列第1位～第361位)的C末端融合了FLAG标签的Nectin-2ED-FLAG蛋白质(序列号31)的cDNA序列(序列号32)。
参考例13重组型Nectin-2ED-FLAG蛋白质的制备 使用FreeStyle293表达系统(Invitrogen公司)来制备由参考例12所制作的动物细胞用表达载体(pCMV-Tag4-Nectin-2ED-FLAG)所编码的Nectin-2ED-FLAG蛋白质。具体地说，使用293fectinTM(Invitrogen公司)将动物细胞用表达载体pCMV-Tag4-Nectin-2ED-FLAG转染293F细胞株，将该细胞在8％二氧化碳气流中、在37℃旋转培养3天。将离心分离细胞悬浮液而得的培养上清使用0.45μm的过滤器进行过滤，然后上用磷酸缓冲生理盐水(PBS)平衡之后的抗FLAG抗体柱(Sigma公司)。用PBS洗涤柱，然后用含有浓度为0.1mg/mL的FLAG肽的PBS洗脱Nectin-2ED-FLAG蛋白质。将该洗脱馏分使用Vivaspin(VIVA SCIENCE公司)进行超浓缩，然后使用以PBS平衡后的凝胶过滤柱PD-10(Amersham Biosciences公司，公司名变更为GE Healthcare公司)除去混入的FLAG肽，再次进行浓缩而获得高纯度的重组型Nectin-2ED-FLAG蛋白质。
参考例14兔抗Nectin-2多克隆抗体的制作 以参考例13所制备的重组型Nectin-2ED-FLAG蛋白质作为免疫原，来制作兔抗Nectin-2多克隆抗体。将Nectin-2ED-FLAG蛋白质的PBS溶液与弗氏完全佐剂等量混合而制作的乳液，免疫3只家兔(日本白色种，雌性，3kg)的背部皮下和皮内，每只各免疫0.1mg Nectin-2ED-FLAG蛋白质。在第2次以后的免疫中使用弗氏不完全佐剂同样地来制备蛋白质乳液，每隔2周追加免疫，共免疫7次。
在免疫之前以及第4次目和第6次免疫1周之后，从耳静脉进行试验采血、使用涂布了Nectin-2ED-FLAG蛋白质的酶标板通过ELISA来确认血清抗体效价上升。在最终免疫的1周之后用3只兔在麻醉下进行颈动脉采血，分别获得78.9ml、78.2ml、78.8ml的抗血清。
将这些抗血清用PBS稀释2倍并进行离心分离，将得到的上清液上抗原柱，该抗原柱是将Nectin-2ED-FLAG蛋白质固定在HiTrap NHS-ActivatedHP(Amersham Biosciences公司，公司名变更为GE Healthcare公司)上而制得的。将柱用PBS洗涤，然后用含0.15M NaCl的0.1M Glycine-HCl(pH3)洗脱，用1M Tris-HCl(pH8)迅速中和洗脱液，然后在4℃对PBS透析过夜，从而获得兔抗Nectin-2多克隆抗体(N2-No.1、N2-No.2和N2-No.3)。
参考例15重组型Nectin-2细胞外区域-Fc蛋白质的动物细胞用表达载体的构建 (1)人IgG1-Fc片段基因的克隆 以来自人脾脏的Marathon-Ready cDNA(BD BIOSCIENCES公司)为模板，使用添加了限制性酶EcoRI的识别序列的引物33(序列号33)和添加了限制性酶XhoI的识别序列的引物34(序列号34)来进行PCR。该反应中反应液的组成如下，即上述cDNA 1μL、Pfu Turbo Hotstart DNAPolymerase(STRATAGENE公司)1U、引物33(序列号33)和引物34(序列号34)各1μM、dNTPs 200μM、以及2×GC Buffer I(TaKaRa Bio公司)10μL，总计20μL。PCR反应如下，即在95℃、1分钟之后，将95℃、20秒，60℃、15秒，72℃、2分钟的循环重复30次。接着用PCR PurificationKit(QIAGEN公司)纯化该PCR产物，用限制性酶EcoRI和XhoI消化。同样地，pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)也用限制性酶EcoRI和XhoI消化。将它们用PCR Purification Kit纯化，使用DNA Ligation Kit ver.2(TaKaRa Bio公司)连接两DNA片段，然后导入大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司)中，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，从而得到动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-hFc，其具有编码人IgG1的Fc区的cDNA序列。
(2)Nectin-2细胞外区域-人Fc嵌合蛋白质表达载体的构建 以参考例4所制作的pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ为模板，使用添加了限制性酶HindIII的识别序列的引物35(序列号35)和添加了限制性酶EcoRI的识别序列的引物36(序列号36)来进行PCR。该反应中反应液的组成如下，即pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ10ng、Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase2.5U、引物35(序列号35)和引物36(序列号36)各0.2μM、dNTPs 200μM、2×GC BufferI 10μL，总计20μL。PCR如下，即在95℃、1分钟之后，将95℃、20秒，60℃、15秒，72℃、2分30秒的循环重复35次。将反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)纯化，并用限制性酶HindIII和EcoRI消化。同样地，pcDNA3.1(+)-hFc也用限制性酶HindIII和EcoRI消化。使用DNA Ligation Kit ver.2连接两DNA片段，然后导入大肠杆菌TOP10，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，结果得到动物细胞用表达载体(pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-hFc)，其具有编码融合了Nectin-2δ蛋白质的细胞外区域(序列号3所表示的Nectin-2δ的氨基酸序列的第1位～第350位)和人IgG1的Fc区的蛋白质(序列号37)的cDNA序列(序列号38)。
参考例16重组型Nectin-2ED-Fc蛋白质的制备 使用FreeStyle293表达系统(Invitrogen公司)，制备由参考例15所制作的动物细胞用表达载体(pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-hFc)编码的Nectin-2ED-hFc蛋白质。具体地说，使用293fectinTM(Invitrogen公司)将pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-hFc转染293F细胞株，在8％二氧化碳气流中、在37℃旋转培养3天。将细胞悬浮液离心分离而得的培养上清使用0.22μm的过滤器进行过滤，然后上用PBS平衡的rProteinA Sepharose FF柱(AmershamBiosciences公司，公司名变更为GE Healthcare公司)。用PBS洗涤柱，然后用含0.15M NaCl的0.1M Glycine-HCl (pH 3.5)洗脱，用1M Tris-HCl(pH 8)迅速中和洗脱液。将Nectin-2ED-hFc洗脱馏分在4℃对PBS透析过夜，然后使用Amicon Ultra15 30MWCO(MILLIPORE公司)进行超浓缩し，从而获得重组型Nectin-2ED-Fc蛋白质。
参考例17使用肽抗原来制作兔抗Nectin-2多克隆抗体 基于Nectin-2α蛋白质(序列号1)和Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的氨基酸序列，合成由15个氨基酸构成的以下3种肽(肽1～3)。
肽1的氨基酸序列 〔Cys-Lys-Met-Gly-Pro-Ser-Phe-Pro-Ser-Pro-Lys-Pro-Gly-Ser-Glu (序列号39)〕是Nectin-2α蛋白质(序列号1)和Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的第88位～第101位的氨基酸序列的N末端添加了Cys残基的序列。
肽2的氨基酸序列 〔Arg-Glu-Thr-Pro-Arg-Ala-Ser-Pro-Arg-Asp-Val-Gly-Pro-Leu-Cys (序列号40)〕是在Nectin-2α蛋白质(序列号1)的第347位～第360位的氨基酸序列的C末端添加了Cys残基的序列。
肽3的氨基酸序列 〔Cys-Thr-Leu-Gly-Ala-Ser-Glu-His-Ser-Pro-Leu-Lys-Thr-Pro-Tyr (序列号41)〕是在Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的第426位～第439位的氨基酸序列的N末端添加了Cys残基的序列。
使上述肽1、肽2和肽3分别与作为载体蛋白质的马来酰亚胺化Keyholelimpet hemocyanin(KLH)(Pierce公司)进行化学键合，并作为免疫原。免疫动物使用雄性兔KBL:JW(年龄11周，北山ラベス)，初次在背部皮下免疫含有上述免疫原与弗氏完全佐剂(Difco公司)的乳液，第2次以后在背部皮下免疫含有相同免疫原与弗氏不完全佐剂(Difco公司)的乳液，蛋白量分别为各0.5mg，每隔2周进行免疫，总计免疫4次。初次免疫之后第52天，将各兔在麻醉下进行颈动脉采血，分别从免疫了肽1、肽2或肽3的兔得到70ml、66ml、72ml的抗血清。从这样得到的抗血清中利用硫酸铵沉淀法来浓缩免疫球蛋白馏分，用蛋白A亲和柱(Amersham Biosciences公司，公司名变更为GE Healthcare公司)纯化，从而得到IgG抗体馏分。将这样得到的IgG抗体上将各肽通过Cys残基偶联在Sepharose柱(Amersham Biosciences公司公司名变更为GE Healthcare公司)上而得的固定化柱。将柱用PBS洗涤，然后使用含8M尿素的PBS来洗脱肽特异性抗体。将这些洗脱液对PBS进行透析而除去尿素，然后通过超浓缩、过滤器过滤灭菌，从而获得对肽1、肽2和肽3的兔抗Nectin-2多克隆抗体纯化标准品(AS-2704、AS-2705和AS-2706)。
参考例18稳定表达重组型全长Nectin-2δ的NS0细胞株的建立 建立稳定地表达Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的NS0细胞株。为了获得动物细胞用表达载体pEE12.4-Nectin-2δ，将参考例4所制作的pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ用限制性酶EcoRI和EcoRV消化。同样地，将动物细胞表达载体pEE12.4(Lonza Biologics公司)用限制性酶EcoRI和SmaI消化。将它们进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的片段，用MinElute Gel ExtractionKit(QIAGEN公司)纯化，使用Ligation High(TOYOBO公司)连接两DNA片段，然后导入Competent high DH5α(TOYOBO公司)中，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。将增殖的大肠杆菌菌落用含氨苄西林的LB培养基进行培养，用QIAfilter Plasmid Maxi kit(QIAGEN公司)自离心而回收的菌体来制备质粒。将质粒用限制性酶EcoRI消化，然后用琼脂糖凝胶电泳确认插入了Nectin-2δ基因，从而得到动物细胞用表达载体pEE12.4-Nectin-2δ，其具有编码Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的cDNA序列(序列号4)。使用Gene Pulsar(Bio-Rad公司)将通过限制性酶(PvuI)消化而线性化的pEE12.4-Nectin-2δ40μg转染(250V，400μF)到NS0细胞(2×107个)中。使该细胞重悬浮到含有10％透析FBS(Invitrogen公司)和2mM L-谷氨酸的DMEM培养基(JRH公司)中，并接种在96孔平底组织培养板上，使得16块板每孔为8,000个/50μL，20块板每孔为2,000个/50μL，40块板每孔为400个/50μL。将它们在8％二氧化碳气流中、在37℃培养24小时，然后在各孔中各加入含10％透析FBS和GS supplement(JRH公司)的GS选择DMEM培养基(JRH公司)150μL，在8％二氧化碳气流中、在37℃继续培养3～4周。将在上述选择培养基中增殖的菌落重新接种在24孔平底组织培养板上，使用RNeasy 96Kit(QIAGEN公司)从增殖的细胞提取总RNA，然后使用TaqMan One Step PCR Master Mix Reagents Kit(Applied Biosystems公司)进行定量PCR，从而选择高表达Nectin-2δmRNA的细胞株。定量PCR的反应液如下，即以100ng总RNA为模板，加入2×Master Mix(AppliedBiosystems公司)25μL、40×MultiScribe(Applied Biosystems公司)1.25μL、引物42(序列号42)和引物43(序列号43)各50nM、FAM标记的TaqMan探针3(序列号44)50nM，反应液量为50μL。PCR如下，即在48℃、30分钟，95℃、10分钟之后，将95℃、15秒，60℃、1分钟的循环重复40次。其结果选择获得了高表达Nectin-2δ基因的mRNA的NS0细胞12株。
通过使用参考例17所制作的兔抗Nectin-2肽多克隆抗体(AS-2704)的流式细胞仪来比较这12株的Nectin-2δ蛋白质表达量，从而选择获得了尤其高表达Nectin-2δ蛋白质的NS0细胞株(#2-75)。
参考例19稳定表达重组型全长Nectin-2δ的FM3A细胞株的建立 建立稳定地表达Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的FM3A细胞株。为了获得动物细胞用表达载体pEF1-Nectin-2δ，将参考例4所制作的pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ用限制性酶EcoRI和EcoRV消化。同样地，将动物细胞表达载体pEF1/myc-HisA(Invitrogen公司)用限制性酶EcoRI和EcoRV消化。将它们用PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化，使用DNA LigationKit ver.2(TaKaRa Bio公司)连接两DNA片段，然后导入Competent highJM109(TOYOBO公司)中，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。将增殖的大肠杆菌菌落用含氨苄西林的LB培养基进行培养，用QIAprepTurbo Miniprep Kit(QIAGEN公司)离心而回收的菌体来制备质粒。将质粒用限制性酶EcoRI和EcoRV消化，然后用琼脂糖凝胶电泳来确认插入了Nectin-2δ基因，从而得到动物细胞用表达载体pEF1-Nectin-2δ，其具有编码Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的cDNA序列(序列号4)。
使用Gene Pulsar(Bio-Rad公司)将pEF1-Nectin-2δ40μg转染FM3A细胞(1×107个)。将该细胞重悬浮到含10％FBS(Invitrogen公司)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)中，在5％二氧化碳气流中、在37℃培养18小时。使该导入基因的细胞重悬浮到添加了10％FBS和1mg/mLGeneticine(Invitrogen公司)的RPMI1640培养基中，并接种在96孔平底组织培养板上，使得每孔1,000个/200μL、100个/200μL的板各20块，在5％二氧化碳气流中、在37℃继续培养1～2周。将在上述选择培养基中增殖的菌落再次接种到24孔平底组织培养板上，使用RNeasy 96Kit(QIAGEN公司)从增殖的细胞提取总RNA，然后使用TaqMan One Step PCR Master MixReagents Kit(Applied Biosystems公司)进行定量PCR，从而选择高表达Nectin-2δmRNA的细胞株。定量PCR的反应液如下，即以总RNA 100ng为模板，加入2×Master Mix(Applied Biosystems公司)25μL、40×MultiScribe(Applied Biosystems公司)1.25μL、引物1(序列号9)和引物2(序列号10)各50nM、FAM标记的TaqMan探针1(序列号11)50nM，反应液量为50μL。PCR反应如下，即在48℃、30分钟，95℃、10分钟之后，将95℃、15秒，60℃、1分钟的循环重复40次。其结果选择获得了高表达Nectin-2δ基因的mRNA的FM3A细胞7株。
通过使用参考例17所制作的兔抗Nectin-2肽多克隆抗体(AS-2704)的流式细胞仪来比较这7株Nectin-2δ蛋白质表达量，选择获得尤其高表达Nectin-2δ蛋白质的FM3A细胞株(#58、#60)。并且使这些细胞株重新悬浮在上述选择培养基中，并接种在96孔平底组织培养板上，使得每孔3个/200μL、1个/200μL、0.3个/200μL的平板各1块，在5％二氧化碳气流中、在37℃继续培养。将作为单菌落而增殖的细胞株的一部分供给上述的流式细胞仪，选择获得Nectin-2δ蛋白质表达量较高的克隆(#60-6)。
参考例20稳定表达重组型全长Nectin-2δ的CHO-K1细胞株的建立 建立稳定地表达Nectin-2δ蛋白质(序列号3)的CHO-K1细胞株。通过限制性酶PvuI消化将参考例18所构建的Nectin-2δ动物细胞用表达载体(pEE12.4-Nectin-2δ)进行线性化，使用Gene Pulsar将40μg转染CHO-K1细胞(1×107个)。使该细胞重新悬浮到含10％透析FBS(Invitrogen公司)和GSsupplement(JRH公司)的DMEM培养基(JRH公司)中，接种到40块96孔平底组织培养板上，使得每孔为2,500个/50μL。在5％二氧化碳气流中、在37℃培养24小时，然后在各20块中分别加入含有33.3μM或66.6μM MSX(ICN公司)的上述培养基150μL，在5％二氧化碳气流中、在37℃继续培养3～4周。将在上述选择培养基中增殖的菌落再次接种到24孔平底组织培养板上，使用RNeasy 96Kit(QIAGEN公司)从增殖的细胞获得总RNA，以此为模板来进行逆转录反应。并且以该反应产物为模板进行定量PCR，从而选择获得高表达Nectin-2δ的mRNA的上位60株。
通过使用参考例17所制作的兔抗Nectin-2肽多克隆抗体(AS-2704)的流式细胞仪来比较这60株的Nectin-2δ蛋白质表达量，从而选择获得高表达Nectin-2δ蛋白质的CHO-K1细胞株(43-2)。
参考例21重组型Nectin-3细胞外区域-Fc蛋白质的动物细胞用表达载体的构建 (1)小鼠IgG2a、Fc片段的克隆 以来自小鼠脾脏的Marathon-Ready cDNA(BD Biosciences公司)为模板，使用添加了限制性酶EcoRI的识别序列的引物45(序列号45)和添加了限制性酶XhoI的识别序列的引物46(序列号46)来进行PCR反应。该反应中反应液的组成如下，即加入上述cDNA 1μL、Pfu Turbo Hotstart DNAPolymerase(STRATAGENE公司)1U、引物45(序列号45)和引物46(序列号46)各1μM、dNTPs 200μM以及2×GC BufferI(TaKaRa Bio公司)10μL，总计液量为20μL。PCR如下，即在95℃、1分钟之后，将95℃、20秒，60℃、15秒，72℃、2分钟的循环重复30次。接着用PCR PurificationKit(QIAGEN公司)纯化该PCR产物，用限制性酶EcoRI和XhoI消化。同样地，pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)也用限制性酶EcoRI和XhoI消化。将它们用PCR Purification Kit纯化，使用DNA Ligation Kit ver.2(TaKaRa Bio公司)来连接两DNA片段，然后导入大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司)中，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，结果得到动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-mFc，其具有编码小鼠IgG2a的Fc区的cDNA序列。
(2)Nectin-3细胞外区-人Fc嵌合蛋白质表达载体的构建 以来自人肺癌细胞株A549的Marathon-Ready cDNA(BD Biosciences公司)为模板，使用添加了限制性酶HindIII的识别序列的引物47(序列号47)和添加了限制性酶EcoRI的识别序列的引物48(序列号48)来进行PCR。该反应中反应液的组成如下，即加入上述cDNA 1μL、Pfu Turbo HotstartDNA Polymerase 2.5U、引物47(序列号47)和引物48(序列号48)各1μM、dNTPs 200μM、以及2×GC BufferI(TaKaRa Bio公司)25μL，总计液量为50μL。PCR如下，即在95℃、1分钟之后，将95℃、20秒，60℃、15秒，72℃、2分钟的循环重复35次。将该PCR产物用PCR Purification Kit纯化，然后用限制性酶HindIII和EcoRI消化。同样地，将参考例15所制作的pcDNA3.1(+)-hFc用限制性酶HindIII和EcoRI消化。将反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)进行纯化。使用DNA Ligation Kit ver.2来连接两DNA片段，然后导入大肠杆菌TOP10中，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，结果得到动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-3ED-hFc，其具有编码融合了Nectin-3蛋白质的细胞外区域(序列号5所表示的Nectin-3的氨基酸序列的第1位～第404位)和人IgG1的Fc区的蛋白质(序列号49)的cDNA序列(序列号50)。
(3)Nectin-3细胞外区-小鼠Fc嵌合蛋白质表达载体的构建 将(2)所得的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-3ED-hFc用限制性酶HindIII和EcoRI消化，并用琼脂糖凝胶电泳分离，然后切下编码Nectin-3蛋白质的细胞外区域的DNA片段，使用Gel Extraction Kit进行纯化。同样地，将(1)所得的pcDNA3.1(+)-mFc用限制性酶HindIII和EcoRI消化，并将反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用Gel Extraction Kit进行纯化。使用DNA Ligation Kit ver.2来连接两DNA片段，然后导入大肠杆菌TOP10，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，结果得到动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-3ED-mFc，其具有编码融合了Nectin-3蛋白质的细胞外区域(序列号5所表示的Nectin-3的氨基酸序列的第1位～第404位)和小鼠的Fc区的蛋白质(序列号51)的cDNA序列(序列号52)。
参考例22重组型Nectin-3ED-mFc蛋白质的制备 使用FreeStyle293表达系统(Invitrogen公司)制备了参考例21中制作的pcDNA3.1(+)-Nectin-3ED-mFc所编码的Nectin-3ED-mFc蛋白质。具体地，对于293F细胞系，使用293Fectin(Invitrogen公司)转染pcDNA3.1(+)-Nectin-3ED-mFc，在8％二氧化碳气流中、37℃旋动培养3日。离心分离细胞悬浮液，将所得培养上清液用0.22μm滤膜进行过滤，然后上样到PBS平衡化的rProteinA Sepharose FF柱(Amersham Biosciences公司公司名已变更为GE Healthcare公司)。用PBS清洗柱，然后用含有0.15MNaCl的0.1M甘氨酸-HCl(pH 3.5)洗脱，将洗脱液迅速用1M Tris-HCl(pH 8)中和。将Nectin-3ED-Fc洗脱级分用PBS于4℃透析过夜，然后使用AmiconUltra15 30MWCO(MILLIPORE公司)进行超浓缩，得到了重组型Nectin-3ED-mFc蛋白质。
参考例23抗Nectin-2兔多克隆抗体的纯化 为了减少免疫组织染色(IHC)时的非特异反应，将参考例14中制作的抗Nectin-2兔多克隆抗体N2-No.2上样于将参考例26中制作的Nectin-3ED-FLAG蛋白质固定化在HiTrap NHS-Activated HP(GE Healthcare公司)上而制作成的Nectin-3ED-FLAG柱，除去与FLAG标签结合的抗体级分。将直接通过上述柱的Nectin-2特异性兔多克隆抗体级分作为N2-No.2-2回收，将其用于IHC实验。
参考例24人癌组织中Nectin-2蛋白质的表达亢进 通过IHC研究了人癌组织中Nectin-2蛋白质的表达。具体地，对人乳腺癌组织阵列(Cybrdi公司)、人卵巢癌组织阵列(Cybrdi公司)、和人正常组织阵列(Biomax公司)人进行脱石蜡处理后，将其浸渍在抗原活化(抗原賦活化)溶液(DAKO公司)中，用高压灭菌器121℃处理15分钟。然后，将这些组织阵列用水清洗，再用3％过氧化氢水于室温处理7.5分钟，用PBS清洗后，使用山羊血清(Vectastain公司)于室温进行20分钟封闭反应。除去山羊血清后，使用含有参考例23中纯化的1μg/mL的N2-No.2-2的抗体稀释缓冲液(DAKO公司)于4℃反应一夜。用PBS清洗阵列后，使用ENVISION+(DAKO公司)于室温反应30分钟。再次用PBS清洗，将含0.01％过氧化氢水的DAB基质(Merck公司)溶液添加到组织阵列中，室温反应3分钟。其后，用水清洗，在苏木精中浸渍1分钟，进行脱水处理。用显微镜观察点样于各阵列的组织，结果可知Nectin-2蛋白质在癌组织中显著地表达亢进，其比例如表2A和表2B所示。
表2A 乳房组织(Breast tissues) 表2B 卵巢组织(Ovarian Tissues)
参考例25重组型Nectin-3细胞外区-FLAG蛋白质的动物细胞用表达载体的构建 在制作重组型Nectin-3细胞外区-FLAG蛋白质的动物细胞用表达载体时，首先，构建能够附加FLAG标签序列的载体。具体地，将5’末端磷酸化的2种合成DNA、FLAG-FSALNOT(序列号53)或者FLAG-RSALNOT(序列号54)用TE(1mM EDTA含有Tris-HCl(pH 8))稀释，使其为50μM，然后等量混合，95℃加热10分钟后缓慢冷却进行退火。然后，将动物细胞用表达载体pCI-neo(Promega公司)用限制性酶NheI和NotI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，用Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)抽提载体片段。将该限制性酶处理后的pCI-neo与退火后的上述合成DNA混合，使用Ligation High(TOYOBO公司)进行连接反应，构建了附加了FLAG标签序列的动物发细胞表达用载体pCI-FLAG。
然后，以参考例21中制作的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-3ED-hFc为模板，使用附加了限制性酶SalI的识别序列的引物55(序列号55)、和附加了限制性酶NheI的识别序列的引物56(序列号56)进行PCR反应。该反应中反应液的组成为以pcDNA3.1(+)-Nectin-3ED-hFc为模板，Pyrobest DNA Polymerase(Takara Bio公司)2.5U、引物55(序列号55)和引物56(序列号56)各0.5μM、dNTPs200μM、和10x Pyrobest Buffer II(Takara Bio公司)5μL，体系合计为50μL。PCR反应条件为94℃/2分钟，然后(94℃/30秒、60℃/30秒、68℃/1.5分钟)进行30个循环，然后68℃/2分钟。然后，将该PCR产物使用PCRPurification Kit(QIAGEN公司)纯化后，用限制性酶SalI和NheI进行消化。同样地，将上述pCI-FLAG用限制性酶SalI和NheI进行消化。使用PCRPurification Kit对两DNA片段进行纯化后，使用Ligation High(TOYOBO公司)将两DNA片段连接起来。将所得反应物导入大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司)，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有下述cDNA序列(序列号58)的动物细胞用表达载体pCI-Nectin-3ED-FLAG，所述cDNA序列编码Nectin-3蛋白质(序列号5)氨基酸序列的第1位～第404位的C末端与FLAG标签融合而得到的Nectin-3ED-FLAG蛋白质(序列号57)。
参考例26重组型Nectin-3ED-FLAG蛋白质的制备 使用FreeStyle293表达系统(Invitrogen公司)制备了参考例25中制作的动物细胞用表达载体(pCI-Nectin-3ED-FLAG)所编码的Nectin-3ED-FLAG蛋白质。具体地，使用293Fectin(Invitrogen公司)，以动物细胞用表达载体pCI-Nectin-3ED-FLAG转染293F细胞系，将该细胞在8％二氧化碳气流中、37℃旋动培养3日。对细胞悬浮液进行离心分离，将所得培养上清用0.45μm滤膜进行过滤，然后上样到用含0.3M NaCl的0.1M Tris-HCl(pH 7.5)平衡的抗FLAG抗体柱(Sigma公司)。用含0.3M NaCl的0.1M Tris-HCl(pH 7.5)清洗柱，然后用含0.1mg/mL浓度的FLAG肽的同缓冲液洗脱Nectin-3ED-FLAG蛋白质。将洗脱级分使用Amicon Ultra 15(30K MWCO)(Millipore公司)进行超浓缩，然后上样到用PBS平衡的PD-10Desaltingcolumn(GE Healthcare公司)，除去混入的FLAG肽，再次进行浓缩，得到了高纯度的重组型Nectin-3ED-FLAG蛋白质。
参考例27抗Nectin-3兔多克隆抗体的制作 以参考例26中制备的重组型Nectin-3ED-FLAG蛋白质为免疫原，制作了抗Nectin-3兔多克隆抗体。将Nectin-3ED-FLAG蛋白质的PBS溶液与弗氏完全佐剂(Difco公司)等量混合，制作成乳液，用该乳液免疫2只家兔(日本白色种，雌，3kg)的背部皮下和皮内，每1只以Nectin-3ED-FLAG蛋白质计免疫0.1mg。第2次以后的免疫中，相似地制备使用弗氏不完全佐剂(Difco公司)的相同蛋白质乳液，每2周免疫7次。
免疫前、以及第4次和第6次免疫1周后，从耳静脉试验采血，通过使用了覆盖Nectin-3ED-FLAG蛋白质的免疫板的ELISA，确认了血清抗体效价的上升。最终免疫1周后，在麻醉下从2只兔的颈动脉采血，分别得到了78.9ml、78.8ml的抗血清。
将这些抗血清用PBS稀释2倍，进行离心分离，将上清液上样到将Nectin-3ED-FLAG蛋白质固定化在HiTrap NHS-Activated HP(GE Healthcare公司)上而制作成的抗原柱。将柱用PBS清洗后，用含0.15M NaCl的0.1M甘氨酸-HCl(pH 3)洗脱，将洗脱液迅速用1M Tris-HCl(pH 8)中和后，用PBS于4℃透析过夜，得到了抗Nectin-3兔多克隆抗体(N3-No.1和N3-No.3)。
参考例28抗Nectin-2人单克隆抗体的大量制备 对于In vivo抗肿瘤活性测定中使用的11种抗Nectin-2人单克隆抗体，从该抗体产生杂交瘤(Nec1-803-2、Nec1-964-1、Nec1-303-2、Nec1-554-1、Nec1-1302-2、Nec1-769-2、Nec1-1305-1、Nec1-141-3、Nec1-209-2、Nec1-909-1和Nec1-847-2)进行制备。以下示例出典型的制备方法。将上述杂交瘤细胞系在含10％FBS，Ultra-Low IgG(Invitrogen公司)的IH培养基(Iscove’sModified Dulbecco’s Medium∶Ham’s F-12＝1∶1、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液、1mM丙酮酸钠溶液、2mM L-谷氨酸溶液；Invitrogen公司)中37℃、5％二氧化碳气流中进行扩大培养后，在1次驯化培养基(primaryadaption medium)(IH培养基∶CD Hybridoma Medium、8mM L-谷氨酸溶液＝1∶1、Invitrogen公司)中扩大培养1日，再在主培养培养基(IH培养基∶CDHybridoma Medium、8mM L-谷氨酸溶液＝1∶3；Invitrogen公司)中扩大培养，当使用旋动培养瓶(spinner flask)时，37℃、5％二氧化碳气流中培养5～7日，当使用50L容量搅拌培养罐时37℃、溶氧浓度2ppm、pH 7.0、搅拌转数40rpm的条件下培养5～7日。其间，根据培养基成分分析添加葡萄糖溶液和L-谷氨酸溶液。以细胞生存率50％左右为指标停止主培养。培养结束后，进行离心分离(7,460xg、20分钟)，回收培养上清。
将所得各杂交瘤培养上清使用超滤膜(Hydrosart膜、分级分子量10,000；Sartorius公司)进行浓缩，将缓冲液替换为含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)后，进行离心分离操作(14,300xg、20分钟)，得到了上清液。将其进一步精密过滤(Stericup HV、0.45μm；Millipore公司)，得到了浓缩液。将其吸附于用含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡化的Protein A Sepharose柱(22mmIDx79mm、GE Healthcare公司)，用20倍柱容量的同缓冲液清洗柱通过通入20倍柱容量的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)，来洗脱与柱结合的抗体级分，立即加入1/10容量的1MTris-HCl缓冲液(pH 9.0)进行中和。将抗体溶液用超滤膜(AmiconUltra、分级分子量30,000；Millipore公司)浓缩后，上样于用PBS平衡化的Superdex200柱(26mmIDx60cm、GE Healthcare公司)，用同缓冲液洗脱，得到了抗体单体级分。将其上样于用PBS平衡化的ActiClean ETox柱(25mIDx59mm、Sterogene Bioseparations公司)，除去内毒素后，使用超滤膜(AmiconUltra、分级分子量10,000；Millipore公司)进行浓缩，再进行无菌过滤(Millex GV、0.22μm；Millipore公司)，得到了纯化抗体。
可知从杂交瘤Nec1-554-1的培养上清使用Protein A柱纯化得到的抗体级分例外地是活性抗体与非活性抗体的混合物，因此，再将该抗体级分上样于阳离子交换柱，分离得到了活性级分。即，将上述Protein A柱纯化抗体级分用20mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)稀释3倍，再使其吸附于用含100mM NaCl的20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)平衡化的SP-5PW柱(21.5mmIDx150mm、东曹公司)。将该柱用约2倍柱容量的含100mM NaCl的20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)清洗后，通过直线浓度梯度洗脱法分离活性抗体级分和非活性抗体级分，其中，作为洗脱液的NaCl浓度在70分钟内从100mM提高至300mM，回收了活性抗体级分(SP3)。将这样得到的抗体洗脱液用超滤膜(AmiconUltra、分级分子量30,000；Millipore公司)浓缩，上样到用PBS平衡化的Superdex 200柱(26mmIDx60cm、GE Healthcare公司)，用同缓冲液洗脱，得到了抗体单体级分。将其上样到用PBS平衡化的ActiClean ETox柱(25mmIDx59mm、Sterogene Bioseparations公司)，除去内毒素后，使用超滤膜(AmiconUltra、分级分子量10,000；Millipore公司)进行浓缩，再进行无菌过滤(MillexGV、0.22μm、Millipore公司)，得到了纯化抗体。将该纯化抗体命名为Nec1-554-1SP3。
这样获得的纯化抗体中的任一种均在使用SDS-PAGE和Superdex 200柱的凝胶过滤HPLC中显示95％以上的纯度。此外，使用Endospecy ES-24SSet(生化学工业公司)和Toxicolor DIA Set(生化学工业公司)分析了抗体标准品的内毒素含量，任一种均为0.1EU/mg抗体以下。
参考例29Nectin-1、Nectin-3、Nectin-4、Nec1-5d的动物细胞用表达载体的构建 人Nectin-1基因是以人脑Marathon-Ready cDNA(Takara Bio公司)为模板、使用附加限制性酶EcoRV识别序列的引物59(序列号59)和附加限制性酶XhoI识别序列的引物60(序列号60)通过PCR获得的。该反应中反应液的组成为以上述cDNA溶液1μL为模板、Pfu Turbo Hotstart DNAPolymerase(STRATAGENE公司)1U、引物59(序列号59)和引物60(序列号60)各1μM、dNTPs 200μM、和10x Pfu Ultra Buffer(STRATAGENE公司)2μL，体系合计20μL。PCR反应条件为95℃/1分钟后，(95℃/20秒、60℃/15秒、72℃/3分钟)进行40个循环。将该PCR产物使用PCRPurification Kit(QIAGEN公司)纯化后，用限制性酶EcoRV和XhoI进行消化。同样地，将pCMV-Tag4(STRATAGEN公司)用限制性酶EcoRV和XhoI消化。将这些DNA片段分别使用PCR Purification Kit纯化，将两DNA片段使用DNA Ligation Kit ver.2(TakaRa Bio公司)连接起来。将该反应混合物导入大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司)，在含卡那霉素的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码Nectin-1蛋白质(序列号62)的cDNA序列(序列号61)的动物细胞用表达载体pCMV-Tag4-Nectin-1。
人Nectin-3基因是通过以MTC Multiple Tissue cDNA Panels(Takara Bio公司)中所含的人胎盘cDNA为模板、使用附加了限制性酶HindIII识别序列的引物47(序列号47)、和附加了限制性酶EcoRV识别序列的引物63(序列号63)进行PCR而得到的。该反应中的反应液组成为上述cDNA溶液1μL、Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 1U、引物47(序列号47)和引物63(序列号63)各1μM、dNTPs 200μM、和2xGC BufferI(TaKaRa Bio公司)10μL，体系合计20μL。PCR反应条件为95℃/1分钟后，(95℃/20秒、60℃/15秒、72℃/2分钟)40个循环。将该PCR产物使用PCR PurificationKit纯化后，用限制性酶HindIII和EcoRV消化。同样地，将pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)用限制性酶HindIII和EcoRV消化。将这些DNA片段用PCR Purification Kit分别纯化，将两DNA片段用DNA Ligation Kit ver.2连接。将该反应混合物导入大肠杆菌TOP10，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码Nectin-3蛋白质(序列号5)的cDNA序列(序列号6)的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-3。以此处所得的pcDNA3.1(+)-Nectin-3为模板，使用附加了限制性酶HindIII识别序列的引物47(序列号47)和附加了限制性酶XhoI识别序列的引物64(序列号64)进行PCR。该反应中反应液的组成为pcDNA3.1(+)-Nectin-3100ng、PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase 2.5U、引物47(序列号47)和引物64(序列号64)各1μM、dNTPs 200μM、和2xGC BufferI 25μ，体系合计50μL。PCR反应条件为95℃/1分钟后，(95℃/20秒、60℃/15秒、72℃/2分钟)30个循环。将该PCR产物使用PCR Purification Kit纯化后，用限制性酶HindIII和XhoI消化。同样地，将pCMV-Tag4用限制性酶HindIII和XhoI进行消化。将这些DNA片段用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化，将两DNA片段使用DNA Ligation Kit ver.2连接起来。将该反应混合物导入大肠杆菌TOP10，在含卡那霉素的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码Nectin-3蛋白质(序列号5)的cDNA序列(序列号6)的动物细胞用表达载体pCMV-Tag4-Nectin-3。
人Nectin-4基因是通过以人肺Marathon-Ready cDNA(Takara Bio公司)为模板，使用附加限制性酶EcoRI识别序列的引物65(序列号65)和附加限制性酶XhoI识别序列的引物66(序列号66)进行PCR而得到的。该反应中的反应液组成为上述cDNA溶液1μL、Pfu Turbo Hotstart DNAPolymerase 1U、引物65(序列号65)和引物66(序列号66)各1μM、dNTPs200μM、和10xPfu Ultra Buffer 2μL，体系合计20μL。PCR反应条件为95℃/1分钟/后，(95℃/20秒、60℃/15秒、72℃/3分钟)40个循环。然后，将该PCR产物使用PCR Purification Kit进行纯化后，用限制性酶EcoRI和XhoI消化。同样地，将pCMV-Tag4用限制性酶EcoRI和XhoI进行消化。将这戏DNA片段用PCR Purification Kit纯化，将插入DNA片段和载体片段用DNA Ligation Kit ver.2连接起来。将该反应混合物导入大肠杆菌TOP10，在含卡那霉素的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码Nectin-4蛋白质(序列号68)的cDNA序列(序列号67)的动物细胞用表达载体pCMV-Tag4-Nectin-4。
人Nec1-5基因是通过以人小肠Marathon-Ready cDNA(Takara Bio公司)为模板、使用附加限制性酶HindIII识别序列的引物69(序列号69)、和附加限制性酶SalI识别序列的引物70(序列号70)进行PCR而得到的。该反应中反应液的组成为上述cDNA溶液1μL、Pfu Turbo Hotstart DNAPolymerase 1U、引物69(序列号69)和引物70(序列号70)各1μM、dNTPs200μM、和10xPfu Ultra Buffer 2μL，体系合计20μL。PCR反应条件为95℃/1分钟后，(95℃/20秒、60℃/5秒、72℃/3分钟)40个循环。然后，将该PCR产物使用PCR Purification Kit进行纯化后，与pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen公司)连接。将该反应混合物导入大肠杆菌TOP10，在含卡那霉素的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码Nec1-5蛋白质(序列号71)的cDNA序列(序列号72)的克隆化载体pCR-BluntII-Nec1-5。将此处所得的pCR-BluntII-Nec1-5用限制性酶HindIII和SalI进行消化，同样地，将pCMV-Tag4用限制性酶HindIII和SalI进行消化。将这些DNA片段用MinElute PCR Purification Kit纯化，将两DNA片段用DNA Ligation Kit ver.2连接起来。将该反应物导入大肠杆菌TOP10，在含卡那霉素的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码Nec1-5蛋白质(序列号71)的cDNA序列(序列号72)的动物细胞用表达载体pCMV-Tag4-Nec1-5。
参考例30Ig1或者Ig2域缺陷Nectin-2变异体的动物细胞用表达载体的构建 Nectin-2细胞外区的Ig1域、或者Ig2域缺陷的Nectin-2变异体基因是采用以下方法获得的。以参考例4中所得的pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ为模板，进行PCR。该反应中的反应液组成为上述pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ10ng、PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase(STRATAGENE公司)1U、对于Ig1域缺陷体使用附加限制性酶EcoRI识别序列的引物5(序列号15)和附加限制性酶EcoRV识别序列的引物73(序列号73)、或者对于Ig2域缺陷体使用附加限制性酶EcoRI识别序列的引物5(序列号15)和附加限制性酶EcoRV识别序列的引物74(序列号74)各1μM、dNTPs 200μM、和2xGCBuffer I(TaKaRa Bio公司)10μL，体系合计20μL。PCR反应条件为95℃/1分钟后，(95℃/20秒、60℃/15秒、72℃/.5分钟)30个循环。然后，将该PCR产物用PCR Purification Kit(QIAGEN公司)进行纯化后，用限制性酶EcoRI和EcoRV消化。同样地，将pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)用限制性酶EcoRI和EcoRV进行消化。将这些用PCR Purification Kit纯化，将PCR产物的限制性酶消化物与载体片段用DNA Ligation Kit ver.2(TaKaRa Bio公司)连接后，将其导入大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司)，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养，得到了具有扩增的各PCR片段的质粒pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg1-1、和pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg2-1。
然后，以pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ10ng为模板，使用Pfu Turbo HotstartDNA Polymerase 1U、对于Ig1域缺陷体使用附加限制性酶EcoRV识别序列的引物75(序列号75)和附加限制性酶XhoI识别序列的引物76(序列号76)、或者对于Ig2域缺陷体使用附加限制性酶EcoRV识别序列的引物77(序列号77)和附加限制性酶XhoI识别序列的引物76(序列号76)各1μM、dNTPs 200μM、和2xGC Buffer I 10μL，体系合计20μL。PCR反应条件为95℃/1分钟后，(95℃/20秒、60℃/15秒、72℃/1.5分钟)30个循环。然后，将该PCR产物用PCR Purification Kit进行纯化后，用限制性酶EcoRV和XhoI进行消化。同样地，将上述构建的pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg1-1、和pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg2-1也用限制性酶EcoRV和XhoI消化。将这些用PCR Purification Kit纯化，将使用引物75(序列号75)和引物76(序列号76)得到的PCR产物的限制性酶消化物与pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg1-1的限制性酶消化物用DNA Ligation Kit ver.2连接起来，同样地，将使用引物77(序列号77)和引物76(序列号76)得到的PCR产物的限制性酶消化物与pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg2-1的限制性酶消化物用DNA Ligation Kit ver.2连接起来。将这些导入大肠杆菌TOP10，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养，得到了具有编码Nectin-2的Ig1域缺陷蛋白质(序列号78)的cDNA 序列(序列号79)的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg1、以及具有编码Nectin-2的Ig2域缺陷蛋白质(序列号80)的cDNA序列(序列号81)的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg2。
参考例31食蟹猴Nectin-2cDNA的克隆化与碱基序列测定 如下地获得食蟹猴Nectin-2基因。以从食蟹猴的精巢制备的总RNA约1μg(UNITECH公司)为模板，使用TaqMan Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems公司)按附带的规程进行逆转录反应，制备了cDNA文库。以该cDNA文库为模板，使用引物82(序列号82)和引物83(序列号83)进行PCR。该反应中的反应液组成为与总RNA约40ng相当的上述cDNA、Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase(STRATAGENE公司)1U、引物82(序列号82)和引物83(序列号83)各1μM、dNTPs 200μM、和10x Pfu Ultra Buffer(STRATAGENE公司)2μL，体系合计20μL。PCR反应条件为96℃/1分钟后，(96℃/20秒、60℃/15秒、72℃/2.5分钟)40个循环。然后，以该PCR产物为模板，使用引物84(序列号84)和引物85(序列号85)进行PCR。该反应中的反应液组成为上述该PCR产物1μL、Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase 1U、引物84(序列号84)和引物85(序列号85)各1μM、dNTPs 200μM、和10x Pfu Ultra Buffer 2μL，体系合计20μL。PCR反应条件为96℃/1分钟后，(96℃/20秒、60℃/15秒、72℃/2.5分钟)40个循环。然后，将该该PCR产物用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化，将其与pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen公司)连接后，导入大肠杆菌感受态细胞TOP10(Invitrogen公司)，在含卡那霉素的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码食蟹猴Nectin-2蛋白质(序列号86)的cDNA序列(序列号87)的载体pCR-BluntII-maNectin-2。
参考例32食蟹猴Nectin-2动物细胞用表达载体的构建 以参考例31中制作的含有食蟹猴Nectin-2基因的pCR-BluntII-maNectin-2为模板，使用附加限制性酶EcoRI识别序列的引物88(序列号88)、和附加限制性酶XhoI识别序列的引物89(序列号89)进行PCR。该反应中的反应液组成为pCR-BluntII-maNectin-210ng、KOD-Plus-DNA Polymerase(TOYOBO公司)1U、引物88(序列号88)和引物89(序列号89)各0.3μM、dNTPs 200μM、和10x PCR Buffer(TOYOBO公司)5μL，体系合计50μL。PCR反应条件为95℃/3分钟后，(95℃/30秒、60℃/30秒、68℃/1分钟30秒)35个循环/。然后，将该PCR产物用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化后，用限制性酶EcoRI和XhoI消化，使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化。同样地，将pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)用限制性酶EcoRI和XhoI消化，进行琼脂糖电泳分离后，将载体片段用MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)纯化。将这样获得的插入DNA片段与载体片段使用Ligation High(TOYOBO公司)连接起来后，导入大肠杆菌Competent highDH5α(TOYOBO公司)，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码食蟹猴Nectin-2蛋白质(序列号86)的cDNA序列(序列号87)的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-maNectin-2。
参考例33导入了食蟹猴型变异人的Nectin-2的动物细胞用表达载体的构建 以参考例4中制作的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ为模板，使用附加限制性酶HindIII识别序列的引物90(序列号90)和引物91(序列号91)、或者附加限制性酶EcoRI识别序列的引物92(序列号92)和引物93(序列号93)进行PCR。该反应中的反应液组成为pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ10ng、KOD-Plus-DNA Polymerase(TOYOBO公司)1U、引物90(序列号90)和引物91(序列号91)或者引物92(序列号92)和引物93(序列号93)各0.3μM、dNTPs 200μM、和10x PCR Buffer(TOYOBO公司)5μL，体系合计50μL。PCR反应条件为95℃/3分钟后，(95℃/30秒、60℃/30秒、68℃/1分钟)35个循环。然后，将该PCR产物用MinElutePCR Purification Kit(QIAGEN公司)纯化。然后、以这样得到的PCR产物的混合物为模板，使用引物90(序列号90)和引物92(序列号92)进行PCR。该反应中的反应液组成为上述纯化PCR产物各5μL、KOD-Plus-DNAPolymerase 1U、引物90(序列号90)和引物92(序列号92)各0.3μM、dNTPs200μM、和10x PCR Buffer 5μL，体系合计50μL。PCR反应条件为95℃/3分钟后，(95℃/30秒、60℃/30秒、68℃/1分钟)20个循环。然后，将该PCR产物用MinElute PCR Purification Kit进行纯化后，用限制性酶HindIII、和EcoRI消化，将消化物用MinElute PCR Purification Kit纯化。同样地，将pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)用限制性酶HindIII和EcoRI消化，琼脂糖凝胶电泳后、将目的载体片段用MinElute Gel Extruction Kit(QIAGEN公司)纯化。将插入DNA片段和载体片段用Ligation High(TOYOBO公司)连接起来后，将其导入大肠杆菌Competent High DH5α(TOYOBO公司)，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，得到了具有编码AN77-78PD的cDNA序列的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2(AN77-78PD)，所述AN77-78PD是人Nectin-2δ蛋白质(序列号3)中第77位的Ala变异为Pro、第78位的Asn变异为Asp而得到的蛋白质。
然后，以参考例4中制作的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ为模板，使用附加限制性酶HindIII识别序列的引物90(序列号90)和引物94(序列号94)、或者附加限制性酶EcoRI识别序列的引物92(序列号92)和引物95(序列号95)进行PCR。该反应中的反应液组成为pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ10ng、KOD-Plus-DNA Polymerase 1U、引物90(序列号90)和引物94(序列号94)或者引物92(序列号92)和引物95(序列号95)各0.3μM、dNTPs 200μM、和10x PCR Buffer 5μL，体系合计50μL。PCR反应条件为95℃/3分钟后，(95℃/30秒、60℃/30秒、68℃/1分钟)35个循环。然后，将该PCR产物用MinElute PCR Purification Kit纯化。以这样得到的PCR产物的混合物为模板，使用引物90(序列号90)和引物92(序列号92)进行PCR。该反应中的反应液组成为上述纯化PCR产物各5μL、KOD-Plus-DNA Polymerase 1U、引物90(序列号90)和引物92(序列号92)各0.3μM、dNTPs 200μM、和10x PCR Buffer 5μL，体系合计50μL。PCR反应条件为95℃/3分钟后，(95℃/30秒、60℃/30秒、68℃/1分钟)20个循环。以下，按与上述相同的方法得到了具有编码G113R的cDNA序列的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2(G113R)，所述G113R为人Nectin-2δ蛋白质(序列号3)第113位的Gly变异为Arg而得到的蛋白质。
然后，以参考例4中制作的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ为模板，使用附加限制性酶HindIII识别序列的引物90(序列号90)和引物96(序列号96)、或者附加限制性酶EcoRI识别序列的引物92(序列号92)和引物97(序列号97)进行PCR。该反应中的反应液组成为pcDNA3.1(+)-Nectin-2δ10ng、KOD-Plus-DNA Polymerase 1U、引物90(序列号90)和引物96(序列号96)或者引物96(序列号96)和引物97(序列号97)各0.3μM、dNTPs 200μM、和10x PCR Buffer 5μL，体系合计50μL。PCR反应条件为95℃/3分钟后，(95℃/30秒、60℃/30秒、68℃/1分钟)35个循环。然后，将该PCR产物用MinElute PCR Purification Kit纯化。然后，以这样得到的PCR产物为模板，使用引物90(序列号90)和引物92(序列号92)进行PCR。该反应中的反应液组成为上述纯化PCR产物各5μL、KOD-Plus-DNA Polymerase 1U、引物90(序列号90)和引物92(序列号92)各0.3μM、dNTPs200μM、和10x PCR Buffer 5μL，体系合计50μL。PCR反应条件为95℃/3分钟后，(95℃·30秒、60℃·30秒、68℃·1分钟)20个循环。以下，按与上述同样的方法，得到了具有编码H128R的cDNA序列的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2(H128R)，所述H128R为人Nectin-2δ蛋白质(序列号3)中第128位的His变异为Arg而得到的蛋白质。
参考例34在Ig1域中进行了1个氨基酸取代的人Nectin-2ED-Fc蛋白质的动物细胞用表达载体的构建 以参考例15中制作的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-hFc为模板，使用Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司)对编码Nectin-2的Ig1域中的26处氨基酸残基的DNA序列实施了变异，所述变异使得这些氨基酸残基中的每一个分别被取代为丙氨酸残基或者甘氨酸残基。该反应中的反应液组成为上述表达质粒(20ng/μL)7μL、10xBuffer 35μL、dNTP mix 7μL、Quick Solution21μL、Pfu Turbo DNA Polymerase(2.5U/μL)7μL中加蒸馏水至体积合计为300μL，将其分注到26个PCR用管中，每管9μL，然后分别各添加3.7μM的引物Q37A(序列号98)和引物Q37A R(序列号99)、或者引物P40G(序列号100)和引物P40G R(序列号101)、或者引物Q45A(序列号102)和引物Q45A R(序列号103)、或者引物H55A(序列号104)和引物H55AR(序列号105)、或者引物V60A(序列号106)和引物V60A R(序列号107)、或者引物Y64A(序列号108)和引物Y64A R(序列号109)、或者引物Q71A(序列号110)和引物Q71A R(序列号111)、或者引物A75G(序列号112)和引物A75G R(序列号113)、或者引物P76G(序列号114)和引物P76G R(序列号115)、或者引物A77G(序列号116)和引物A77GR(序列号117)、或者引物N78A(序列号118)和引物N78A R(序列号119)、或者引物H79A(序列号120)和引物H79A R(序列号121)、或者引物Q80A(序列号122)和引物Q80A R(序列号123)、或者引物N81A(序列号124)和引物N81A R(序列号125)、或者引物K88A(序列号126)和引物K88A R(序列号127)、或者引物S95A(序列号128)和引物S95AR(序列号129)、或者引物K109A(序列号130)和引物K109A R(序列号131)、或者引物E117A(序列号132)和引物E117A R(序列号133)、或者引物D122A(序列号134)和引物D122A R(序列号135)、或者引物H128A(序列号136)和引物H128A R(序列号137)、或者引物N137A(序列号138)和引物N137A R(序列号139)、或者引物F145A(序列号140)和引物F145A R(序列号141)、或者引物K147A(序列号142)和引物K147A R(序列号143)、或者引物V150A(序列号144)和引物V150A R(序列号145)、或者引物M153A(序列号146)和引物M153A R(序列号147)、或者引物T154A(序列号148)和引物T154A R(序列号149)的组合的引物0.5μL。PCR反应条件为95℃/1分钟后，(95℃/50秒、60℃/50秒、68℃/7分钟40秒)18个循环，然后68℃/7分钟。反应后，26根管的PCR液中分别添加限制性酶DpnI(2U/μL)1μL，37℃反应1小时。将各反应混合液2μL导入大肠杆菌XL10-Gold ultracompetent cells 20μL，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，分别得到了具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第37位的Gln变异成Ala而得到的蛋白质Q37A的cDNA序列的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q37A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第40位的Pro变异成Gly而得到的蛋白质P40G的cDNA序列的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(P40G)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第45位的Gln变异成Ala而得到的蛋白质Q45A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q45A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第55位的His变异成Ala而得到的蛋白质H55A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(H55A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第60位的Val变异成Ala而得到的蛋白质V60A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(V60A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第64位的Tyr变异成Ala而得到的蛋白质Y64A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Y64A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第71位的Gln变异成Ala而得到的蛋白质Q71A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q71A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第75位的Ala变异成Gly而得到的蛋白质A75G的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(A75G)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第76位的Pro变异成Gly而得到的蛋白质P76G的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(P76G)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第77位的Ala变异成Gly而得到的蛋白质A77G的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(A77G)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第78位的Asn变异成Ala而得到的蛋白质N78A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(N78A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第79位的His变异成Ala而得到的蛋白质H79A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(H79A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第80位的Gln变异成Ala而得到的蛋白质Q80A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q80A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第81位的Asn变异成Ala而得到的蛋白质N81A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(N81A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第88位的Lys变异成Ala而得到的蛋白质K88A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K88A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第95位的Ser变异成Ala而得到的蛋白质S95A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(S95A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第109位的Lys变异成Ala而得到的蛋白质K109A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K109A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第117位的Glu变异成Ala而得到的蛋白质E117A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(E117A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第122位的Asp变异成Ala而得到的蛋白质D122A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(D 122A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第128位的His变异成Ala而得到的蛋白质H128A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(H128A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第137位的Asn变异成Ala而得到的蛋白质N137A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(N137A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第145位的Phe变异成Ala而得到的蛋白质F145A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(F145A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第147位的Lys变异成Ala而得到的蛋白质K147A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K147A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第150位的Val变异成Ala而得到的蛋白质V150A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(V150A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第153位的Met变异成A la而得到的蛋白质M153A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(M153A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第154位的Thr变异成Ala而得到的蛋白质T154A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T154A)。
参考例35在Ig2域中进行了1个氨基酸取代的人Nectin-2ED-Fc蛋白质的动物细胞用表达载体的构建 以参考例15中制作的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-hFc为模板，使用Quick Change XL Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene公司)对编码Nectin-2的Ig2域中的13处氨基酸残基的DNA序列实施了变异，所述变异使得这些氨基酸残基中的每一个分别被取代为丙氨酸残基或者甘氨酸残基。该反应中的反应液组成为上述表达载体(20ng/μL)3.5μL、10xBuffer 17.5μL、dNTP mix 3.5μL、Quick Solution10.5μL、Pfu Turbo DNA Polymerase(2.5U/μL)3.5μL 中加蒸馏水至合计为150μL，将其分注到13根PCR用管，每只9μL，然后分别添加3.7μM的引物Q165A(序列号150)和引物Q165A R(序列号151)、或者引物K170A(序列号152)和引物K170A R(序列号153)、或者引物F173A(序列号154)和引物F173A R(序列号155)、或者引物P177G(序列号156)和引物P177GR(序列号157)、或者引物I184A(序列号158)和引物I184A R(序列号159)、或者引物K186A(序列号160)和引物K186A R(序列号161)、或者引物L197A(序列号162)和引物L197A R(序列号163)、或者引物W202A(序列号164)和引物W202A R(序列号165)、或者引物E206A(序列号166)和引物E206A R(序列号167)、或者引物T212A(序列号168)和引物T212AR(序列号169)、或者引物T235A(序列号170)和引物T235A R(序列号171)、或者引物K239A(序列号172)和引物K239A R(序列号173)、或者引物A249G(序列号174)和引物A249G R(序列号175)的组合的引物0.5μL。PCR反应条件为95℃/1分钟后，(95℃/50秒、60℃/50秒、68℃/7分钟40秒)18个循环，然后68℃/7分钟。反应后，在13管PCR液中分别添加限制性酶DpnI(2U/μL)1μL，37℃反应1小时。将各反应混合液2μL导入大肠杆菌XL10-Gold ultracompetent cells 20μL，在含氨苄西林的LB琼脂培养基中进行选择培养。分析从增殖的大肠杆菌菌落回收的各个基因克隆的序列，分别得到了具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第165位的Gln变异成Ala而得到的蛋白质Q165A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q165A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第170位的Lys变异成Ala而得到的蛋白质K170A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K170A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第173位的Phe变异成Ala而得到的蛋白质F173A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(F173A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第177位的Pro变异成Gly而得到的蛋白质P177G的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(P177G)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第184位的Ile变异成Ala而得到的蛋白质I184A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(I184A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第186位的Lys变异成Ala而得到的蛋白质K186A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K186A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第197位的Leu变异成Ala而得到的蛋白质L197A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(L197A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第202位的Trp变异成Ala而得到的蛋白质W202A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(W202A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第206位的Glu变异成Ala而得到的蛋白质E206A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(E206A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第212位的Thr变异成Ala而得到的蛋白质T212A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T212A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第235位的Thr变异成Ala而得到的蛋白质T235A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T235A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第239位的Lys变异成Ala而得到的蛋白质K239A的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K239A)、具有编码Nectin-2ED-Fc(序列号37)中第249位的Ala变异成Gly而得到的蛋白质A249G的cDNA序列动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(A249G)。
实施例1 抗nectin-2人单克隆抗体的制备 将参考例16中制备的Nectin-2ED-Fc蛋白(1.6mg/mL PBS溶液)或参考例13中制备的Nectin-2ED-FLAG蛋白(2mg/mL PBS溶液)与弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)(Difco)等体积混合制备成乳剂，用该乳剂免疫5只KM小鼠(10周龄，12周龄，雄性，Kirin Brewery)，每只动物分别皮下和皮内给予50μg。对于第二次及以后的免疫，每两周也给予通过这些重组nectin-2胞外域蛋白和弗氏不完全佐剂(Freun d′s incomplete adjuvant)(Difco)等体积混合而制备的乳剂作为附加免疫。
除此之外，在细颈瓶中分别培养了稳定表达nectin-2δ的FM3A细胞系(#60-6)(其在参考例19中建立)和稳定表达nectin-2δ的NS0细胞系(#2-75)(其在参考例18中建立)。离心(1200rpmx5分钟)回收细胞，重悬于RPMI1640培养基(Invitrogen)，然后离心(1200rpmx5分钟)回收，重复该过程3次，以除去血清成分。回收的各细胞以每mL 5x107个细胞重悬于RPMI1640培养基，将终浓度20μg/mL的含丝裂霉素C(Wako Pure Chemical)的RPMI1640培养基加至细胞中，随后于37℃温育30分钟。将用丝裂霉素C处理的两种细胞系也用10mL PBS清洗3次，然后以每mL 2x107个细胞重悬于PBS中。将悬浮液腹膜内注射至5只KM小鼠(10-12周龄，雄性)中的每一只，每周重复一次。
除此之外，将Nectin-2ED-Fc蛋白或Nectin-2ED-FLAG蛋白与弗氏完全佐剂(Freund′s complete adjuvant)(Difco)等体积混合制备成乳剂，用该乳剂免疫5只KM小鼠(12周龄，雄性)，每只动物分别皮下和皮内给予50μg。首次免疫后一周，以每500μL 1x107个细胞腹膜内给予丝裂霉素C处理的表达nectin-2δ的FM3A细胞系(#60-6)，用于辅助注射(booster)。对于第三次免疫，将Nectin-2ED-Fc或Nectin-2ED-FLAG与弗氏不完全佐剂等体积混合制备成乳剂，分别皮下和皮内向每只动物施用50μg该乳剂，同时，通过与上述相同的操作，以每500μL 1x107个细胞腹膜内注射丝裂霉素C处理的表达nectin-2δ的FM3A细胞系(#60-6)。对于第四次及以后的辅助注射，通过与上述相同的操作，仅以每500μL 1x107个细胞腹膜内注射丝裂霉素C处理的表达nectin-2δ的FM3A细胞系(#60-6)。
在第一次免疫前和第三次免疫后一周，从乙醚麻醉下的所有小鼠的眼底采集血液，制备抗血清，通过下述流式细胞术测定了血清中的抗体滴度。即，将在参考例20中建立的稳定表达nectin-2δ的CHO细胞系(#43-2)以及模拟-CHO细胞系的细胞悬液(PBS)分别单独分到聚丙烯管中，每管5x105个细胞，然后离心(1200rpmx5分钟)除去PBS。将这些细胞碎片重悬于50μL用含1％BSA和10％FBS的PBS稀释100倍的每种小鼠抗血清，于冰上暗处反应30分钟。将200μL PBS加至细胞碎片之后，离心混合物(1200rpmx5分钟)，吸去上清液。细胞碎片重悬于50μL用含1％BSA和10％FBS的PBS稀释100倍的抗-人IgG(H+L)Alexa 488(Invitrogen)溶液，于冰上暗处反应30分钟。用PBS同样清洗细胞悬液3次后，将细胞碎片重悬于200μLPBS。用流式细胞仪MPL500(BECKMAN COULTER)分析了各个细胞的荧光强度，制作曲线图，横坐标代表荧光强度，纵坐标代表细胞计数，从而比较了抗血清的抗体滴度。
在确定其中血清抗体滴度得到充分增加的KM小鼠中，向用Nectin-2ED-Fc或Nectin-2ED-FLAG免疫的小鼠经尾静脉注射这些蛋白抗原，剂量为每只动物各10μg，向用稳定表达nectin-2δ的细胞系免疫的小鼠腹膜内注射相同的细胞系用于最终的辅助注射，剂量为各1x107个细胞。最终的辅助注射3天后，将小鼠放血致死，取出脾脏。将得到的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(P3X63Ag8U.1(P3U1))以5∶1混合，从而使用聚乙二醇(PEG)1500(Roche Diagnostics)使其融合，之前已使得所述小鼠骨髓瘤细胞适应于下述培养基10％添加FBS的Daigo T培养基(F-12营养培养基(HAM)(Invitrogen)和Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)(Invitrogen)的等体积培养基混合物，添加了MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen)、丙酮酸钠(Invitrogen)和L-谷氨酰胺(Invitrogen))，每500mL含一小瓶8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine)(Sigma)。按照附带的手册进行了细胞融合操作。融合后将细胞重悬于添加了10％FBS和10％BM Condimed H1(Roche Diagnostics)的Daigo T培养基，以每孔100μL 5x104个脾细胞将所述细胞接种到96孔培养板上，于37℃在5％二氧化碳气流下温育1天。接下来，向培养板中每孔加入100μL添加了0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、0.016mM胸苷(HAT)、10％BM Condimed H1和10％FBS的Daigo T培养基(HAT选择性培养基)，然后再于37℃在5％二氧化碳气流下温育，每三天用新鲜的HAT选择性培养基更换两次3/4的培养上清液。
利用稳定表达nectin-2δ的CHO细胞系(#43-2)或模拟-CHO细胞系，将培养上清液(温育的第7-14天在其中观察到了集落生长)用于Cell ELISA，从而筛选出产生抗nectin-2人单克隆抗体的杂交瘤。换言之，将稳定表达nectin-2δ的CHO细胞系(#43-2)和模拟-CHO细胞系在96孔组织培养板中温育，所述96孔组织培养板中装有添加了10％透析的FBS和GS添加物的GS选择性DMEM培养基。将各细胞系铺满的平板中的培养上清液吸去之后，向其每孔加入200μL添加2％FBS的PBS(+)，于冰上暗处温育1小时。吸去每个孔的上清液之后，向每孔各加入50μL杂交瘤培养上清液，于冰上暗处温育2小时。用4℃预冷的PBS(+)将该板清洗一次后，每孔各加入100μL用添加2％FBS的PBS(+)稀释3000倍的抗-人IgG(H+L)链特异性(GOAT)过氧化物酶偶联物(CALBIOCHEM)，于冰上暗处温育2小时。用4℃预冷的PBS(+)洗板3次后，每孔各加入100μL四甲基联苯胺(3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine)(TMB)溶液(SureBlue Microwell TMB过氧化物酶底物；Kirkegaard & Perry Laboratories)，保持在室温5分钟，使得颜色形成。每孔各加入100μL 2N硫酸(Wako Pure Chemical)，终止了酶反应。使用平板读取器(Multiskan BICHROMATIC；Thermo Electron Co.)测定了各孔的吸收度(450nm)，判定在nectin-2表达CHO细胞系平板中显示吸收度为0.5或更高以及在模拟-CHO细胞系平板中显示吸收度小于0.3的那些细胞为阳性细胞。产生IgG抗体的杂交瘤即选自其中，预期所述杂交瘤的抗原特异性和亲和力特别高。将这些杂交瘤重悬于添加10％FBS和10％BMCondimed H1的Daigo T培养基中，以每孔0.5个细胞置于96孔组织培养板中。将通过显微镜观察确认为单克隆的杂交瘤的培养上清液再用上述CellELISA筛选，建立产生抗nectin-2人单克隆抗体的杂交瘤克隆。将这样得到的256个产生抗nectin-2人单克隆抗体的杂交瘤分别在细颈瓶中温育，所述细颈瓶装有100mL添加10％FBS Ultra low IgG(Invitrogen)的Daigo T培养基，离心培养上清液(1200rpm x 5分钟)以得到含有单克隆抗体的上清液。将用PBS平衡的200μL蛋白A Sepharose FF(Amersham Biosciences，更名为GE Healthcare Bio-sciences)加至这些培养上清液后，于4℃轻轻振摇过夜，抗体吸附至其上。通过离心操作和PBS清洗回收了该蛋白A载体。然后，用1.2mL含0.3M NaC1的0.1M甘氨酸-HCl(pH 3.0)洗脱IgG级分。立即用1M Tris-HCl(pH 8.0)中和该洗脱物，然后使用超滤膜(Vivaspin 6截留分子量为10000，Sartorius)通过超浓缩用PBS代替缓冲液，其作为抗nectin-2人单克隆抗体制剂用在随后的体外表征中。
实施例2 抗nectin-2人单克隆抗体的结合活性 抗nectin-2人单克隆抗体具有亲合力，利用实施例1中所示的稳定表达nectin-2的CHO细胞系，用添加2％FBS的PBS(+)在实施例1中制备了连续稀释的抗nectin-2人单克隆抗体用于Cell ELISA，应用所述连续稀释的抗nectin-2人单克隆抗体并作出浓度依赖性曲线从而测定了每种抗体的EC50值，其是相对估计值。通过比较与稳定表达nectin-2的CHO细胞系平板的结合性和与模拟-CHO细胞系平板的结合性，确定了每种单克隆抗体的抗原特异性。各个抗nectin-2人单克隆抗体的EC50均示于表3。
实施例3 抗nectin-2人单克隆抗体的亚类 通过如下所示的ELISA确定了实施例1中得到的抗nectin-2人单克隆抗体的亚类。将6种能够特异性识别人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM的H链以及人κ链的抗体(抗人IgG1，Fc片段(小鼠)，纯化；CALBIOCHEM，抗-人IgG2，Fc片段(小鼠)，纯化；CALBIOCHEM，小鼠抗-人IgG3；Zymed，Msx Hu IgG4Fc；CHEMICON，单克隆小鼠抗-人-IgM；Zymed，山羊抗-人κ轻链抗体b+f，亲和纯化；Bethyl)分别用50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释至浓度为2μg/mL。将各稀释物加至96孔半孔免疫板(Costar)，每孔各50μL，接着室温反应5小时。从各孔除去反应溶液后，向每孔加入100μL25％含Block Ace的蒸馏水(DAINIPPON PHARMACEUTICALS)4℃封闭过夜。
用含0.05％Tween 20的PBS清洗这样制备的用于ELISA的平板两次。此后，将实施例1中纯化和获得的每种抗nectin-2人单克隆抗体用10％含Block Ace的蒸馏水稀释至1μg/mL，得到的稀释液以每孔50μL加至平板，接着室温反应2小时。用含0.05％Tween 20的PBS洗板4次后，每孔加入50μL用10％含Block Ace的蒸馏水稀释5000倍的抗-IgG+IgA+IgM(H+L)，人，山羊，辣根过氧化物酶(Zymed)，然后室温反应2小时。再用含0.05％Tween 20的PBS洗板6次。每孔加入50μL TMB溶液(SureBlueMicrowell TMB过氧化物酶底物)，然后使平板保持在室温2分钟，以使得颜色形成。接着，每孔加入50μL 2N硫酸(Wako Pure Chemical)，终止酶反应。使用平板读取器(Multiskan BICHROMATIC)测定了每个孔的吸收度(450nm)，根据固定在孔中显示出明显比其他的吸收度更高的抗体的抗原特异性确定了每种抗体的亚类。结果示于表3A。
实施例4 抗nectin-2人单克隆抗体根据表位分类 将实施例1中得到的抗nectin-2人单克隆抗体根据其识别表位的差异进行分类。其过程如下所示。为进行抗体间的竞争性抑制反应，对实施例1中得到的抗体中的187个抗nectin-2人单克隆抗体进行生物素化。即，将10μg抗nectin-2人单克隆抗体加至50μL Biotin Labeling Kit-NH2(Dojindo)附带的WS缓冲液中，使用Microcon YM50(MILLIPORE)将混合物超浓缩至几乎干燥。将50μL Biotin Labeling Kit-NH2附带的反应缓冲液和含4μLNH2活性生物素(Reactive Biotin)溶液的50μL DMSO按此顺序连续地加至液体残留物。混合物于37℃反应10分钟。再将反应混合物超浓缩，用WS缓冲液代替缓冲液，以得到生物素化的抗nectin-2人单克隆抗体。这些抗体用于下述的测定。向FMAT平板(384孔板Black/Clear Bottom with Lid；Applied Biosystems)中加入5μL实施例1中得到的抗nectin-2人单克隆抗体的添加2％FBS的PBS溶液(25μg/mL)、15μL稳定表达nectin-2δ的CHO细胞系的添加2％FBS的PBS悬液(2x105个细胞/mL)，以及5μLStreptavidin-Alexa Fluor 647偶联物(Invitrogen)，互相混合，然后使它们于室温反应10分钟。向每孔加入5μL通过上述操作制备的生物素化抗nectin-2人单克隆抗体的添加2％FBS的PBS溶液(0.5μg/mL)以后，室温将平板温育60分钟。对于对照试验，孔中加入添加2％FBS的PBS代替未标记的抗nectin-2人单克隆抗体溶液。用经生物素化的抗体的所有组合考察了该竞争性抑制反应。将所述平板置于Applied Biosystems 8200Cellular DetectionSystem(Applied Biosystems)上，测定每个孔的荧光强度。根据如下所示的公式计算了各抗nectin-2人单克隆抗体的组合中的竞争性抑制率。
竞争性抑制率＝(1-A/B)x100 A其中加入未标记抗体的孔的总FL1值 B其中未加入未标记抗体的孔的总FL1值 使用多变量分析(multivariable analysis)软件SpotFire DecisionSite forLead Discovery(Spotfire)分析了用该公式得到的各个抗体的所有组合的抑制率。根据这样得到的树状图，将抗nectin-2人单克隆抗体通过表位进行了分类。结果表明，抗体被分成属于7个大类I-VII的那些抗体以及不属于任何类的抗体。每种抗nectin-2人单克隆抗体的表位类别均示于表4。
实施例5 抗nectin-2人单克隆抗体的nectin-2-nectin-3反式结合抑制活性 已知nectin-2异嗜性(heterophilically)与nectin-3反式相互作用。通过下述Biacore测定(Biacore 2000；Biacore，更名为GE Healthcare)定量估计了实施例1中得到的各个抗nectin-2人单克隆抗体的nectin-2-nectin-3反式结合抑制活性。将传感器芯片CM5(Biacore，更名为GE Healthcare)装在Biacore2000上，通过以下操作制备了固定Nectin-3ED-Fc蛋白的芯片。即，将AmineCoupling Kit(Biacore，更名为GE Healthcare)附带的N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)盐酸碳二亚胺(N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)(NHS)溶入蒸馏水，得到的溶液各100μL等体积混合。使用HBS-EP缓冲液(Biacore，更名为GE Healthcare)作为运行缓冲液，使溶液混合物以10μL/分钟的流速通过传感器芯片7分钟。此后，将参考例22中制备的Nectin-3ED-mFc(1mg/mL PBS溶液)用10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.0)(Biacore，更名为GEHealthcare)稀释至160μg/mL，使稀释液以10μL/分钟的流速通过传感器芯片7分钟，以将蛋白固定在芯片上。接下来，使相同试剂盒附带的乙醇胺溶液以10μL/分钟的流速通过传感器芯片7分钟，以封闭残留的活性NHS基团。此外，使10mM NaOH以10μL/分钟的流速通过1分钟，以清洗传感器芯片。使Nectin-2ED-hFc蛋白溶液(80μg/mL HBS-EP缓冲液)与抗nectin-2人单克隆抗体溶液或对照人抗体溶液(Human IgG Whole MoleculeChrom Pure；Jackson ImmunoResearch Laboratories)(60μg/mL HB S-EP缓冲液)的等体积混合物以20μL/分钟的流速通过如此制备的固定Nectin-3ED-mFc蛋白的传感器芯片2分钟。记录响应变化，根据下述公式计算了nectin 2-nectin-3反式结合抑制率。
Nectin 2-nectin 3反式结合抑制率(％)＝(A-B)x100/A A使用对照抗体时的响应 B使用抗nectin-2人单克隆抗体时的响应 各个抗nectin-2人单克隆抗体的nectin 2-nectin 3反式结合抑制活性均示于表5。
实施例6 抗nectin-2人单克隆抗体针对OV-90人卵巢癌细胞系的细胞增殖抑制活性 通过下述方法测定了实施例1中得到的各个抗nectin-2人单克隆抗体针对人OV-90卵巢癌细胞系的体外增殖抑制活性。对于OV-90细胞系的培养，使用了添加15％FBS(JRH)的MCDB105(Sigma)和Medium 199(Sigma)的等体积培养基混合物。每隔一日，将细胞接种在10cm组织培养Petri培养皿(Becton Dickinson)中，细胞密度为每皿4.5x105个细胞，于37℃在5％二氧化碳气流下温育细胞进行继代培养。用400U胶原酶N-2(Nitta Gelatin)于37℃处理2分钟从Petri培养皿中分离了OV-90细胞系，随后用2mL细胞消化液(Invitrogen)于37℃进一步处理15分钟。离心这样获得的细胞悬液(1000rpm，3分钟)，将回收的细胞重悬于添加1％FBS的MCDB 105和Medium 199的等体积培养基混合物中，密度为每mL 3x104个细胞。
将实施例1中得到的抗nectin-2人单克隆抗体的溶液、参考例14中制备的抗nectin-2多克隆抗体(N2-No.1)的溶液，以及含对照人抗体(HumanIgG Whole molecule Chrom Pure；Jackson ImmunoResearch Laboratories)的PBS(将其制备成300μg/mL)，或PBS加至96孔培养板(Becton Dickinson)，每孔各10μL，并在每孔各加入100μL上述OV-90细胞悬液。此外，为了测定用于计算下述细胞增殖抑制率的本底水平，制备了含100μL相同培养基和10μL PBS的孔。平板于37℃在5％二氧化碳气流下温育6天后，每孔各加入10μL WST-8溶液(Cell Counting Kit-8；Dojindo)作为细胞增殖测定试剂。平板于37℃在5％二氧化碳气流下温育1小时后，用平板读取器(Multiskan BICHROMATIC)测定了每个孔因产生甲月替(formazan)引起的吸收度(450nm)，根据如下公式计算了OV-90细胞系的增殖抑制率。
细胞增殖抑制率＝[(A-B)-(C-B)]x100/(A-B) A加入对照人抗体的孔的吸收度 B加入PBS的孔的吸收度(未加入OV90细胞系) C加入抗nectin-2人单克隆抗体或抗nectin-2兔多克隆抗体的孔的吸收度 在得到的抗nectin-2人单克隆抗体中，有些抗体显示出针对OV-90细胞系的强细胞增殖抑制活性或者弱细胞增殖抑制活性。此外，终浓度30μg/mL的抗nectin-2兔多克隆抗体(N2-No.1)显示出针对OV-90细胞系的约10％的增殖抑制活性。各个抗nectin-2人单克隆抗体(终浓度30μg/mL)的体外OV-90细胞系增殖抑制率均示于表6。
通过温育各个杂交瘤又制备了在上述初步筛选中显示相对较强的体外OV-90细胞系增殖抑制活性的30个抗体，随后通过蛋白A柱层析和凝胶过滤HPLC进行纯化。利用产生的高纯度抗体样品，通过上述操作测定了针对OV-90细胞系的浓度依赖性(100μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL和0.03μg/mL)细胞增殖抑制活性。结果选择了8个抗nectin-2人单克隆抗体(Nec1-803-2、Nec1-520-1、Nec1-530-1、Nec1-845-2、Nec1-834-1、Nec1-244-3、Nec1-303-2和Nec1-903-1)，其显示强的OV-90细胞系浓度依赖性增殖抑制活性，有良好的再现性。即使将OV-90细胞系移至96孔细胞培养板上，然后向其中加入抗体溶液，这些抗体也显示相同的活性。上述8个抗nectin-2人单克隆抗体的OV-90细胞系增殖抑制活性均示于表7。
表3
表3A


表4
表5 表6 表7 实施例7抗Nectin-2人单克隆抗体的ADCC(antibody-dependentcellular cytotoxicity) 对于实施例1中制作的抗Nectin-2人单克隆抗体，测定其中的Nec1-803-2、Nec8-4116-8、Nec1-520-1、Nec1-530-1、Nec1-845-2、Nec8-3941-4、Nec1-834-1、Nec1-244-3、Nec1-918-2、Nec8-3806-1、Nec1-303-2、Nec1-903-1的ADCC。以人卵巢癌细胞系OV-90作为靶细胞，作为效应细胞，将市售冷冻人外周血单核细胞(旭Techno Glass公司)在含10nM重组型人IL-2(DIACLONE Research公司)、55μM 2-巯基乙醇(Invitrogen公司)、和10％FBS(JRH公司)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)中培养一夜后使用。
按实施例6所述的方法回收对数增殖期的OV-90细胞系，对1x106个细胞添加250μCi的Na251CrO4(Amersham Biosciences公司公司名变更为GE Healthcare公司)，37℃温育1小时，来进行51Cr标记。将这些细胞用含有0.4％BSA(Invitrogen公司)的RPMI1640培养基(以下称为0.4％BSA/RPMI培养基)清洗4次后，以1x105个/mL重悬于0.4％BSA/RPMI培养基。将靶细胞悬浮液100μL(1x104细胞)与将上述抗Nectin-2人单克隆抗体用0.4％BSA/RPMI培养基稀释成终浓度0.015μg/mL、0.15μg/mL和1.5μg/mL而得的溶液50μL添加到96孔RMC板(BIOBIK公司)的各孔中。作为阴性对照，添加了相同量的非免疫人IgG(最终浓度1.5μg/mL)或者D-PBS(Invitrogen公司)。将这些板在冰上温育1小时后，各添加5x105个/孔的上述效应细胞悬浮液(效应细胞∶靶细胞＝50∶1)，5％二氧化碳气流中、37℃反应4小时。将各孔的细胞悬浮液转移到96孔multiscreen45μm(Millipore公司)中，通过离心分离操作回收培养上清。在这些培养上清中，使用γ计数器(AccuFLEX γ7000；Aloka Co.)测定从细胞内漏出的放射活性(样品释放，sample release)。在培养上清中检测到的放射活性，在添加最终浓度1％的Triton-X 100(Sigma公司)时，为ADCC的最大毒性活性(最大释放，maximum release)；或者，在添加含10％FBS的RPMI1640培养基代替效应细胞时，为自然释放活性(自然释放，spontaneous release)。作为ADCC强度指标的比裂解(specific lysis)(％)是这样求出的(〔样品释放〕-〔自然释放〕)/(〔最大释放〕-〔自然释放〕)x100(表8)。添加非免疫人IgG(最终浓度1.5μg/mL)时和添加D-PBS时的ADCC(比裂解(％))均为17％，与此相对，亚类属于IgG1的抗Nectin-2人单克隆抗体Nec1-803-2、Nec8-4116-8、Nec1-520-1、Nec1-530-1、Nec1-845-2、Nec8-3941-4、Nec1-834-1、Nec1-903-1的ADCC均显著地高，在1.5μg/mL的情况下分别为35％、34％、30％、27％、30％、34％、31％、32％。特别是抗体4116-8显示出比其它抗Nectin-2人单克隆抗体抗体更强的ADCC，其在最终浓度0.015μg/mL的情况下比裂解仍为33％。
表8 实施例8抗Nectin-2人单克隆抗体的附加制作 除实施例1中制作的抗体外，采用以下免疫KM小鼠，附加制作了抗Nectin-2人单克隆抗体。即，将等容量混合参考例16中制备的Nectin-2ED-Fc蛋白质(1.6mg/mL PBS溶液)与弗氏完全佐剂(Difco公司)而制备成的乳液免疫到5只KM小鼠(10周龄、12周龄、雄；Kirin Brewery(株))的皮下和皮内，分别免疫50μg/只。2周后，将使用弗氏不完全佐剂(Difco公司)制作的相同蛋白质乳液免疫到KM小鼠5只的皮下和皮内，分别免疫25μg/只。再2周后，用10μg/只的相同乳液进行免疫。
免疫开始前和第3次免疫1周后，醚麻醉下从所有小鼠的眼底采血，获得了抗血清，按实施例1记载的方法考察了血清抗体效价。对于确认了充分的血清抗体效价上升的KM小鼠，分别尾静脉注射10μg/只的Nectin-2ED-Fc，按实施例1记载的方法，附加获取了抗Nectin-2人单克隆抗体产生杂交瘤，从其培养上清制备了抗体。
实施例9抗Nectin-2人单克隆抗体对Nectin-1、Nectin-3、Nectin-4、Nec1-5蛋白质的交差反应性 为了确认实施例1中制作的抗Nectin-2人单克隆抗体的对人Nectin-2的特异性，通过使用这些蛋白质的瞬时表达细胞的流式细胞术法(以下称为FCM)考察了对人Nectin家族蛋白质(Nectin-1、Nectin-3、Nectin-4)和人Nec1-5的交差反应性。具体地，将CHO-K1细胞系在T75培养瓶中使用含10％FBS(JRH公司)的DMEM和F-12的等量混合培养基(Invitrogen公司)，于5％二氧化碳气流中、37℃培养1～2日。在该细胞约90％铺满时，用参考例18中制作的pEE12.4-Nectin-2δ、参考例29中制作的pCMV-Tag4-Nectin-1、pCMV-Tag4-Nectin-3、pCMV-Tag4-Nectin-4、pCMV-Tag4-Nec1-5、和作为阴性对照质粒的pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)利用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)按附带规程进行了转染。4小时后，将这些基因导入CHO-K1细胞的培养基更换为新鲜的上述培养基，继续培养2日。将这些细胞用D-PBS清洗2，使用Cell Dissociation Bufferenzyme-free，PBS-based(Invitrogen公司)剥离细胞，用含1％FBS、0.1％叠氮化纳的D-PBS(-)(以下称为FCM缓冲液)以5×106个/mL的密度将其重悬。分别在96孔V底板中加入这些细胞悬浮液各30μL，再加入用FCM缓冲液稀释成15μg/mL的抗人Nectin-2人单克隆抗体(Nec1-803-2、Nec1-520-1、Nec1-530-1、Nec1-834-1、Nec1-244-3、Nec1-303-2、Nec1-903-1、或者Nec8-4116-8)和、阳性对照抗体〔抗人Nectin-1小鼠单克隆抗体(ZYMED公司)、参考例14中制作的抗Nectin-2兔多克隆抗体N2-No.2、参考例27中制作的抗人Nectin-3兔多克隆抗体、抗人Nectin-4山羊多克隆抗体(R&D公司)、或者抗人Nec1-5小鼠单克隆抗体(LAB VISION公司)〕20μL(最终浓度6μg/mL)，在冰上反应1小时。在各孔中加入FCM缓冲液200μL，通过离心分离操作清洗1次后，每1孔加入50μL的用FCM缓冲液稀释成10μg/mL的Alexa488标记第二抗体并使之悬浮，然后在冰上反应1小时。而且，在作为第一抗体使用人抗体、小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体时，分别使用Alexa Fluor488goat anti-human IgG(H+L)、Alexa Fluor488goat anti-mouse IgG(H+L)、Alexa Fluor488goat anti-rabbit IgG(H+L)、Alexa Fluor488donkey anti-goat IgG(H+L)(Invitrogen公司)作为第二抗体。将这些细胞再用FCM缓冲液清洗2次后，重悬于250μL的FCM缓冲液中，用流式细胞仪MPL500(BECKMAN COULTER公司)测定了染色细胞的荧光强度。对于各抗体，计算如下比值各基因导入CHO-K1细胞的荧光强度中位值/阴性对照质粒pcDNA3.1(+)导入CHO-K1细胞的荧光强度中位值，其结果示于表9。该比值为1时，表示抗体完全不与该蛋白质结合，比值越大表示抗体与该蛋白质的结合越强。由这些结果可知用于本实验的8种抗人Nectin-2人单克隆抗体不与其它人Nectin家族蛋白质(Nectin-1、Nectin-3、Nectin-4)和人Nec1-5发生交差反应，是人Nectin-2特异性的抗体。
表9 实施例10抗Nectin-2人单克隆抗体的Nectin-2-Nectin-2反式结合抑制活性 通过利用时间分辨荧光法的下述方法定量地评价了实施例1和实施例8中所得的抗Nectin-2人单克隆抗体的Nectin-2-Nectin-2反式结合抑制活性。首先，将参考例16中制备的Nectin-2ED-Fc蛋白质1mg通过使用VIVASPIN MWCO 30,000(VIVA SCIENCE公司)的超滤法浓缩交换到50mM碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中，制备了4mg/mL的溶液。在该Nectin-2ED-Fc溶液中添加DELFIA Eu-Labeling kit(Perkin Elmer公司)附带的Eu-标记试剂并混合后，4℃反应一夜。通过上述超滤法从反应混合物中除去未反应的Eu3+，同时将缓冲液更换为PBS，制备了Eu标记Nectin-2ED-Fc。此时的Eu3+导入数为相对于1分子的Nectin-2-ED-Fc为5.23分子。然后，将Nectin-2ED-Fc用50mM碳酸钠缓冲液(pH 9.6)稀释成5μg/mL的浓度，将其以100μL/孔添加在Wallac Delfia用板(Perkin Elmer公司)上，室温反应5小时。其后，向各孔分别添加200μL的含2％BSA的PBS，4℃封闭过夜。将该板用0.05％Tween20-PBS(PBS-T)清洗2次后，将用含0.2％BSA的PBS稀释成600μg/mL的抗Nectin-2人单克隆抗体或者对照hIgG(HumanIgG Whole molecule Chrom Pure；Jackson公司)与用含0.2％BSA的PBS稀释成6.4μg/mL的Eu标记Nectin-2ED-Fc等量混合，将其与100μL/孔的量添加，室温反应1.5小时。将该板用PBS-T清洗6次后，以200μL/孔添加Enhancement Solution(Perkin Elmer公司)，用板混合器室温下搅拌1分钟。使用ARVO 1420Multilabel Counter(Perkin Elmer公司)测定这样反应后的各孔的615nm处的荧光(激发光340nm、延迟时间400μ秒)，通过下述算式计算出Nectin-2-Nectin-2反式结合抑制率。
Nectin-2-Nectin-2反式结合抑制率(％)＝(A-B)×100/A A使用对照hIgG时的读数值 B使用抗Nectin-2人单克隆抗体时的读数值 各抗Nectin-2人单克隆抗体的Nectin-2-Nectin-2反式结合抑制活性总结示于表10。
表10 实施例11抗Nectin-2人单克隆抗体的ADCC(Antibody-dependentcellular cytotoxicity) 在实施例1中制作的抗Nectin-2人单克隆抗体中，测定了组I的Nec1-964-1、组IV的Nec1-303-1、Nec1-554-1、Nec1-1302-2、组V的Nec1-769-2、Nec1-1305-1、组VI的Nec1-141-3、Nec1-209-2、Nec1-909-1、Nec1-847-2、Nec1-803-2、组VII的Nec8-4116-8的ADCC。以人卵巢癌细胞系OV-90作为靶细胞，作为效应细胞，将市售冷冻人外周血单核细胞(旭Techno Glass公司)在含10nM重组型人IL-2(DIACLONE Research公司)、55μM2-巯基乙醇(Invitrogen公司)、和10％FBS(JRH公司)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)中培养一夜后使用。
按实施例6所述的方法回收对数增殖期的OV-90细胞系，对1x106个细胞添加250μCi的Na2 51CrO4(Amersham Biosciences公司公司名变更为GE Healthcare公司)，37℃温育1小时，来进行51Cr标记。将这些细胞用含有0.4％BSA(Invitrogen公司)的RPMI1640培养基(以下称为0.4％BSA/RPMI培养基)清洗4次后，以1x105个/mL重悬于0.4％BSA/RPMI培养基。将靶细胞悬浮液100μL(1x104细胞)与将上述抗Nectin-2人单克隆抗体用0.4％BSA/RPMI培养基稀释成终浓度0.015μg/mL、0.15μg/mL和1.5μg/mL而得的溶液50μL添加到96孔RMC板(BIOBIK公司)的各孔中。作为阴性对照，添加了相同量的非免疫人IgG(最终浓度1.5μL/mL)或者D-PBS(Invitrogen公司)。将这些板在冰上温育1小时后，各添加5x105个/孔的上述效应细胞悬浮液(效应细胞∶靶细胞＝50∶1)，5％二氧化碳气流中、37℃反应4小时。将各孔的细胞悬浮液转移到96孔multiscreen45μm(Millipore公司)中，通过离心分离操作回收培养上清。在这些培养上清中，使用γ计数器(AccuFLEXγ7000；Aloka Co.)测定从细胞内漏出的放射活性(样品释放，sample release)。在培养上清中检测到的放射活性，在添加最终浓度1％的Triton-X 100(Sigma公司)时，为ADCC的最大毒性活性(最大释放，maximum release)；或者，在添加含10％FBS的RPMI1640培养基代替效应细胞时，为自然放出活性(自然释放，spontaneous release)。作为ADCC强度指标的比裂解(specific lysis)(％)是这样求出的(〔样品释放〕-〔自然释放〕)/(〔最大释放〕-〔自然释放〕)x100(表11和表12)。
添加非免疫人IgG(最终浓度1.5μg/mL)时和添加D-PBS时的ADCC(比裂解(％))分别为4％、3％，与此相对，组I的抗Nectin-2人单克隆抗体Nec1-964-1、组IV的Nec1-554-1、Nec1-1302-2、Nec1-769-2、组VI的Nec1-803-2、组VII的Nec8-4116-8的ADCC显著地高，在抗体最终浓度1.5μg/mL的情况下分别为12％、19％、15％、12％、15％、17％。特别是，组IV的Nec1-554-1和组VII的Nec8-4116-8显示出比其它抗Nectin-2人单克隆抗体更强的ADCC，其在抗体最终浓度0.15μg/mL的情况下的比裂解分别为15％、12％。
表11
表12 实施例12抗Nectin-2人单克隆抗体的in vivo抗肿瘤活性 对于在实施例1中所得的抗Nectin-2人单克隆抗体，在OV-90人卵巢癌细胞系的裸小鼠皮下移植模型中考察了其中的Nec1-803-2、Nec1-964-1、Nec1-303-2、Nec1-554-1SP3、Nec1-1302-2、Nec1-769-2、Nec1-1305-1、Nec1-141-3、Nec1-209-2、Nec1-909-1和Nec1-847-2的抗肿瘤活性。使用的各抗Nectin-2人单克隆抗体标准品采用参考例28所述的方法制备。对于OV-90细胞系，使用含15％FBS(JRH公司)的MCDB105(Sigma公司)和Medium199(Sigma公司)的等量混合培养基，将其播种于150cm2组织培养培养瓶(Corning公司)，在5％二氧化碳气流中37℃进行培养。通过胰蛋白酶-EDTA处理进行剥离，将得到的对数增殖期的OV-90细胞系悬浮液采用离心分离操作(1,000rpm、3分钟)用Hank’s Balanced SaltSolution(HBSS)(Invitrogen公司)清洗3次。将这样得到的细胞以8x107个/mL的密度重悬于HBSS。
将从Nippon Crea购买的裸小鼠(BALB/cAJcl-nu/nu)(5周龄、雌)驯化喂养1周后，腹侧皮下接种100μL/个体的上述OV-90细胞悬浮液。细胞接种10日后，用测径器测定OV-90肿瘤块的长径和短径，按下述算式计算出肿瘤体积。
肿瘤体积(mm3)＝长径x(短径)2/2 从移植了OV-90细胞系后的上述裸小鼠中选出有肿瘤块生长的小鼠，测定各个体的体重后，进行分组，使得各组的平均肿瘤块体积均等(约50mm3)。在细胞接种的第10、13、17、20、24、27、31日，分别尾静脉施用10mL/kg的用PBS稀释成0.15mg/mL的上述抗Nectin-2人单克隆抗体溶液或者PBS，同时采用上述方法测定了肿瘤体积。抗Nectin-2人单克隆抗体的增殖抑制活性，基于药物施用开始4周后的肿瘤体积，按下述算式计算出T/C(处置/对照，Treatment/Control)值。此外，施用组间的显著差异检验采用用了参数Dunnet型多重比较检验(parametric Dunnett multiplecomparison test)(SAS前临床软件包版本5.0)。
T/C(％)＝[(抗体施用组中药物施用开始时起的肿瘤体积的增加量)/(PBS施用组中药物施用开始时起的肿瘤体积的增加量)]x100 上述抗Nectin-2人单克隆抗体中，存在强抑制或弱抑制OV-90细胞系肿瘤块增殖的抗体。各抗Nectin-2人单克隆抗体的T/C和对于PBS施用组的显著差异检验值(P值)总结示于表13。
表13 实施例13抗Nectin-2人单克隆抗体的结合域解析 作为抗Nectin-2人单克隆抗体的表位探索方法之一，通过使用这些蛋白质的瞬时表达CHO-K1细胞的FCM考察了对于Nectin-2的Ig1域(序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的第47～142位)缺陷蛋白质和Ig2域(序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的第175～240位)缺陷蛋白质的反应性。具体地，按照与实施例9相同的方法，制作了瞬时表达参考例18中制作的pEE12.4-Nectin-2δ、和参考例30中制作的pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg1、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg2、或作为阴性对照的pcDNA3.1(+)的CHO-K1细胞的悬浮液。将这些细胞悬浮液分别添加到96孔V底板的各孔中，每孔30μL，向其中分别加入20μL的用FCM缓冲液稀释成15μg/mL的数种实施例1中制作的抗人Nectin-2单克隆抗体或参考例14中制作的抗Nectin-2兔多克隆抗体N2-No.2(终浓度6μg/mL)，在冰上反应1小时。在各孔中加入FCM缓冲液200μL，通过离心分离操作清洗1次后，分别加入用FCM缓冲液稀释成10μg/mL的Alexa488标记第二抗体50μL并混合，在冰上反应1小时。作为Alexa488标记第二抗体，对于人抗体使用了Alexa Fluor488goat anti-human IgG(H+L)，对于兔抗体使用了Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG(H+L)(Invitrogen公司)。将各孔的细胞用FCM缓冲液清洗2次后，将其重悬于250μL的FCM缓冲液，使用流式细胞仪MPL500(BECKMAN COULTER公司)测定了染色细胞的荧光强度，将各抗体的第一抗体添加组的荧光强度中位值/阴性对照组的荧光强度中位值的比值作为对各基因导入CHO-K1细胞的反应性示于表14和15。表中，对pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg1导入细胞和pcDNA3.1(+)-Nectin-2ΔIg2导入细胞的反应性分别以delta-Ig1、delta-Ig2表示，将对阴性对照的比值为2以上的规定为有反应性，将与Delta-Ig1的比为2以上且与delta-Ig2的比为2以下的判断为识别Nectin-2的Ig2域的抗体，或者将与delta-Ig1的比值为2以下且与delta-Ig2的比值为2以上的判断为识别Nectin-2的Ig1域的抗体。此外，上述中的任一比值均为2以下的反应性的抗体的结合域(表位域)描述为“未知(unknown)”。
其结果表明属于表位组IV的抗体识别Nectin-2的Ig2域。此外，还表明属于表位组V和VI的抗体识别Nectin-2的Ig1域。
表14 表15 实施例14抗Nectin-2单克隆抗体对食蟹猴Nectin-2的交差反应性 通过使用食蟹猴Nectin-2瞬时表达CHO-K1细胞的FCM考察了实施例1中制作的抗Nectin-2人单克隆抗体对食蟹猴Nectin-2的交差反应性。采用与实施例9相同的方法，分别制作了瞬时表达参考例18中制作的pEE12.4-Necin-2δ、参考例32中制作的pcDNA3.1(+)-maNectin-2、或者作为阴性对照的pcDNA3.1(+)的CHO-K1细胞悬浮液。将这些细胞悬浮液分别添加到96孔V底板的各孔中，每孔30μL，向其中分别加入20μL的用FCM缓冲液稀释成15μg/mL的数种实施例1中制作的抗人Nectin-2单克隆抗体或参考例14中制作的抗Nectin-2兔多克隆抗体N2-No.2(终浓度6μg/mL)，在冰上反应1小时。在各孔中加入FCM缓冲液200μL，通过离心分离操作清洗1次后，分别加入用FCM缓冲液稀释成10μg/mL的Alexa488标记第二抗体50μL并混合，在冰上反应1小时。作为Alexa488标记第二抗体，对于人抗体使用了Alexa Fluor488 goat anti-human IgG(H+L)，对于兔抗体使用了Alexa Fluor488 goat anti-rabbit IgG(H+L)(Invitrogen公司)。将各孔的细胞用FCM缓冲液清洗2次后，将其重悬于250μL的FCM缓冲液，使用流式细胞仪MPL500(BECKMAN COULTER公司)测定了染色细胞的荧光强度，确认了各抗体的结合反应性。将各抗体的第一抗体添加组的荧光强度中位值/阴性对照组的荧光强度中位值的比值示于表16。由该结果可知实施例1中制作的抗人Nectin-2人单克隆抗体中存在不与食蟹猴Nectin-2交差反应的抗人Nectin-2人单克隆抗体。属于组IVb的Nec1-554-1、属于表位组VI的Nec1-319-2、Nec1-843-1、属于表位组VII的Nec8-4116-8显示出对食蟹猴Nectin-2的交差反应性。与此相对，属于表位组VI的Nec1-111-3、Nec1-144-1、Nec1-209-2、Nec1-244-3、Nec1-316-1、Nec1-332-1、Nec1-520-1、Nec1-530-1、Nec1-704-1、Nec1-730-4、Nec1-803-2、Nec1-834-1、Nec1-843-1、Nec1-845-2、Nec1-903-1、Nec1-909-1、Nec1-918-2、Nec1-1214-5、Nec8-4024-5未显示出对食蟹猴Nectin-2的交差反应性。
表16 实施例15抗Nectin-2人单克隆抗体对导入了食蟹猴型变异的Nectin-2的交差反应性 通过使用导入了食蟹猴型变异的人Nectin-2的瞬时表达CHO-K1细胞的FCM考察了实施例1中制作的抗Nectin-2人单克隆抗体对导入了食蟹猴型变异的人Nectin-2的交差反应性。按照与实施例9相同的方法，制作了瞬时表达参考例18中制作的pEE12.4-Necin-2δ，参考例33中制作的导入了食蟹猴型变异的Nectin-2的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2(AN77-78PD)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2(G 113R)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2(H128R)，和作为阴性对照的pcDNA3.1(+)的CHO-K1细胞悬浮液。将这些细胞悬浮液分别添加到96孔V底板的各孔中，每孔30μL，向其中分别加入20μL的用FCM缓冲液稀释成15μg/mL的数种实施例1中制作的抗人Nectin-2单克隆抗体(终浓度6μg/mL)，在冰上反应1小时。在各孔中加入FCM缓冲液200μL，通过离心分离操作清洗1次后，加入用FCM缓冲液稀释成10μg/mL的Alexa Fluor488 goat anti-human IgG(H+L)50μL，悬浮之，在冰上反应1小时。将各孔的细胞用FCM缓冲液清洗2次后，将其重悬于250μL的FCM缓冲液，使用流式细胞仪MPL500(BECKMAN COULTER公司)测定了各染色细胞的荧光强度，将各抗体的第一抗体添加组的荧光强度中位值/阴性对照组的荧光强度中位值的比值示于表17。由该结果可知属于组VI的Nec1-111-3、Nec1-209-2、Nec1-244-3、Nec1-316-1、Nec1-332-1、Nec1-520-1、Nec1-530-1、Nec1-704-1、Nec1-730-4、Nec1-803-2、Nec1-834-1、Nec1-843-1、Nec1-845-2、Nec1-903-1、Nec1-909-1、Nec1-918-2、Nec1-1214-5、Nec8-4024-5相对于G113R和H128R等同地结合Nectin-2，但不结合AN77-78PD。该结果提示这些人单克隆抗体识别Nectin-2的含Ala77或Asn78的区域的可能性。另一方面，属于组IVb的Nec1-554-1、属于组VI的Nec1-144-1、Nec1-319-2、Nec1-843-1、属于组VII的Nec8-4116-8相对于AN77-78PD、G113R和H128R等同地结合Nectin-2。
表17 实施例16属于表位组V和VI的抗Nectin-2人单克隆抗体的表位解析 在实施例13中提示属于表位组V和VI的抗体识别Nectin-2的Ig1域。以更具体地确定这些抗Nectin-2人单克隆抗体的表位为目的，制备了在Nectin-2ED-Fc的Ig1域进行了1个氨基酸取代的重组蛋白质，考察了对于这些变异体的抗Nectin-2人单克隆抗体的结合活性。对于293F细胞系，用参考例15中制作的pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-hFc、和参考例34中制作的Nectin-2ED-Fc的1个氨基酸取代体的动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q37A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(P40G)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q45A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(H55A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(V60A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Y64A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q71A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(A75G)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(P76G)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(A77G)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(N78A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(H79A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q80A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(N81A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K88A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(S95A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K109A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(E117A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(D122A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(H128A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(N137A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(F145A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K147A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(V150A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(M153A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T154A)利用293Fectin(Invitrogen公司)进行了转染。然后，将这些细胞在8％二氧化碳气流中、37℃旋动培养3日，使上述质粒所编码的ectin-2ED-Fc蛋白质及其1个氨基酸变异体蛋白质[Q37A、P40G、Q45A、H55A、V60A、Y64A、Q71A、A75G、P76G、A77G、N78A、H79A、Q80A、N81A、K88A、S95A、K109A、E117A、D122A、H128A、N137A、F145A、K147A、V150A、M153A、T154A]分泌到培养上清中。从各细胞悬浮液通过离心分离操作和滤膜过滤制备培养上清，供以下的ELISA。
将实施例1中制作的抗Nectin-2人单克隆抗体Nec8-4116-8用50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释成5μg/mL的浓度，将其以50μL/孔添加到96孔半孔免疫板(Costar公司)，室温反应5小时。从各孔中除去反应液后，添加100μL/孔的含2％BSA的PBS，4℃封闭过夜。将这样制作的ELISA用板用含0.05％Tween20的PBS清洗2次后，添加50μL/孔的下述稀释液，室温反应2小时，所述稀释液是这样制得的将瞬时表达Nectin-2ED-Fc蛋白质(野生型)和上述Nectin-2ED-Fc1氨基酸取代体蛋白质的上述293F细胞系的培养上清用含0.2％BSA的PBS稀释5倍。此外，作为阴性对照，在同一板上添加293F细胞用培养基。将该板用含0.05％Tween20的PBS清洗6次后，添加50μL/孔的将实施例4中制作的生物素化抗Nectin-2人单克隆抗体用含0.2％BSA的PBS稀释成5ng/mL至20ng/mL的浓度而得到的溶液，室温反应2小时。将该板用含0.05％Tween20的PBS清洗6次，添加50μL/孔的用含0.2％BSA的PBS稀释3,000倍的Avidin-HRP(Vector公司)，室温反应2小时。将该板用含0.05％Tween20的PBS清洗6次，添加50μL/孔的TMB溶液(SureBlue Microwell TMB过氧化物酶底物)，然后室温生色1分钟，添加50μL/孔的2N硫酸(和光纯药(株))，终止酶反应。用读板器(Multiskan BICHROMATIC)测定了各孔的吸光度(450nm)。对于各个Nectin-2ED-Fc的1个氨基酸取代体的各生物素化抗Nectin-2人单克隆抗体的反应性是通过下式算出的。
反应性(％野生型)＝[吸光度(1个氨基酸取代体)-吸光度(阴性对照)]/[吸光度(野生型)-吸光度(阴性对照)]×100 在表18中，在实施例4中分类到表位组VI的抗体中，存在可见对A75G、P76G和N78A的结合力低下的抗体，以及可见对A75G、P76G、N78A和N137A结合力低下的抗体，这提示前者的抗体组识别包含Ala75、Pro76、Asn78的表位，后者的抗体组识别包含Ala75、Pro76、Asn78、和Asn137的表位。此外，实施例4中分类到表位组V的抗体可见对F145A的反应性低下，这提示这些抗体识别含有Phe145的表位。
表18
实施例17属于表位组I和VII的抗Nectin-2人单克隆抗体的表位解析 为了对实施例1获得的抗Nectin-2人单克隆抗体的表位进行更详细的鉴定，制备了在Nectin-2ED-Fc的Ig2域中进行了1氨基酸取代的重组蛋白质，并研究了它们的结合活性。利用293fectin(Invitrogen公司)向293F细胞系中转染参考例15制备的pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-hFc和参考例35制备的下列Nectin-2ED-Fc 1氨基酸取代体型动物细胞用表达载体pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(Q165A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K170A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(F173A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(P177G)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(I184A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K186A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(L197A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(W202A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(E206A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T212A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(T235A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(K239A)、pcDNA3.1(+)-Nectin-2ED-Fc(A249G)，将这些细胞在8％二氧化碳气流中、37℃回旋培养3天，使得上述质粒编码的Nectin-2ED-Fc蛋白质及其1氨基酸变异体蛋白质[Q 165A、K170A、F173A、P177G、I184A、K186A、L197A、W202A、E206A、T212A、T235A、K239A、A249G]分泌到培养上清中。通过离心分离操作和滤器过滤从各细胞悬浮液制备培养上清，用于以下的ELISA。
将实施例1获得的抗Nectin-2人单克隆抗体Nec1-803-2用50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释到5μg/mL的浓度，以50μL/孔添加到96孔半孔免疫平板(Costar公司)中，室温反应5小时。除去各孔的反应液后，以100μL/孔添加含2％BSA的PBS，4℃彻夜封闭。将这样制备的ELISA用板用含0.05％Tween20的PBS清洗2次后，以50μL/孔添加瞬时表达了Nectin-2ED-Fc蛋白质(野生型)和Nectin-2ED-Fc 1氨基酸取代体蛋白质的上述293F细胞系培养上清(已用含0.2％BSA的PBS稀释25倍或者125倍)，室温反应2小时。作为阴性对照，向同一板中添加293F细胞用培养基。将该板用含有0.05％Tween20的PBS清洗6次后，以50μL/孔添加实施例4制备的生物素标记抗Nectin-2抗体(已用含0.2％BSA的PBS稀释到1μg/mL的溶液)，室温反应2小时。将该板用含0.05％Tween20的PBS清洗6次，以50μL/孔添加Avidin-HRP(Vector公司)(已用含0.2％BSA的PBS稀释3,000倍)，室温反应2小时。将该板用含有0.05％Tween20的PBS清洗6次，以50μL/孔添加TMB溶液(SureBlue Microwell TMB peroxidase substrate；Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.)后，室温显色1分钟，以50μL/孔添加2N硫酸(和光纯药(株))终止酶反应。用读板器(SPECTRAmax 340PC；Molecular Devices，Inc.)测定各孔的吸光度(450nm)。根据下式算出针对各个Nectin-2ED-Fc1氨基酸取代体的各生物素标记抗Nectin-2人单克隆抗体的反应性，将结果总结在表19中。
反应性(％野生型)＝[吸光度(1氨基酸取代体)-吸光度(阴性对照)]/[吸光度(野生型)-吸光度(阴性对照)]×100 属于表位组I的Nec1-964-1对Nectin-2ED-hFc 1氨基酸取代体的结合活性在I184A、K186A、T212A的情况下显著降低，提示该抗体识别含有Ile184、Lys186、Thr212的表位。另一方面，属于表位组VII的抗体组中，Nec8-4116-8、Nec9-1004-1、Nec9-1236-1、Nec9-1637-1对Nectin-2ED-hFc 1氨基酸取代体的结合活性在F173A的情况下显著降低，提示这些抗体识别含有Phe173的表位。
表19 实施例18表位组的细分 实施例1和实施例8制备的抗Nectin-2人单克隆抗体可如实施例4所示大体分为7个表位组，但根据此后的研究发现，它们还可以进一步细分。例如，通过对实施例4进行的拮抗抑制实验结果详细研究可知，属于表位组IV的抗体中有一组抗体与表位组VII的抗体也可显示拮抗抑制反应。这些抗体被认为同不与表位组VII显示拮抗抑制反应的表位组IV抗体有若干表位的差异，因此为了方便，进行这样的亚组化把这些抗体作为表位组IVb；将属于表位组IV而不与表位组VII显示拮抗抑制反应的抗体组作为表位组IVa(表20)。此外，属于表位组VI的抗体中有一组抗体与属于表位组I的抗体组显示拮抗抑制反应。这些抗体被认为同不与表位组I显示拮抗抑制反应的表位组VI抗体识别若干不同的表位，因此为了方便，将它们称为表位组VIa。而且，对于实施例16中属于表位组VI且与表位组I不显示拮抗抑制反应的抗体组，将其分为显示对A75G、P76G和N78A结合力降低的抗体组，以及显示对A75G、P76G、N78A和N137A的结合力降低的抗体组。因此，将显示针对A75G、P76G和N78A的结合力降低的抗体组方便地称为表位组VIb，而将显示针对A75G、P76G、N78A和N137A的结合力降低的抗体组方便地称为表位组VIc(表20)。在实施例16中，属于表位组Via的抗体Nec1-141-3对任何氨基酸取代体均显示与野生型几乎等同的结合力，暗示它们与表位组VIb及Vic有表位差异。此外，在实施例17中，属于表位组VII的抗体中，发现有显示对F173A的结合力降低的抗体组。因此，将显示针对F173A的结合力降低的表位组VII所属抗体组方便地称为表位组VIIa，而将它们之外的表位组VII所属抗体组方便地称为表位组VIIb(表20)。
表20

实施例19抗Nectin-2人单克隆抗体的可变区碱基序列、氨基酸序列 通过下列手段测定实施例1制备的抗Nectin-2人单克隆抗体Nec1-244-3、Nec1-530-1、Nec1-554-1、Nec1-803-2、Nec1-834-1、Nec1-845-2、Nec1-903-1、Nec8-4116-8的可变区碱基序列、氨基酸序列。具体地说，利用SuperScriptIII Cells Direct cDNA Synthesis System(Invitrogen公司)、将3～10×105个实施例1建立的抗Nectin-2人单克隆抗体产生杂交瘤悬浮在80μLPBS中，从其中取1μL，在冰上加入到已盛有RNaseOUT 1μL和重悬浮缓冲液10μL的PCR小管中，75℃加热10分钟。然后在冰上加入10×DNaseI缓冲液1.6μL和DNaseI 5μL，室温放置5分钟后，将小管放回冰上，加入25mMEDTA 1.2μL，70℃价加热5分钟。然后加入Oligo(dT)202μL和10mM dNTPMix 1μL，70℃加热5分钟后、在冰上放置2分钟，加入5×RT缓冲液6μL、RNase OUT 1μL、SuperScriptIII RT 1μL和0.1mM DTT 1μL，50℃反应50分，再在85℃反应5分钟，合成cDNA。
将从各杂交瘤合成的上述cDNA作为模板，对于Nec1-244-3、Nec1-530-1、Nec1-803-2、Nec1-834-1、Nec1-845-2、Nec1-903-1的H链基因使用引物176(序列号176)和引物177(序列号177)、L链基因使用引物178(序列号178)和引物179(序列号179)；对于Nec8-4116-8的H链基因使用引物177和引物178，L链基因使用引物180(序列号180)和引物179；此外，对于Nec1-554-1的H链基因使用引物181(序列号181)和引物177、L链基因使用引物182(序列号182)和引物179，分别通过PCR法加以扩增。该反应中反应液的组成为包含上述cDNA 4μL、KOD-Plus-(TOYOBO公司)1U、引物各0.3μM、dNTPs 200μM、MgSO41mM、10×PCR缓冲液(TOYOBO公司)，合计50μL。PCR如下进行94℃·2分钟后，重复进行94℃·15秒、60℃·30秒、68℃·1分的循环30次，然后68℃加热5分钟。对于H链基因，使用PCR终了后的反应液1μL作为模板，再次进行上述同样PCR。该PCR产物用PCR Purification Kit(QIAGEN公司)进行纯化，用EB缓冲液75uL洗脱。
用于测定DNA碱基序列的反应如下进行使用包含上述PCR产物纯化溶液10μL、ABI PRISM BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit CycleSequencing Mix(Applied Biosystems公司)8μL及引物183(序列号183)3.2pmol的体积20μL的溶液，96℃·2分后，重复进行96℃·10秒、50℃·5秒、60℃·4分的循环25次。反应液的纯化是利用Sephadex G-75Superfine(GE healthcare公司)置换为蒸馏水30μL。将反应生成物提供给DNA序列分析装置ABI PRISM 3100(Applied Biosystems公司)，根据该装置自带的手册进行DNA序列测定。依照通常方法根据DNA序列推定各抗体的氨基酸序列。
其结果可知，Nec1-244-3的H链可变区为编码序列号187所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号191)、Nec1-244-3的L链可变区编码序列号195所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号199)、Nec1-530-1的H链可变区为编码序列号203所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号207)、Nec1-530-1的L链可变区为编码序列号211所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号215)、Nec1-554-1的H链可变区为编码序列号219所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号223)、Nec1-554-1的L链可变区为编码序列号227所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号231)、Nec1-803-2的H链可变区为编码序列号235所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号239)、Nec1-803-2的L链可变区为编码序列号243所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号247)、Nec1-834-1的H链可变区为编码序列号251所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号255)、Nec1-834-1的L链可变区为编码序列号259所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号263)、Nec1-845-2的H链可变区为编码序列号267所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号271)、Nec1-845-2的L链可变区为编码序列号275所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号279)、Nec1-903-1的H链可变区为编码序列号283所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号287)、Nec1-903-1的L链可变区为编码序列号291所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号295)、Nec8-4116-8的H链可变区为编码序列号299所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号303)、Nec8-4116-8的L链可变区为编码序列号307所表示的氨基酸序列的碱基序列(序列号311)。
其中所得的抗体的重链的CDR1～3(氨基酸序列)的组合如表21中记载的。此外，其抗体轻链的CDR1～3(氨基酸序列)的组合如表22中记载的。此外，其中所得的抗体的重链的CDR1～3(碱基序列)为编码表21所述的氨基酸序列的碱基序列，其组合如表23中记载的。此外，其中所得的抗体的轻链的CDR1～3(碱基序列)为编码表22所述的氨基酸序列的碱基序列，其组合如表24中记载的。
进一步地，其中所得的抗体的可变区的氨基酸序列和碱基序列如表25中记载的。
为供参考，图1显示了上述各抗体的H链和L链可变区的氨基酸序列，图2和3显示了它们各自的碱基序列。
表21抗Nectin-2抗体重链的CDR序列(氨基酸序列)

序列后括号内的数字表示序列号。
表22抗Nectin-2抗体轻链的CDR序列(氨基酸序列)
序列后括号内的数字表示序列号。
表23抗Nectin-2抗体重链的CDR序列(碱基序列)
序列后括号内的数字表示序列号。
表24抗Nectin-2抗体轻链的CDR序列(碱基序列)
序列后括号内的数字表示序列号。
表25抗Nectin-2抗体可变区的碱基序列和氨基酸序列
针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质、其部分肽或其盐的人单克隆抗体可以安全地用作例如癌(例如大肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、精巢癌、甲状腺癌、胰癌、脑肿瘤、血液肿瘤等)的预防和/或治疗剂(优选、乳腺癌、肺癌、大肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰癌等的预防和/或治疗剂)、癌细胞凋亡促进剂、癌细胞增殖抑制剂、癌细胞细胞周期变化诱发剂、效应细胞依赖性癌细胞毒剂等。
参考例36抗Nectin-2人单克隆抗体的制备 将(i)使编码参考例16制备的Nectin-2δ的胞外区(Met1-Gly361)与人IgG1抗体Fc区(Pro217-Lys447)的融合蛋白质的动物细胞表达载体在人293F细胞系(Invitrogen公司)中瞬时表达而制备的重组Nectin-2ED-hFc融合蛋白质(1.6mg/mL PBS溶液)或(ii)参考例13中使编码Nectin-2δ的胞外区(Met1-Gly361)与FLAG标签(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)的融合蛋白质的动物细胞表达载体在人293F细胞系(Invitrogen公司)中瞬时表达而制备的重组Nectin-2ED-FLAG融合蛋白质(2mg/mL PBS溶液)与弗氏完全佐剂(Difco公司)等体积混合，制备乳液。
将这些乳液分别以10～50μg/只在KM小鼠(10周龄、12周龄、雄；麒麟啤酒(株))各5只的皮下和皮内进行初次免疫。从第二次及以后，用重组Nectin-2ED-hFc蛋白质或重组Necin-2ED-FLAG蛋白质与弗氏不完全佐剂(Difco公司)等量混合制备的乳液同样地每2周一次进行附加免疫。此外，将稳定表达Nectin-2δ的重组FM3A细胞系(#60-6)(参见PCT/JP2006/320429)或稳定表达Nectin-2δ的重组NS0细胞系(#2-75)进行培养瓶培养，回收，通过清洗操作除去血清成分后，用丝裂霉素C(和光纯药(株))37℃处理30分钟。将经丝裂霉素C处理后的两种细胞系用10mLPBS清洗3次后，以2x107个/mL重悬于PBS中，将它们分别以1x107个/500μL每周一次地反复对KM小鼠(麒麟啤酒(株)；10周龄-12周龄、雄)各5只进行腹腔内免疫。
此外，用上述重组Nectin-2ED-hFc蛋白质或重组Nectin-2ED-FLAG蛋白质与弗氏完全佐剂等体积混合制得的乳液以10～50μg/只分别皮下和皮内免疫KM小鼠(12周龄、雄)各5只，作为初次免疫。初次免疫1周后，将通过上述方法丝裂霉素处理过的Nectin-2δ表达型重组FM3A细胞系以1x107个/500μL腹腔内免疫。第3次是用将重组Nectin-2ED-hFc或重组Nectin-2ED-FLAG与弗氏不完全佐剂等体积混合而制备的乳液分别皮下和皮内免疫，同时用经过丝裂霉素C处理的Nectin-2δ表达型重组FM3A细胞系(#60-6)以1x107个/500μL每周一次腹腔内免疫。第4次及其以后是仅用经上述方法丝裂霉素C处理后的Nectin-2δ表达型重组FM3A细胞系(#60-6)以1x107个/500μL腹腔内免疫。
在免疫开始前和免疫后，对全体小鼠在乙醚麻醉下进行眼底采血获得抗血清，通过下文叙述流式细胞术考察血清抗体效价。即，将稳定表达Nectin-2δ的重组CHO细胞系(#43-2)(参见PCT/JP2006/320429)和模拟-CHO细胞系的细胞悬浮液(PBS)分别以5x105个分加到聚丙烯小管中，离心分离(1,200rpmx5分)除去PBS。将这些细胞残渣用上述小鼠抗血清(已用含1％BSA和10％FBS的PBS稀释了100倍)各50μL重悬浮，在冰上黑暗中反应30分钟。向该细胞悬浮液中添加PBS 200μL，离心分离(1,200rpmx5分)后，吸引除去上清液，将细胞残渣重悬浮于抗人IgG(H+L)Alexa488(Invitrogen公司)溶液(已用含1％BSA和10％FBS的PBS稀释了100倍)50μL中，在冰上黑暗中反应30分钟。将该细胞悬浮液同样用PBS清洗3次后，将细胞残渣重悬浮于PBS 200μL中，使用流式细胞仪MPL500(BECKMAN COULTER公司)测定各细胞的荧光强度，横轴取荧光强度、纵轴取细胞数作图，比较血清抗体效价。
在根据上述方法确认了血清抗体效价充分上升的KM小鼠中，对于用重组Nectin-2ED-hFc或重组Nectin-2ED-FLAG免疫的个体用这些蛋白质抗原尾静脉注射，对于用稳定表达Nectin-2δ的重组细胞系免疫的个体则用同一细胞系腹腔内注射。上述最终免疫3日后，放血处死该小鼠，摘出脾脏，将获得的小鼠脾脏细胞与预先驯化培养的小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8U.1(P3U1)(ATCC)以5∶1的比例混合，使用聚乙二醇(PEG)1,500(Roche Diagnotics公司)使其融合；所述驯化培养是在将1小瓶8-氮鸟嘌呤(HybriMax、Sigma-Aldrich公司)溶解在500mL含10％FBS的Daigo T培养基中所得的培养基中进行的[Daigo T培养基是向F-12NutrientMixture(HAM)(Invitrogen公司)和Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(Invitrogen公司)等量混合的培养基中添加MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen公司)、丙酮酸钠(Invitrogen公司)和L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)而成的培养基]。细胞融合操作依照试剂随附的手册进行。将融合后的细胞重悬浮于含10％FBS和10％BM Condimed H1(Roche Diagnotics公司)的Daigo T培养基中，以5x104个脾脏细胞/100μL/孔接种于96孔培养板。将板在5％二氧化碳气流中37℃培养1天后、分别添加100μL/孔的含0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、0.016mM胸苷(HAT)、10％BMCondimed H1和10％FBS的Daigo T培养基(HAT选择培养基)，并每3天2次将培养上清的3/4更换为新鲜的HAT选择培养基，同时在5％二氧化碳气流中37℃继续培养。
对于在培养第7天～第14天中观察到集落增殖的孔，用稳定表达Nectin-2δ的重组CHO细胞系(#43-2)或模拟-CHO细胞系进行Cell ELISA对其培养上清进行筛选，从而建立了抗Nectin-2人单克隆抗体产生杂交瘤。即，将稳定表达Nectin-2δ的重组CHO细胞系(#43-2)与模拟-CHO细胞系用含10％经透析的FBS和GS添加物的GS选择DMEM培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium；Invitrogen公司)在96孔组织培养板中进行培养。各细胞系达到汇合的板吸引除去培养上清后，分别添加200μL/孔的含2％FBS的PBS(+)，冰上黑暗中温育1小时。吸引除去各孔的上清液后，分别添加50μL/孔的杂交瘤培养上清，冰上黑暗中反应2小时。将该板用4℃冷却的PBS(+)清洗1次后，分别添加100μL/孔的抗人IgG(H+L)链特异性(山羊)过氧化物酶缀合物(CALBIOCHEM公司)(已用含2％FBS的PBS(+)稀释了3,000倍)，冰上黑暗中反应2小时。将用板4℃冷却的PBS(+)清洗3次后，分别添加100μL/孔的3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB)溶液(SureBlue Microwell TMB过氧化物酶底物；Kirkegaard & PerryLaboratories公司)，室温显色5分钟，分别添加100μL/孔的2N硫酸(和光纯药(株))终止酶反应。使用读板器(Multiskan BICHROMATIC；ThermoElectron Co.)测定各孔的吸光度(450nm)，将接种了Nectin-2表达重组CHO细胞系的板的吸光度为0.5以上、而接种了模拟-CHO细胞系的板的吸光度为不到0.3的孔判定为阳性孔。从它们中选择产生特别高抗原特异性和亲和性的IgG抗体的杂交瘤，重悬浮于含有10％FBS及10％BM CondimedH1的Daigo T培养基中。将这些细胞系以0.5个/孔接种到96孔组织培养板中，将通过显微镜观察确认为单克隆的杂交瘤的培养上清利用上述CellELISA进行再度筛选，建立了258种抗Nectin-2人单克隆抗体产生杂交瘤·克隆。
将这样得到的抗Nectin-2人单克隆抗体产生杂交瘤在100mL含10％FBS Ultra low IgG(Invitrogen公司)的Daigo T培养基中进行培养瓶培养，对培养上清离心分离(1,200rpmx5分)获得其上清液。将这些培养上清添加到用PBS平衡的蛋白A Sepharose FF 200μL(GE Healthcare Bio-science公司)，4℃彻夜缓慢振荡使抗体吸附。通过离心分离操作回收该蛋白A载体，用PBS清洗后，用含0.3M NaCl的0.1M甘氨酸-HCl(pH3.0)1.2mL洗脱IgG级分。向该洗脱液中加入1M Tris-HCl(pH 8.0)快速中和后，通过用超滤膜(Vivaspin 6分级分子量10kDa)(Sartorius公司)进行超滤浓缩操作将缓冲液置换为PBS，将其作为抗Nectin-2人单克隆抗体标准品用于体外特性分析。
从抗体产生杂交瘤·克隆中，获得了产生用于本发明的抗体的杂交瘤·克隆Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)、Nec8-4116-8(FERM BP-10685)、Nec1-1044-4、Nec8-3517-11或Nec8-3704-7。
参考例37与用于本发明的抗体竞争性结合Nectin-2的抗体的选择 通过如下所述的方法选择与参考例36制备的用于本发明的抗体竞争性结合Nectin-2的单克隆抗体。
首先，为了进行抗Nectin-2人单克隆抗体之间的针对Nectin-2的竞争性结合抑制反应，将参考例36获得的抗Nectin-2人单克隆抗体作为受试抗体用生物素进行标记。即，将抗Nectin-2人单克隆抗体10μg添加到BiotinLabeling Kit-NH2(Dojindo公司)所附带的WS缓冲液50μL中，用MicroconYM50(MILLIPORE公司)进行超滤浓缩直到溶液量几乎耗尽。向该液体残余中依次添加Biotin Labeling Kit-NH2附带的反应缓冲液50μL和溶于50μL DMSO的NH2反应性生物素4μL，37℃反应10分钟。将反应混合物再次进行超滤浓缩操作置换为WS缓冲液、制备生物素标记抗Nectin-2人单克隆抗体，用于以下的测定。
将参考例36制备的用于本发明的抗体(非标记抗Nectin-2单克隆抗体)(用含2％FBS的PBS稀释到25μL/mL的溶液)5μL、15μL Nectin-2δ稳定表达CHO细胞系(#43-2)在含2％FBS的PBS中重悬的悬浮液(2x105个/mL)、和链亲和素-Alexa Fluor 647缀合物(Invitrogen公司)5μL添加到FMAT板(384孔板黑色/透明底，带盖；Applied Biosystems公司)，将它们混合后，室温反应10分钟。向该板中添加5μL通过上述方法制备的生物素标记抗Nectin-2人单克隆抗体(受试抗体)(已用含2％FBS的PBS稀释到0.5μg/mL的溶液)，室温温育60分钟。设置这样的孔作为对照实验，其中添加同体积的含2％FBS的PBS来取代非标记抗Nectin-2单克隆抗体溶液。该Nectin-2竞争性结合抑制反应针对供生物素标记的受试抗体和用于本发明的抗体的所有组合来进行。用Applied Biosystems 8200 Cellular Detection系统(Applied Biosystems公司)测定各孔的荧光强度(总FL1值)。抗Nectin-2人单克隆抗体各个组合中的竞争性结合抑制率通过以下所示的公式算出。
竞争性结合抑制率＝(1-A/B)x100 A；向受试抗体添加了非标记抗体的孔的总FL1值 B；未向受试抗体添加非标记抗体的孔的总FL1值 通过本手段，例如，从参考例36制备的抗Nectin-2人单克隆抗体中选择性地获得了Nec1-1044-4和Nec1-1302-2作为与Nec1-554-1竞争性结合Nectin-2的抗体。而且，例如，选择性地获得了Nec8-3704-7和Nec8-3517-11作为与Nec8-4116-8竞争性结合Nectin-2的抗体。
表26显示了抗Nectin-2人单克隆抗体对生物素标记Nec8-4116-8与Nectin-2的结合的抑制率；表27显示了抗Nectin-2人单克隆抗体对生物素标记Nec1-554-1与Nectin-2的结合的竞争性结合抑制率。
此外，如此选择的与用于本发明的抗体竞争性结合Nectin-2的抗体Nec1-1044-4和Nec1-1302-2、Nec8-3704-7和Nec8-3517-11分别已被保藏。
表26 表27

参考例38重组抗Nectin-2人单克隆抗体(Nec8-4116-8)的大量制备 通过将重组抗Nectin-2人单克隆抗体(Nec8-4116-8)基因在CHOK1SV细胞系(Lonza Biologics)中稳定表达制备了该抗体。将用蛋白A柱从抗Nectin-2人单克隆抗体产生杂交瘤Nec8-4116-8培养上清纯化的抗体标准品在还原条件下进行SDS-聚丙烯酸酰胺凝胶电泳来分离其H链和L链，将H链、L链蛋白质转移到PVDF膜上。H链的N末端多发生焦谷氨酰化，因此使用Pfu焦谷氨酸氨肽酶(Takara Bio)进行去除焦谷氨酸的反应。对于转移到PVDF膜上的蛋白质，用蛋白测序仪(ABI)测定其N末端氨基酸序列。对于这样得到的N末端氨基酸序列(H链(序列号312)、L链(序列号313))使用V BASE(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)进行同源性检索，选择了与上述氨基酸序列一致的胚系(VH4、VKIIIA27)及从其预测的信号序列之N末端的编码碱基序列(H链(序列号314)、L链(序列号315))。合成向该信号序列添加限制性酶Hind III位点和Kozak序列而成的寡DNA作为正向引物(H链(序列号176)、L链(序列号180))。另一方面，分别合成在抗体H链和L链基因终止密码子下游添加限制性酶EcoR I位点而成的寡DNA作为反向引物(H链(序列号316)、L链(序列号317))。从杂交瘤细胞(Nec8-4116-8)用SuperScriptIII CellsDirect cDNA Synthesis System(Invitrogen公司)制备cDNA作为模板，利用上述引物进行PCR，分别获得了Nec8-4116-8抗体H链和L链的全长基因。
将这样得到的H链基因、L链基因用限制性酶HindIII、EcoRI分别消化后，将其纯化DNA片段分别插入动物细胞表达载体pEE6.4(LonzaBiologics公司)和含有谷氨酸合成酶(GS)基因的动物细胞表达载体pEE12.4(Lonza Biologics公司)的Hind III-EcoR I位点，构建了H链表达载体和L链表达载体。此外，通过限制性酶Not I/Sal I消化从各载体切出H链基因插入片段和L链基因插入片段，分离后，使其连接，构建了共同含有GS基因、H链基因和L链基因的双基因(double gene)载体。将该载体依照Lonza Biologics公司的手册转染到CHOK1SV细胞中，在含有甲硫氨酸砜亚胺(MSX)的培养基中用96孔组织培养板进行选择培养。对于单一集落增殖的孔的培养上清中的人抗体浓度用ELISA加以定量，选择了22种稳定地高表达Nec8-4116-8的重组细胞系。将这些细胞系扩大培养后，在无血清培养基中进行悬浮驯化，建立了具有高细胞增殖性和抗体生产性的Nec8-4116-8稳定表达CHOK1SV细胞系(克隆25-78)。
将上述CHOK1SV细胞系在含25μM甲硫氨酸砜亚胺(MP Biomedicals公司)和GS补充物(50×、SAFC公司)的ProCHO5培养基(Cambrex公司)中与37℃、5％二氧化碳气流中扩大培养后，用2L小型发酵罐进行32天的搅拌培养(37℃、溶氧浓度2mg/L、pH 6.7～7.0、搅拌转数80rpm、通气100～300mL/min)。在此期间中，根据培养基的成分分析添加葡萄糖溶液、L-谷氨酸溶液、GS补充物(50×、SAFC公司)、氨基酸(50×、SAFC公司)、微量元素(10,000×、SAFC公司)、维生素(100×、SAFC公司)和大豆水解物(50×、SAFC公司)。细胞生存率下降到约10％时主培养终了。
然后，将该培养上清离心分离(7,460xg、20分钟)，回收其上清液，用超滤膜(Hydrosart膜、分级分子量10,000；Sartorius公司)浓缩，置换为含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。对该浓缩液离心分离(14,300xg、20分钟)获得上清液，将其进一步滤器过滤(Stericup HV、0.45μm；Millipore公司)得到浓缩液。使其吸附到用含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡的蛋白A Sepharose柱(22mIDx79mm、GEHealthcare公司)上，用20个柱体积的相同缓冲液清洗柱子后，用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱结合在柱上的抗体级分。立即向洗脱液中添加1/10体积的1M Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)中和后，将此抗体溶液利用超滤膜(AmiconUltra、分级分子量30,000；Millipore公司)浓缩。将其加载到用PBS平衡的Superdex 200柱(26mmIDx60cm、GEHealthcare公司)上，用相同缓冲液洗脱，得到抗体单体级分。进一步将该抗体级分施加到用PBS平衡的ActiClean EtOX柱(25mmIDx59mm、Sterogene公司)上去除内毒素，用超滤膜(AmiconUltra、分级分子量10,000；Millipore公司)浓缩，无菌过滤(Millex GV、0.22μm；Millipore公司)得到重组Nec8-4116-8纯化标准品。这样得到的纯化抗体用SDS-PAGE和Superdex 200柱凝胶过滤HPLC显示95％以上的纯度。此外，用Endospecy ES-24S套装(生化学工业公司)和Toxicolor DIA套装(生化学工业公司)分析抗体标准品的内毒素含量，结果为0.1EU/mg抗体以下。
参考例39抗Nectin-2人单克隆抗体(Nec1-554-1)的大量制备 从抗Nectin-2人单克隆抗体Nec1-554-1杂交瘤细胞系(Nec1-554-1)通过下述方法制备该抗体。将杂交瘤细胞系Nec1-554-1用含10％FBS(Ultra-Low IgG，Invitrogen公司)的IH培养基(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium∶Ham’s F-12＝1∶1、0.1mM MEM非必需氨基酸溶液、1mM丙酮酸钠溶液、2mM L-谷氨酸溶液；Invitrogen公司)37℃、5％二氧化碳气流中扩大培养后，在1次驯化培养基(IH培养基∶CD杂交瘤培养基、8mM L-谷氨酸溶液＝1∶1、Invitrogen公司)中扩大培养1天，进一步在主培养培养基(IH培养基∶CD杂交瘤培养基、8mM L-谷氨酸溶液＝1∶3；Invitrogen公司)中扩大，用50L搅拌培养槽培养5～7天(37℃、溶氧浓度2mg/L、pH7.0、搅拌转数40rpm)。在此期间中，根据培养基的成分分析添加葡萄糖溶液和L-谷氨酸溶液。细胞生存率降低到约50％时点终止主培养。
然后将该培养上清离心分离(7,460xg、20分钟)回收其上清液，用超滤膜(Hydrosart膜、分级分子量10,000；Sartorius公司)浓缩，将缓冲液置换为含有0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。将其离心分离(14,300xg、20分钟)得到上清液，进一步进行微滤(Stericup HV、0.45μm；Millipore公司)得到浓缩液。使其吸附于用含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)平衡的蛋白A Sepharose柱(22mmIDx79mm、GE Healthcare公司)上，用20个柱体积的相同缓冲液清洗柱子。用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)洗脱柱上结合的抗体级分，马上添加1/10体积的1M Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)予以中和。
这样得到的纯化抗体级分例外地被发现是活性抗体和无活性抗体的混合物。因此，将抗体级分进一步用20mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)3倍稀释，使其吸附到用含100mM NaCl的20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)平衡的SP-5PW阳离子交换柱(21.5mmIDx150mm、Toso公司)上。将该柱用约2个柱体积的相同缓冲液清洗后，利用洗脱液的NaCl浓度在70分钟内从100mM上升到300mM的直线浓度梯度洗脱法，分离了3个洗脱级分。用固定化重组Nectin-2-ED-Fc蛋白质进行ELISA测定了这些洗脱级分对Nectin-2的结合活性，将显示最高比活性的抗体级分(SP3)作为抗Nectin-2抗体级分回收。将这样得到的抗体洗脱液用超滤膜(AmiconUltra、分级分子量30,000；Millipore公司)浓缩后、施加到用PBS平衡的Superdex 200柱(26mmIDx60cm、GE Healthcare Bio-Sciences公司)上，用相同缓冲液洗脱得到抗体单体级分。将其施加到PBS平衡的ActiClean EtOX柱(25mIDx59mm、Sterogene公司)除去内毒素后、用超滤膜(AmiconUltra、分级分子量10,000；Millipore公司)浓缩，进一步进行无菌过滤(Millex GV、0.22μm、Millipore公司)得到纯化抗体。将该纯化抗体命名为Nec1-554-1SP3。
这样得到的纯化抗体用SDS-PAGE和Superdex 200柱进行凝胶过滤HPLC显示95％以上的纯度。此外，用Endospecy ES-24S套装(生化学工业公司)和Toxicolor DIA套装(生化学工业公司)分析抗体标准品的内毒素含量，结果为0.1EU/mg抗体以下。
实施例20抗Nectin-2人单克隆抗体的针对人乳腺癌细胞系的ADCC 测定了参考例36和参考例37制备的抗Nectin-2人单克隆抗体Nec1-554-1、Nec1-1044-4、Nec1-1302-2、Nec8-4116-8、Nec8-3517-11、Nec8-3704-7的ADCC。将根据实施例22所述方法培养的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC)用作靶细胞，而将市售的冷冻人外周血单核细胞(ALLCELLS公司)在含0.1nM重组型人IL-2(DIACLONE Research公司)、55μM 2-巯基乙醇(Invitrogen公司)和10％胎牛血清(FBS)(JRH公司)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)(下面称为10％FBS/RPMI1640培养基)中过夜培养后用作效应细胞。Nec1-1044-4、Nec1-1302-2、Nec8-4116-8、Nec8-3517-11、Nec8-3704-7分别使用参考例36所述的抗体标准品，Nec1-554-1使用参考例39所述的抗体标准品(Nec1-554-1SP3)。
回收对数增殖期的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，对1.0x106个细胞添加250μCi的Na2 51CrO4(GE Healthcare Bio-sciences公司)，37℃温育1小时以进行51Cr标记。将该细胞系用10％FBS/RPMI1640培养基清洗4次后，对10％FBS/RPMI1640培养基以1x105个/mL重悬浮。向96孔RMC板(BIOBIK公司)的各个孔中添加细胞悬浮液50μL(5x103细胞)以及将上述抗体用10％FBS/RPMI1640培养基稀释到终浓度0.0015μg/mL、0.015μg/mL、0.15μg/mL和1.5μg/mL的溶液25μL，进行ADCC。作为阴性对照，添加相同量的非免疫人IgG(最终浓度0.0015μg/mL、0.015μg/mL、0.15μg/mL和1.5μg/mL)或者用于检测未添加抗体(No Ab)时的非特异活性的D-PBS(Invitrogen公司)。将这些板在冰上温育1小时温育后，分别添加2.5x105个/孔的上述效应细胞悬浮液(效应细胞∶靶细胞＝50∶1)，在5％二氧化碳气流中、37℃反应4小时，如实施例20所述方法同样地用闪烁计数器(TopCount NXT)测定从各孔的细胞内漏出到培养上清中的放射性(样品释放)(表34)。具体地，将反应后的细胞悬浮液转移到Multi-screen 0.45μm过滤板(Millipora公司)中，将板离心分离(1,200rpm、10分钟)回收培养上清。将50μL该培养上清50μL添加到加有150μL/孔的MicroScinti-40(PerkinElmer公司)的96孔板(Costar公司)中，室温30分钟混合后、用闪烁计数器测定各孔的荧光(表33)。ADCC的最大伤害活性(最大释放)定义为添加Triton-X 100(Sigma公司)至最终浓度1％时的放射活性，而自然释放活性(自然释放)定义为添加含10％FBS的RPMI1640培养基来代替效应细胞时的放射活性。作为ADCC强度指标的比裂解(Specific lysis)(％)按照(〔样品释放〕-〔自然释放〕)/(〔最大释放〕-〔自然释放〕)x100来算出。
表33

实施例21抗Nectin-2人单克隆抗体的针对人前列腺癌细胞系、人肺癌细胞系、人血液癌来源细胞系的ADCC 测定了参考例36制备的抗Nectin-2人单克隆抗体、Nec1-554-1、Nec8-4116-8的ADCC。将人肺癌细胞系NCI-H1299、人前列腺癌细胞系Du145、人血液癌细胞系U937用作靶细胞，而将市售的冷冻人外周血单核细胞(ALLCELLS公司)在含0.1nM重组型人IL-2(DIACLONE Research公司)、55μM 2-巯基乙醇(Invitrogen公司)、和10％胎牛血清(FBS)(JRH公司)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)(下面称为10％FBS/RPMI1640培养基)中过夜培养后用作效应细胞。人肺癌细胞系NCI-H1299、人前列腺癌细胞系Du145、人血液癌细胞系U937购自ATCC，按照ATCC推荐的方法培养这些细胞系。Nec8-4116-8使用参考例36所述的抗体标准品，Nec1-554-1则使用参考例39所述的抗体标准品(Nec1-554-1SP3)。
回收对数增殖期的各种癌细胞、对1.0x106个细胞添加250μCi的Na2 51CrO4(GE Healthcare Bio-sciences公司)，37℃温育1小时以进行51Cr标记。将该细胞系用10％FBS/RPMI1640培养基清洗4次后，对10％FBS/RPMI1640培养基以1x105个/mL重悬浮。向96孔RMC板(BIOBIK公司)的各个孔中添加细胞悬浮液50μL(5x103细胞)以及将上述抗体用10％FBS/RPMI1640培养基稀释到终浓度0.0015μg/mL、0.015μg/mL、0.15μg/mL和1.5μg/mL的溶液25μL，进行ADCC。作为阴性对照，添加相同量的非免疫人IgG(最终浓度0.0015μg/mL、0.015μg/mL、0.15μg/mL和1.5μg/mL)或者用于检测未添加抗体(No Ab)时的非特异活性的D-PBS(Invitrogen公司)。将这些板在冰上温育1小时温育后，分别添加2.5x105个/孔的上述效应细胞悬浮液(效应细胞∶靶细胞＝50∶1)，在5％二氧化碳气流中、37℃反应4小时，用闪烁计数器(TopCount NXT)测定从各孔的细胞内漏出到培养上清中的放射性(样品释放)。ADCC的最大伤害活性(最大释放)定义为添加Triton-X 100(Sigma公司)至最终浓度1％时的放射性，而自然释放活性(自然释放)定义为添加含10％FBS的RPMI1640培养基来代替效应细胞时的放射性。作为ADCC强度指标的比裂解(Specific lysis)(％)按照(〔样品释放〕-〔自然释放〕)/(〔最大释放〕-〔自然释放〕)x100来算出。
表34

实施例22抗Nectin-2人单克隆抗体的体内抗肿瘤活性(MDA-MB-231人乳腺癌细胞系SCID小鼠肺转移治疗模型) 在使用MDA-MB-231人乳腺癌细胞系(从ATCC购买)的SCID小鼠肺转移治疗模型中考察了参考例36制备的抗Nectin-2人单克隆抗体(Nec8-4116-8和Nec1-554-1)的抗肿瘤活性。Nec8-4116-8抗体标准品使用根据参考例38的方法制备的标准品，Nec1-554-1SP3抗体标准品使用根据参考例39所述的方法制备的标准品。对于MDA-MB-231细胞系，使用含10％FBS(Thermo Electron公司)的Leibovitz′s L-15(Invitrogen公司)培养基，接种到10cm组织培养盘(Corning公司)中，在不供给二氧化碳的条件下37℃培养。将通过胰蛋白酶-EDTA处理解离得到的对数增殖期MDA-MB-231细胞系的悬浮液利用离心分离操作(1,000rpm、3分)用Hank氏平衡盐溶液(HBSS)(Invitrogen公司)清洗3次。将这样得到的细胞以5x106个/mL的密度重悬浮在HBSS中。
将上述MDA-MB-231细胞悬浮液分别以200μL/个体接种到从日本CLEA公司购买的SCID小鼠(C.B-17/Icr-scid/scidJcl)(5周龄、雌)的尾静脉中。在细胞接种后第14天，测定各个体的体重后，按每组5只分组，使得各组的平均体重均等(约20g)。在Nec1-554-1の抗肿瘤活性评价实验中，于细胞接种后第14、21、28、35、42、49天，分别以10mL/kg尾静脉施用以PBS稀释到0.3mg/mL或者0.03mg/mL的Nec1-554-1SP3溶液或者PBS。另一方面，在Nec8-4116-8的抗肿瘤活性评价实验中，于细胞接种后第14、21、28、35、42、49、56天，分别以10mL/kg尾静脉施用以PBS稀释到0.3mg/mL或者0.03mg/mL的Nec8-4116-8溶液或者PBS。
通过测定肺的膈侧产生的癌集落数来评价Nec1-554-1和Nec8-4116-8的抗肿瘤活性。此外，实验组间的显著性差异用参数Dunnett型多重比较检验(SAS Preclinical Package Version 5.0)来检验。
Nec1-554-1和Nec8-4116-8在任一施用浓度均显著地(p＜0.0001)抑制了MDA-MB-231细胞在肺中的增殖。Nec1-554-1施用组和PBS施用组的癌集落数(平均±标准偏差)和两组间的显著差检验值(P值)示于表35，Nec8-4116-8施用组和PBS施用组的癌集落数(平均±标准偏差)和两组间的P值示于表36。
表35 表36 实施例23抗Nectin-2人单克隆抗体的体内抗肿瘤活性(MDA-MB-231乳腺癌细胞系SCID小鼠皮下移植治疗模型) 在使用MDA-MB-231人乳腺癌细胞系(从ATCC购买)的SCID小鼠皮下移植治疗模型中考察了参考例36制备的Nec8-4116-8和Nec1-554-1的抗肿瘤活性。Nec8-4116-8抗体标准品使用根据参考例38的方法制备的标准品，Nec1-554-1SP3抗体标准品使用根据参考例39所述的方法制备的标准品。对于MDA-MB-231细胞系，使用含10％FBS(Hyclone公司)和7.5％碳酸氢钠(Invitrogen公司)1/40体积的Leibovitz′s L-15(Invitrogen公司)培养基，接种到10cm组织培养盘(Becton Dickinson公司)中，在5％二氧化碳气流中37℃培养。将通过胰蛋白酶-EDTA处理解离得到的对数增殖期MDA-MB-231细胞系的悬浮液利用离心分离操作(1,000rpm、3分)用Hank氏平衡盐溶液(HBSS)(Invitrogen公司)清洗3次。将这样得到的细胞在HBSS与Matrigel(BD Biosciences公司)的等量混合液中重悬浮，得到3x107个/mL密度的细胞悬浮液。
将购自日本CLEA公司的SCID小鼠(C.B-17/Icr-scid/scidJcl)(5周龄、雌)驯化饲养1周后，分别以100μL/个体腹侧皮下接种上述MDA-MB-231细胞悬浮液。细胞接种28天后，用卡尺测定MDA-MB-231肿瘤块的长径和短径，用下述计算式算出肿瘤体积。
肿瘤体积(mm3)＝长径x(短径)2/2 对于接种了MDA-MB-231细胞系的上述SCID小鼠的各个体测定体重后，将它们分组，使得各组的平均肿瘤块体积均等(约170mm3)。在细胞接种后第28、31、35、38、42天，分别以10mL/kg尾静脉施用以PBS稀释到3mg/mL的上述Nec8-4116-8或者Nec1-554-1SP3抗体溶液，或者PBS，与此同时通过上述方法测定肿瘤体积。基于药物施用开始3周间后的肿瘤体积，通过下述计算式算出T/C(处理/对照)值，作为Nec8-4116-8和Nec1-554-1的增殖抑制活性。此外，实验组间的显著性差异用参数Dunnett型多重比较检验(SAS Preclinical Package Version 5.0)来检验。
T/C(％)＝[(抗体施用组中从药物施用开始时起的肿瘤体积的增加量)/(PBS施用组中从药物施用开始时起的肿瘤体积增加量)]x100 图4显示癌细胞系移植后的肿瘤体积平均值的经时变化。
Nec8-4116-8施用组和Nec1-554-1施用组のT/C值分别为39.2％、38.7％，两种抗体均显著地抑制了MDA-MB-231细胞系肿瘤的增殖(p＜0.0001)(图4)。
实施例24抗Nectin-2人单克隆抗体的体内抗肿瘤活性(OV-90卵巢癌细胞系裸小鼠肝脏转移治疗模型) 在使用OV-90人卵巢癌细胞系(从ATCC购买)的裸小鼠肝脏转移治疗模型中考察了参考例36制备的抗Nectin-2人单克隆抗体(Nec8-4116-8)的抗肿瘤活性。Nec8-4116-8抗体标准品使用通过参考例38记载的方法制备的标准品。将OV-90细胞系用如下文所述制备的培养基在150cm2培养瓶(Corning公司)中接种，在5％二氧化碳气流中、37℃培养；所述培养基是将MCDB 105培养基(Sigma公司)溶于1L蒸馏水后调整到pH 7.5，无菌过滤，然后将该MCDB 105培养基500mL和培养基199(Sigma公司)500mL混合，向其中加入150mL FBS(Thermo Electron公司)而制备的。将通过胰蛋白酶-EDTA处理解离而得到的对数增殖期的OV-90细胞系悬浮液通过离心分离(1,000rpm、3分)沉淀后，用Hank氏平衡盐溶液(HBSS)(Invitrogen公司)清洗3次。将这样得到的细胞以1x107个/mL重悬浮于HBSS中。
对从日本CLEA公司购买的裸小鼠(BALB/cAJcl-nu/nu)(5周龄、雌)在乙醚麻醉下开腹，暴露脾脏，将上述OV-90细胞悬浮液分别以100μL/个体接种到脾脏内。细胞接种后、在观察到移入肝脏的第14天及其之后，每周一次(第14、21、28、35和42天)尾静脉内施用以PBS稀释到3mg/mL的Nec8-4116-8以达到30mg/kg。
对照组施用生理盐水。最终施用的1周后，尾静脉内施用2.5％伊文思蓝1mL，摘出肝脏后浸泡在10％中性缓冲福尔马林溶液中固定，肉眼观察转移到肝脏的癌细胞系的增殖。
其结果，在对照组中，6例中6例确认了肝脏中的肿瘤增殖，与之相对的是，在Nec8-4116-8施用组中，6例中仅有1例确认了肝脏中的肿瘤增殖，Nec8-4116-8显著地抑制了移入肝脏的癌细胞的增殖。
序列表
<110>武田药品工业株式会社(Takeda Pharmaceutical Company Limited)
<120>癌症的预防和/或治疗剂
<130>PCT07-0057
<150>PCT/JP2006/320429
<151>2006-10-06
<150>JP2007-100876
<151>2007-04-06
<160>317
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>479
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
50 55 60
Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gln
65 70 75 80
Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr
100 105 110
Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
115 120 125
Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
130 135 140
Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asn Gln Ala Glu Ala Gln Lys Val Thr Phe Ser Gln Asp
165 170 175
Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys Ile Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala
180 185 190
Arg Ile Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gln
195 200 205
Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr
210 215 220
Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val
225 230 235 240
Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu Ile Pro Val Thr Leu Ser
245 250 255
Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp
260 265 270
Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn
275 280 285
Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro
290 295 300
Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp
305 310 315 320
Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly
325 330 335
Met Gly Arg Ala Glu Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Arg Ala
340 345 350
Ser Pro Arg Asp Val Gly Pro Leu Val Trp Gly Ala Val Gly Gly Thr
355 360 365
Leu Leu Val Leu Leu Leu Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe lle Leu
370 375 380
Leu Arg Val Arg Arg Arg Arg Lys Ser Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gly
385 390 395 400
Ala Ser Gly Asp Gly Gly Phe Tyr Asp Pro Lys Ala Gln Val Leu Gly
405 410 415
Asn Gly Asp Pro Val Phe Trp Thr Pro Val Val Pro Gly Pro Met Glu
420 425 430
Pro Asp Gly Lys Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Ala Glu
435 440 445
Lys Gly Leu Met Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Glu Asp Asp Met Glu
450 455 460
Ser Gln Leu Asp Gly Ser Leu Ile Ser Arg Arg Ala Val Tyr Val
465 470 475
<210>2
<211>1437
<212>DNA
<213>人类
<400>2
atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg60
ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc 120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt 180
cctggactgt acatctccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag 240
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ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac 960
agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct 1020
gagcaggtca tctttgtccg agaaaccccc agggcctcgc cccgagatgt gggcccgctg 1080
gtgtgggggg ccgtgggggg gacactgctg gtgctgctgc ttctggctgg ggggtccttg 1140
gccttcatcc tgctgagggt gaggaggagg aggaagagcc ctggaggagc aggaggagga 1200
gccagtggcg acgggggatt ctacgatccg aaagctcagg tgttgggaaa tggggacccc 1260
gtcttctgga caccagtagt ccctggtccc atggaaccag atggcaagga tgaggaggag 1320
gaggaggagg aagagaaggc agagaaaggc ctcatgttgc ctccaccccc agcactcgag 1380
gatgacatgg agtcccagct ggacggctcc ctcatctcac ggcgggcagt ttatgtg 1437
<210>3
<211>538
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
50 55 60
Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gln
65 70 75 80
Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr
100 105 110
Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
115 120 125
Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
130 135 140
Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asn Gln Ala Glu Ala Gln Lys Val Thr Phe Ser Gln Asp
165 170 175
Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys Ile Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala
180 185 190
Arg Ile Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gln
195 200 205
Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr
210 215 220
Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val
225 230 235 240
Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu Ile Pro Val Thr Leu Ser
245 250 255
Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp
260 265 270
Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn
275 280 285
Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro
290 295 300
Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp
305 310 315 320
Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly
325 330 335
Met Gly Arg Ala Glu Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr
340 345 350
Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ile Ile Gly Gly Ile Ile Ala Ala
355 360 365
Ile Ile Ala Thr Ala Val Ala Ala Thr Gly Ile Leu Ile Cys Arg Gln
370 375 380
Gln Arg Lys Glu Gln Thr Leu Gln Gly Ala Glu Glu Asp Glu Asp Leu
385 390 395 400
Glu Gly Pro Pro Ser Tyr Lys Pro Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Glu
405 410 415
Ala Gln Glu Met Pro Ser Gln Leu Phe Thr Leu Gly Ala Ser Glu His
420 425 430
Ser Pro Leu Lys Thr Pro Tyr Phe Asp Ala Gly Ala Ser Cys Thr Glu
435 440 445
Gln Glu Met Pro Arg Tyr His Glu Leu Pro Thr Leu Glu Glu Arg Ser
450 455 460
Gly Pro Leu His Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Ser Pro Ile Pro Val
465 470 475 480
Pro Pro Gly Pro Pro Ala Val Glu Asp Val Ser Leu Asp Leu Glu Asp
485 490 495
Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Lys Ile Asn Pro Ile
500 505 510
Tyr Asp Ala Leu Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Asp Ser Tyr Gln Gly Lys
515 520 525
Gly Phe Val Met Ser Arg Ala Met Tyr Val
530 535
<210>4
<211>1614
<212>DNA
<213>人类
<400>4
atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg60
ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc 120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt 180
cctggactgt acatttccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag 240
aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc 300
gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc 360
caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc 420
gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc 480
aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg 540
gccctctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg 600
gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc 660
agccgcttca ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg 720
gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct 780
cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc 840
ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca 900
ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac 960
agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct 1020
gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc aacacagcag gcgcaggggc cacaggcggc 1080
atcatcgggg gcatcatcgc cgccatcatt gctactgctg tggctgccac gggcatcctt 1140
atctgccggc agcagcggaa ggagcagacg ctgcaggggg cagaggagga cgaagacctg 1200
gagggacctc cctcctacaa gccaccgacc ccaaaagcga agctggaggc acaggagatg 1260
ccctcccagc tcttcactct gggggcctcg gagcacagcc cactcaagac cccctacttt 1320
gatgctggcg cctcatgcac tgagcaggaa atgcctcgat accatgagct gcccaccttg 1380
gaagaacggt caggaccctt gcaccctgga gccacaagcc tggggtcccc catcccggtg 1440
cctccagggc cacctgctgt ggaagacgtt tccctggatc tagaggatga ggagggggag 1500
gaggaggaag agtatctgga caagatcaac cccatctatg atgctctgtc ctatagcagc 1560
ccctctgatt cctaccaggg caaaggcttt gtcatgtccc gggccatgta tgtg1614
<210>5
<211>549
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Met Ala Arg Thr Leu Arg Pro Ser Pro Leu Cys Pro GIy Gly Gly Lys
5 10 15
Ala Gln Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Pro Pro Thr Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu
35 40 45
Phe Ser Arg Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Pro Ile Ile Val Glu Pro
50 55 60
His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile
65 70 75 80
Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile Ser Trp Glu Lys Ile His Gly
85 90 95
Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser
100 105 110
Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu
115 120 125
Asn Asp Ala Thr Ile Thr Leu His Asn Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly
130 135 140
Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gln Ser
145 150 155 160
Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys
165 170 175
Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile
180 185 190
Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala His Ile Asp Trp Glu Gly
195 200 205
Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr
210 215 220
Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg
225 230 235 240
Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys His Pro Ala Leu Glu Lys Asp
245 250 255
lle Arg Tyr Ser Phe Ile Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser
260 265 270
Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn
275 280 285
Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp
290 295 300
Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn
305 310 315 320
Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr
325 330 335
Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val
340 345 350
Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile
355 360 365
Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro
370 375 380
Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp
385 390 395 400
Thr Ile Ala Thr Ile Ile Ala Ser Val Val Gly Gly Ala Leu Phe Ile
4054 10 415
Val Leu Val Ser Val Leu Ala Gly Ile Phe Cys Tyr Arg Arg Arg Arg
420 425 430
Thr Phe Arg Gly Asp Tyr Phe Ala Lys Asn Tyr Ile Pro Pro Ser Asp
435 440 445
Met Gln Lys Glu Ser Gln Ile Asp Val Leu Gln Gln Asp Glu Leu Asp
450 455 460
Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys Lys Glu Asn Lys Asn Pro Val Asn Asn
465 470 475 480
Leu Ile Arg Lys Asp Tyr Leu Glu Glu Pro Glu Lys Thr Gln Trp Asn
485 490 495
Asn Val Glu Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Pro Met Asp Tyr Tyr Glu
500 505 510
Asp Leu Lys Met Gly Met Lys Phe Val Ser Asp Glu His Tyr Asp Glu
515 520 525
Asn Glu Asp Asp Leu Val Ser His Val Asp Gly Ser Val Ile Ser Arg
530 535 540
Arg Glu Trp Tyr Val
545
<210>6
<211>1647
<212>DNA
<213>人类
<400>6
atggcgcgga ccctgcggcc gtccccgctg tgtcctggag gcggcaaagc acaactttcc60
tccgcttctc tcctcggagc cgggctcctg ctgcagcccc cgacgccacc tccgctgctg 120
ctgctgctct tcccgctgct gctcttctcc aggctctgtg gtgccttagc tggaccaatt 180
attgtggagc cacatgtcac agcagtatgg ggaaagaatg tttcattaaa gtgtttaatt 240
gaagtaaatg aaaccataac acagatttca tgggagaaga tacatggcaa aagttcacag 300
actgttgcag ttcaccatcc ccaatatgga ttctctgttc aaggagaata tcagggaaga 360
gtcttgttta aaaattactc acttaatgat gcaacaatta ctctgcataa cataggattc 420
tctgattctg gaaaatacat ctgcaaagct gttacattcc cgcttggaaa tgcccagtcc 480
tctacaactg taactgtgtt agttgaaccc actgtgagcc tgataaaagg gccagattct 540
ttaattgatg gaggaaatga aacagtagca gccatttgca tcgcagccac tggaaaaccc 600
gttgcacata ttgactggga aggtgatctt ggtgaaatgg aatccactac aacttctttt 660
ccaaatgaaa cggcaacgat tatcagccag tacaagctat ttccaaccag atttgctaga 720
ggaaggcgaa ttacttgtgt tgtaaaacat ccagccttgg aaaaggacat ccgatactct 780
ttcatattag acatacagta tgctcctgaa gtttcggtaa caggatatga tggaaattgg 840
tttgtaggaa gaaaaggtgt taatctcaaa tgtaatgctg atgcaaatcc accacccttc 900
aaatctgtgt ggagcaggtt ggatggacaa tggcctgatg gtttattggc ttcagacaat 960
actcttcatt ttgtccatcc attgactttc aattattctg gtgtttatat ctgtaaagtg 1020
accaattccc ttggtcaaag aagtgaccaa aaagtcatct acatttcaga tcctcctact 1080
actaccaccc ttcagcctac aattcagtgg catccctcaa ctgctgacat cgaggatcta 1140
gcaacagaac ctaaaaaatt gcccttccca ttgtcaactt tggcaacaat taaggatgac 1200
acaattgcca cgatcattgc tagtgtagtg ggtggggctc tcttcatagt acttgtaagt 1260
gttttggctg gaatattctg ctataggaga agacggacgt ttcgtggaga ctactttgcc 1320
aagaactaca ttccaccatc agatatgcaa aaagaatcac aaatagatgt tcttcaacaa 1380
gatgagcttg attcttaccc agacagtgta aaaaaagaaa acaaaaatcc agtgaacaat 1440
ctaatacgta aagactattt agaagagcct gaaaaaactc agtggaacaa tgtagaaaat 1500
ctcaataggt ttgaaagacc aatggattat tatgaagatc taaaaatggg aatgaagttt 1560
gtcagtgatg aacattatga tgaaaacgaa gatgacttag tttcacatgt agatggttcc 1620
gtaatttcca ggagggagtg gtatgtt 1647
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸1
<400>7
tcccaacacc tgagctttcg20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对照寡核苷酸1
<400>8
gctttcgagt ccacaaccct 20
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
ggtcatcttt gtccgagaaa cc 22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
tgagctttcg gatcgtagaa tc 22
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TaqMan探针1
<400>11
ccgagatgtg ggcccgct18
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
cccactcaag accccctact tt 22
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
gctcatggta tcgaggcatttc22
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TaqMan探针2
<400>14
atgctggcgc ctcatgcact gag 23
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
aattgaattc atggcccggg ccgct25
<210>16
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
aattgatatc tcacacataa actgcccgcc gt 32
<210>17
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
gatatctcac acatacatgg cccgggaca 29
<210>18
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
attgat atct cacacataca tggcccggga catg 34
<210>19
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-1
<400>19
acuacacuug cgaguuugc 19
<210>20
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-1
<400>20
gcaaacucgc aaguguagu 19
<210>21
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-2
<400>21
aaaguggagc augagagcu 19
<210>22
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-2
<400>22
agcucucaug cuccacuuu 19
<210>23
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-3
<400>23
ggucaucuuu guccgagaa 19
<210>24
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-3
<400>24
uucucggaca aagaugacc 19
<210>25
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-4
<400>25
gauucuacga uccgaaagc 19
<210>26
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-4
<400>26
gcuuucggau cguagaauc 19
<210>27
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-5
<400>27
ggaagagaag gcagagaaa 19
<210>28
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>siRNA-5
<400>28
uuucucugcc uucucuucc 19
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
aattgaattc atggcccggg ccgct 25
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
aattctcgag ggcccctgcg cctgctgtgt 30
<210>31
<211>371
<212>PRT
<213>人类
<400>31
Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
50 55 60
Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gln
65 70 75 80
Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr
100 105 110
Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
115 120 125
Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
130 135 140
Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asn Gln Ala Glu Ala Gln Lys Val Thr Phe Ser Gln Asp
165 170 175
Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys Ile Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala
180 185 190
Arg Ile Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gln
195 200 205
Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr
210 215 220
Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val
225 230 235 240
Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu Ile Pro Val Thr Leu Ser
245 250 255
Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp
260 265 270
Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn
275 280 285
Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro
290 295 300
Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp
305 310 315 320
Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly
325 330 335
Met Gly Arg Ala Glu Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr
340 345 350
Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ile Leu Glu Asp Tyr Lys Asp Asp
355 360 365
Asp Asp Lys
370
<210>32
<211>1113
<212>DNA
<213>人类
<400>32
atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg60
ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc 120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt 180
cctggactgt acatttccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag 240
aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc 300
gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc 360
caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc 420
gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc 480
aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg 540
gccctctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg 600
gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc 660
agccgcttca ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg 720
gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct 780
cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc 840
ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca 900
ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac 960
agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct 1020
gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc aacacagcag gcgcaggggc cacaggcggc 1080
atcctcgagg attacaagga tgacgacgat aag 1113
<210>33
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
aattgaattc cccaaatctt gtgacaaaac30
<210>34
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
aattctcgag tcatttaccc ggagacagg 29
<210>35
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
aattaagctt atggcccggg ccgct 25
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
aattgaattc gggggtttct cgga 24
<210>37
<211>583
<212>PRT
<213>人类
<400>37
Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
50 55 60
Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gln
65 70 75 80
Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr
100 105 110
Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
115 120 125
Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
130 135 140
Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asn Gln Ala Glu Ala Gln Lys Val Thr Phe Ser Gln Asp
165 170 175
Pro Thr Thr Val Ala Leu Cys Ile Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala
180 185 190
Arg Ile Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gln
195 200 205
Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr
210 215 220
Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val
225 230 235 240
Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu Ile Pro Val Thr Leu Ser
245 250 255
Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp
260 265 270
Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn
275 280 285
Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro
290 295 300
Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp
305 310 315 320
Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly
325 330 335
Met Gly Arg Ala Glu Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Glu Phe
340 345 350
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
450 455 460
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
530 535 540
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210>38
<211>1749
<212>DNA
<213>人类
<400>38
atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg60
ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc 120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt 180
cctggactgt acatttccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag 240
aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc 300
gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc 360
caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc 420
gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc 480
aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttca gccaggaccc tacgacagtg 540
gccctctgca tctccaaaga gggccgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg 600
gactgggaag ccaaagagac tcaggtgtca gggaccctgg ccggaactgt cactgtcacc 660
agccgcttca ccttggtgcc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg 720
gagcatgaga gcttcgagga accagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct 780
cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc 840
ctgagctgtg acgtccgcag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca 900
ggcaccttcc cgacctccgc agtggcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcagtggac 960
agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct 1020
gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc gaattcccca aatcttgtga caaaactcac 1080
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 1140
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 1200
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1260
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1320
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1380
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1440
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1500
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1560
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1620
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1680
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1740
ccgggtaaa 1749
<210>39
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>实施例16中使用的肽1
<400>39
Cys Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro Lys Pro Gly Ser Glu
5 10 15
<210>40
<21l>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>实施例16中使用的肽2
<400>40
Arg Glu Thr Pro Arg Ala Ser Pro Arg Asp Val Gly Pro Leu Cys
5 10 15
<210>41
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>实施例16中使用的肽3
<400>41
Cys Thr Leu Gly Ala Ser Glu His Ser Pro Leu Lys Thr Pro Tyr
5 10 15
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>42
gcccactcaa gaccccc tac 20
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
tcgaggcatt tcctgctca 19
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
ttgatgctgg cgcctcatgc a 21
<210>45
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
aattgaattc cccagagggc ccacaatc 28
<210>46
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
aattctcgag tcatttaccc ggagtcc27
<210>47
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
agttaagctt atggcgcgga ccctgcggc 29
<210>48
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
attgaattcc gtggcaattg tgtcat26
<210>49
<211>637
<212>PRT
<213>人类
<400>49
Met Ala Arg Thr Leu Arg Pro Ser Pro Leu Cys Pro Gly Gly Gly Lys
5 10 15
Ala Gln Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Pro Pro Thr Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu
35 40 45
Phe Ser Arg Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Pro Ile Ile Val Glu Pro
50 55 60
His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile
65 70 75 80
Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile Ser Trp Glu Lys Ile His Gly
85 90 95
Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser
100 105 110
Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu
115 120 125
Asn Asp Ala Thr Ile Thr Leu His Asn Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly
130 135 140
Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gln Ser
145 150 155 160
Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys
165 170 175
Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile
180 185 190
Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala His Ile Asp Trp Glu Gly
195 200 205
Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr
210 215 220
Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg
225 230 235 240
Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys His Pro Ala Leu Glu Lys Asp
245 250 255
Ile Arg Tyr Ser Phe Ile Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser
260 265 270
Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn
275 280 285
Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp
290 295 300
Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn
305 310 315 320
Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr
325 330 335
Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val
340 345 350
Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile
355 360 365
Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro
370 375 380
Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp
385 390 395 400
Thr Ile Ala Thr Glu Phe Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
405 410 415
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
420 425 430
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
435 440 445
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
450 455 460
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
465 470 475 480
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
485 490 495
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
500 505 510
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
515 520 525
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
530 535 540
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
545 550 555 560
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
565 570 575
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
580 585 590
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
595 600 605
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
610 615 620
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
625 630 635
<210>50
<211>1911
<212>DNA
<213>人类
<400>50
atggcgcgga ccctgcggcc gtccccgctg tgtcctggag gcggcaaagc acaactttcc60
tccgcttctc tcctcggagc cgggctcctg ctgcagcccc cgacgccacc tccgctgctg 120
ctgctgctct tcccgctgct gctcttctcc aggctctgtg gtgccttagc tggaccaatt 180
attgtggagc cacatgtcac agcagtatgg ggaaagaatg tttcattaaa gtgtttaatt 240
gaagtaaatg aaaccataac acagatttca tgggagaaga tacatggcaa aagttcacag 300
actgttgcag ttcaccatcc ccaatatgga ttctctgttc aaggagaata tcagggaaga 360
gtcttgttta aaaattactc acttaatgat gcaacaatta ctctgcataa cataggattc 420
tctgattctg gaaaatacat ctgcaaagct gttacattcc cgcttggaaa tgcccagtcc 480
tctacaactg taactgtgtt agttgaaccc actgtgagcc tgataaaagg gccagattct 540
ttaattgatg gaggaaatga aacagtagca gccatttgca tcgcagccac tggaaaaccc 600
gttgcacata ttgactggga aggtgatctt ggtgaaatgg aatccactac aacttctttt 660
ccaaatgaaa cggcaacgat tatcagccag tacaagctat ttccaaccag atttgctaga 720
ggaaggcgaa ttacttgtgt tgtaaaacat ccagccttgg aaaaggacat ccgatactct 780
ttcatattag acatacagta tgctcctgaa gtttcggtaa caggatatga tggaaattgg 840
tttgtaggaa gaaaaggtgt taatctcaaa tgtaatgctg atgcaaatcc accacccttc 900
aaatctgtgt ggagcaggtt ggatggacaa tggcctgatg gtttattggc ttcagacaat 960
actcttcatt ttgtccatcc attgactttc aattattctg gtgtttatat ctgtaaagtg 1020
accaattccc ttggtcaaag aagtgaccaa aaagtcatct acatttcaga tcctcctact 1080
actaccaccc ttcagcctac aattcagtgg catccctcaa ctgctgacat cgaggatcta 1140
gcaacagaac ctaaaaaatt gcccttccca ttgtcaactt tggcaacaat taaggatgac 1200
acaattgcca cggaattccc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 1260
gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 1320
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 1380
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1440
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1500
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1560
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1620
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1680
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1740
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1800
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1860
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1911
<210>51
<211>638
<212>PRT
<213>人类
<400>51
Met Ala Arg Thr Leu Arg Pro Ser Pro Leu Cys Pro Gly Gly Gly Lys
5 10 15
Ala Gln Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Pro Pro Thr Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu
35 40 45
Phe Ser Arg Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Pro Ile Ile Val Glu Pro
50 55 60
His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile
65 70 75 80
Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile Ser Trp Glu Lys Ile His Gly
85 90 95
Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser
100 105 110
Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu
115 120 125
Asn Asp Ala Thr Ile Thr Leu His Asn Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly
130 135 140
Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gln Ser
145 150 155 160
Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys
165 170 175
Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile
180 185 190
Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala His Ile Asp Trp Glu Gly
195 200 205
Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr
210 215 220
Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg
225 230 235 240
Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys His Pro Ala Leu Glu Lys Asp
245 250 255
Ile Arg Tyr Ser Phe Ile Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser
260 265 270
Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn
275 280 285
Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp
290 295 300
Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn
305 310 315 320
Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr
325 330 335
Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val
340 345 350
Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile
355 360 365
Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro
370 375 380
Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp
385 390 395 400
Thr Ile Ala Thr Glu Phe Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro
405 410 415
Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
420 425 430
Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val
450 455 460
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
465 470 475 480
Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala
485 490 495
Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys
500 505 510
Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser
515 520 525
Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro
530 535 540
Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val
545 550 555 560
Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly
565 570 575
Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp
580 585 590
Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp
595 600 605
Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His
610 615 620
Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
625 630 635
<210>52
<211>1914
<212>DNA
<213>人类
<400>52
atggcgcgga ccctgcggcc gtccccgctg tgtcctggag gcggcaaagc acaactttcc60
tccgcttctc tcctcggagc cgggctcctg ctgcagcccc cgacgccacc tccgctgctg 120
ctgctgctct tcccgctgct gctcttctcc aggctctgtg gtgccttagc tggaccaatt 180
attgtggagc cacatgtcac agcagtatgg ggaaagaatg tttcattaaa gtgtttaatt 240
gaagtaaatg aaaccataac acagatttca tgggagaaga tacatggcaa aagttcacag 300
actgttgcag ttcaccatcc ccaatatgga ttctctgttc aaggagaata tcagggaaga 360
gtcttgttta aaaattactc acttaatgat gcaacaatta ctctgcataa cataggattc 420
tctgattctg gaaaatacat ctgcaaagct gttacattcc cgcttggaaa tgcccagtcc 480
tctacaactg taactgtgtt agttgaaccc actgtgagcc tgataaaagg gccagattct 540
ttaattgatg gaggaaatga aacagtagca gccatttgca tcgcagccac tggaaaaccc 600
gttgcacata ttgactggga aggtgatctt ggtgaaatgg aatccactac aacttctttt 660
ccaaatgaaa cggcaacgat tatcagccag tacaagctat ttccaaccag atttgctaga 720
ggaaggcgaa ttacttgtgt tgtaaaacat ccagccttgg aaaaggacat ccgatactct 780
ttcatattag acatacagta tgctcctgaa gtttcggtaa caggatatga tggaaattgg 840
tttgtaggaa gaaaaggtgt taatctcaaa tgtaatgctg atgcaaatcc accacccttc 900
aaatctgtgt ggagcaggtt ggatggacaa tggcctgatg gtttattggc ttcagacaat 960
actcttcatt ttgtccatcc attgactttc aattattctg gtgtttatat ctgtaaagtg 1020
accaattccc ttggtcaaag aagtgaccaa aaagtcatct acatttcaga tcctcctact 1080
actaccaccc ttcagcctac aattcagtgg catccctcaa ctgctgacat cgaggatcta 1140
gcaacagaac ctaaaaaatt gcccttccca ttgtcaactt tggcaacaat taaggatgac 1200
acaattgcca cggaattccc cagagggccc acaatcaagc cctgtcctcc atgcaaatgc 1260
ccagcaccta acctcttggg tggaccatcc gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat 1320
gtactcatga tctccctgag ccccatagtc acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat 1380
gacccagatg tccagatcag ctggtttgtg aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca 1440
caaacccata gagaggatta caacagtact ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag 1500
caccaggact ggatgagtgg caaggagttc aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca 1560
gcgcccatcg agagaaccat ctcaaaaccc aaagggtcag taagagctcc acaggtatat 1620
gtcttgcctc caccagaaga agagatgact aagaaacagg tcactctgac ctgcatggtc 1680
acagacttca tgcctgaaga catttacgtg gagtggacca acaacgggaa aacagagcta 1740
aactacaaga acactgaacc agtcctggac tctgatggtt cttacttcat gtacagcaag 1800
ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa agaaatagct actcctgttc agtggtccac 1860
gagggtctgc acaatcacca cacgactaag agcttctccc ggactccggg taaa1914
<210>53
<211>102
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码FLAG蛋白的DNA
<400>53
ctagtctcga gaattcacgc gtggtacctc tagagtcgac atggactaca aggacgacga 60
tgacaaggct agcgactaca aggacgacga tgacaagtga gc 102
<210>54
<211>101
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码FLAG蛋白的DNA
<400>54
ggccgctcac ttgtcatcgt cgtccttgta gtcgctagcc ttgtcatcgt cgtccttgta60
gtccatgtcg actctagagg taccacgcgt aattctcgag a 101
<210>55
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>55
acgcgtcgac caccatggcg cggaccctgc ggcc 34
<210>56
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>56
ctagctagcc gtggcaattg tgtcatcct 29
<210>57
<211>414
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Nectin-3ED-FLAG蛋白
<400>57
Met Ala Arg Thr Leu Arg Pro Ser Pro Leu Cys Pro Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Ala Gln Leu Ser Ser Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Pro Pro Thr Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Pro Leu Leu Leu
35 40 45
Phe Ser Arg Leu Cys Gly Ala Leu Ala Gly Pro Ile Ile Val Glu Pro
50 55 60
His Val Thr Ala Val Trp Gly Lys Asn Val Ser Leu Lys Cys Leu Ile
65 70 75 80
Glu Val Asn Glu Thr Ile Thr Gln Ile Ser Trp Glu Lys Ile His Gly
85 90 95
Lys Ser Ser Gln Thr Val Ala Val His His Pro Gln Tyr Gly Phe Ser
100 105 110
Val Gln Gly Glu Tyr Gln Gly Arg Val Leu Phe Lys Asn Tyr Ser Leu
115 120 125
Asn Asp Ala Thr Ile Thr Leu His Asn Ile Gly Phe Ser Asp Ser Gly
130 135 140
Lys Tyr Ile Cys Lys Ala Val Thr Phe Pro Leu Gly Asn Ala Gln Ser
145 150 155 160
Ser Thr Thr Val Thr Val Leu Val Glu Pro Thr Val Ser Leu Ile Lys
165 170 175
Gly Pro Asp Ser Leu Ile Asp Gly Gly Asn Glu Thr Val Ala Ala Ile
180 185 190
Cys Ile Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Ala His Ile Asp Trp Glu Gly
195 200 205
Asp Leu Gly Glu Met Glu Ser Thr Thr Thr Ser Phe Pro Asn Glu Thr
210 215 220
Ala Thr Ile Ile Ser Gln Tyr Lys Leu Phe Pro Thr Arg Phe Ala Arg
225 230 235 240
Gly Arg Arg Ile Thr Cys Val Val Lys His Pro Ala Leu Glu Lys Asp
245 250 255
Ile Arg Tyr Ser Phe Ile Leu Asp Ile Gln Tyr Ala Pro Glu Val Ser
260 265 270
Val Thr Gly Tyr Asp Gly Asn Trp Phe Val Gly Arg Lys Gly Val Asn
275 280 285
Leu Lys Cys Asn Ala Asp Ala Asn Pro Pro Pro Phe Lys Ser Val Trp
290 295 300
Ser Arg Leu Asp Gly Gln Trp Pro Asp Gly Leu Leu Ala Ser Asp Asn
305 310 315 320
Thr Leu His Phe Val His Pro Leu Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Val Tyr
325 330 335
Ile Cys Lys Val Thr Asn Ser Leu Gly Gln Arg Ser Asp Gln Lys Val
340 345 350
Ile Tyr Ile Ser Asp Pro Pro Thr Thr Thr Thr Leu Gln Pro Thr Ile
355 360 365
Gln Trp His Pro Ser Thr Ala Asp Ile Glu Asp Leu Ala Thr Glu Pro
370 375 380
Lys Lys Leu Pro Phe Pro Leu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Lys Asp Asp
385 390 395 400
Thr Ile Ala Thr Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
405 410
<210>58
<211>1242
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码Nect in-3ED-FLAG蛋白的DNA
<400>58
atggcgcgga ccctgcggcc gtccccgctg tgtcctggag gcggcaaagc acaactttcc 60
tccgcttctc tcctcggagc cgggctcctg ctgcagcccc cgacgccacc tccgctgctg120
ctgctgctct tcccgctgct gctcttctcc aggctctgtg gtgccttagc tggaccaatt180
attgtggagc cacatgtcac agcagtatgg ggaaagaatg tttcattaaa gtgtttaatt240
gaagtaaatg aaaccataac acagatttca tgggagaaga tacatggcaa aagttcacag300
actgttgcag ttcaccatcc ccaatatgga ttctctgttc aaggagaata tcagggaaga360
gtcttgttta aaaattactc acttaatgat gcaacaatta ctctgcataa cataggattc420
tctgattctg gaaaatacat ctgcaaagct gttacattcc cgcttggaaa tgcccagtcc480
tctacaactg taactgtgtt agttgaaccc actgtgagcc tgataaaagg gccagattct540
ttaattgatg gaggaaatga aacagtagca gccatttgca tcgcagccac tggaaaaccc600
gttgcacata ttgactggga aggtgatctt ggtgaaatgg aatccactac aacttctttt660
ccaaatgaaa cggcaacgat tatcagccag tacaagctat ttccaaccag atttgctaga720
ggaaggcgaa ttacttgtgt tgtaaaacat ccagccttgg aaaaggacat ccgatactct780
ttcatattag acatacagta tgctcctgaa gtttcggtaa caggatatga tggaaattgg840
tttgtaggaa gaaaaggtgt taatctcaaa tgtaatgctg atgcaaatcc accacccttc900
aaatctgtgt ggagcaggtt ggatggacaa tggcctgatg gtttattggc ttcagacaat960
actcttcatt ttgtccatcc attgactttc aattattctg gtgtttatat ctgtaaagtg 1020
accaattccc ttggtcaaag aagtgaccaa aaagtcatct acatttcaga tcctcctact 1080
actaccaccc ttcagcctac aattcagtgg catccctcaa ctgctgacat cgaggatcta 1140
gcaacagaac ctaaaaaatt gcccttccca ttgtcaactt tggcaacaat taaggatgac 1200
acaattgcca cggctagcga ctacaaggac gacgatgaca ag 1242
<210>59
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>59
aattgatatc atggctcgga tggggctt 28
<210>60
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>60
aattctcgag cacgtaccac tccttctt 28
<210>61
<211>1551
<212>DNA
<213>人类
<400>61
atggctcgga tggggcttgc gggcgccgct ggacgctggt ggggactcgc tctcggcttg 60
accgcattct tcctcccagg cgtccactcc caggtggtcc aggtgaacga ctccatgtat120
ggcttcatcg gcacagacgt ggttctgcac tgcagctttg ccaacccgct tcccagcgtg180
aagatcaccc aggtcacatg gcagaagtcc accaatggct ccaagcagaa cgtggccatc240
tacaacccat ccatgggcgt gtccgtgctg gctccctacc gcgagcgtgt ggaattcctg300
cggccctcct tcaccgatgg cactatccgc ctctcccgcc tggagctgga ggatgagggt360
gtctacatct gcgagtttgc taccttccct acgggcaatc gagaaagcca gctcaatctc420
acggtgatgg ccaaacccac caattggata gagggtaccc aggcagtgct tcgagccaag480
aaggggcagg atgacaaggt cctggtggcc acctgcacct cagccaatgg gaagcctccc540
agtgtggtat cctgggaaac tcggttaaaa ggtgaggcag agtaccagga gatccggaac600
cccaatggca cagtgacggt catcagccgc taccgcctgg tgcccagcag ggaagcccac660
cagcagtcct tggcctgcat cgtcaactac cacatggacc gcttcaagga aagcctcact720
ctcaacgtgc agtatgagcc tgaggtaacc attgaggggt ttgatggcaa ctggtacctg780
cagcggatgg acgtgaagct cacctgcaaa gctgatgcta accccccagc cactgagtac840
cactggacca cgctaaatgg ctctctcccc aagggtgtgg aggcccagaa cagaaccctc900
ttcttcaagg gacccatcaa ctacagcctg gcagggacct acatctgtga ggccaccaac960
cccatcggta cacgctcagg ccaggtggag gtcaatatca cagaattccc ctacaccccg 1020
tctcctcccg aacatgggcg gcgcgccggg ccggtgccca cggccatcat tgggggcgtg 1080
gcggggagca tcctgctggt gttgattgtg gtcggcggga tcgtggtcgc cctgcgtcgg 1140
cgccggcaca ccttcaaggg tgactacagc accaagaagc acgtgtatgg caacggctac 1200
agcaaggcag gcatccccca gcaccaccca ccaatggcac agaacctgca gtaccccgac 1260
gactcagacg acgagaagaa ggccggccca ctgggtggaa gcagctatga ggaggaggag 1320
gaggaggagg agggcggtgg agggggcgag cgcaaggtgg gcggccccca ccccaaatat 1380
gacgaggacg ccaagcggcc ctacttcacc gtggatgagg ccgaggcccg tcaggacggc 1440
tacggggacc ggactctggg ctaccagtac gaccctgagc agctggactt ggctgagaac 1500
atggtttctc agaacgacgg gtctttcatt tccaagaagg agtggtacgt g1551
<210>62
<211>517
<212>PRT
<213>人类
<400>62
Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Val His Ser Gln Val
20 25 30
Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp Val Val
35 40 45
Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Ser Val Lys Ile Thr Gln
50 55 60
Val Thr Trp Gln Lys Ser Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val Ala Ile
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg
85 90 95
Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg Leu Ser
100 105 110
Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe Ala Thr
115 120 125
Phe Pro Thr Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala
130 135 140
Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys
145 150 155 160
Lys Gly Gln Asp Asp Lys Val Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn
165 170 175
Gly Lys Pro Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr Arg Leu Lys Gly Glu
180 185 190
Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile
195 200 205
Ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro Ser Arg Glu Ala His Gln Gln Ser Leu
210 215 220
Ala Cys Ile Val Asn Tyr His Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser Leu Thr
225 230 235 240
Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly
245 250 255
Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp
260 265 270
Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser
275 280 285
Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Lys Gly
290 295 300
Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn
305 310 315 320
Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe
325 330 335
Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu His Gly Arg Arg Ala Gly Pro Val
340 345 350
Pro Thr Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Gly Ser Ile Leu Leu Val Leu
355 360 365
lle Val Val Gly Gly Ile Val Val Ala Leu Arg Arg Arg Arg His Thr
370 375 380
Phe Lys Gly Asp Tyr Ser Thr Lys Lys His Val Tyr Gly Asn Gly Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Ala Gly Ile Pro Gln His His Pro Pro Met Ala Gln Asn Leu
405 410 415
Gln Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Asp Glu Lys Lys Ala Gly Pro Leu Gly
420 425 430
Gly Ser Ser Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Glu Arg Lys Val Gly Gly Pro His Pro Lys Tyr Asp Glu Asp Ala
450 455 460
Lys Arg Pro Tyr Phe Thr Val Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gln Asp Gly
465 470 475 480
Tyr Gly Asp Arg Thr Leu Gly Tyr Gln Tyr Asp Pro Glu Gln Leu Asp
485 490 495
Leu Ala Glu Asn Met Val Ser Gln Asn Asp Gly Ser Phe Ile Ser Lys
500 505 510
Lys Glu Trp Tyr Val
515
<210>63
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>63
atcgatatct caaacatacc actccctcc 29
<210>64
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>64
aattctcgag aacataccac tccctcctg 29
<210>65
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>65
aattgaattc atgcccctgt ccctg 25
<210>66
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>66
ttaactcgag gaccaggtgt ccccgccca 29
<210>67
<211>1530
<212>DNA
<213>人类
<400>67
atgcccctgt ccctgggagc cgagatgtgg gggcctgagg cctggctgct gctgctgcta 60
ctgctggcat catttacagg ccggtgcccc gcgggtgagc tggagacctc agacgtggta120
actgtggtgc tgggccagga cgcaaaactg ccctgcttct accgagggga ctccggcgag180
caagtggggc aagtggcatg ggctcgggtg gacgcgggcg aaggcgccca ggaactagcg240
ctactgcact ccaaatacgg gcttcatgtg agcccggctt acgagggccg cgtggagcag300
ccgccgcccc cacgcaaccc cctggacggc tcagtgctcc tgcgcaacgc agtgcaggcg360
gatgagggcg agtacgagtg ccgggtcagc accttccccg ccggcagctt ccaggcgcgg420
ctgcggctcc gagtgctggt gcctcccctg ccctcactga atcctggtcc agcactagaa480
gagggccagg gcctgaccct ggcagcctcc tgcacagctg agggcagccc agcccccagc540
gtgacctggg acacggaggt caaaggcaca acgtccagcc gttccttcaa gcactcccgc600
tctgctgccg tcacctcaga gttccacttg gtgcctagcc gcagcatgaa tgggcagcca660
ctgacttgtg tggtgtccca tcctggcctg ctccaggacc aaaggatcac ccacatcctc720
cacgtgtcct tccttgctga ggcctctgtg aggggccttg aagaccaaaa tctgtggcac780
attggcagag aaggagctat gctcaagtgc ctgagtgaag ggcagccccc tccctcatac840
aactggacac ggctggatgg gcctctgccc agtggggtac gagtggatgg ggacactttg900
ggctttcccc cactgaccac tgagcacagc ggcatctacg tctgccatgt cagcaatgag960
ttctcctcaa gggattctca ggtcactgtg gatgttcttg acccccagga agactctggg 1020
aagcaggtgg acctagtgtc agcctcggtg gtggtggtgg gtgtgatcgc cgcactcttg 1080
ttctgccttc tggtggtggt ggtggtgctc atgtcccgat accatcggcg caaggcccag 1140
cagatgaccc agaaatatga ggaggagctg accctgacca gggagaactc catccggagg 1200
ctgcattccc atcacacgga ccccaggagc cagccggagg agagtgtagg gctgagagcc 1260
gagggccacc ctgatagtct caaggacaac agtagctgct ctgtgatgag tgaagagccc 1320
gagggccgca gttactccac gctgaccacg gtgagggaga tagaaacaca gactgaactg 1380
ctgtctccag gctctgggcg ggccgaggag gaggaagatc aggatgaagg catcaaacag 1440
gccatgaacc attttgttca ggagaatggg accctacggg ccaagcccac gggcaatggc 1500
atctacatca atgggcgggg acacctggtc1530
<210>68
<211>510
<212>PRT
<213>人类
<400>68
Met Pro Leu Ser Leu Gly Ala Glu Met Trp Gly Pro Glu Ala Trp Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Phe Thr Gly Arg Cys Pro Ala Gly
20 25 30
Glu Leu Glu Thr Ser Asp Val Val Thr Val Val Leu Gly Gln Asp Ala
35 40 45
Lys Leu Pro Cys Phe Tyr Arg Gly Asp Ser Gly Glu Gln Val Gly Gln
50 55 60
Val Ala Trp Ala Arg Val Asp Ala Gly Glu Gly Ala Gln Glu Leu Ala
65 70 75 80
Leu Leu His Ser Lys Tyr Gly Leu His Val Ser Pro Ala Tyr Glu Gly
85 90 95
Arg Val Glu Gln Pro Pro Pro Pro Arg Asn Pro Leu Asp Gly Ser Val
100 105 110
Leu Leu Arg Asn Ala Val Gln Ala Asp Glu Gly Glu Tyr Glu Cys Arg
115 120 125
Val Ser Thr Phe Pro Ala Gly Ser Phe Gln Ala Arg Leu Arg Leu Arg
130 135 140
Val Leu Val Pro Pro Leu Pro Ser Leu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Glu
145 150 155 160
Glu Gly Gln Gly Leu Thr Leu Ala Ala Ser Cys Thr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Pro Ala Pro Ser Val Thr Trp Asp Thr Glu Val Lys Gly Thr Thr Ser
180 185 190
Ser Arg Ser Phe Lys His Ser Arg Ser Ala Ala Val Thr Ser Glu Phe
195 200 205
His Leu Val Pro Ser Arg Ser Met Asn Gly Gln Pro Leu Thr Cys Val
210 215 220
Val Ser His Pro Gly Leu Leu Gln Asp Gln Arg Ile Thr His Ile Leu
225 230 235 240
His Val Ser Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Arg Gly Leu Glu Asp Gln
245 250 255
Asn Leu Trp His Ile Gly Arg Glu Gly Ala Met Leu Lys Cys Leu Ser
260 265 270
Glu Gly Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Asn Trp Thr Arg Leu Asp Gly Pro
275 280 285
Leu Pro Ser Gly Val Arg Val Asp Gly Asp Thr Leu Gly Phe Pro Pro
290 295 300
Leu Thr Thr Glu His Ser Gly Ile Tyr Val Cys His Val Ser Asn Glu
305 310 315 320
Phe Ser Ser Arg Asp Ser Gln Val Thr Val Asp Val Leu Asp Pro Gln
325 330 335
Glu Asp Ser Gly Lys Gln Val Asp Leu Val Ser Ala Ser Val Val Val
340 345 350
Val Gly Val Ile Ala Ala Leu Leu Phe Cys Leu Leu Val Val Val Val
355 360 365
Val Leu Met Ser Arg Tyr His Arg Arg Lys Ala Gln Gln Met Thr Gln
370 375 380
Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Leu Thr Arg Glu Asn Ser Ile Arg Arg
385 390 395 400
Leu His Ser His His Thr Asp Pro Arg Ser Gln Pro Glu Glu Ser Val
405 410 415
Gly Leu Arg Ala Glu Gly His Pro Asp Ser Leu Lys Asp Asn Ser Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met Ser Glu Glu Pro Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Thr Leu
435 440 445
Thr Thr Val Arg Glu Ile Glu Thr Gln Thr Glu Leu Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Ser Gly Arg Ala Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Gly Ile Lys Gln
465 470 475 480
Ala Met Asn His Phe Val Gln Glu Asn Gly Thr Leu Arg Ala Lys Pro
485 490 495
Thr Gly Asn Gly Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Gly His Leu Val
500 505 510
<210>69
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>69
aattaagctt atggcccgag ccatg 25
<210>70
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>70
aattgtcgac ccttgtgccc tctgt 25
<210>71
<211>417
<212>PRT
<213>人类
<400>71
Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln
20 25 30
Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro
35 40 45
Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu
50 55 60
Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln
65 70 75 80
Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly
100 105 110
Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe
115 120 125
Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys
130 135 140
Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro
145 150 155 160
Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln
165 170 175
Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val
180 185 190
Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu
195 200 205
Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu
210 215 220
His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr
245 250 255
Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro
275 280 285
Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys
290 295 300
Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala
305 310 315 320
Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu
325 330 335
His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe Leu Val Leu Gly Ile
340 345 350
Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Phe Tyr Trp Ser
355 360 365
Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His Leu Cys Pro Ser Ser
370 375 380
Thr Glu His Ala Ser Ala Ser Ala Asn Gly His Val Ser Tyr Ser Ala
385 390 395 400
Val Ser Arg Glu Asn Ser Ser Ser Gln Asp Pro Gln Thr Glu Gly Thr
405 410 415
Arg
<210>72
<211>1251
<212>DNA
<213>人类
<400>72
atggcccgag ccatggccgc cgcgtggccg ctgctgctgg tggcgctact ggtgctgtcc 60
tggccacccc caggaaccgg ggacgtcgtc gtgcaggcgc ccacccaggt gcccggcttc120
ttgggcgact ccgtgacgct gccctgctac ctacaggtgc ccaacatgga ggtgacgcat180
gtgtcacagc tgacttgggc gcggcatggt gaatctggca gcatggccgt cttccaccaa240
acgcagggcc ccagctattc ggagtccaaa cggctggaat tcgtggcagc cagactgggc300
gcggagctgc ggaatgcctc gctgaggatg ttcgggttgc gcgtagagga tgaaggcaac360
tacacctgcc tgttcgtcac gttcccgcag ggcagcagga gcgtggatat ctggctccga420
gtgcttgcca agccccagaa cacagctgag gttcagaagg tccagctcac tggagagcca480
gtgcccatgg cccgctgcgt ctccacaggg ggtcgcccgc cagcccaaat cacctggcac540
tcagacctgg gcgggatgcc caatacgagc caggtgccag ggttcctgtc tggcacagtc600
actgtcacca gcctctggat attggtgccc tcaagccagg tggacggcaa gaatgtgacc660
tgcaaggtgg agcacgagag ctttgagaag cctcagctgc tgactgtgaa cctcaccgtg720
tactaccccc cagaggtatc catctctggc tatgataaca actggtacct tggccagaat780
gaggccaccc tgacctgcga tgctcgcagc aacccagagc ccacaggcta taattggagc840
acgaccatgg gtcccctgcc accctttgct gtggcccagg gcgcccagct cctgatccgt900
cctgtggaca aaccaatcaa cacaacttta atctgcaacg tcaccaatgc cctaggagct960
cgccaggcag aactgaccgt ccaggtcaaa gagggacctc ccagtgagca ctcaggcatg 1020
tcccgtaacg ccatcatctt cctggttctg ggaatcctgg tttttctgat cctgctgggg 1080
atcgggattt atttctattg gtccaaatgt tcccgtgagg tcctttggca ctgtcatctg 1140
tgtccctcga gtacagagca tgccagcgcc tcagctaatg ggcatgtctc ctattcagct 1200
gtgagcagag agaacagctc ttcccaggat ccacagacag agggcacaag g1251
<210>73
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>73
aattgatatc agcgcccccg ag 22
<210>74
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>74
aattgatatc agggaacgtg accttct 27
<210>75
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>75
aattgatatc cagaaggtca cgttcag 27
<210>76
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>76
aattcctcga gtcacacata catggc 26
<210>77
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>77
aattgatatc tccatctccg gctatga 27
<210>78
<211>421
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的蛋白
<400>78
Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
Ala Asp Ile Gln Lys Val Thr Phe Ser Gln Asp Pro Thr Thr Val Ala
50 55 60
Leu Cys Ile Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala Arg Ile Ser Trp Leu
65 70 75 80
Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gln Val Ser Gly Thr Leu
85 90 95
Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr Leu Val Pro Ser Gly
100 105 110
Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe
115 120 125
Glu Glu Pro Ala Leu Ile Pro Val Thr Leu Ser Val Arg Tyr Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp Tyr Leu Gly Arg Thr
145 150 155 160
Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly
165 170 175
Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro Thr Ser Ala Val Ala
180 185 190
Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp Ser Leu Phe Asn Thr
195 200 205
Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly Met Gly Arg Ala Glu
210 215 220
Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr Ala Gly Ala Gly Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gly Ile Ile Gly Gly Ile Ile Ala Ala Ile Ile Ala Thr Ala
245 250 255
Val Ala Ala Thr Gly Ile Leu Ile Cys Arg Gln Gln Arg Lys Glu Gln
260 265 270
Thr Leu Gln Gly Ala Glu Glu Asp Glu Asp Leu Glu Gly Pro Pro Ser
275 280 285
Tyr Lys Pro Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Glu Ala Gln Glu Met Pro
290 295 300
Ser Gln Leu Phe Thr Leu Gly Ala Ser Glu His Ser Pro Leu Lys Thr
305 310 315 320
Pro Tyr Phe Asp Ala Gly Ala Ser Cys Thr Glu Gln Glu Met Pro Arg
325 330 335
Tyr His Glu Leu Pro Thr Leu Glu Glu Arg Ser Gly Pro Leu His Pro
340 345 350
Gly Ala Thr Ser Leu Gly Ser Pro Ile Pro Val Pro Pro Gly Pro Pro
355 360 365
Ala Val Glu Asp Val Ser Leu Asp Leu Glu Asp Glu Glu Gly Glu Glu
370 375 380
Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Lys Ile Asn Pro Ile Tyr Asp Ala Leu Ser
385 390 395 400
Tyr Ser Ser Pro Ser Asp Ser Tyr Gln Gly Lys Gly Phe Val Met Ser
405 410 415
Arg Ala Met Tyr Val
420
<210>79
<211>1263
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>79
atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg 60
ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcgctgat atccagaagg tcacgttcag ccaggaccct180
acgacagtgg ccctctgcat ctccaaagag ggccgcccac ctgcccggat ctcctggctc240
tcatccctgg actgggaagc caaagagact caggtgtcag ggaccctggc cggaactgtc300
actgtcacca gccgcttcac cttggtgccc tcgggccgag cagatggtgt cacggtcacc360
tgcaaagtgg agcatgagag cttcgaggaa ccagccctga tacctgtgac cctctctgta420
cgctaccctc ctgaagtgtc catctccggc tatgatgaca actggtacct cggccgtact480
gatgccaccc tgagctgtga cgtccgcagc aacccagagc ccacgggcta tgactggagc540
acgacctcag gcaccttccc gacctccgca gtggcccagg gctcccagct ggtcatccac600
gcagtggaca gtctgttcaa taccaccttc gtctgcacag tcaccaatgc cgtgggcatg660
ggccgcgctg agcaggtcat ctttgtccga gagaccccca acacagcagg cgcaggggcc720
acaggcggca tcatcggggg catcatcgcc gccatcattg ctactgctgt ggctgccacg780
ggcatcctta tctgccggca gcagcggaag gagcagacgc tgcagggggc agaggaggac840
gaagacctgg agggacctcc ctcctacaag ccaccgaccc caaaagcgaa gctggaggca900
caggagatgc cctcccagct cttcactctg ggggcctcgg agcacagccc actcaagacc960
ccctactttg atgctggcgc ctcatgcact gagcaggaaa tgcctcgata ccatgagctg 1020
cccaccttgg aagaacggtc aggacccttg caccctggag ccacaagcct ggggtccccc 1080
atcccggtgc ctccagggcc acctgctgtg gaagacgttt ccctggatct agaggatgag 1140
gagggggagg aggaggaaga gtatctggac aagatcaacc ccatctatga tgctctgtcc 1200
tatagcagcc cctctgattc ctaccagggc aaaggctttg tcatgtcccg ggccatgtat 1260
gtg 1263
<210>80
<211>451
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的蛋白
<400>80
Met Ala Arg Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Glu Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
50 55 60
Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Ala Asn His Gln
65 70 75 80
Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Gly Ser Glu Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr
100 105 110
Gly Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu His
115 120 125
Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
130 135 140
Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asn Gln Ala Glu Ala Gln Lys Val Thr Phe Pro Asp Ile
165 170 175
Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala
180 185 190
Thr Leu Ser Cys Asp Val Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp
195 200 205
Trp Ser Thr Thr Ser Gly Thr Phe Pro Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly
210 215 220
Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe
225 230 235 240
Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly Met Gly Arg Ala Glu Gln Val
245 250 255
Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly
260 265 270
Gly Ile Ile Gly Gly Ile Ile Ala Ala Ile Ile Ala Thr Ala Val Ala
275 280 285
Ala Thr Gly Ile Leu Ile Cys Arg Gln Gln Arg Lys Glu Gln Thr Leu
290 295 300
Gln Gly Ala Glu Glu Asp Glu Asp Leu Glu Gly Pro Pro Ser Tyr Lys
305 310 315 320
Pro Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Glu Ala Gln Glu Met Pro Ser Gln
325 330 335
Leu Phe Thr Leu Gly Ala Ser Glu His Ser Pro Leu Lys Thr Pro Tyr
340 345 350
Phe Asp Ala Gly Ala Ser Cys Thr Glu Gln Glu Met Pro Arg Tyr His
355 360 365
Glu Leu Pro Thr Leu Glu Glu Arg Ser Gly Pro Leu His Pro Gly Ala
370 375 380
Thr Ser Leu Gly Ser Pro Ile Pro Val Pro Pro Gly Pro Pro Ala Val
385 390 395 400
Glu Asp Val Ser Leu Asp Leu Glu Asp Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu
405 410 415
Glu Tyr Leu Asp Lys Ile Asn Pro Ile Tyr Asp Ala Leu Ser Tyr Ser
420 425 430
Ser Pro Ser Asp Ser Tyr Gln Gly Lys Gly Phe Val Met Ser Arg Ala
435 440 445
Met Tyr Val
450
<210>81
<211>1353
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>81
atggcccggg ccgctgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg 60
ctgctgctgc tgctgctcct ggaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtgctaccc120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt180
cctggactgt acatttccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctgc gaaccaccag240
aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcctggcagc300
gagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactgggc aagacacaga ggcagagctc360
caggacgcca cgctggccct ccacgggctc acggtggagg acgagggcaa ctacacttgc420
gagtttgcca ccttccccaa ggggtccgtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc480
aagcccaaga accaagctga ggcccagaag gtcacgttcc ctgatatctc catctccggc540
tatgatgaca actggtacct cggccgtact gatgccaccc tgagctgtga cgtccgcagc600
aacccagagc ccacgggcta tgactggagc acgacctcag gcaccttccc gacctccgca660
gtggcccagg gctcccagct ggtcatccac gcagtggaca gtctgttcaa taccaccttc720
gtctgcacag tcaccaatgc cgtgggcatg ggccgcgctg agcaggtcat ctttgtccga780
gagaccccca acacagcagg cgcaggggcc acaggcggca tcatcggggg catcatcgcc840
gccatcattg ctactgctgt ggctgccacg ggcatcctta tctgccggca gcagcggaag900
gagcagacgc tgcagggggc agaggaggac gaagacctgg agggacctcc ctcctacaag960
ccaccgaccc caaaagcgaa gctggaggca caggagatgc cctcccagct cttcactctg 1020
ggggcctcgg agcacagccc actcaagacc ccctactttg atgctggcgc ctcatgcact 1080
gagcaggaaa tgcctcgata ccatgagctg cccaccttgg aagaacggtc aggacccttg 1140
caccctggag ccacaagcct ggggtccccc atcccggtgc ctccagggcc acctgctgtg 1200
gaagacgttt ccctggatct agaggatgag gagggggagg aggaggaaga gtatctggac 1260
aagatcaacc ccatctatga tgctctgtcc tatagcagcc cctctgattc ctaccagggc 1320
aaaggctttg tcatgtcccg ggccatgtat gtg1353
<210>82
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>82
agctgggccg ggagagcaga aca23
<210>83
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>83
aaatgggatg cacgtgtgtt aactgac27
<210>84
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>84
agagcagaac agggaggcta gag23
<210>85
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>85
caagaaagct aaggga tcaa caggtgag 28
<210>86
<211>538
<212>PRT
<213>食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400>86
Met Ala Arg Ala Val Ala Leu Leu Pro Ser Arg Ser Pro Pro Thr Pro
1 5 10 15
Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Lys Thr Gly Ala Gln
20 25 30
Asp Val Arg Val Gln Val Leu Pro Glu Val Arg Gly Gln Leu Gly Gly
35 40 45
Thr Val Glu Leu Pro Cys His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Leu Tyr
50 55 60
Ile Ser Leu Val Thr Trp Gln Arg Pro Asp Ala Pro Pro Asp His Gln
65 70 75 80
Asn Val Ala Ala Phe His Pro Lys Met Gly Pro Ser Phe Pro Ser Pro
85 90 95
Lys Pro Gly Ser Gln Arg Leu Ser Phe Val Ser Ala Lys Gln Ser Thr
100 105 110
Arg Gln Asp Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ala Thr Leu Ala Leu Arg
115 120 125
Gly Leu Thr Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Phe Ala Thr
130 135 140
Phe Pro Lys Gly Ser Val Arg Gly Met Thr Trp Leu Arg Val Ile Ala
145 150 155 160
Lys Pro Gln Asn His Ala Glu Ala Gln Glu Val Thr Phe Ser Gln Asp
165 170 175
Pro Val Pro Val Ala Arg Cys Ile Ser Lys Glu Gly Arg Pro Pro Ala
180 185 190
Arg Ile Ser Trp Leu Ser Ser Leu Asp Trp Glu Ala Lys Glu Thr Gln
195 200 205
Val Ser Gly Thr Leu Ala Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Arg Phe Thr
210 215 220
Leu Val Pro Ser Gly Arg Ala Asp Gly Val Thr Val Thr Cys Lys Val
225 230 235 240
Glu His Glu Ser Phe Glu Glu Pro Ala Leu Ile Pro Val Thr Leu Ser
245 250 255
Val Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asp Asn Trp
260 265 270
Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Leu Ser Cys Asp Val His Ser Asn
275 280 285
Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asp Trp Ser Thr Thr Ser Gly Ile Phe Pro
290 295 300
Thr Ser Ala Val Ala Gln Gly Ser Gln Leu Val Ile His Ala Val Asp
305 310 315 320
Ser Leu Phe Asn Thr Thr Phe Val Cys Thr Val Thr Asn Ala Val Gly
325 330 335
Met Gly Arg Ala Glu Gln Val Ile Phe Val Arg Glu Thr Pro Asn Thr
340 345 350
Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ile Ile Gly Gly Ile Ile Ala Ala
355 360 365
Ile Ile Ala Thr Ala Val Ala Ala Thr Gly Ile Leu Ile Cys Arg Gln
370 375 380
Gln Arg Lys Glu Gln Thr Leu Gln Gly Ala Glu Glu Asp Glu Asp Leu
385 390 395 400
Glu Gly Pro Pro Ser Tyr Lys Pro Pro Thr Pro Lys Ala Lys Leu Glu
405 410 415
Glu Gln Glu Met Pro Ser Gln Leu Phe Thr Leu Gly Ala Ser Glu His
420 425 430
Ser Pro Leu Lys Thr Pro Tyr Phe Asp Ala Gly Ala Ser Cys Thr Glu
435 440 445
Gln Glu Met Pro Arg Tyr His Glu Leu Pro Thr Leu Glu Glu Arg Ser
450 455 460
Gly Pro Leu His Pro Gly Ala Thr Ser Leu Gly Ser Pro Ile Pro Val
465 470 475 480
Pro Pro Gly Pro Pro Val Val Glu Asp Val Ser Leu Asp Leu Glu Asp
485 490 495
Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Lys Ile Asn Pro Val
500 505 510
Tyr Asp Ala Leu Ser Tyr Ser Ser Pro Ser Asp Ser Tyr Gln Gly Lys
515 520 525
Gly Phe Val Met Ser Arg Ala Met Tyr Val
530 535
<210>87
<211>1614
<212>DNA
<213>食蟹猴
<400>87
atggcccggg ccgttgccct cctgccgtcg agatcgccgc cgacgccgct gctgtggccg 60
ctgctgctgc tgctgctccg gaaaaccgga gcccaggatg tgcgagttca agtactaccc120
gaggtgcgag gccagctcgg gggcaccgtg gagctgccgt gccacctgct gccacctgtt180
cctggactgt acatctccct ggtgacctgg cagcgcccag atgcacctcc agaccaccag240
aatgtggccg ccttccaccc taagatgggt cccagcttcc ccagcccgaa gcccggcagc300
cagcggctgt ccttcgtctc tgccaagcag agcactaggc aagacacaga ggcggagctc360
caggacgcca cgctggccct ccgcgggctc acggtggagg acgaaggcaa ctacacctgc420
gagtttgcca ccttccccaa ggggtcggtc cgagggatga cctggctcag agtcatagcc480
aagccccaga accacgctga ggcccaggag gtcacgttca gccaggaccc tgtgccagtg540
gcccgctgca tctccaaaga gggtcgccca cctgcccgga tctcctggct ctcatccctg600
gactgggaag ccaaagagac ccaggtatca gggaccctgg ccggcactgt caccgtcacc660
agccgcttca ccttggtccc ctcgggccga gcagatggtg tcacggtcac ctgcaaagtg720
gagcatgaga gcttcgagga gccagccctg atacctgtga ccctctctgt acgctaccct780
cctgaagtgt ccatctccgg ctatgatgac aactggtacc tcggccgtac tgatgccacc840
ctgagctgtg acgtccacag caacccagag cccacgggct atgactggag cacgacctca900
ggcatcttcc caacctccgc agtagcccag ggctcccagc tggtcatcca cgcggtggac960
agtctgttca ataccacctt cgtctgcaca gtcaccaatg ccgtgggcat gggccgcgct 1020
gagcaggtca tctttgtccg agagaccccc aacacagcag gcgcaggggc cacgggcggc 1080
atcatcgggg gcatcatcgc cgccatcatt gcgactgctg tggctgccac gggcatcctt 1140
atctgccggc agcagcggaa ggagcagacg ctgcaggggg cagaggagga tgaagaccta 1200
gagggacctc cctcctacaa gccaccgacc ccaaaagcga agctggagga gcaggagatg 1260
ccctcccagc tcttcactct gggggcctcg gagcacagcc cactcaagac cccctacttt 1320
gacgctggcg cctcatgcac tgagcaggaa atgcctcgat accatgaatt gcccactttg 1380
gaagagcggt caggacccct gcaccctgga gccacaagcc tgggatcccc catcccggtg 1440
cctccagggc cacctgttgt ggaagacgtt tccctggatc tagaggatga ggagggggag 1500
gaggaggaag agtatctgga taagatcaac cccgtctacg atgctctgtc ctacagcagc 1560
ccctctgatt cctaccaggg caaaggcttt gtcatgtccc gggccatgta cgtg 1614
<210>88
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>88
aattgaattc atggcccggg ccgtt 25
<210>89
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>89
aattctcgag tcacacgtac atggcccggg a 31
<210>90
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>90
agaagcttgc caccatggcc cgggccgctg ccctcc36
<210>91
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>91
cattctggtg gtctggaggt gcatc25
<210>92
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>92
gagaattctc acacatacat ggcccgggac atg 33
<210>93
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>93
gatgcacctc cagaccacca gaatg25
<210>94
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>94
ctgtgtcttg cctagtgctc tg 22
<210>95
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>95
cagagcacta ggcaagacac ag 22
<210>96
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>96
cgtgagcccg cggagggcca g21
<210>97
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>97
ctggccctcc gcgggctcac g21
<210>98
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>98
ggatgtgcga gttgcagtgc tacccgag 28
<210>99
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>99
ctcgggtagc actgcaactc gcacatcc 28
<210>100
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>100
gagttcaagt gctaggcgag gtgcgaggcc 30
<210>101
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>101
ggcctcgcac ctcgcctagc acttgaactc 30
<210>102
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>102
ccgaggtgcg aggcgcgctc gggggcaccg 30
<210>103
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>103
cggtgccccc gagcgcgcct cgcacctcgg 30
<210>104
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>104
tggagctgcc gtgcgccctg ctgccacctg 30
<210>105
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>105
caggtggcag cagggcgcac ggcagctcca 30
<210>106
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>106
ctgctgccac ctgctcctgg actgtac 27
<210>107
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>107
gtacagtcca ggagcaggtg gcagcag 27
<210>108
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>108
ctgttcctgg actggccatc tccctggtga 30
<210>109
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>109
tcaccaggga gatggccagt ccaggaacag 30
<210>110
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>110
cctggtgacc tgggcgcgcc cagatgcac 29
<210>111
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>111
gtgcatctgg gcgcgcccag gtcaccagg 29
<210>112
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>112
gcagcgccca gatggacctg cgaaccacc 29
<210>113
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>113
ggtggttcgc aggtccatct gggcgctgc 29
<210>114
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>114
gcgcccagat gcaggtgcga accaccag 28
<210>115
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>115
ct ggtggttc gcacctgcat ctgggcgc 28
<210>116
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>116
gcccagatgc acctgggaac caccagaatg30
<210>117
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>117
cattctggtg gttcccaggt gcatctgggc30
<210>118
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>118
cagatgcacc tgcggcccac cagaatgtgg30
<210>119
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>119
ccacattctg gtgggccgca ggtgcatctg30
<210>120
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>120
atgcacctgc gaacgcccag aatgtggccg 30
<210>121
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>121
cggccacatt ctgggcgttc gcaggtgcat 30
<210>122
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>122
cctgcgaacc acgcgaatgt ggccgc 26
<210>123
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>123
gcggccacat tcgcgtggtt cgcagg 26
<210>124
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>124
ctgcgaacca ccaggctgtg gccgcct tcc 30
<210>125
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>125
ggaaggcggc cacagcctgg tggttcgcag 30
<210>126
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>126
ccgccttcca ccctgcgatg ggtcccagct 30
<210>127
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>127
agctgggacc catcgcaggg tggaaggcgg 30
<210>128
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>128
gtcccagctt ccccgccccg aagcctggca 30
<210>129
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>129
tgccaggctt cggggcgggg aagctgggac 30
<210>130
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>130
ccttcgtctc tgccgcgcag agcactgggc 30
<210>131
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>131
gcccagtgct ctgcgcggca gagacgaagg 30
<210>132
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>132
tgggcaagac acagcggcag agctccagg 29
<210>133
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>133
cctggagctc tgccgctgtg tcttgccca 29
<210>134
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>134
ggcagagctc caggccgcca cgctggccc 29
<210>135
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>135
gggccagcgt ggcggcctgg agctctgcc 29
<210>136
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>136
ccacgctggc cctcgccggg ctcacggtgg 30
<210>137
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>137
ccaccgtgag cccggcgagg gccagcgtgg 30
<210>138
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>138
ggaggacgag ggcgcctaca cttgcgag 28
<210>139
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>139
ctcgcaagtg taggcgccct cgtcctcc 28
<210>140
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>140
gcgagtttgc caccgccccc aaggggtccg30
<210>141
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>141
cggacccctt gggggcggtg gcaaactcgc30
<210>142
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>142
ttgccacctt ccccgcgggg tccgtccgag30
<210>143
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>143
ctcggacgga ccccgcgggg aaggtggcaa30
<210>144
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>144
cccaaggggt ccgcccgagg gatgacc 27
<210>145
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>145
ggtcatccct cgggcggacc ccttggg 27
<210>146
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>146
ggtccgtccg aggggcgacc tggctcagag 30
<210>147
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>147
ctctgagcca ggtcgcccct cggacggacc 30
<210>148
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>148
ccgtccgagg gatggcctgg ctcagagtc29
<210>149
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>149
gactctgagc caggccatcc ctcggacgg29
<210>150
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>150
ccaagcccaa gaacgcagct gaggcccaga 30
<210>151
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>151
tctgggcctc agctgcgttc ttgggcttgg 30
<210>152
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>152
aagctgaggc ccaggcggtc acgttcagcc 30
<210>153
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>153
ggctgaacgt gaccgcctgg gcctcagctt 30
<210>154
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>154
cccagaaggt cacggccagc caggacccta 30
<210>155
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>155
tagggtcctg gctggccgtg acct tctggg 30
<210>156
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>156
cgttcagcca ggacggtacg acagtggccc 30
<210>157
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>157
gggccactgt cgtaccgtcc tggctgaacg 30
<210>158
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>158
cagtggccct ctgcgcctcc aaagagggcc 30
<210>159
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>159
ggccctcttt ggaggcgcag agggccactg 30
<210>160
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>160
ccctctgcat ctccgcagag ggccgcccac 30
<210>161
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>161
gtgggcggcc ctctgcggag atgcagaggg 30
<210>162
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>162
cccggatctc ctgggcctca tccctggact 30
<210>163
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>163
agtccaggga tgaggcccag gaga tccggg 30
<210>164
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>164
tctcatccct ggacgcggaa gccaaagaga 30
<210>165
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>165
tctctttggc ttccgcgtcc agggatgaga 30
<210>166
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>166
ctgggaagcc aaagcgactc aggtgtcag 29
<210>167
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>167
ctgacacctg agtcgctttg gcttcccag 29
<210>168
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>168
ctcaggtgtc aggggccctg gccggaact 29
<210>169
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>169
agttccggcc agggcccctg acacctgag 29
<210>170
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>170
gagcagatgg tgtcgcggtc acctgcaaa 29
<210>171
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>171
tttgcaggtg accgcgacac catctgctc 29
<210>172
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>172
tcacggtcac ctgcgcagtg gagcatgaga 30
<210>173
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>173
tctcatgctc cactgcgcag gtgaccgtga 30
<210>174
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>174
cttcgaggaa ccaggcctga tacctgtga 29
<210>175
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>175
tcacaggtat caggcctggt tcctcgaag 29
<210>176
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>176
caaaagcttg ccgccaccat gaaacacctg tggttcttc 39
<210>177
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>177
aaaatgaatt ctcatttacc cggagacag 29
<210>178
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>178
ataaagcttg ccgccaccat ggacatgagg gtc 33
<210>179
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>179
ccggaattcc taacactctc ccctgttgaa gctctttg38
<210>180
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>180
caaaagcttg ccgccaccat ggaarcccca gckcag36
<210>181
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>181
caaaagcttg ccgccaccat ggaactgggg ctccg 35
<210>182
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>182
caaaagcttg ccgccaccat gttgccatca 30
<210>183
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>183
aagtagtcct tgaccaggc 19
<210>184
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>184
Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210>185
<211>16
<212>PRT
<213>人类
<400>185
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn His Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>186
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>186
Asp Gly Gly Asp Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210>187
<211>121
<212>PRT
<213>人类
<400>187
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn His Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ala Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Gly Asp Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210>188
<211>15
<212>DNA
<213>人类
<400>188
agttactact ggagc 15
<210>189
<211>48
<212>DNA
<213>人类
<400>189
tatatctatt acagtgggag caccaaccac aacccctccc tcaagagt 48
<210>190
<211>36
<212>DNA
<213>人类
<400>190
gatggtgggg acgactacaa ctacggtatg gacgtc 36
<210>191
<211>363
<212>DNA
<213>人类
<400>191
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc60
atctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caaccacaac180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgg ccaagaacca gttctccctg240
aagctgaact ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatggtggg300
gacgactaca actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca360
gcc 363
<210>192
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>192
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Xaa Leu Ala
1 5 10
<210>193
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>193
Asp Ala Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
<210>194
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>194
Gln Gln Xaa Asn Ser Tyr Pro Xaa Thr
1 5
<210>195
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(46)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(55)..(55)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(58)..(58)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(91)..(91)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(96)..(96)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>195
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Xaa
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Xaa Ser Gly Xaa Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ile Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Asn Ser Tyr Pro Xaa
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>196
<211>33
<212>DNA
<213>人类
<400>196
cgggcragtc agggcattag cagygsktta gcc33
<210>197
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>197
gatgcmtcca gtttgsaaagt21
<210>198
<211>27
<212>DNA
<213>人类
<400>198
caacagtwta atagttaccc tyggacg 27
<210>199
<211>321
<212>DNA
<213>人类
<400>199
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgyc gggcragtca gggcattagc agygskttag cctggtatca gcagaaacca120
gggaaagctc ctaagytcct gatctatgat gcmtccagtt tgsaaagtgg grtcccatca180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcatcag cctgcagcct240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag twtaatagtt accctyggac gttcggccaa300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210>200
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>200
Ser Tyr Tyr Trp Thr
1 5
<210>201
<211>16
<212>PRT
<213>人类
<400>201
Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>202
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>202
Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210>203
<211>121
<212>PRT
<213>人类
<400>203
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
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<210>204
<211>15
<212>DNA
<213>人类
<400>204
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<210>205
<211>48
<212>DNA
<213>人类
<400>205
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<211>36
<212>DNA
<213>人类
<400>206
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<212>DNA
<213>人类
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<213>人类
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<400>208
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<213>人类
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<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>211
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<212>DNA
<213>人类
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<213>人类
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<212>DNA
<213>人类
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<213>人类
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aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtacgag agaccctggg300
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<210>276
<211>33
<212>DNA
<213>人类
<400>276
cgggcragtc agggyattag cagygcttta gcc 33
<210>277
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>277
gatgcctcca gtttggaaag t 21
<210>278
<211>27
<212>DNA
<213>人类
<400>278
caacagttta atagttaccc tcggacg 27
<210>279
<211>321
<212>DNA
<213>人类
<400>279
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcragtca gggyattagc agygctttag cctggtatca gcagaaacca120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcggac gttcggccaa300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210>280
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>280
Ser Tyr Xaa Trp Thr
1 5
<210>281
<211>16
<212>PRT
<213>人类
<400>281
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>282
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>282
Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210>283
<211>121
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(33)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>283
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Xaa Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Asp Pro Gly Glu Asp Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210>284
<211>15
<212>DNA
<213>人类
<400>284
agttacwact ggacc 15
<210>285
<211>48
<212>DNA
<213>人类
<400>285
tatatctatt acagtgggag caccaactac aacccctccc tcaagagt 48
<210>286
<211>36
<212>DNA
<213>人类
<400>286
gaccctgggg aagactacaa ctacggtatg gacgtc 36
<210>287
<211>363
<212>DNA
<213>人类
<400>287
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cttgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttacwact ggacctggat ccggcagccc120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atctattaca gtgggagcac caactacaac180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca ttagacacgt ccaagaacca gttctccctg240
aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtacgag agaccctggg300
gaagactaca actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca360
gcc 363
<210>288
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>288
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210>289
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>289
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210>290
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>290
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210>291
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>291
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>292
<211>33
<212>DNA
<213>人类
<400>292
cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcc 33
<210>293
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>293
gatgcctcca gtttggaaag t21
<210>294
<211>27
<212>DNA
<213>人类
<400>294
caacagttta atagttaccc tcggacg 27
<210>295
<211>321
<212>DNA
<213>人类
<400>295
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcggac gttcggccaa300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210>296
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>296
Ser Tyr Tyr Trp Thr
1 5
<210>297
<211>16
<212>PRT
<213>人类
<400>297
Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>298
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>298
Gly Ile Ala Gly Met Asp Val
1 5
<210>299
<211>116
<212>PRT
<213>人类
<400>299
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Cys Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Ile Ala Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala
115
<210>300
<211>15
<212>DNA
<213>人类
<400>300
agttactatt ggacc 15
<210>301
<211>48
<212>DNA
<213>人类
<400>301
tatatctttt acagtgggag caccaactac aacccctccc tcaagagt 48
<210>302
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>302
ggt atagcag gtatggacgt c 21
<210>303
<211>348
<212>DNA
<213>人类
<400>303
caggtgcaac tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcaga agttactatt ggacctggat ccggcagccc120
ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atcttttaca gtgggagcac caactacaac180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gtgctccctg240
aagctgacct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgaa aggtatagca300
ggtatggacg tctggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcc 348
<210>304
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>304
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His
1 5 10
<210>305
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>305
Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser
1 5
<210>306
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>306
His Gln Ser Arg Ser Leu Pro Ile Thr
1 5
<210>307
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>307
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Arg Ser Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>308
<211>36
<212>DNA
<213>人类
<400>308
agggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcc 36
<210>309
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>309
ggtgcatcca gcagggccac t 21
<210>310
<211>27
<212>DNA
<213>人类
<400>310
cagcagtatg gtagctcacc gtacact27
<210>311
<211>324
<212>DNA
<213>人类
<400>311
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgta cacttttggc300
caggggacca agctggagat caaa 324
<210>312
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>312
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
1 5 10
<210>313
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>313
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
1 5 10
<210>314
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>314
atgaaacacc tgtggttctt c 21
<210>315
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>315
atggaaaccc cagcgcag 18
<210>316
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>316
ggatgaattc tcatttaccc ggagacaggg 30
<210>317
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>317
ccggaattcc taacactctc ccctgttg 28
权利要求
1.针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐的单克隆抗体。
2.权利要求1的抗体，其为针对含有序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐的单克隆抗体。
3.权利要求1的抗体，其为人单克隆抗体。
4.权利要求1的抗体，其为嵌合单克隆抗体。
5.权利要求1的抗体，其为人化单克隆抗体。
6.权利要求1的抗体，其为属于人IgG1亚类的单克隆抗体。
7.权利要求1的抗体，其具有癌细胞增殖抑制活性。
8.权利要求1的抗体，其具有抗体依赖性细胞毒性(ADCCAntibody-dependent cellular cytotoxicity)。
9.权利要求1的抗体，其具有Nectin-2/Nectin-3或Nectin-2/Nectin-2反式结合抑制活性。
10.权利要求1的抗体，其为单克隆抗体，且识别存在于序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的第1-350位的氨基酸序列中的表位。
11.权利要求1的抗体，其为单克隆抗体，且识别存在于序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的第47-142位或第175-240位的氨基酸序列中的表位。
12.权利要求1的抗体，其为单克隆抗体，且识别序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列的、包含第75，76，77，78，95，137，145，173，184，186和212位中的至少1个氨基酸残基的氨基酸序列。
13.权利要求1的抗体，其与由Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
14.权利要求1的抗体，其识别下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与由Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)或Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体所识别的氨基酸序列相同或实质上相同。
15.产生权利要求1的抗体的杂交瘤细胞。
16.用Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)表示的权利要求15的杂交瘤细胞。
17.由权利要求16的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
18.权利要求1的抗体，其为重组型单克隆抗体。
19.权利要求1的抗体，其中，抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与(i)选自序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、(ii)选自序列号185，201，217，233，249，265，281和297中序列号和(iii)选自序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列。
20.权利要求1的抗体，其中，抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与(iv)选自序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、(v)选自序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和(vi)选自序列号194，210，226，242，258，274，290和306中序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列。
21.一种诊断剂，其包含下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
22.权利要求21的诊断剂，其为癌的诊断剂。
23.一种药物，其包含下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
24.权利要求23的药物，其为癌的预防和/或治疗剂。
25.权利要求23的药物，其为癌细胞的凋亡促进剂。
26.权利要求23的药物，其为癌细胞的增殖抑制剂。
27.权利要求23的药物，其为利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞毒剂。
28.癌的预防和/或治疗方法，其中，对哺乳动物施用有效量的下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
29.一种癌细胞凋亡促进方法，其中，对哺乳动物施用有效量的下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
30.一种癌细胞增殖抑制方法，其中，对哺乳动物施用有效量的下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
31.一种利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞损伤方法，其中，对哺乳动物施用有效量的下述单克隆抗体，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
32.下述单克隆抗体在制造癌的预防和/或治疗剂中的用途，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
33.下述单克隆抗体在制造癌细胞凋亡促进剂中的用途，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
34.下述单克隆抗体在制造癌细胞增殖抑制剂中的用途，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
35.下述单克隆抗体在制造利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞毒剂中的用途，所述单克隆抗体针对含有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质或其部分肽或其盐。
36.一种乳腺癌的预防或治疗剂，其含有Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)、或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
37.含有下述单克隆抗体的乳腺癌的预防或治疗剂，所述单克隆抗体与Nec1-803-2(FERM BP-10417)、Nec1-244-3(FERM BP-10423)、Nec1-530-1(FERM BP-10424)、Nec1-903-1(FERM BP-10425)、Nec1-520-1(FERM BP-10426)、Nec1-845-2(FERM BP-10427)、Nec1-834-1(FERM BP-10428)、Nec1-964-1(FERM BP-10683)、Nec1-1302-2(FERM BP-10684)、Nec1-554-1(FERM BP-10681)、Nec1-769-2(FERM BP-10682)、或Nec8-4116-8(FERM BP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合Nectin-2。
38.权利要求37的乳腺癌的预防或治疗剂，其中，与Nec1-554-1(FERMBP-10681)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合Nectin-2的单克隆抗体为Nec1-1044-4(FERM BP-10805)或Nec1-1302-2(FERMBP-10684)。
39.权利要求37的乳腺癌的预防或治疗剂，其中，与Nec8-4116-8(FERMBP-10685)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合Nectin-2的单克隆抗体为Nec8-3704-7(FERM BP-10807)或Nec8-3517-11(FERMBP-10806)。
40.权利要求36～39中任一项的乳腺癌的预防或治疗剂，其利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制。
41.含有下述抗体的乳腺癌的预防或治疗剂，所述抗体的抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与(i)选自序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、(ii)选自序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的序列号和(iii)选自序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列。
42.含有下述抗体的乳腺癌的预防或治疗剂，所述抗体的抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与(iv)选自序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、(v)选自序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和(vi)选自序列号194，210，226，242，258，274，290和306中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列。
43.含有下述抗体的乳腺癌的预防或治疗剂，所述抗体包含抗体重链可变区、抗体轻链可变区和抗体恒定区，其中，所述抗体重链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与(i)选自序列号184，200，216，232，248，264，280和296中的序列号、(ii)选自序列号185，201，217，233，249，265，281和297中的序列号和(iii)选自序列号186，202，218，234，250，266，282和298中的序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区的第1互补决定区(CDR1)、第2互补决定区(CDR2)和第3互补决定区(CDR3)的氨基酸序列分别包含与(iv)选自序列号192，208，224，240，256，272，288和304中的序列号、(v)选自序列号193，209，225，241，257，273，289和305中的序列号和(vi)选自序列号194，210，226，242，258，274，290和306中序列号所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列。
44.Nec1-1044-4(FERM BP-10805)、Nec8-3517-11(FERM BP-10806)或Nec8-3704-7(FERM BP-10807)所表示的杂交瘤细胞。
45.权利要求44的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
46.与Nec1-1044-4(FERM BP-10805)、Nec8-3517-11(FERM BP-10806)或Nec8-3704-7(FERM BP-10807)所表示的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体竞争性结合的单克隆抗体。
47.含有权利要求45或46的单克隆抗体的乳腺癌的预防或治疗剂。
全文摘要
针对具有与序列号1或序列号3所表示的氨基酸序列相同或者实质上相同的氨基酸序列的蛋白质、其部分肽或其盐的人单克隆抗体作为癌症的预防和/或治疗剂、癌细胞的凋亡促进剂、癌细胞增殖抑制剂、利用了抗体的Fc区介导的生物体防御机制的癌细胞毒剂等是有用的。
文档编号C07K16/32GK101541834SQ20078003714
公开日2009年9月23日 申请日期2007年10月4日 优先权日2006年10月6日
发明者佐藤秀司, 大岛勉, 黑川智文 申请人:武田药品工业株式会社