针对ErbB2的人抗体的制作方法

专利名称：：针对ErbB2的人抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗ErbB2抗体，特别是人抗体，以及用于制备和使用抗ErbB2抗体例如以治疗癌症的方法。
背景技术：
：受体酪氨酸激酶的ErbB家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。受体家族包括4个不同成员，包括表皮生长因子受体(EGFR或ErbBl)、HER2(ErbB2或pl85neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。由erbBl基因编码的EGFR已有原因地与人恶性肿瘤有牵连。特别地，EGFR增加的表达已在乳腺、膀胱、肺、头、颈和胃癌以及成胶质细胞瘤中观察到。增加的EGFR受体表达通常与EGFR配体——转化生长因子a(TGF-a)经由相同肺瘤细胞增加的生产相关，导致经由自分泌刺激途径的受体活化(Baselga和Mendelsohn,Pharmac.Ther.64:127-154(1994))。针对EGFR或其配体TGF-a和EGF的单克隆抗体已评估为此种恶性肿瘤治疗中的治疗剂。参见例如，Baselga和Mendelsohn,同上；Masui等人CancerResearch44:1002-1007(1984);和Wu等人J.Clin.Invest.95:1897-1905(1995)。ErbB家族的第二个成员pl85neu最初鉴定为来自用化学方法处理的大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。激活型neu原癌基因起因于编码蛋白质的跨膜区中的点突变(缬氨酸至谷氨酸)。neu的人同源物(homolog)的扩增在乳腺和卯巢癌中观察到且与预后不良关联(Slamon等人，Science,235:177-182(1987);Slamon等人，Science,244:707-712(1989);和美国专利号4,968,603)。迄今为止，对于人肿瘤尚未报道与neu原癌基因中的那种类似的点突变。ErbB2的超表达(通常但并非一致地由于基因扩增)也已在其他癌中观察到，包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰和膀胱癌。其中参见King等人，Science,229:974(1985);Yokota等人，Lancet:1:765-767(1986);Fukushige等人,MolCellBiol.，6:955-958(1986);Guerin等人，OncogeneRes.，3:21-31(1988);Cohen等人，Oncogene,4:81-88(1989);Yonemura等人，CancerRes.，51:1034(1991);Borst等人，Gynecol.Oncol.,38:364(1990);Weiner等人，CancerRes.,50:421-425(1990);Kern等人，CancerRes.，50:5184(1990);Park等人，CancerRes.，49:6605(1989);Zhau等人，Mol.Carcinog.，3:254-257(1990);Aasland等人Br.J.Cancer57:358-363(1988);Williams等人Pathobiology59:46-52(1991);和McCann等人，Cancer,65:88-92(19卯)。ErbB2可能在前列腺癌中超表达(Gu等人CancerLett.99:185-9(1996);Ross等人Hum.Pathol.28:827-33(1997);Ross等人Cancer79:2162-70(1997);和Sadasivan等人J.Urol.150:126-31(1993))。针对大鼠pi85neu和人ErbB2蛋白质产物的抗体已得到描述。Drebin及同事已产生针对大鼠neu基因产物pl85neu的抗体。参见例如，Drebin等人，Cell41:695-706(1985);Myers等人，Meth.Enzym.198:277-290(1991);和W094/22478。Drebin等人Oncogene2:273-277(1988)报道与pl85neu的2个不同区域反应的抗体的混合物导致对植入棵鼠内的neu转化的NIH-3T3细胞的抗肿瘤作用。还参见于1998年10月20日授权的美国专利号5,824，311。Hudziak等人,Mol.Cell.Biol.9(3):1165-1172(1989)描述了使用人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3进行表征的一组抗ErbB2抗体的产生。暴露于抗体后SK-BR-3细胞的相对细胞增殖通过72小时后单层的结晶紫染色来测定。使用这种测定，用称为4D5的抗体获得最大抑制，所述4D5使细胞增殖抑制56%。该组中的其他抗体在这个测定中使细胞增殖减少至较小的程度。进一步发现抗体4D5使ErbB2超表达乳腺肺瘤细胞系对TNF-a的细胞毒性作用变得敏感。还参见于1997年10月14日授权的美国专利号5,677,171。Hudziak等人中讨论的抗ErbB2抗体在下述参考文献中进一步得到表征Fendly等人CancerResearch50:1550-1558(1990);Kotts等人/"v"ra26(3):59A(1990);Sarup等人GrowthRegulation1:72-82(1991);Shepard等人J.Clin.Immunol.11(3):117-127(1991);Kumar等人Mol.Cell.Biol.11(2):979-986(1991);Lewis等人CancerImmunol.Immunother.37:255-263(1993);Pietras等人Oncogene9:1829-1838(1994);Vitetta等人CancerResearch54:5301-5309(1994);Sliwkowski等人J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994);Scott等人J.Biol.Chem.266:14300-5(1991);D'souza等人Proc.Natl.Acad.Sci.91:7202-7206(1994);Lewis等人CancerResearch56:1457-1465(1996);和Schaefer等人Oncogene15:1385-1394(1997)。鼠抗ErbB2抗体4D5的重组人源化形式(huMAb4D5-8、rhuMAbHER2或HERCEPTIN;美国专利号5,821,337)在具有ErbB2超表达转移性乳腺癌的患者中是临床活性的，所述患者已接受广泛的先前抗癌治疗(Baselga等人，J.Clin.Oncol.14:737-744(1996))。HERCEPTIN⑧接受1998年9月25日来自食品与药物管理局(FoodandDrugAdministration)用于治疗具有转移性乳腺癌的患者的销售批准，所述肺瘤超表达ErbB2蛋白质。Tagliabue等人Int.J.Cancer47'.933-937(1991);McKenzie等人Oncogene4:543-548(1989);Maier等人CancerRes.51:5361-5369(1991);Bacus等人MolecularCarcinogenesis3:350-362(1990);Stancovski等人PNAS(USA)88:8691-8695(1991);Bacus等人CancerResearch52:2580-2589(1992);Xu等人Int.J.Cancer53:401-408(1993);WO94/00136;Kasprzyk等人CancerResearch52:2771-2776(1992);Hancock等人CancerRes.54575-4580(1991);Shawver等人CancerRes.54:1367-1373(1994);Arteaga等人CancerRes.54:3758-3765(1994);Harwerth等人J.Biol.Chem.267:15160-15167(1992);美国专利号5,783,186;和Klapper等人Oncogene14:2099-2109(1997)。同源性筛选已导致2个其他ErbB受体家族成员的鉴定；ErbB3(美国专利号5,183,884和5,480,968以及Kraus等人PNAS(USA)86:9193-9197(1989))和ErbB4(EP专利申请号599,274;Plowman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993);和Plowman等人，Nature,366:473-475(1993))。这2种受体在至少一些乳腺癌细胞系上展示出增加的表达。ErbB受体在细胞中一般以各种组合发现，并且异二聚化被认为增加对于多种ErbB配体的细胞应答的多样性(Earp等人BreastCancerResearchandTreatment35:115-132(1995))。EGFR由至少6种不同配体结合；表皮生长因子(EGF)、转化生长因子a(TGF-a)、双调蛋白、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、卩细胞素(betacellulin)和表皮调节素(Groenen等人GrowthFactors11:235-257(1994))。起因于单个基因的可变剪接的调蛋白(heregulin)蛋白质家族是关于ErbB3和ErbB4的配体。调蛋白家族包括a、卩和y调蛋白(Holmes等人，Science，256:1205-1210(1992);美国专利号5,641,869;和Schaefer等人Oncogene15:1385-1394(1997));neu分化因子(NDFs)、狡质生长因子(GGFs);乙酰胆石咸受体诱导活性(ARIA);以及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)。关于综述，参见Groenen等人GrowthFactors11:235-257(1994);Lemke,G.Molec.&Cell.Neurosci.7:247-262(1996)和Lee等人Pharm.Rev.47:51-85(1995)。近来鉴定了3种另外的ErbB配体；报道与ErbB3或ErbB4结合的神经调节蛋白-2(NRG-2)(Chang等人Nature387509-512(1997);和Carraway等人Nature387:512-516(1997));结合ErbB4的神经调节蛋白-3(Zhang等人PNAS(USA)94(18):9562-7(1997));和结合ErbB4的神经调节蛋白-4(Haran等人Oncogene18:2681-89(1999))HB-EGF、(3细胞素和表皮调节素也与ErbB4结合。虽然EGF和TGFa不结合ErbB2,但EGF刺激EGFR和ErbB2以形成异二聚体，这激活EGFR且导致异二聚体中的ErbB2的转磷酸作用。二聚化和/或转磷酸作用看起来激活ErbB2酪氨酸激酶。参见Earp等人，同上。同样，当ErbB3与ErbB2共表达时，形成活性信号传导复合物且针对ErbB2的抗体能够破坏这种复合物(Sliwkowski等人，丄Biol.Chem.，269(20):14661-14665(1994))。此外，当与ErbB2共表达时，ErbB3对于调蛋白(HRG)的亲和力增加至更高的亲和力状态。关于ErbB2-ErbB3蛋白质复合物，还参见Levi等人，JournalofNeuroscience15:1329-1340(1995);Morrissey等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:1431-1435(1995);和Lewis等人，CancerRes.,56:1457-1465(1996)。ErbB4如同ErbB3，与ErbB2形成活性信号传导复合物(Carraway和Cantley,Cell78:5-8(1994))。HER-2/neu原癌基因的产物HER2是酪氨酸激酶受体的人表皮生长因子受体(HER)家族的第二个成员，且已提议为配体孤儿受体。HER2和另一种HER家族成员HER1、HER3或HER4之间的配体依赖性异二聚化，激活HER2信号传导途径。HER2的细胞内信号传导途径被认为涉及ras-MAPK和PI3K途径，以及MAPK不依赖性S6激酶和磷脂酶C-y信号传导途径(Graus-Porta等人，MolCellBiol.1995March;15(3):1182—1191;Grant等人，FrontBiosci.2002Feb1;7:d376-89)。HER2信号传导还影响促血管生成(proangiogenic)因子，血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素-8(IL-8)以及抗血管生成因子，血小板反应蛋白-1(TSP-1)。内源性表达低水平的HER2的MCF-7和T-47D乳腺癌细胞中HER2的再表达导致VEGF和IL-8升高的表达以及TSP-1减少的表达。用人源化抗HER2抗体(司徒曼布或Herc印tin⑧)或针对HER2的逆转录病毒介导的小干扰RNA(siHER2)抑制HER2减少表达高水平的HER2的BT474乳腺癌细胞中的VEGF和IL-8表达，但增加TSP-1表达。HER2信号传导因此经由不同的信号传导途径来影响促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡。司徒曼布至少部分通过HER2-p38-TSP-l途径的活化和HER2-PI3K-AKT-VEGF/IL-8途径的抑制来抑制血管生成和肿瘤生长(Wen等人，Oncogene.2006May22;Epub)。此外，ErbB2膜RTK通过直接使Cdc2磷酸化可以赋予对于紫杉醇诱导的凋亡的抗性(Tan等人，MolCell.2002May;9(5):993-1004)。发明概述本发明的某些实施方案在下文描述。在一个实施方案中，本发明包含与ErbB2特异性结合的靶向结合剂，例如人单克隆抗体或其抗原结合部分。靶向结合剂可以具有至少一种下述性质(a)与人细胞结合；(b)与表达猕猴ErbB2的细胞结合；(c)与Herceptin⑧部分竟争但不与2C4竟争；(d)以小于50ng/ml的EC50抑制MCF7细胞中的ErbB2磷酸化；(e)以小于50ng/ml的EC50抑制SKBR3细胞中的细胞增殖；(f)以13.5nM或更小的KD与ErbB2结合；或(g)具有关于ErbB2的2.14x10-4s-l或更小的解离速率(koff)。在另一个实施方案中，靶向结合剂以13.5nM或更小的KD结合ErbB2且抑制ErbB的活化。在另一个实施方案中，所述耙向结合剂是抗体。在一个实施方案中，所述抗体是人源化的、嵌合的或人单克隆抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，本发明包含与人ErbB2特异性结合且抑制人ErbB2的把向结合剂，例如人源化的、嵌合的或人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述靶向结合剂具有选自下述的至少一种性质(a)与选自下述的抗体竟争与ErbB2的结合:1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、U8.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44,1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)与选自下述的抗体竟争与ErbB2的结合:1,44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(c)与选自下述的抗体结合相同的ErbB2表位1.44.1、1.140、1.43、114.1、1.100.1、1.%、1.18.1、1.20、1.39、.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(d)以与选自下述的抗体基本上相同的KD与ErbB2结合1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71,31.44.1、1.140、1.43、.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;和(e)以与选自下述的抗体基本上相同的解离速率与ErbB2结合1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18,1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在另一个实施方案中，所述靶向结合剂是抗体。在另一个实施方案中，所迷抗体是人源化的、嵌合的或人单克隆抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，本发明包含特异性结合ErbB2的靶向结合剂，例如单克隆抗体或其抗原结合部分，其中(a)靶向结合剂包含选自下述的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)靶向结合剂包含选自下述的抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.%、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、].140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;和(c)靶向结合剂包含(a)的重链和(b)的轻链；或(c)的靶向结合剂，其中重链和轻链CDR氨基酸序列选自相同抗体。在另一个实施方案中，所述靶向结合剂是抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是人源化的、嵌合的或人单克隆抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分进一步包括SEQIDNO:46中所示的重链氨基酸序列、SEQIDNO:47中所示的轻链氨基酸序列或两者。在另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分可以来自任何同种型。在另一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分包括利用人VH3-21基因、人VH3-7基因、人VH4-31基因或人VH3-13基因的重链。在另一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分包括利用人VH3-21基因、人VH3-7基因、人VH4-31基因或人VH3-13基因的重链。在另一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分包括利用人VKB3基因、人VKL1基因、人VKA2基因或人VKAl基因的轻链。在另一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分包括进一步包含利用人VKB3基因、人VKL1基因、人VKA2基因或人VKAl基因的轻链的抗体或部分。在另一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分的VL结构域、VH结构域或两者在氨基酸序列中与下述的单克隆抗体的VL结构域、VH结构域或两者分别至少90%等同1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.441、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在另一个实施方案中，本发明包括特异性结合ErbB2的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含选自下述的抗体的FR1、FR2、FR3或FR4氨基酸序列中的一个或多个1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、l.訓.l、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在另一个实施方案中，本发明包括人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括(a)与下述的单克隆抗体的重链氨基酸序列至少90%等同的重链氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)与下述的单克隆抗体的轻链氨基酸序列至少90%等同的轻链氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;或(a)和(b)两者。在另一个实施方案中，本发明包括本文描述的人单克隆抗体或抗原结合部分，其中所述抗原结合部分选自Fab、Fab，、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv或scFv2)、嵌合抗体、双抗体、双特异性抗体和这样的多肽，其包含足以赋予与多肽特异性抗原结合的抗体的至少部分。在另外一个实施方案中，本发明包括包含本文描述的靶向结合剂，例如抗体或抗原结合部分和药学上可接受的载体的组合物。组合物可以进一步包含另外的治疗或诊断剂。在一个实施方案中，组合物进一步包括特异性结合ErbB2的第二种抗体，其中所述第二种抗体不与选自下述的抗体竟争与ErbB2的结合1.14.1、1.18.1、1.20.1、1.24.3、1.39.1、1.71.3、1.96.2、1.100.1和1.140.1。在另外一个实施方案中，本发明包括生产本文描述的靶向结合剂、抗体或抗原结合部分或者所述抗体或所述部分的重链或轻链的分离的细胞系。在另外一个实施方案中，本发明包括包含核苦酸序列的分离的核酸分子，所述核苷酸序列编码重链或其抗原结合部分、轻链或其抗原结合部分或两者。分离的核酸可以包括选自下述的核苷酸序列(a)SEQIDNO:1的核苦酸序列；(b)编码SEQIDNO:2的核苦酸序列；(c)SEQIDNO:3的核苷酸序列；(d)编码SEQIDNO:4的核苷酸序列；(e)SEQIDNO:5的核苦酸序列；(f)编码SEQIDNO:6的核苷酸序列；(g)SEQIDNO:7的核苷酸序列；(h)编码SEQIDNO:8的核苷酸序列；(i)SEQIDNO:9的核普酸序列；(j)编码SEQIDNO:IO的核苷酸序列；(k)SEQIDNO:ll的核苷酸序列；(1)编码SEQIDNO:12的核苷酸序列；(m)SEQIDNO:13的核普酸序列；(n)编码SEQIDNO:14的核苦酸序列；(o)SEQIDNO:15的核苷酸序列；(p)编码SEQIDNO:16的核苷酸序列；(q)SEQIDNO:17的核苷酸序列；(r)编码SEQIDNO:18的核香酸序列；(s)SEQIDNO:19的核苷酸序列；(t)编码SEQIDNO:20的核香酸序列；(u)SEQIDNO:21的核苦酸序列；(v)编码SEQIDNO:22的核苷酸序列；(w)SEQIDNO:23的核苦酸序列；(x)编码SEQIDNO:24的核苦酸序列；(y)SEQIDNO:25的核苷酸序列；(z)编码SEQIDNO:26的核苷酸序列；(aa)SEQIDNO:27的核苷酸序列；(bb)编码SEQIDNO:28的核普酸序列；(cc)SEQIDNO:29的核普酸序列；(dd)编码SEQIDNO:30的核苷酸序列；(ee)SEQIDNO:31的核苷酸序列；(ff)编码SEQIDNO:32的核苷酸序列；(gg)SEQIDNO:33的核普酸序列；(hh)编码SEQIDNO:34的核普酸序列；(ii)SEQIDNO:35的核苦酸序列；(jj)编码SEQIDNO:36的核苷酸序列；(kk)SEQIDNO:37的核苦酸序列；(11)编码SEQIDNO:38的核香酸序列；(mm)SEQIDNO:39的核苷酸序列；(nn)编码SEQIDNO:40的核苷酸序列；(00)SEQIDNO:41的核苦酸序列；(pp)编码SEQIDNO:42的核普酸序列;(qq)SEQIDNO:43的核普酸序列;和(rr)编码SEQIDNO:44的核苷酸序列。本发明进一步包括包含本文描述的核酸分子的载体，其中所述载体任选包含与核酸分子可操作地连接的表达控制序列。在另一个实施方案中，本发明包括包含本文描述的载体或核酸分子的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明包括用于生产本文描述的靶向结合剂、单克隆抗体或抗原结合部分的方法，其包括在合适的条件下培养本文描述的宿主细胞或细胞系和回收所述抗体或抗原结合部分的步骤。本发明进一步包括包含本文描述的核酸的非人转基因动物或转基因植物，其中所述非人转基因动物或转基因植物表达所述核酸。本发明还包括用于分离与人ErbB2特异性结合的抗体或其抗原结合部分的方法。该方法包括从非人转基因动物或转基因植物中分离抗体的步骤。在另一个实施方案中，本发明包括用于制备与ErbB2特异性结合的人单克隆抗体的方法，其包括下述步骤(1)用ErbB2、ErbB2的免疫原性部分或者表达ErbB2的细胞或组织免疫能够生产人抗体的非人转基因动物；(ii)允许转基因动物发动(mount)针对ErbB2的免疫应答；和(iii)回收抗体。在另一个实施方案中，本发明包括用于治疗、预防或减轻有此需要的受试者中ErbB2介导的病症的症状的方法，其包括给所述受试者施用本文描述的靶向结合剂、抗体或抗原结合部分或组合物的步骤，其中所述靶向结合剂、抗体或抗原结合部分抑制ErbB2。在另外一个方面，本发明包括用与ErbB2特异性结合的靶向结合剂，例如抗体或其抗原结合部分用于治疗、预防或减轻有此需要的受试者中ErbB2介导的病症例如癌症的症状的方法，其包4舌下述步骤(i)施用有效量的编码重链或其抗原结合部分的分离的核酸分子，编码靶向结合剂例如轻链或其抗原结合部分的分离的核酸分子，或编码抗体的轻链和重链或其抗原结合部分的核酸分子两者；和(b)表达核酸分子。ErbB2介导的病症可以选自乳腺、膀胱、肺、头、颈、前列腺、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、曱状腺、胰癌和成胶质细胞瘤。在另一个实施方案中，本发明包括抑制有此需要的受试者中表达ErbB2的癌细胞增殖的方法，所述方法包括给所述受试者施用本文描述的耙向结合剂，例如抗体或抗原结合部分或组合物的步骤，其中所述靶向结合剂抑制ErbB2。在另一个实施方案中，所述结合靶向剂是抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是人源化的、嵌合的或人单克隆抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，本发明包括用于抑制表达ErbB2的例如受试者的细胞或癌细胞中的ErbB2活性的方法，其包括使细胞与本文描述的把向结合剂或组合物接触，其中细胞中的ErbB2活性选自(a)ErbB2的磷酸化；(b)MAPK途径的活化；(c)PI3K途径的活化；(d)CDC2的抑制；和(e)其组合。在一个实施方案中，ErbB2的磷酸化(phophorylation)#皮抑制48小时。在另一个实施方案中，所述靶向结合剂是抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是人源化的、嵌合的或人单克隆抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，本发明包括用于调节表达ErbB2的细^^中的ErbB2活性的方法，其包括使细胞与本文描述的抗体或抗原结合部分或组合物接触，其中细胞中的ErbB2活性是p38-TSP-l途径的活化。在一个实施方案中，抗原结合部位可以包含在所7>开的CDRs内具有多至20、16、10、9或更少，例如1、2、3、4或5个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入的抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的任何一个的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。此种修饰可以在CDRs内的任何残基处潜在地进行制备。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包括包含如表4、4(a)和/或表5中所示的CDR1、CDR2或CDR3序列的任何1、2、3、4、5或6个的序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包括包含如表4和/或4(a)中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包括包含如表5中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包括包含如表4或3(a)中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列以及如表5中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。注意到本领域普通技术人员可以容易地实现CDR测定。参见例如，Kabat等人，iSe《we/7c'es。/尸n9"/"5o/7wwwo/og7ca//"&r^st,第5片反,NIHPublication91-3242，BethesdaMD(1991),第l陽3巻，或如本文定义的。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包括包含如表4、4(a)或表5中所示的，全人单克隆抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的任何一个的CDR1、CDR2和CDR3序列的任何1、2、3、4、5或6个的序列。在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包括包含如表4和4(a)中所示的，全人单克隆抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一个实施方案中，耙向结合剂或抗体可以包括包含如表5中所示的，全人单克隆抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可以包括包含如表4和4(a)中所示的全人单克隆抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及如表5中所示的全人单克隆抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1,71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、UOO.l、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。附图简述图1是描述在1小时(Y轴)和24小时(X轴)预温育后，在MCF7细胞中152杂交瘤上清液对调蛋白诱导的ErbB2磷酸化的作用的相关性的图。图2是LA/HAELISA分析的数据图。Y轴指出当31ng/mlhErbB2(ECD)/cMyc-His包被在ELISA板上时，OD值中的结合信号。X轴指出当10pg/mlErbB2(ECD)/cMyc-His包被在ELISA板上时，衍生自HAELISA的杂交瘤上清液中ErbB2特异性抗体的浓度。图3A-3C显示在MCF7细胞中调蛋白诱导的ErbB2磷酸化中关于本发明的10种抗ErbB2单克隆抗体(B和C)和对照抗体(A)的剂量应答曲线。图4A-4C显示在MCF7细胞的调蛋白诱导的增殖中关于本发明的10种抗ErbB2单克隆抗体(B和C)和对照抗体(A)的剂量应答曲线。图5A和5B显示在BT474细胞增殖测定中关于本发明的8种抗ErbB2单克隆抗体(B)和对照抗体(A)的剂量应答曲线。图6A和6B显示在SKBR3细胞增殖测定中关于本发明的8种抗ErbB2单克隆抗体(B)和对照抗体(A)的剂量应答曲线。图7A-7C显示在使细胞与mAbs温育24、48、72或96小时后，总ErbB2磷酸化对mAb1.18.1(A)、Herceptin(B)和2C4(C)的剂量依赖性应答。图8A-8C显示在使细胞与mAbs温育24、48、72或96小时后，标准化ErbB2磷酸化对mAb1.18.1(A)、Herceptin(B)和2C4(C)的剂量依赖性应答。图9A和9B显示指出在ELISA中本发明的测试抗体不与2C4(B)或Herceptin(A)竟争ErbB2结合的竟争装箱(binning)的结果。发明详述定乂和一袭戎术除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般地，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本发明众所周知的以及如本说明书自始至终引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的常规方法来进行。参见例如，引入本文作为参考的Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和A腿bel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992)和Harlow和LaneAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常完成或如本文描述的来进行。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的术语以及其实验室程序和技术是本领域众所周知且通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及受试者的治疗。每种抗体都已给予包括由1个或2个小数点分开的2个或3个数字的识别号码。在一些情况下，制备一种抗体的几个克隆。许多克隆具有不同的识别号码，尽管它们具有与亲本序列相同的核酸和氨基酸序列，它们也可以分开列举。因此，例如关于下迷的核酸和氨基酸序列是相同的1.44.1=1.44.2=1.44.3=1.44;1.124=1.148=1.140=1.140.1;1.41=1.43=143.1=143.2=1.22.1;1.14.1=1.4.2=.4.3=1.14;1.100.1=1.100.2=1.100.3-1.100;1.107=1.104=].128—.96-1.99=1.96.2;1.18.1=1.18.2=1.18.3=1.18;1.20=1.19=1.20.1;1.39=1.39.1=1.39.2=1.39.3;1.24=1.22.2=1,71.1=1.24.3;1.71.2=1.71.3。除非另有说明，下述术语应理解为具有下述含义术语"多肽"包含天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。术语"分离的蛋白质"、"分离的多肽"或"分离的抗体"是这样的蛋白质、多肽或抗体，其由于其起源或衍生来源(1)不与在其天然状态中伴随其的天然结合组分结合，(2)不含来自相同物种的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，与其天然4合的组分";离;的"。蛋白质k可以通过使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术分离而使得基本上不含天然结合的组分。分离的抗体的例子包括已使用ErbB2亲和纯化的抗ErbB2抗体、已通过杂交瘤或其他细胞系体外合成的抗ErbB2抗体、和衍生自转基因小鼠的人抗ErbB2抗体。靶向结合剂还可以使用本文描述的类似技术进行纯化。如本文所使用的，术语"多肽片段"指具有氨基末端和/或羧基末端缺失，但其中剩余氨基酸序列等同于天然存在的序列中的相应位置的多肽。在一些实施方案中，片段长至少5、6、8或10个氨基酸。在其他实施方案中，片,殳长至少14,至少20，至少50,或至少70、80、90、100、150或200个氨基酸。如本文所使用的，术语"调节"指途径的任何量的抑制或活化。在某些实施方案中，关于抗ErbB2抗体或其抗原结合部分的氨基酸置换是这样的，其(1)减少对于蛋白酶解的易感性，(2)减少对于氧化的易感性，(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力，和(4)赋予或修饰此种类似物的其他物理化学或功能性质，但仍保留与ErbB2变蛋白质。例如，单个;多个氨基酸置换，优选地保守氨基酸置换可以在天然存在的序列，优选在形成分子间接触的一个或多个结构域外的多肽部分中进行。保守氨基酸置换不应相当大地改变亲本序列的结构特征；例如，替代氨基酸不应改变构成亲本序列中存在的免疫球蛋白结合结构域的反平行p折叠、或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构。一般而言，甘氨酸和脯氨酸将不在反平行p折叠中使用。领域公认的多肽二级和三级结构的例子在引入本文作为参考的Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton,编辑,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C.Branden和J.Tooze，编辑，GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));和Thornton等人，Nature354:105(1991)中得到描述。非肽类似物在制药工业中通常作为具有与模板肽的那些类似的性质的药物使用。这些类型的非肽化合物称为"肽才莫拟物(peptidemimetics)"或"拟肽(peptidomimetics)"。Fauchere，J.Adv.DrugRes.15:29(1986);Veber和Freidinger,TINS第392页(1985);和Evans等人，J.Med.Chem.30:1229(1987),引入本文作为参考。此种化合物通常借助于计算机化的分子建模来开发。在结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可以用于产生等价治疗或预防作用。一般地，拟肽在结构上类似于范例多肽(即，具有所需生物化学性质或药理学活性的多肽)，例如人抗体，但具有通过本领域众所周知的方法任选由选自下述的键替代的一个或多个肽键—CH2NH.....CH2S.....CH2-CH2.....CH=CH—(顺式和反式)、—COCH2.....CH(〇H)CH2—和一CH2SO—。用相同类型的D-氨基酸系统置换共有序列的一个或多个氨基酸(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸)还可以用于产生更稳定的肽。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变异的限制肽可以通过本领域已知的方法来产生(Rizo和G跳sch,Ann.Rev.Biochem.61:387(1992),引入本文作为参考)；例如，通过添加能够形成使肽环化的分子内二石克4定的内部半胱氨酸残基。当就本发明而言在本文中提及"抗体"时，通常认为还可以使用其抗原结合部分。抗原结合部分与完整抗体竟争特异性结合。一般参见，FundamentalImmunology,第7章(Paul，W.，编辑，第2版RavenPress,N.Y.(1989))(为了所有目的整体引入作为参考)。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。在一些实施方案中，抗原结合部分包括Fab、Fab，、F(ab，)2、Fd、Fv、dAb、和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv或scFv2)、嵌合抗体、双抗体、双特异性抗体和这样的多肽，其包含足以赋予与多肽特异性抗原结合的抗体的至少部分。从N末端到C末端，成熟的轻和重链可变结构域都包含区域FRl、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。关于本文每个结构域的氨基酸的指定依月氛Kabat,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987和1991)),Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia等人，Nature342:878-883(1989)的定义。如本文所使用的，由数字提及的抗体与得自相同数字的杂交瘤的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体1.18是与得自杂交瘤1*18,或其亚克隆的那种相同的抗体。亚克隆由进一步的小数鉴定，例如1.18.1。如本文所使用的，Fd片段意指由VH和CHI组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；并且dAb片段(Ward等人，Nature341'.544-546(1989))由VH结构域组成。在一些实施方案中，抗体是其中VL和VH结构域经由合成接头配对以形成单价分子的单链抗体(scFv),所述合成接头使得其能够作为单条蛋白质链制备。(Bird等人，Science242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988).)在一些实施方案中，抗体是双抗体，即这样的二价抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短以致于不允许相同链上的2个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位。(参见例如，HolligerP.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯6444-6448(1993)和PoljakR.J.等人，Structure2:1121-1123(1994)。)在一些实施方案中，来自本发明的抗体的一个或多个CDRs可以共价或非共价掺入分子内，以使得它成为与ErbB2特异性结合的免疫粘附素。在此种实施方案中，一个或多个CDR可以作为较大的多肽链的部分掺入，可以与另一条多肽链共价连接，或可以非共价掺入。在具有一个或多个结合部位的实施方案中，结合部位可以彼此相同或可以是不同的。如本文所使用的，术语"人抗体"意指其中可变和恒定结构域序列是人序列的任何抗体。该术语包含具有衍生自人基因的序列的抗体，但其已改变例如以减少可能的免疫原性、增加亲和力、消除可能引起不希望的折叠的半胱氨酸等。该术语包含在非人细胞中重组生产的此种抗体，其可能赋予非人细胞特有的糖基化。如下文描述的，这些抗体可以以多种方式进行制备。如本文所使用的，术语"嵌合抗体"意指包含来自2种或更多不同抗体的区域的抗体。在一个实施方案中，嵌合抗体的一个或多个CDRs衍生自人抗ErbB2抗体。在另一个实施方案中，所有CDRs衍生自人抗ErbB2抗体。在另一个实施方案中，来自超过一种人抗ErbB2抗体的CDRs在嵌合抗体中进行组合。例如，嵌合抗体可以包含来自第一种人抗ErbB2抗体的轻链的CDR1、来自第二种人抗ErbB2抗体的轻链的CDR2和来自第三种人抗ErbB2抗体的轻链的CDR3,并且来自重链的CDRs可以衍生自一种或多种其他抗ErbB2抗体。此外，构架区可以衍生自从其中获取一个或多个CDRs的抗ErbB2抗体之一或者衍生自一种或多种不同的人抗体。在一些实施方案中，本发明的嵌合抗体是人源化的抗ErbB2抗体。本发明的人源化的抗ErbB2抗体包含一个或多个构架区的氨基酸序列和/或来自本发明的一种或多种人抗ErbB2抗体的恒定区的至少部分的氨基酸序列和衍生自非人抗ErbB2抗体的CDRs。如本文所使用的，"抑制抗体"(在本文中也称为"拮抗抗体")意指当加入表达ErbB2的细胞、组织或生物中时，使一种或多种ErbB2活性抑制至少约30%的抗体。在一些实施方案中，抗体使ErbB2活性抑制至少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或超过100%。在一些实施方案中，抑制抗体在配体例如调蛋白的存在下加入。在一些实施方案中，本发明的拮抗抗体使ErbB2的至少一种活性减少5倍。抗体的"结合片段"通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab，)2、Fv、dAb和单链抗体。除"双特异性"或"双功能"抗体外的抗体被理解为其结合部位的每一个相同。当过量抗体使与反受体结合的受体量减少至少约20%、40%、60%或80%,并且更通常超过约85%时(如在体外竟争结合测定中测量的)，抗体相当大地抑制受体与反受体的粘附。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以由本领域普通技术人员根据本说明书的教导容易地制备。片段或类似物优选的氨基和羧基末端存在于功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可以通过核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开的或私有的序列数据库比较进行鉴定。优选地，计算机化的比较法用于鉴定存在于已知结构和/或功能的其他蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。参见Bowie等人，Science253.'164(1991)。已显示整个抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的例子是(Ward,E.S.等人，(1989)Nature341,544-546)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(McCafferty等人(1990)Nature,348，552-554)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(Holt等人(2003)TrendsinBiotechnology21,484-490)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH或VL结构域组成的dAb片段(Ward,E.S.等人，Nature341,544-546(1989)，McCafferty等人(1990)Nature,348,552-554,Holt等人(2003)TrendsinBiotechnology21,484-490];(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段——包含2个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv),其中VH结构域和VL结构域由允许2个结构域结合以形成抗原结合部位的肽接头连接(Bird等人,(1988)Science,242，423-426,,Huston等人，(1988)PNASUSA,85，5879-5883);(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)通过基因融合构建的"双抗体"，多价或多特异性片段(WO94/13804;Holliger，P.(1993)等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键得到稳定(Reiter,Y.等人,NatureBiotech,14，1239-1245,1996)。还可以制备包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(minibodies)(Hu,S.等人，(1996)CancerRes.,56,3055-3061)。结合片段的其他例子是Fab，，其通过在重链CHI结构域的羧基末端处添加少数残基而不同于Fab片段，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，和Fab，-SH,这是其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab，片段。如本文所使用的，"抑制性靶向结合剂"意指当加入表达ErbB2的细胞、组织或生物中时，使一种或多种ErbB2活性抑制至少约30。/。的靶向结合剂。在一些实施方案中，靶向结合剂使ErbB2活性抑制至少约40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或超过100%。在一些实施方案中，抑制性靶向结合剂在配体例如调蛋白的存在下加入。在一些实施方案中，本发明的靶向结合剂使ErbB2的至少一种活性减少5倍。如本文所使用的，术语"表面等离振子共振"指通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度中的改变而允许分析实时双特异性相互作用的光学现象，例如使用BIACORETM系统(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N.J.)。关于进一步的描述,参见JonssonU.等人，Ann.Biol.Clin.51:19-26(1993);JonssonU.等人，Biotechmques11:620-627(1991);Jo賜onB.等人，J.Mol.Recognit.8:125-131(1995);和JohnssonB.等人,Anal.Biochem.198:268-277(1991)。术语"KD"指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。术语"表位"包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或者以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇一般由分子的化学活性表面原子团(groupings)例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成，且一般具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可以是"线性的"或"构象的"。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质上的氨基酸残基发生。当解离常数^lmM、优选Sl00nM且最优选^10nM时，抗体^皮说成特异性结合抗原。在某些实施方案中，KD是lpM-500pM。在其他实施方案中，KD是500pM-lnM。在其他实施方案中，KD是1pM-lOOnM在其他实施方案中，KD是100mM-10nM。一旦测定抗原上的所需表位，就可能产生针对那个表位的抗体，例如使用本发明中描述的技术。可替代地，在开发过程期间，抗体的产生和表征可以阐明关于所需表位的信息。根据这个信息，随后可能竟争性筛选与相同表位结合的抗体。实现这点的方法是进行交叉竟争研究以发现彼此竟争结合的抗体，例如竟争与抗原的结合的抗体。用于基于其交叉竟争"装箱"抗体的高通量方法在国际专利申请号WO03/48731中得到描述。如本文所使用的，20种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见引入本文作为参考的Immunology-ASynthesis(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren,编辑，SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))。如本文提及的，术语"多核苷酸"意指长度至少10个碱基的聚合形式的核苦酸，其为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或经修饰形式的任一类型的核苷酸。该术语包括单链和双链形式。如本文所使用的，术语"分离的多核苦酸"意指基因组、cDNA或合成起源或其一些组合的多核苷酸，其由于其起源"分离的多核苷酸"(1)不与"分离的多核苷酸"在自然界中与之一起发现的多核苷酸的全部或部分结合，(2)与其在自然界中不与之连接的多核苷酸可操作地连接，或(3)在自然界中不作为较大序列的部分存在。如本文所使用的，术语"天然存在的核苷酸"包括脱氧核糖核普酸和核糖核苷酸。如本文所使用的，术语"经修饰的核苷酸"包括具有经修饰的或取代的糖基等的核苷酸。本文提及的术语"寡核普酸键"包括这样的寡核苷酸键，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二竭代磷酸酉旨(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基碌酸酉旨(phosphoroamidate)等。参见例如，LaPlanche等人,Nucl.AcidsRes.14:9081(1986);Stec等人，J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984);Stem等人，Nucl.AcidsRes.16:3209(1988);Zon等人，Anti-CancerDrugDesign6:539(1991);Zon等人，OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,第87-108页(F.Eckstein,编辑，OxfordUniversityPress,OxfordEngland(1991));美国专利号5,151,510;Uhlmann和Peyman,ChemicalReviews90:543(1990),其的公开内容在此引入作为参考。若需要，寡核苷酸可以包括用于检测的标记。"可操作地连接的"序列包括与目的基因邻接的表达控制序列和反式或隔开一段距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。如本文所使用的，术语"表达控制序列"意指实现它们与之连接的编码序列的表达和加工所必需的多核普酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及需要时，增强蛋白质分泌的序列。此种控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般地，此种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语"控制序列，，意欲最低限度包括其存在是表达和加工所必需的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。如本文所使用的，术语"载体"意指能够转运它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体是质粒，即另外的DNA区段可以连接到其中的DNA的环状双链部分。在一些实施方案中，载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。在一些实施方案中，载体能够在它们引入其内的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在其他实施方案中，载体(例如非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞的基因组内，并且因此连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因的表达。此种载体在本文中称为"重组表达载体"(或简单地"表达载体")。如本文所使用的，术语"重组宿主细胞"(或简单地"宿主细胞")意指重组表达载体已引入其内的细胞。应当理解"重组宿主细胞"和"宿主细胞"不仅意指特定受试细胞，还意指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响某些修饰可能在随后的世代中发生，所以此种后代事实上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文所使用的术语"宿主细胞"的范围内。本文提及的术语"选择性杂交"意指可检测地且特异性地结合。依照本发明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在这样的杂交和洗涤条件下与核酸链选择性杂交，所述杂交和洗涤条件使与非特异性核酸的可检测结合的可估计量降到最低。如本领域已知的和本文讨论的，"高严格性"或"高度严格，，条件可以用于达到选择性杂交条件。"高严格性"或"高度严格"条件的一个例子是多核苷酸与另一种多核苷酸的温育，其中一种多核苷酸可以与固体表面例如膜附着，在6XSSPE或SSC、50%曱酰胺、5XDenhardt，s试剂、0.5%SDS、100吗/ml变性的、断裂的鲑精DNA的杂交緩沖液中在42。C的杂交温度下12-16小时，随后为于55。C使用IXSSC、0.5%SDS的洗涤緩冲液洗涤2次。还参见Sambrook等人，同上，第9.50-9.55页。术语"CDR区"或"CDR"意指免疫球蛋白的重和轻链的高变区，如由Kabat等人1991(Kabat,E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.USDepartmentofHealthandHumanServices,PublicService,NIH，Washington)和随后版本定义的或如本文定义的。抗体一般包含3个重链CDRs和3个轻链CDRs。根据情况，术语CDR或CDRs在本文中用于指这些区域之一，或这些区域中的几个或甚至全部，其包含通过抗体对于它识别的抗原或表位的亲和力负责结合的大多数氨基酸残基。在6个短CDR序列中，重链的第3个CDR(HCDR3)具有更大的尺寸变异性(基本上由于产生其的基因的排列机制更大的多样性)。它可以短至2个氨基酸，尽管已知的最大尺寸是26。CDR长度还可以根据可以由特定潜在构架容纳的长度而变。在功能上，HCDR3在抗体的特异性的决定中部分起作用(Segal等人，PNAS,71:4298-4302,1974,Amit等人,Science,233:747-753,1986，Chothm等人,J.Mol.Biol.，1%:901-917，1987,Chothm等人，Nature,342:877-883，1989,Caton等人，J.Immunol.,144:1965-1968,1990，Sharon等人，PNAS，87:4814-4817,1990，Sharon等人，J.Immunol.,144:4863-4869，1990，Kabat等人，丄Immunol.,147:1709-1719，1991)。在本文中提及的术语"CDRs组"包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDRs组指HCDR1、HCDR2和HCDR3,并且LCDRs组指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有说明，"CDRs组"包括HCDRs和LCDRs。在核苷酸序列的背景中的术语"百分比序列同一性"意指当就最大对应比对时2个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以在至少约9个核苷酸的序列段(stretch)上，通常至少约18个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，一般至少约28个核苦酸，更一般至少约32个核苦酸，且优选至少约36、48或更多核苷酸。存在可以用于测量核苦酸序列同一性的本领域已知的许多不同算法。例如，多核苷酸序列可以使用FASTA、Gap或Bestfit进行比4交，其是WisconsinPackageVersion10.0，GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wisconsin中的程序。包括例如程序FASTA2和FASTA3的FASTA提供查询和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990);Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000);Pearson,MethodsEnzymol.266:227-258(1996);Pearson,J.Mol.Biol.276:71-84(1998);引入本文作为参考)。除非另有说明，使用关于特定程序或算法的缺省参数。例如，核苷酸序列之间的百分比序列同一性可以使用FASTA与其缺省参数(字长6和NOPAM因子用于评分矩阵)或使用Gap与其缺省参数进行测定，如引入本文作为参考的GCGVersion6.1中提供的。除非另有说明，提及核苷酸序列包含其互补物。因此，提及具有特定序列的核酸应理解为包含其互补链，与其互补序列。如本文所使用的，术语"百分比序列同一性"和"百分比序列同源性"可互换使用。当提及核酸或其片段时，术语"相当大相似性"或"相当大序列相似性"意指当以合适的核苦酸插入或缺失与另一种核酸(或其互补链)最佳比对时，存在至少约85%，优选至少约90%,和更优选至少约95%、96%、97%、98%或99%核普酸碱基的核苷酸序列同一性，如通过序列同一性的任何众所周知的算法测量的，例如FASTA、BLAST或Gap,如上文讨i仑的。当应用于多肽时，术语"相当大同一性"意指当例如通过程序GAP或BESTFIT使用如由程序提供的缺省缺口权重最佳比对时，2个肽序列共享至少70%、75%或80%序列同一性，优选至少90%或95%序列同一性，且更优选至少97%、98%或99%序列同一性。在某些实施方案中，不同的残基位置由于保守氨基酸置换而不同。"保守氨基酸置换"是其中氨基酸残基由具有带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的另一个氨基酸残基置换的那种。一般而言，保守氨基酸置换将基本上不改变蛋白质的功能性质。在其中2个或更多氨基酸序列由于保守置换而彼此不同的情况下，百分比序列同一性可以向上调整以校正置换的保守性质。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员众所周知的。参见，例如Pearson,MethodsMol.Biol.243:307-31(1994)。具有带有类似化学性质的侧链的氨基酸基团的例子包括1)脂族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族-羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸；和7)含石克侧链半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸置换基团是缀氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守置换是在引入本文作为参考的Gonnet等人，Science256:1443-45(1992)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有阳性值的任何改变。"适度保守"置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变。关于多肽的序列同一性一般使用序列分析软件进行测量。蛋白质分析软件使用对于各种置换、缺失和其他修饰包括保守氨基酸置换指定的相似性测量来匹配序列。例如，GCG包含程序例如"Gap"和"Bestfit",其可以与如由程序指定的缺省参数一起使用，以测定紧密相关多肽例如来自不同生物物种的同源多肽之间或野生型蛋白质及其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCGVersion6.1(UniversityofWisconsin,WI)。多肽序列还可以使用FASTA使用缺省或推荐参数进行比较，参见GCGVersion6.1。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990);Pearson,MethodsMol.Biol.132:185-219(2000))。当比较本发明的序列与包含来自不同生物的大量序列的数据库时，另一种优选算法是计算机程序BLAST,特别是blastp或tblastn,其使用如由程序提供的缺省参数。参见，例如Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990);Altschul等人，NucldcAcidsRes.25:3389-402(1997)。就同源性进行比较的多肽序列的长度一般将是至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，一般至少约28个残基，且优选超过约35个残基。当搜索包含来自大量不同生物的序列的数据库时，优选比较氨基酸序列。如本文讨论的，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中的较少变异预期由本发明包含，前提是氨基酸序列中的变异维持与本文描述的抗体或免疫球蛋白分子至少75%，更优选至少80%、90%、95%,且最优选99%的序列同一性。特别地，预期保守氨基酸置换。保守置换是在具有相关侧链的氨基酸家族内发生的那些。遗传编码的氨基酸一般分成下述家族(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是丝氨酸和苏氨酸是脂族-轻基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂族家族；并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族家族。例如，预期亮氨酸由异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸由谷氨酸、苏氨酸由丝氨酸独立的置换，或氨基酸由结构上相关的氨基酸的相似置换对所得到的分子的结合功能或性质将没有较大的作用是合理的，特别是若置换不涉及构架位点内的氨基酸的话。氨基酸改变是否导致功能肽可以通过测定多肽衍生物的比活性容易地进行测定。测定在本文中详细描述。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以由本领域普通技术人员容易地制备。片段或类似物优选的氨基和羧基末端存在于功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可以通过核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开的或私有的序列数据库比较进行鉴定。优选地，计算机化的比较法用于鉴定存在于已知结构和/或功能的其他蛋白质中的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人，Science253:164(1991)。因此，前述例子证实本领域技术人员可以识别可以用于限定与本文描述的抗体一致的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。抗原结合部位一般由可变重(VH)和可变轻(VL)免疫球蛋白结构域形成，具有由6个表面多肽环形成的抗原结合界面，称为互补性决定区(CDRs)。在每个VH(HCDR1,HCDR2,HCDR3)和每个VLLCDR1,LCDR2，LCDR3)中存在3个CDRs,连同构架区(FRs)。一般地，VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合部位，尽管VH或VL结构域单独可以用于结合抗原。VH结构域(参见表4)可以与VL结构域(参见表5)配对，从而使得形成包含VH和VL结构域两者的抗体抗原结合部位。提供了关于本文公开的其他VH和VL结构域的类似实施方案。在其他实施方案中，表4中的VH链与表5中的异源VL结构域配对。轻链混乱是本领域非常确定的。此外，本发明提供了关于本文公开的其他VH和VL结构域的类似实施方案。因此，亲本或表4上的任何抗体链的VH可以与亲本或表5上的任何抗体或者其他抗体的VL配对。抗原结合部位可以包含在所公开的H和/或LCDRs组内具有多至20、16、10、9或更少，例如l、2、3、4或5个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入的亲本抗体或表1中的任何抗体的H和/或LCDRs组。可替代地，抗原结合部位可以包含在所公开的H和/或LCDRs组内具有多至20、16、10、9或更少，例如l、2、3、4或5个氨基酸置换的亲本抗体或表1中的任何抗体的H和/或LCDRs组。此种修饰可以在CDRs组内的任何残基处潜在地进行制备。优选的氨基酸置换是这样的，其(1)减少对于蛋白酶解的易感性，(2)减少对于氧化的易感性，(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或修饰此种类似物的其他物理化学或功能性质。类似物可以包括除天然存在的肽序列外的序列的各种突变蛋白质。例如，单个或多个氨基酸置换(优选地保守氨基酸置换)可以在天然存在的序列(优选在形成分子间接触的一个或多个结构域外的多肽部分中进行。保守氨基酸置换不应相当大地改变亲本序列的结构特征(例如，替代氨基酸不应倾向于断裂亲本序列中存在的螺旋、或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。领域公认的多肽二级和三级结构的例子在引入本文作为参考的Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton,编辑,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C.Branden牙口J.Tooze，编辑，GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));和Thornton等人，Nature354:105(1991)中得到描述。本发明的进一步方面是包含VH结构域的抗体分子，所述VH结构域与表1中列出的任何抗体、附加序列表、本文描述的抗体的VH结构域或者与表4或表4(a)中所示的HCDR(例如HCDR1、HCDR2或HCDR3)具有至少约60、70、80、85、90、95、98或约99%氨基酸序列同一性。抗体分子可以任选还包含与表1中列出的任何抗体、附加序列表、本文描述的抗体的VL结构域或者与表5中所示的LCDR(例如LCDR1、LCDR2或LCDR3)具有至少约60、70、80、85、90、95、98或约99%氨基酸序列同一性的VL结构域。可以用于计算2个氨基酸序列的％同一性的算法包含例如BLAST(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:405-410),FASTA(Pearson和Lipman(1988)PNASUSA85:2444-2448),或Smith-Waterman算法(Smith和Waterman(1981)J.MolBiol.147:195-197),例如使用缺省参数。此外，本发明的VH和VL结构域以及CDRs的变体，包括关于其在本文中列出氨基酸序列且可以在关于ErbB2的耙向结合剂和抗体中使用的那些，可以借助于序列改变或突变的方法且筛选具有所需特征的抗原靶向来获得。所需特征的例子包括但不限于相对于对于抗原特异的已知抗体增加的关于抗原的结合亲和力；相对于对于抗原特异的已知抗体增加的抗原活性中和，如果活性已知的话；以特定摩尔比与已知抗体或配体对抗原特定的竟争能力；免疫沉淀复合物的能力；与特定表位结合的能力；线性表位，例如使用如本文描述的肽结合扫描鉴定的肽序列，例如使用以线性和/或限定构象筛选的肽；由不连续残基形成的构象表位；调节ErbB2或下游分子的新生物活性的能力。此种方法也在本文中提供。，、二乂、。、、，、、f,'量数据分析技术应用于结构/性质-活性关系中的计算化学的引导下(Wold,等人Multivariatedataanalysisinchemistry.Chemometrics—MathematicsandStatisticsinChemistry(乡扁寿專B.Kowalski),D,ReidelPublishingCompany,Dordrecht,Holland,1984),抗体的定量活性-性质关系可以使用众所周知的数学技术来获得，例如统计学回归、模式识另'J和分类(Norman等人AppliedRegressionAnalysis.Wiley-Interscience;第3版(April1998);Kandel,Abraham&Backer,Eric.Computer-AssistedReasoninginClusterAnalysis.PrenticeHallPTR,(Mayll,1995);Krzanowski,Wojtek.PrinciplesofMultivariateAnalysis:AUser'sPerspective(OxfordStatisticalScienceSeries,No22(Paper)).OxfordUniversityPress;(December2000);Witten,IanH.&Frank,Eibe.DataMining:PracticalMachineLearningToolsandTechniqueswithJavaImplementations.MorganKaufmann;(October11,1999);DenisonDavidG.T.(编辑)，ChristopherC.Holmes,BaniK.Mallick,AdrianF.M.Smith.BayesianMethodsforNonlinearClassificationandRegression(WileySeriesinProbabilityandStatistics).JohnWiley&Sons;(July2002);Ghose,Ar叩K.&Viswanadhan,VellarkadN.CombinatorialLibraryDesignandEvaluationPrinciples,Software,Tools,andApplicationsinDrugDiscovery)。抗体的性质可以衍生自抗体序列的经验和理论模型(例如，可能接触的残基的分析或计算的物理化学性质)、功能和三维结构，并且这些性质可以单独和组合加以考虑。序列-结构关系的这种研究可以用于预测具有已知序列但是三维结构未知的抗体中的那些残基，所述残基在维持其CDR环的三维结构且因此维持结合特异性中是重要的。这些预测可以通过比较预测与来自前导最优化实验的结果得到支持。在结构方法中，使用任何免费可用或商业包例如WAM可以制备抗体分子的模型。蛋白质显现和分析软件包例如InsightII(Accelrys,Inc.)或DeepView随后可以用于评估在CDR中每个位置上的可能置换。这种信息随后可以用于制备对活性可能具有最低限度或有利作用的置换。在CDRs、抗体VH或VL结构域和/或靶向结合剂的氨基酸序列内制备置换所需的技术通常是本领域可用的。可以制备具有可能预期对活性具有或不具有最低限度或有利作用的置换的变体序列，且就结合靶和/或中和靶的能力和/或就任何其他所需性质进行测试。其序列在本文中具体公开的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体可以依照本发明而使用，如讨论的。如本文所使用的，术语"标记"或"标记的"指在抗体或靶向结合剂上掺入另一种分子。在一个实施方案中，标记是可检测标记，例如掺入放射性标记的氨基酸或与可以通过标记的抗生物素蛋白(例如包含可以通过光学或比色法进行检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)进行检测的生物素化部分的多肽附着。在另一个实施方案中，标记或标志可以是治疗性的，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的且可以使用。用于多肽的标记的例子包括但不限于下述放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、32P、33P、35S、90Y、99Tc、lllln、1251、1311),荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、(3-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素化基团，由次级报道分子识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合部位、金属结合结构域、附加表位)，磁性试剂，例如钆螯合物，毒素例如百日咳毒素，紫杉醇，细胞松弛素B,短杆菌肽D,溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷(tenoposide),长春新碱，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氩睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂进行附着以减少可能的位阻。如本文所使用的，"耙向结合剂"是与耙位点优先结合的试剂，例如抗体或其结合片段。在一个实施方案中，耙向结合剂对唯——个靶位点特异。在其他实施方案中，靶向结合剂对于超过一个靶位点特异。在一个实施方案中，耙向结合剂可以是单克隆抗体且靶位点可以是表位。如下文描述的，粑向结合剂可以包含抗体的至少一个抗原结合结构域，其中所述结构域与异源蛋白质支架融合或包含在异源蛋白质支架内，所述异源蛋白质支架例如非抗体蛋白质支架。在本说明书和权利要求自始至终，单词"包含"或其变体应当理解为暗示包括所述的整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。人抗ErbB2抗体及其表征在一个实施方案中，本发明提供了抗ErbB2靶向结合剂。在另一个实施方案中，本发明提供了抗ErbB2抗体。在一些实施方案中，抗ErbB2抗体是人抗体。在一些实施方案中，本发明提供了不含信号序列氨基酸l-22与人ErbB2结合的抗ErbB2抗体(GenbanklD:P04626)(SEQIDNO:45)。在一些实施方案中，人抗ErbB2抗体通过免疫非人转基因动物例如啮齿类动物来产生，所述非人转基因动物的基因组包含人免疫球蛋白基因，从而使得转基因动物生产人抗体。本发明的抗ErbB2抗体可以包含人k或人X轻链或由其衍生的氨基酸序列。在包含k轻链的一些实施方案中，轻链可变结构域(VL)部分由人VK1、VK2或VK4家族基因编码。在某些实施方案中，轻链利用人VKA1、VKA2、VKB3或VKL1基因。在各种实施方案中，轻链可变结构域利用人A2基因和人JK1基因；人L1基因和人JK5基因；人B3基因和人JK3基因；或人A1基因和人JK4基因。在一些实施方案中，ErbB2抗体的VL包含相对于人基因的种系氨基酸序列的一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，抗ErbB2抗体的VL包含相对于种系氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸置换。在一些实施方案中，抗ErbB2抗体的VL包含相对于种系氨基酸序列的0、1或2个氨基酸插入。在一些实施方案中，来自种系的那些置换中的一个或多个在轻链的CDR区中。在一些实施方案中，相对于种系的氨基酸置换在一个或多个与下述抗体的VL中的任何一个或多个中相对于种系的置换相同的位置处1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。例如，本发明的抗ErbB2抗体的VL可以包含与抗体1.14的VL中发现的种系相比较的一个或多个氨基酸置换，或与抗体1.18的VL中发现的种系相比较可以存在一个或多个氨基酸置换。在一些实施方案中，氨基酸改变在一个或多个相同位置处，但涉及与参考抗体中不同的置换。在一些实施方案中，相对于种系的氨基酸改变在与下述抗体的任何VL中相同的位置中的一个或多个处发生1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3,但改变可以表示相对于参考抗体中的氨基酸在此种位置处的保守氨基酸置换。例如，如果这些抗体之一中的特定位置相对于种系改变且是谷氨酸，那么人们可以在那个位置处置换天冬氨酸。类似地，如果与种系相比较的氨基酸置换是丝氨酸，那么人们可以用苏氨酸保守地置换那个位置处的丝氨酸。保守氨基酸置换在上文进行讨论。在一些实施方案中，人抗ErbB2抗体的轻链包含抗体1.44.l(SEQIDNO:4)、1.140(SEQIDNO:8)、1.43.1(SEQIDNO:12)、1.14.1(SEQIDNO:16)、1.100.1(SEQIDNO:20)、1.96.2(SEQIDNO:24)、1.18.1(SEQIDNO:28)、1.20.1(SEQIDNO:32)、1.39.1(SEQIDNO:36)、1.24.3(SEQIDNO:40)、1.71.3(SEQIDNO:44)的VL氨基酸序列，或具有最高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个保守氨基酸置换和/或总共最高达3个非保守氨基酸置换的所述氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB2抗体的轻链包含抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3区，所述抗体包含选自抗体1.44.1(SEQIDNO:4)、1.140(SEQIDNO:8)、1.43.KSEQIDNO:12)、1.14.KSEQIDNO:16)、1.100.1(SEQIDNO:20)、1.96.2(SEQIDNO:24)、1,18.1(SEQIDNO:28)、1.20.1(SEQIDNO:32)、1.39.1(SEQIDNO:36)、1.24.3(SEQIDNO:40)、1.71.3(SEQIDNO:44)的抗体的VL区的氨基酸序列，或各自具有小于4个或小于3个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的所述CDR区。就重链而言，在一些实施方案中，可变结构域(VH)部分由人VH3或VH4家族基因编码。在某些实施方案中，重链VH利用人VH3-21、VH3-13、VH4-31或VH3-7基因。在各种实施方案中，重链VH利用人VH3-21基因、人D5-24基因和人JH4B基因。在其他实施方案中，重链VH利用人VH3-7基因和人JH6;人VH4-31基因、人D3-10基因和人JH6B基因；或人VH3-13基因、人D6-19基因和人JH6B基因。在一些实施方案中，抗ErbB2抗体的VH序列包含相对于种系氨基酸序列的一个或多个氨基酸置换、缺失或插入(添加)。在一些实施方案中，重链的可变结构域包含来自种系氨基酸序列的1、2、3、4、5、6或7个突变；其中的0、1、2或3个可以是置换。在一些实施方案中，重链的可变结构域包含与种系氨基酸序列相比较的0、1、2或3个添加。在一些实施方案中，一个或多个突变是与种系氨基酸序列相比较的非保守置换。在一些实施方案中，突变在重链的CDR区中。在一些实施方案中，氨基酸改变在与下述抗体的VH中的任何一个或多个中来自种系的突变相同的位置中的一个或多个处进行1.14.1、1.18.1、U9、1.20.1、1.22.1、1.22.2、1.24.3、1.41、1.43.1、143.2、1.44.1、1.39.1、1.71.1、1.71.3、1.96.2、1.99、1.100.1、1.104、1.107、1.124、1.128、1.140.1或1.148。在其他实施方案中，氨基酸改变在一个或多个相同位置处，但涉及与参考抗体中不同的突变。在一些实施方案中，重链包含抗体144.1(SEQIDNO:2)、1.140.1(SEQIDNO:6)、1.43.1(SEQIDNO:10)、1.14.1(SEQIDNO:14)、1.100.1(SEQIDNO:18)、1.96.2(SEQIDNO:22)、1.18.1(SEQIDNO:26)、1.20.1(SEQIDNO:30)、1.39.1(SEQIDNO:34)、1.24.3(SEQIDNO:38)、1.71.3(SEQIDNO:42)的VH氨基酸序列；或具有最高达l、2、3、4、6、8或IO个保守氨基酸置换和/或总共最高达3个非保守氨基酸置换的所述VH氨基酸序列。在一些实施方案中，重链包含抗体1.14.1、1.18.1、1.19、1.20.1、1.22.1、1.22.2、1.24.3、1.41、1.43.1、143.2、1.44.1、1.39.1、1.71.1、1.71.3、1.96.2、1.99、1.100.1、1.104、1.107、1.124、1.128、1.140.1或1.148的重链CDR1、CDR2和CDR3区，或各自具有小于5个、小于4个、小于3个或小于2个保守氨基酸置换和/或总共3个或更少的非保守氨基酸置换的所述CDR区。在另一个实施方案中，抗体包含如上文公开的轻链和如上文公开的重链。在进一步的实施方案中，轻链CDRs和重链CDRs来自相同抗体。可以进行的一种类型的氨基酸置换是改变抗体中的一个或多个半胱氨酸，其可以与另一种残基例如但不限于丙氨酸或丝氨酸化学反应。在一个实施方案中，存在非规范半胱氨酸的置换。置换可以在抗体的可变结构域的CDR或构架区或恒定结构域中进行。在一些实施方案中，半胱氨酸是经典的。可以进行的另一种类型的氨基酸置换是改变抗体中的任何潜在的蛋白酶解位点。此种位点可以存在于抗体的可变结构域的CDR或构架区中或恒定结构域中。半胱氨酸残基的置换和蛋白酶解位点的去除可以减少抗体产物中的任何异质性的危险且因此增加其同质性。另一种类型的氨基酸置换是通过改变一个或两个残基而消除天冬酰胺-甘氨酸对，其形成潜在的脱酰胺作用位点。另外一种类型的氨基酸置换在曱硫氨酸残基处以消除氧化位点。在一些实施方案中，切割本发明的抗ErbB2抗体的重链的C末端赖氨酸。在本发明的各种实施方案中，抗ErbB2抗体的重和轻链可以任选包括信号序列。在一个方面，本发明涉及抑制性人抗ErbB2单克隆抗体和生产其的杂交瘤细胞系。表l列出了编码重和轻链的可变结构域的核酸的序列标识符(SEQIDNO:)，以及相应推导的氨基酸序列。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>抗ErbB2抗体的种类和亚类抗ErbB2抗体的种类和亚类可以通过本领域已知的任何方法进行测定。一般而言，抗体的种类和亚类可以使用对于抗体的特定种类和亚类特异的抗体进行测定。此种抗体是商购可得的。种类和亚类可以通过ELISA、或蛋白质印迹以及其他技术进行测定。可替代地，种类和亚类可以通过下述进行测定测序抗体的重和/或轻链的恒定结构域的全部或部分，比较它们的氨基酸序列与免疫球蛋白的各个种类和亚类的已知氨基酸序列，且测定抗体的种类和亚类。在一些实施方案中，抗ErbB2抗体是单克隆抗体。抗ErbB2抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在另一个实施方案中，抗ErbB2抗体是IgG且是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4亚类。在另一个优选实施方案中，抗体是亚类IgG2(参见Kabat等人，(1991)Se^ewc"。/尸ra^,rao//m應脂/og/co//&潛/，第5版.USDepartmentofHealthandHumanServices,Washington,DC)。抗ErbB2靶向结合剂和抗体对于ErbB2的结合亲和力在本发明的一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体以高亲和力与ErbB2结合。在一些实施方案中，使用高分辨率biocore分析，耙向结合剂和/或抗ErbB2抗体以13.5l(T9M或更小的Kd与ErbB2结合。在另外其他的实施方案中，使用高分辨率biocore分析，靶向结合剂和/或抗体以13.x1CT9M、13.xl(T9M、11.xl(T9M、12.x1(T9M、10.x10.9M、5.xlO力M、3xlCT9、2x10-9、1xl(T9M或5x10"。M或更小的kd与ErbB2结合。在某些实施方案中，靶向结合剂和/或抗体以与选自下述的抗体基本上相同的Kd与ErbB2结合1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在另外一个优选实施方案中，靶向结合剂和/或抗体以与抗体基本上相同的KD与ErbB2结合，所述抗体包含具有SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42中发现的vh区的氨基酸序列的重链可变结构域，具有SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域，或两者。在另一个优选实施方案中，抗体以与靶向结合剂和/或抗体基本上相同的KD与ErbB2结合，所述把向结合剂和/或抗体包含具有SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域的CDR区，或包含具有SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42中发现的vh区的氨基酸序列的重链可变结构域的CDR区，或两者。在一些实施方案中，把向结合剂和/或抗ErbB2抗体具有低解离速率常数(K。ff)。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体具有l.Oxl(T3s-l或更低的k。ff或者5.0x10-、"或更低的k。ff。在其他优选实施方案中，抗体以2x10"s"或更低的k。ff与ErbB2结合。在一些实施方案中，k。ff与本文描述的抗体基本上相同，包括选自1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的抗体。在一些实施方案中，耙向结合剂和/或抗体以与抗体基本上相同的k。ff与ErbB2结合，所述抗体包含来自选自下述的抗体的重链的CDR区，或轻链的CDR区，或两者1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗体以与抗体基本上相同的k。ff与ErbB2结合，所述抗体包含具有SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42中发现的VH区的氨基酸序列的重链可变结构域，具有SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44中发现的VL区的氨基酸序列的轻链可变结构域，或两者。耙向结合剂和抗ErbB2抗体与ErbB2的结合亲和力和解离速率可以通过本领域已知的方法进行测定。结合亲和力可以通过ELISAs、RIAs、流式细胞术、表面等离振子共振例如BIACORETM进行测量。解离速率可以通过表面等离振子共振进行测量。优选地，结合亲和力和解离速率通过表面等离振子共振进行测量。更优选地，结合亲和力和解离速率使用BIACORETM进行测量。人们可以通过使用本领域已知的方法测定抗体是否具有与抗ErbB2抗体基本上相同的KD。实施例12例示了用于通过流式细胞术测定抗ErbB2单克隆抗体的亲和常数的方法。由抗ErbB2抗体识别的ErbB2表位的鉴定本发明提供了靶向结合剂和/或人抗ErbB2单克隆抗体，其与ErbB2结合且竟争或与下述竟争和/或结合相同的表位(a)选自1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的抗体；(b)包含具有SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42的可变结构域的氨基酸序列的重链可变结构域的抗体，(c)包含具有SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44的可变结构域的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗体，或(d)包含如(b)中定义的重链可变结构域和如(c)中定义的轻链可变结构域两者的抗体。如杲2种抗体彼此相互地竟争与ErbB2的结合，那么它们被说成竟争。人们可以通过使用本领域已知的方法测定靶向结合剂和/或抗体是否与抗ErbB2抗体结合相同的表位或竟争结合。在一个实施方案中，人们允许本发明的抗ErbB2抗体在饱和条件下与ErbB2结合，且随后测量测试抗体与ErbB2结合的能力。如果测试抗体能够与抗ErbB2抗体同时与ErbB2结合，那么测试抗体与抗ErbB2抗体结合不同的表位。然而，如果测试抗体不能同时与ErbB2结合，那么测试抗体与相同表位、重叠表位、或与由人抗ErbB2抗体结合的表位紧密接近的表位结合。这个实验可以使用ELISA、RIA、BIACORETM或流式细胞术来进行。为了测试靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体是否与另一种抗ErbB2抗体竟争，人们可以以2个方向使用上文描述的竟争法，即测定参考抗体是否阻断测试抗体且反之亦然。在另一个实施方案中，实验使用ELISA来进行。测定Ko的方法在下文进一步讨论。ErbB2活性经由抗ErbB2抗体的抑制在各种实施方案中，本发明提供了抑制经由ErbB2的信号传导的靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体。在一个实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体抑制ErbB2的配体资导的信号传导。在一个实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体抑制ErbB2的配体诱导的信号传导而不阻断配体与ErbB2的结合。在另一个实施方案中，ErbB2是人的。在另一个实施方案中，抗ErbB2抗体是人抗体。在一些实施方案中，配体是调蛋白-p。靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体的EC5o可以通过在经由ELISA或RIA监控的直接结合测定中，或经由基于细胞的测定例如下文描述的那些检测抗体与抗原的结合进行测量。在一个实施方案中，耙向结合剂和/或抗体或其部分以^又仅50ng/ml的EC5o抑制经由ErbB2受体的配体诱导的信号传导，优选仅仅25ng/ml，更优选仅仅10ng/ml，甚至更优选仅仅5ng/ml。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体使ErbB2的配体诱导的信号传导抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。测量抑制可以通过本领域已知的任何方法来完成。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制ErbB2的磷酸化的靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体。在各种实施方案中，耙向结合剂和/或抗体的EC5o为仅仅50ng/ml,优选仅仅25ng/ml,更优选仅仅10ng/ml，甚至更优选仅仅5ng/ml。在一些实施方案中，耙向结合剂和/或抗ErbB2抗体使ErbB2的磷酸化抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。实施例4、9和11例示了ErbB2磷酸化测定。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制MAPK途径的活化的靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体。在各种实施方案中，耙向结合剂和/或抗体的ECso为仅仅50ng/ml，优选仅仅25ng/ml,更优选仅仅10ng/ml,甚45至更优选仅仅5ng/ml。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体<吏ErbB2的石舞酸4匕抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。用于监控细胞中的MAPK途径活化的测定是本领域已知的(参见为了所有目的整体51入本文作为参考的美国专利申请号20030186382和20030096333)。在另一个实施方案中，本发明提供了调节p38-TSP-l途径的活性的把向结合剂和/或抗ErbB2抗体。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗体活化p38-TSP-l途径。在其他实施方案中，靶向结合剂和/或抗体抑制p38-TSP-l途径。在各种实施方案中，靶向结合剂和/或抗体的EC50为仅仅50ng/ml,优选仅仅25ng/ml，更优选仅仅10ng/ml,甚至更优选仅仅5ng/ml。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体使ErbB2的磷酸化抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。用于监控细胞中的p38-TSP-l途径活化的测定是本领域已知的(参见为了所有目的整体引入本文作为参考的美国专利申请号20060089393和20020103253)。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制PI3K途径的活化的靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体。在各种实施方案中，耙向结合剂和/或抗体的EC5。为仅仅50ng/ml,优选仅仅25ng/ml,更优选仅仅10ng/ml，甚至更优选仅仅5ng/ml。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体使ErbB2的磷酸化抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。用于监控细胞中的PI3K途径活化的测定是本领域已知的(参见为了所有目的整体51入本文作为参考的美国专利申请号20020037276和20040176385)。在另一个实施方案中，本发明提供了抑制CDC2的抑制的靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体。在各种实施方案中，靶向结合剂和/或抗体的EC50为亏又仅50ng/ml，优选4又仅25ng/ml，更优选4叉仅10ng/ml,甚至更优选仅仅5ng/ml。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体使ErbB2的磷酸化抑制至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。用于监控细胞中的CDC2的抑制的测定是本领域已知的(参见为了所有目的整体引入本文作为参考的美国专利申请号20030225098和20040110775)。用抗ErbB2抗体抑制细胞增殖根据一些实施方案，本发明提供了在体内或在体外或两者抑制癌或转化细胞的增殖的靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体。在另一个实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体使增殖抑制至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。在一个实施方案中，磷酸化在动物已开始用抗体治疗后至少1天进行测量，并且增殖在动物已开始用抗体治疗后3天进行测量。在另一个实施方案中，在动物已开始用抗体治疗后至少1小时测量抑制。在各种实施方案中，如通过细胞滴度或增殖标记测量的，靶向结合剂和/或抗体的EC50为仅仅3.5昭/ml,优选仅仅300ng/ml,更优选仅仅100ng/ml,甚至更优选仅仅50ng/ml。实施例9和10例示了增殖测定。物种和分子选择性在本发明的另一个方面，^^向结合剂和/或抗ErbB2抗体证实了物种和分子选择性。在一些实施方案中，耙向结合剂和/或抗ErbB2抗体与人(SEQIDNO:45)和猕猴ErbB2结合。根据本说明书的教导，人们可以使用本领域众所周知的方法测定关于靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体的物种选才奪性。例如，人们可以使用蛋白质印迹、流式细胞术、ELISA、免疫沉淀或RIA测定物种选4奪性。在另一个实施方案中，人们可以使用流式细胞术测定物种选4奪性。在一些实施方案中，靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体不显示与除ErbB2外的任何其他蛋白质的任何可估计的特异性结合。人们可以使用本领域众所周知的方法根据本说明书的教导测定靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体对ErbB2的选择性。例如人们可以使用蛋白质印迹、流式细胞术、ELISA、免疫沉淀或RIA测定选择性。产生抗体和抗体产生性细胞系的方法在一些实施方案中，人抗体通过用ErbB2抗原免疫在其基因组内包含一些或全部人免疫球蛋白重链和轻链基因座的非人、转基因动物来生产。在另一个实施方案中，非人动物是XENOMOUSETM动物(AmgenFremont,Inc.,Fremont,CA)。XENOMOUSE小鼠是包含人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大片段且在小鼠抗体生产中有缺陷的人工改造的小鼠品系。参见，例如，Green等人，NatureGenetics7:13-21(1994)以及美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963和6,150,584。还参见WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735、WO98/16654、WO98/24893、WO98/50433、WO99/45031、WO99/53049、WO00/09560和WO00/037504。在另一个方面，本发明提供了通过用ErbB2抗原免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物用于制备来自非人、非小鼠动物的抗ErbB2抗体的方法。人们可以使用上文引用的文件中描述的方法生产此种动物。这些文件中7>开的方法可以如美国专利5,994,619中描述的进行修饰，所述专利在此引入作为参考。美国专利5,994,619描述了用于生产衍生自猪和牛的新培养的内细胞群(CICM)细胞和细胞系的方法，以及异源DNA已插入其内的转基因CICM细胞。CICM转基因细胞可以用于生产克隆的转基因胚胎、胎儿和后代。'619专利还描述了生产能够将异源DNA传递给其后代的转基因动物的方法。在本发明的优选实施方案中，非人动物是哺乳动物，优选大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。XENOMOUSE小鼠生产全人抗体的成体样人i普(repertoire)且产生抗原特异性人抗体。在一些实施方案中，XENOMOUSE小鼠通过在酵母人工染色体(YAC)中引入人重链基因座和k轻链基因座的种系构型片段包含约80%的人抗体V基因语。在其他实施方案中，XENOMOUSETM小鼠进一步包含约全部人人轻链基因座。参见Mendez等人，iV幽reGeweto15:146-156(1997)，Green和Jakobovits,j5"平iUet/.188:483-495(1998)和WO98/24893,其7^开内容在此引入作为参考。在其他实施方案中，抗体在人转染色体(trans-chromosomic)小鼠中产生(参见在此引入作为参考的WO02/43478和WO02/092812)。在一些实施方案中，包含人免疫球蛋白基因的非人动物是具有人免疫球蛋白"微小基因座(minilocus)"的动物。在微小基因座方法中，外源Ig基因座通过包括来自Ig基因座的个别基因进行模拟。因此，一种或多种VH基因、一种或多种DH基因、一种或多种JH基因、p恒定结构域和第二种恒定结构域(优选Y恒定结构域)形成构建体用于插入动物内。这种方法尤其在在此引入作为参考的美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中得到描述。在另一个方面，本发明提供了用于制备人源化的抗ErbB2抗体的方法。在一些实施方案中，非人动物如下文描述的在允许抗体生产的条件下用ErbB2抗原进行免疫。从动物中分离出抗体产生性细胞，将其与骨髓瘤融合以产生杂交瘤，并且分离编码目的抗ErbB2抗体的重和轻链的核酸。这些核酸使用本领域技术人员已知的技术且如下文进一步描述的进行后续人工改造，以减少非人序列的量，即使抗体人源化以减少人中的免疫应答。在一些实施方案中，ErbB2抗原是分离的和/或纯化的ErbB2。在另一个实施方案中，ErbB2抗原是人ErbB2。在一些实施方案中，ErbB2抗原是ErbB2的片段。在一些实施方案中，ErbB2片段是ErbB2的细胞外结构域。在一些实施方案中，ErbB2片段是ErbB2的细胞外环(参见在此引入作为参考的Cho等人，Nature.2003Feb13;421(6924):756-60)。在一些实施方案中，ErbB2片段包含ErbB2的至少一个表位。在其他实施方案中，ErbB2抗原是在其表面上表达或超表达ErbB2或其免疫原性片段的细胞。在一些实施方案中，ErbB2抗原是ErbB2融合蛋白。在一些实施方案中，ErbB2是合成肽免疫原。动物的免疫接种可以通过本领域已知的任何方法进行。参见，例如，Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1990。用于免疫非人动物例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Harlow和Lane,同上和美国专利5，994,619。在另一个实施方案中，ErbB2抗原与佐剂一起施用以刺激免疫应答。示例性佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此种佐剂可以通过使多肽隔绝在局部沉积物中保护多肽不受快速分散，或它们可以包含刺激宿主以分泌对于巨噬细胞趋化性的因子和免疫系统的其他组分的物质。优选地，如果多肽被施用，那么免疫接种时间表将涉及在几周内展开的多肽的2次或更多次施用。实施例1例示了用于在XenoMouseTM小鼠中生产抗ErbB2单克隆抗体的方法。祐傳和^傳Z^:^勿^敏,秀的Z^:用ErbB2抗原免疫接种动物后，可以从动物获得抗体和/或抗体产生性细胞。在一些实施方案中，通过使动物出血或处死动物从动物获得包含抗ErbB2抗体的血清。血清可以在它得自动物时使用，可以从血清获得免疫球蛋白级分，或可以从血清纯化抗ErbB2抗体。在一些实施方案中，由从免疫动物中分离的细胞制备抗体产生性无限增殖化细胞系。免疫接种后，处死动物且通过本领域已知的任何方法使淋巴结和/或脾B细胞无限增殖化。使细胞无限增殖化的方法包括但不限于用癌基因转染它们，用致癌病毒感染它们且在选择无限增殖化细胞的条件下培养它们，对它们实施致癌或突变化合物，使它们与无限增殖化细胞例如骨髓瘤细胞融合，和灭活肿瘤抑制基因。参见，例如Harlow和Lane,同上。如果使用与骨髓瘤细胞的融合，那么骨髓瘤细胞优选不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。无限增殖化细胞使用ErbB2、其部分或表达ErbB2的细胞进行筛选。在另一个实施方案中，起始筛选使用酶联免疫测定(ELISA)或放射免疫测定来进行。ELISA筛选的例子在引入本文作为参考的WO00/37504中提供。选择抗ErbB2抗体产生性细胞例如杂交瘤、克隆且就所需特征进一步筛选，包括强生长、高抗体产生和所需抗体特征，如下文进一步讨论的。杂交瘤可以在同基因动物中、在缺乏免疫系统的动物例如棵鼠中体内或在细胞培养中体外进行扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。在一个实施方案中，免疫动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物，且脾B细胞与来自与非人动物相同的物种的骨髓瘤细胞系融合。在更优选的实施方案中，免疫动物是XENOMOUSETM小鼠，并且骨髓瘤细胞系是非分泌小鼠骨髓瘤。在甚至更加优选的实施方案中，骨髓瘤细胞系是P3-X63-Ag8.653(美国典型培养物保藏中心)。参见，例如实施例2。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于产生细胞系的方法，所述细胞系产生针对ErbB2的人单克隆抗体或其片段，所述方法包括(a)用ErbB2、ErbB2的部分或者表达ErbB2的细胞或组织免疫本文描述的非人转基因动物；(b)允许转基因动物发动针对ErbB2的免疫应答；(c)从转基因动物中分离抗体产生性细胞；(d)使抗体产生性细胞无限增殖化；(e)生成无限增殖化抗体产生性细胞的个别单克隆群体；和(f)筛选无限增殖化抗体产生性细胞以鉴定针对ErbB2的抗体。在另一个方面，本发明提供了产生人抗ErbB2抗体的杂交瘤。在另一个实施方案中，如上所述，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在其他实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤。在本发明的一个实施方案中，抗体产生性细胞得到分离且在宿主细胞中进行表达，例如骨髓瘤细胞。在另一个优选实施方案中，转基因动物用ErbB2进行免疫，从免疫的转基因动物中分离原代细胞例如脾或外周血细胞，并且鉴定产生对于所需抗原特异的抗体的个别细胞。分离来自每个个别细胞的聚腺苷酸化mRNA,并且使用与可变区序列退火的有义引物(例如识别人重和轻链可变区基因的大部分或全部FR1区的简并引物)和与恒定或连接区序列退火的反义引物进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。重和轻链可变结构域的cDNAs随后进行克隆，且在任何合适的宿主细胞中作为具有分别的免疫球蛋白恒定区，例如重链和k或X轻链恒定结构域的嵌合抗体进行表达。参见引入本文作为参考的Babcook,J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-48,1996。抗ErbB2抗体随后可以如本文描述的进行鉴定和分离。在另一个实施方案中，噬菌体展示技术可以用于提供包含对于ErbB2具有不同亲和力的抗体谦的文库。对于此种镨的产生，无需使来自免疫动物的B细胞无限增殖化。相反，原代B细胞可以作为DNA的来源直接使用。得自B细胞例如衍生自血液或脾的cDNAs的混合物用于制备表达文库，例如转染到大肠杆菌co//)内的人噬菌体展示文库。所得到的细胞就与ErbB2的免疫反应性进行测试。用于鉴定来自此种文库的高亲和力人抗体的技术由Griffiths等人，￡71^(913:3245-3260(1994);Nissim等人,同前，第692-698页和Griffiths等人，同前12:725-734进行描述，所述参考文献引入作为参考。最后，从文库中鉴定产生对于抗原的所需量级结合亲和力的克隆，且回收编码负责此种结合的产物的DNA且对其进行处理用于标准重组表达。噬菌体展示文库还可以使用先前处理的核苷酸序列进行构建且以类似方式进行筛选。一般而言，编码重和轻链的cDNAs独立地提供或连接，以形成Fv类似物用于在噬菌体文库中生产。在某些实施方案中，可以利用链改组(参见在此引入作为参考的Kang等人,PNAS(1991)Dec15;88(24):11120-3)。噬菌体文库随后就对于ErbB2具有最高亲和力的抗体进行筛选，且从合适的克隆中回收遗传材料。进一步的筛选循环可以增加分离的原始抗体的亲和力。核酸、载体、宿主细胞和制备抗体的重组法#凝一些实施方案中，不同的核酸分子编码抗ErbB2免疫球蛋白的重链和轻链。在其他实施方案中，相同的核酸分子编码抗ErbB2免疫球蛋白的重链和轻链。在一个实施方案中，核酸编码本发明的ErbB2抗体。在一些实施方案中，编码轻链的可变结构域(VO的核酸分子利用人VkB3、VkL1、VkA2或VkAl基因和Jk1、Jk3、jK4或Jk5基因，含或不含来自种系的突变。在一些实施方案中，编码轻链的核酸分子编码相对于种系氨基酸序列包含l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个置换和/或0、1或2个插入的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含编码VL氨基酸序列的核苷酸序列，所述VL氨基酸序列与种系VK和JK序列相比较包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个保守氨基酸置换和/或总共最高达3个非保守置换。置换可以在CDR区、构架区或在恒定结构域中。在一些实施方案中，核酸分子编码与种系序列相比專交包含一种或多种变体的VL氨基酸序列，其等同于抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的任何一种的V^中发现的变异。在一些实施方案中，与抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3之一的VL中发现的种系序列相比较，核酸分子编码至少3个氨基酸置换。在一些实施方案中，核酸分子包含核普酸序列，其编码单克隆抗体1.44.1(SEQIDNO:4)、1.140(SEQIDNO:8)、1.43.1(SEQIDNO:12)、1.14.1(SEQIDNO:16)、1.100.1(SEQIDNO:20)、1.96.2(SEQIDNO:24)、1.18.1(SEQIDNO:28)、1.20.1(SEQIDNO:32)、1.39.1(SEQIDNO:36)、1.24.3(SEQIDNO:40)、1.71.3(SEQIDNO:44)的Vt氨基酸序列，或其变体或部分。在一些实施方案中，核酸编码包含所述上文列出的抗体之一的轻链CDRs的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含核苷酸序列，其编码SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40或44之一的氨基酸序列。在一些优选实施方案中，核酸分子包含SEQIDNO:3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43的核苷酸序列，或其部分。在一些实施方案中，核酸编码所述抗体的轻链CDRs的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子编码V^氨基酸序列，其与抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、I.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的任何一种的Vl区的VL氨基酸序列，或SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40或44中的任何一个的氨基酸序列至少70%、750/。、80%、85%、90%、95%、97。/o、98%或99%等同。本发明的核酸分子包括核酸，所述核酸在高度严格条件例如上文描迷的那些下与编码SEQIDNO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44中发现的V^区的氨基酸序列的核苷酸序列杂交，或具有编码SEQIDNO:3、7、II、15、19、23、27、31、35、39或43中发现的VL区的核酸分子的核苦酸序列。在另一个实施方案中，核酸编码选自1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的抗体的全长轻链。在另一个优选实施方案中，核酸分子编码重链的可变结构域(VH),其包含人Vh3-21、人Vh3-7、人Vh4-31或人Vh3-13基因序列或由其衍生的序列。在各种实施方案中，核酸分子利用人Vh3-7基因和人JH6;人Vh4-31基因、人D3-10基因和人JH6B基因；或人Vh3-13基因、人D6-19基因和人Jh6B基因。在一些实施方案中，核酸分子编码与人V、D和J基因的种系氨基酸序列相比较包含l、2、3、4、5、6或7个突变的氨基酸序列；其中的0、1、2或3个可以是置换。在一些实施方案中，所述突变在VH区中。在一些实施方案中，所述突变在CDR区中。在一些实施方案中，与种系序列相比较核酸分子编码一个或多个氨基酸突变，其与单克隆抗体1.14.1、1.18.1、1.19、1.20.1、1.22.1、1.22.2、1.24.3、1.41、1.43.1、143.2、1.44.1、1.39.1、1.71.1、1.71.3、1.96.2、1.99、1.100.1、1.104、1.107、1.124、1.128、1.140.1或1.148的VH中发现的氨基酸突变等同。在一些实施方案中，与种系序列相比较核酸编码至少3个氨基酸突变，其与上文列出的单克隆抗体之一中发现的至少3个氨基酸突变等同。在一些实施方案中，核酸分子包含核苷酸序列，其编码选自1.44.1(SEQIDNO:2)、1.140.1(SEQIDNO:6)、1.43.1(SEQIDNO:10)、1.14.1(SEQIDNO:14)、1.100.1(SEQIDNO:18)、1.96.2(SEQIDNO:22)、1.18.1(SEQIDNO:26)、1.20.1(SEQIDNO:30)、1.39.1(SEQIDNO:34)、1.24.3(SEQIDNO:38)、1.71.3(SEQIDNO:42)的抗体的VH氨基酸序列的至少部分，其变体，或具有保守氨基酸突变和/或总共3个或更少非保守氨基酸置换的所述序列。在各种实施方案中，序列编码一个或多个CDR区，优选CDR3区，所有3个CDR区，或整个Vh区。在一些实施方案中，核酸分子包含编码SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38和42之一的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些优选实施方案中，核酸分子包含SEQIDNO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41的核苷酸序列的至少部分。在一些实施方案中，所述部分编码vh区、CDR3区或所有3个CDR区。在一些实施方案中，核酸分子编码vh氨基酸序列，其与SEQIDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38或42中的任何一个的Vh氛基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%等同。本发明的核酸分子包括核酸，所述核酸在高度严格条件例如上文描述的那些下与编码SEQIDNO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41的氨基酸序列的核苷酸序列，或与其vh区杂交，或具有SEQIDNO:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37或41的核普酸序列，或编码其Vn区。在另一个实施方案中，核酸编码选自1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3的抗体的全长重链。编码抗ErbB2抗体或其部分的重或轻链的核酸分子可以从产生此种抗体的任何来源中分离。在各种实施方案中，从由用ErbB2免疫的动物分离的B细胞、从衍生自表达抗ErbB2抗体的此种B细胞的无限增殖化细胞、或从噬菌体分离核酸分子。分离编码抗体的mRNA的方法是本领域众所周知的。参见，例如Sambrook等人。mRNA可以用于产生cDNA用于在聚合酶链反应(PCR)或抗体基因的cDNA克隆中使用。在一个实施方案中，核酸分子从具有作为其融合配偶体之一来自非人转基因动物的人免疫球蛋白产生性细胞的杂交瘤中分离。在另一个实施方案中，人免疫球蛋白产生性细胞从XENOMOUSETM动物中分离。在另一个实施方案中，如上所述，人免疫球蛋白产生性细胞来自非人、非小鼠转基因动物。在另一个实施方案中，核酸从非人、非转基因动物中分离。从非人、非转基因动物中分离的核酸分子可以用于例如人源化抗体。在另一个实施方案中，核酸从细菌或噬菌体中分离。在一些实施方案中，编码本发明的抗ErbB2抗体的重链的核酸可以包含与编码来自任何来源的重链恒定结构域的核苷酸序列框内连接的编码本发明的vh结构域的核苷酸序列。类似地，编码本发明的抗ErbB2抗体的轻链的核酸分子可以包含与编码来自任何来源的轻链恒定结构域的核香酸序列框内连接的编码本发明的VL结构域的核苷酸序列。在本发明的进一步方面，将编码重(Vh)和/或轻(VJ链的可变结构域的核酸分子"转变成"全长抗体基因。在一个实施方案中，通过插入已分别编码重链恒定(Ch)或轻链恒定(CJ结构域的表达载体内，从而使得VH区段与载体内的Ch区段可操作地连接，和/或VL区段与载体内的Cl区段可操作地連接，将编码Vh或Vi结构域的核酸分子转变成全长抗体基因。在另一个实施方案中，使用标准分子生物学技术通过使编码Vh和/或Vi^结构域的核酸分子与编码Ch和/或CL结构域的核酸分子相联例如连接，将编码Vh和/或Vt结构域的核酸分子转变成全长抗体基因。人重和轻链免疫球蛋白恒定结构域的核苷酸序列是本领域已知的。参见,例如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，NIHPubl.No.91-3242,1991。编码全长重和/或轻链的核酸分子随后可以由它们已引入其内的细胞进行表达，且分离抗ErbB2抗体。核酸分子可以用于重组表达大量抗ErbB2抗体。核酸分子还可以用于产生嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素、双抗体、突变抗体和抗体衍生物，如下文进一步描述的。如果核酸分子衍生自非人、非转基因动物，那么核酸分子可以用于抗体人源化，也如下文描述的。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子用作探针或PCR引物用于特定抗体序列。例如，核酸可以在诊断法中用作探针或用作PCR引物以扩增DNA的区域，所述DNA的区域可以尤其用于分离编码抗ErbB2抗体的可变结构域的另外核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是寡核普酸。在一些实施方案中，寡核苷酸来自目的抗体的重和轻链的高度可变结构域。在一些实施方案中，寡核苷酸编码抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3(或如本文描述的其变体)的一个或多个CDRs的全部或部分。郝本发明提供了载体，所述载体包含编码本发明的抗ErbB2抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子，编码此种抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸分子，或两者或耙向结合剂。本发明进一步提供了包含编码融合蛋白、经修饰的抗体、抗体片段及其探针的核酸分子的载体。如上所述获得的编码部分或全长轻和/或重链的DNAs插入表达载体内，从而使得基因与必需的表达控制序列例如转录和翻译控制序列可操作地连接，来进行表达。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植物病毒例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YACs、EBV衍生的附加体等。将抗体基因连接到载体内，从而使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择与使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入分开的载体内。在一些实施方案中，将2种基因插入相同的表达载体内。抗体基因通过标准方法插入表达载体内(例如，在抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，那么平端连接)。方便的载体是编码在功能上完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的那种，具有人工改造的合适的限制位点，从而使得任何Vh或Vl序列可以容易地插入且表达，如上所述。在此种载体中，剪接通常在插入的J区中的剪接供体位点和人C结构域前的剪接受体位点之间发生，并且还在人CH外显子内存在的剪接区域处发生。多腺苷酸化和转录终止在编码区下游的天然染色体位点处发生。重组表达载体也可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体内，从而使得信号肽与免疫球蛋白链的氨基末端框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。本领域技术人员将理解表达载体的设计，包括调节序列的选择可以依赖于此种因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白质表达的病毒元件，例如衍生自逆转录病毒LTRs、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子和/或增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤和强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件及其序列的进一步描述，参见，例如美国专利号5,168,062、美国专利号4,510,245和美国专利号4,968,615。用于在植物中表达抗体的方法，包括启动子和栽体的描述，以及植物的转化是本领域已知的。参见，例如，引入本文作为参考的美国专利6,517,529。在细菌细胞或真菌细胞例如酵母细胞中表达多肽的方法也是本领域众所周知的。除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因促进载体已？1入其内的宿主细胞的选择(参见例如，引入本文作为参考的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，一般地选才奪标记基因在载体已引入其内的宿主细胞上赋予对于药物例如G418、潮霉素或氨曱蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氩叶酸还原酶(DHFR)基因(用于利用氨曱蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)、neo基因(用于G418选择)和谷氨酸合成酶基因。車染Jt身荷2勿應和,逸iZf.编码靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体可以用于转染合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞内的任何已知方法进行。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞内的方法是本领域众所周知的，且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸封装在脂质体中、和DNA直接显微注射到核内。此外，核酸分子可以通过病毒载体引入哺乳动物细胞内。转化细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如引入本文作为参考的美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455)。转化植物细胞的方法是本领域众所周知的，包括例如土壤杆菌属(Agrobactenum)介导的转化、生物射弹(biolistic)转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域众所周知的。可用作宿主用于表达的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多无限增殖化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卯巢(CHO)细胞、N50细胞、SP2纟田胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)、A549细胞和许多其他细胞系。特别优先的细胞系通过测定哪种细胞系具有高表达水平进行选择。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9或Sf21细胞。当编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞内时，抗体通过使宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，抗体分泌到其中宿主细胞生长的培养基内的时间段来产生。抗体可以使用标准蛋白质纯化法从培养基中回收。植物宿主细胞包括例如烟草属(Nicotiana)、鼠耳芥属(Arabid叩sis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌和链霉菌属(&M/^omyc^)物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖糖酵母(Sc/n'zoracc/zaram;/c^户om6e)、啤酒糖酵母(S"cc/z"rowj^^yc'erevz's/"e)和巴其斤《急毕赤氏酵母(尸z.c力/'"/9"s/orw)。此外，本发明的抗体从生产细胞系的表达可以使用许多已知技术得到增强。另外，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于增强在某些条件下的表达的常用方法。GS系统与欧洲专利号0216846、0256055、0323997和0338841结合整体或与部分进行讨论。可能由不同细胞系或在转基因动物中表达的抗体将具有彼此不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸分子编码，或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的部分，与抗体的糖基化无关。脊差^^，弄兹參.'"、，、、，力,、、口回收方式产生抗体来转基因地产生，所述哺乳动物或植物对于目的免疫球蛋白重和轻链序列是转基因的。在哺乳动物中的转基因产生方面，抗ErbB2抗体可以在山羊、牛或其他哺乳动物的乳中产生且回收。参见，例如，引入本文作为参考的美国专利号5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。在一些实施方案中，包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物用ErbB2或其免疫原性部分进行免疫，如上所述。用于在植物中制备抗体的方法在例如引入本文作为参考的美国专利6,046,037和5,959,177中得到描述。在一些实施方案中，非人转基因动物或植物经由标准转基因技术通过将编码本发明的抗ErbB2抗体的一种或多种核酸分子引入动物或植物内来产生。参见Hogan和美国专利6，417,429,同上。用于制备转基因动物的转基因细胞可以是胚胎干细胞或体细胞或受精卵。转基因非人生物可以是嵌合的、非嵌合杂合子和非嵌合纯合子。参见，例如，Hogan等人,ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual第2版，ColdSpringHarborPress(1999);Jackson等人，MouseGeneticsandTransgenics:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(2000);和Pinkert,TransgenicAnimalTechnology:ALaboratoryHandbook,AcademicPress(1999),全部引入本文作为参考。在一些实施方案中，转基因非人动物通过编码目的重链和/或轻链的靶向构建体而具有靶向的破坏和置换。在另一个实施方案中，转基因动物包含且表达编码与ErbB2优选人ErbB2特异性结合的重和轻链的核酸分子。在一些实施方案中，转基因动物包含编码经修饰的抗体例如单链抗体、嵌合抗体或人源化抗体的核酸分子。抗ErbB2抗体可以在任何转基因动物中进行制备。在另一个实施方案中，非人动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马。非人转基因动物在血液、乳、尿、唾液、泪、粘液和其他体液中表达所述编码的多肽。^义岸包括下述步骤在噬菌体上合成人抗体的文库、用ErbB2或其部分筛选文库、分离结合ErbB2的噬菌体、和从噬菌体中获得抗体。例如，用于制备用于在噬菌体展示技术中使用的抗体文库的一种方法包括下述步骤用ErbB2或其抗原部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫应答，从免疫动物中提取抗体产生性细胞；从提取的细胞中分离编码本发明的抗体的重和轻链的RNA,使RNA逆转录以产生cDNA,使用引物扩增cDNA,且将cDNA插入噬菌体展示载体内，从而使得抗体在噬菌体上表达。本发明的重组抗ErbB2抗体可以以这种方式获得。本发明的重组抗ErbB2人抗体可以通过筛选重组组合抗体文库得到分离。优选地文库是scFv噬菌体展示文库，使用由B细胞分离的mRNA制备的人VL和VHcDNAs产生。用于制备和筛选此种文库的方法是本领域已知的。用于产生噬菌体展示文库的试剂盒是商购可得的(例如，PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,目录号27-9400-01;和StratageneSurfZApTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还存在可以在产生和筛选抗体展示文库中使用的其他方法和试剂(参见，例如，美国专利号5,223,409;PCT公开号WO92/18619，WO91/17271，WO92/20791,WO92/15679,WO93/01288,WO92/01047，WO92/09690;Fuchs等人，^o/Tec/wo/og少9:1370-1372(1991);Hay等人，/Zwm.J""k>￡/.〃少6m/ow似3:81-85(1992);Huse等人，S"'e"ce246:1275-1281(1989);McCafferty等人，A^w"348:552-554(1990);Griffiths等人，五Affl(9J.12:725-734(1993);Hawkins等人，丄Afo/.Ao/.226:889-8%(1992);Clackson等人，to訓352:624-628(1991);Gram等人，尸toc.淑/.Sc.园89:3576-3580(1992);Garrad等人，S/o/rec/z"o/ogy9:1373-1377(1991);Hoogenboom等人,iVwc.Jc/t/iRe《.19:4133-4137(1991);和Barbas等人，尸rac.Ato/.Jcad园88:7978-7982(1991),全部引入本文作为参考。在一个实施方案中，为了分离和产生具有所需特征的人抗ErbB2抗体，如本文描述的人抗ErbB2抗体首先用于选4奪具有针对ErbB2的类似结合活性的人重和轻链序列，使用引入本文作为参考的PCT公开号WO93/06213中描述的表位印记法。这种方法中4吏用的抗体文库是优选地如PCT公开号WOWO92/01047,McCafferty等人，A^w"348:552-554(1990);和Griffiths等人，12:725-734(1993)中描述制备和筛选的scFv文库，全部引入本文作为参考。scFv抗体文库优选使用人ErbB2作为抗原进行筛选。一旦选择了起始人Vl和VH结构域，就进行"混合和匹配"实验，其中不同对的起始选择的VL和VH区段就ErbB2结合进行筛选，以选择优选的V:7VH对组合。此外，为了进一步改善抗体的质量，优选的VL/VH对的Vl和VH区段可以进行随机突变，优选在Vh和/或Vl的CDR3区中，在类似于在天然免疫应答过程中负责抗体的亲和力成熟的体内体细胞突变过程的过程中。这种体外亲和力成熟可以通过使用分别与VHCDR3或VLCDR3互补的PCR引物扩增Vh和VL结构域来完成，所述引物已在某些位置处用4种核苷酸碱基的随机混合物"掺料"，从而使得所得到的PCR产物编码随机突变已引入Vh和/或VLCDR3区内的Vh和Vi^区段。这些随机突变的Vh和V^区段可以就与ErbB2的结合进行重新筛选。从重组免疫球蛋白展示文库中筛选和分离本发明的抗ErbB2抗体后，可以从展示包中(例如从噬菌体基因组中)回收编码所选择的抗体的核酸，且通过标准重组DNA技术亚克隆到其他表达载体内。若需要，那么核酸可以进一步进行处理以生成本发明的其他抗体形式，如下所述。为了表达通过筛选组合文库分离的重组人抗体，将编码抗体的DNA克隆到重组表达载体内且引入哺乳动物宿主细胞内，如上所述。本发明的另一个方面提供了用于将抗ErbB2抗体的种类或亚类转变成另一个种类或亚类的方法。在一些实施方案中，不包括编码CL或CH的序列的编码V^或VH的核酸分子使用本领域众所周知的方法进行分离。随后使核酸分子与编码来自所需免疫球蛋白种类或亚类的Cl或Ch的核苷酸序列可操作地连接。这可以使用包含Cl或CH链的载体或核酸分子来实现，如上所述。例如，最初为IgM的抗ErbB2抗体可以类别转换成IgG。此外，类别转换可以用于将一个IgG亚类转变成另一个，例如从IgGl到IgG2。用于产生包含所需同种型的本发明的抗体的另一种方法包括下述步骤分离编码抗ErbB2抗体的重链的核酸和编码抗ErbB2抗体的轻链的核酸，分离编码VH区的序列，使VH序列与编码所需同种型的重链恒定结构域的序列连接，在细胞中表达轻链基因和重链构建体，和收集具有所需同种型的抗ErbB2抗体。炎戎谬應^i^ft/ez'wmwm'zec/J在本发明的另一个方面，抗体可以使用例如PCT公开号W098/52976和WO00/34317(引入本文作为参考)中描述的技术进行脱免疫以减少其免疫原性。爽fW拔傳在另一个实施方案中，核酸分子、载体和宿主细胞可以用于制备突变的抗ErbB2抗体。抗体可以例如在重和/或轻链的可变结构域中进行突变，以改变抗体的结合性质。例如，突变可以在一个或多个CDR区中进行，以增加或减少抗体对于ErbB2的KD,以增加或减少k。ff,或改变抗体的结合特异性。位点定向诱变中的技术是本领域众所周知的。参见，例如Sambrook等人和Ausubel等人，同上。在另一个实施方案中，一个或多个突变在这样的氨基酸残基处进行，所述氨基酸残基与抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3中的种系相比较已知是改变的。突变可以在可变结构域的CDR区或构架区或恒定结构域中进行。在另一个实施方案中，突变在可变结构域中进行。在一些实施方案中，一个或多个突变在这样的氨基酸残基处进行，所述氨基酸残基与选自SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42和44的或其核苷酸序列呈现在SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43中的氨基酸序列的可变结构域的CDR区或构架区中的种系相比较已知是改变的。在另一个实施方案中，构架区这样突变，从而使得所得到的构架区具有相应的种系基因的氨基酸序列。突变可以在构架区或恒定结构域中进行，以增加抗ErbB2抗体的半衰期。参见，例如，引入本文作为参考的PCT公开号WO00/09560。还可以进行构架区或恒定结构域中的突变，以改变抗体的免疫原性，提供用于与另一种分子共价或非共价结合的位点，或改变诸如补体结合、FcR结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的性质。根据本发明，单个抗体可以具有在可变结构域的任何一个或多个CDRs或构架区或恒定结构域中的突变。在一些实施方案中，与突变前的抗ErbB2抗体相比较，在突变的抗ErbB2抗体的Vh或ViJ吉构域中存在1-8个，包括其中的任何数目的氨基酸突变。在上述的任何一种中，突变可以在一个或多个CDR区中发生。此外，任何突变都可以是保守氨基酸置换。在一些实施方案中，在恒定结构域中存在仅仅5、4、3、2或1个氨基酸改变。经修谬的我#在另一个实施方案中，可以制备包含与另一种多肽连接的本发明抗ErbB2抗体的全部或部分的融合抗体或免疫粘附素。在另一个实施方案中，仅抗ErbB2抗体的可变结构域与多肽连接。在另一个优选实施方案中，抗ErbB2抗体的VH结构域与第一种多肽连接，而抗ErbB2抗体的VL结构域与第二种多肽连接，所述第二种多肽以这样的方式与第一种多肽结合，从而使得Vh和VL结构域可以彼此相互作用以形成抗原结合部位。在另一个优选实施方案中，VH结构域通过接头与VL结构域分开，从而使得Vh和VL结构域可以彼此相互作用(参见下文单链抗体下)。VH-接头-VL抗体随后与目的多肽连接。融合抗体用于将多肽导向ErbB2表达细胞或组织。多肽可以是治疗剂，例如毒素、生长因子或其他调节蛋白质，或可以是诊断剂，例如可以容易显现的酶，例如辣根过氧化物酶。此外，可以生成其中2个(或更多)单链抗体彼此连接的融合抗体。如果人们希望在单条多肽链上生成二价或多价抗体，或如果人们希望生成双特异性抗体，那么这是有用的。为了生成单链抗体(scFv)，使编码Vh和Vl的DNA片段与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一个片段可操作地连接，从而使得Vh和VL序列可以作为邻接的单链蛋白质进行表达，其中VL和VH结构域由柔性接头连接。参见，例如，Bird等人，242:423-426(1988);Huston等人，A^/.爿cadV&485:5879-5883(1988);McCafferty等人，A^wre348:552-554(1990)。单链抗体可以是单价的，如果仅使用单个Vh和Vt的话，二价的，如果使用2个VH和VL的话，或多价的，如果使用超过2个Vh和V^的话。可以产生与ErbB2和另一种分子特异性结合的双特异性或多价抗体。在其他实施方案中，使用抗ErbB2抗体编码核酸分子可以制备其他经修饰的抗体。例如，"k体(Kappabodies)"(Ill等人,尸她w10:949隱57(1997))、"微型抗体"(Martin等人，EM5(9,/.13:5303-9(1994))、"双抗体，，(Holliger等人，TVoc.A^/.爿cad"&490:6444-6448(1993))、或"Janusins"(Traunecker等人，五A/B(9丄10:3655-3659(1991)和Traunecker等人，丄C"膨r(Suppl.)7:51-52(1992))双特异性抗体或抗原结合片段可以通过多种方法来产生，包括杂交瘤的融合或Fab，片l殳的连4妾。参见，例如，Songsivilai&Lachmann，C/,'".￡jcp./mwwwo/.79:315-321(1990),Kostelny等人，丄/mwwo/.148:1547-1553(1992)。此外，双特异性抗体可以作为"双抗体"或"Janusins"形成。在一些实施方案中，双特异性抗体与ErbB2的2个不同表位结合。在一些实施方案中，双特异性抗体具有来自抗体1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1,20、1.39、1.24和1.71.3的第一种重链和第一种轻链以及另外的抗体重链和轻链。在一些实施方案中，另外的轻链和重链也来自上文鉴定的单克隆抗体之一，但不同于第一种重和轻链。在一些实施方案中，使用来自本文提供的人抗ErbB2单克隆抗体的一个或多个可变结构域或CDR区制备上文描述的经修饰的抗体。本发明的抗体还包含在哺乳动物优选人中具有超过未经修饰的抗体的那种的半衰期(例如血清半衰期)的抗体。在一个实施方案中，所述抗体半衰期超过约15天，超过约20天，超过约25天，超过约30天，超过约35天，超过约40天，超过约45天，超过约2个月，超过约3个月，超过约4个月，或超过约5个月。本发明的抗体或其片段在哺乳动物优选人中增加的半衰期导致所述抗体或抗体片段在哺乳动物中更高的血清滴度，且因此减少所述抗体或抗体片段的施用频率和/或减少待施用的所述抗体或抗体片段的浓度。具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可以通过本领域技术人员已知的技术来产生。例如，具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可以通过修饰(例如，置换、缺失或添加)氨基酸残基来产生，所述氨基酸残基鉴定为涉及Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用(参见，例如，国际公开号WO97/34631和WO02/060919,其整体引入本文作为参考)。具有增加的体内半衰期的抗体或其片段可以通过使所述抗体或抗体片段附着聚合分子例如高分子量聚乙二醇(PEG)来产生。PEG可以与含或不含多功能接头的所述抗体或抗体片段附着，其通过PEG与所述抗体或抗体片段的N或C末端的位点特异性缀合或经由赖氨酸残基上存在的s-氨基。将使用导致生物活性最低限度的丧失的线性或分支聚合物衍生。缀合程度将通过SDS-PAGE和质谱分析法紧密监控，以确保PEG分子与抗体的正确缀合。未反应的PEG可以通过例如大小排阻或离子交换层析与抗体-PEG缀合物分开。抗原结合部位可以借助于下述来提供在非抗体蛋白质支架例如纤连蛋白或细胞色素B等上安排CDRs(Haan&Maggos(2004)BioCentury,12(5):Al-A6;Koide等人(1998)JournalofMolecularBiology,284:1141-1151;Nygren等人(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,7:463-469),或通过使蛋白质支架内的环的氨基酸残基随机化或突变以赋予对于所需靶的结合特异性。用于人工改造蛋白质中的新结合位点的支架已由Nygren等人(Nygren等人(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,7:463-469)详细综述。用于抗体模拟物的蛋白质支架公开于WO/0034784中，所述文献整体引入本文作为参考，其中发明人描述了包括具有至少1个随机化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白质(抗体^t拟物)。在其内嫁接一个或多个CDRs例如HCDRs组的合适的支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供。支架可以是人或非人蛋白质。非抗体蛋白质支架的优点是它可以提供支架分子中比至少一些抗体分子更小和/或更易于制备的抗原结合部位。结合成员的小尺寸可以赋予有用的生理学性质，例如进入细胞、深度透入组织内或达到其他结构内的耙，或在耙抗原的蛋白质腔内结合的能力。抗原结合部位在非抗体蛋白质支架中的使用在Wess,2004(Wess,L.In:BioCentury，TheBernsteinReportonBioBusiness,12(42),Al-A7，2004)中综述。一般是具有稳定的主链和一个或多个可变环的蛋白质，其中一个或多个环的氨基酸序列特异性或随机突变，以生成结合把抗原的抗原结合部位。此种蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的A蛋白的IgG-结合结构域、运铁蛋白、清蛋白、四连蛋白、纤连蛋白(例如第10个纤连蛋白III型结构域)、脂质运载蛋白以及"结晶和其他AffilinTM支架(ScilProteins)。其他方法的例子包括基于大环寡肽(cyclotide)的合成"微体"-具有分子内二硫键的小蛋白质、微量蛋白(Microproteins)(VersabodiesTM,Amunix)和4苗蛋白重复蛋白质(DARPins,MolecularPartners)。除了抗体序列和/或抗原结合部位外，根据本发明的靶向结合剂可以包含其他氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折叠结构域，或赋予分子除结合抗原的能力外的另一种功能特征。本发明的靶向结合剂可以携带可检测标记，或可以与毒素或靶向部分或酶缀合(例如经由肽基键或接头)。例如，耙向结合剂可以包含催化位点(例如，在酶结构域中)以及抗原结合部位，其中抗原结合部位与抗原结合且因此使催化位点靶向抗原。催化位点可以抑制抗原的生物功能，例如通过切割。衍々标记^拔#本发明的抗ErbB2抗体或抗原结合部分可以衍生或与另一种分子(例如另一种肽或蛋白质)连接。一般而言，抗体或其部分这样衍生，从而使得ErbB2结合不受衍生或标记不利地影响。因此，本发明的抗体和抗体部分预期包括本文描述的完整和经修饰形式的人抗ErbB2抗体。例如，本发明的抗体或抗体部分可以与一种或多种其他分子实体功能连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)，所述分子实体例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、检测试剂、细胞毒剂、药物试剂和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子的结合的蛋白质或肽(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标记)。一种类型的衍生抗体通过使2种或更多抗体(相同类型或不同类型，例如以制备双特异性抗体)交联来产生。合适的交联剂包括异双功能、具有由合适的间隔基分开的2个不同的反应基团(例如间马来酰亚胺苯曱酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)的那些。此种接头可从PierceChemicalCompany,Rockford，Il获得。另一种类型的衍生抗体是标记的抗体。本发明的抗体或抗原结合部分可以由其衍生的有用的检测剂包括荧光化合物，包括焚光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二曱胺-l-萘(napthalene)磺酰氯、藻红蛋白、镧系元素磷光体等。抗体还可以用对于检测有用的酶进行标记，例如辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶等。当抗体用可斥全测的酶进行标记时，它通过添加酶用于产生可以分辨的反应产物的另外试剂进行检测。例如，当试剂辣根过氧化物酶存在时，过氧化氬和二氨基联苯胺的添加导致可检测的有色的反应产物。抗体还可以用生物素进行标记，并且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。抗体还可以用由次级报道分子识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合部位、金属结合结构域、附加表位)进行标记。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂进行附着以减少潜在的位阻。抗ErbB2抗体还可以用放射性标记的氨基酸进行标记。放射性标记可以用于诊断和治疗用途。例如，放射性标记可以通过x射线或其他诊断技术用于检测ErbB2表达细胞。此外，放射性标记可以在治疗上用作毒素用于ErbB2表达细胞，例如引起不希望有的免疫应答的那些。用于多肽的标记的例子包括但不限于，下述放射性同位素或放射性核素3H、14C、15N、35S、90Y、"Tc、川In、125I和131I。在一些实施方案中，抗ErbB2抗体可以用在成^^后可^f企测的顺^磁、放射性或荧光离子进行标记。在一些实施方案中，顺磁离子是铬(m)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、礼(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或饵(III)。在其他实施方案中，放射性离子是碘123、锝99、铟111、铼188、铼186、铜67、碘131、钇90、碘125、砹211和镓67。在其他实施方案中，抗ErbB2抗体用X射线显像剂例如镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)进行标记。抗ErbB2抗体还可以用化学基团例如聚乙二醇(PEG)、曱基或乙基、或碳水化合物基团进行衍生。这些基团用于改善抗体的生物学特征，例如增加血清半衰期或增加组织结合。药物组合物和试剂盒本发明涉及用于治疗需要治疗程序的受试者的包含具有拮抗剂性质的耙向结合剂和/或人抗ErbB2抗体的组合物，所述受试者包括但不限于被癌症折磨的那些。在一些实施方案中，治疗的受试者是人。在其他实施方案中，受试者是兽医学受试者。治疗可以涉及单独或连同药学上可接受的载体的本发明的一种或多种抑制性抗ErbB2单克隆抗体、或其抗原结合片段的施用。本发明的抑制性抗ErbB2抗体和包含其的组合物可以与一种或多种其他治疗、诊断或预防试剂组合使用。在某些实施方案中，公开的治疗剂可以包括抗肿瘤剂。抗肿瘤剂包括但不限于基于柏的试剂，例如卡柏和顺辆；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷化剂，例如卡莫司汀(BCNU)和其他烷化剂；抗代谢物，例如氨曱蝶呤；噪呤类似物抗代谢物；嘧啶类似物抗代谢物，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨；激素抗胂瘤剂，例如性瑞林、醋酸亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗肿瘤剂，例如紫杉烷(例如多西他赛和紫杉醇)、阿地白介素、白细胞介素-2、依托泊苷(VP-16)、干扰素a和维曱酸(ATRA);抗生素天然抗肿瘤剂，例如博来霉素、更生霉素、柔红霉素、阿霉素和丝裂霉素；和长春花生物碱天然抗肺瘤剂，例如长春碱和长春新碱。在各种实施方案中，抗肿瘤剂是5-氟尿嘧啶、6-巯基。票呤(6-mercatopurine)、放线菌素、Adriamycin、Adrucil、氨鲁米特、阿那曲。坐、Aredia、Arimidex、Aromasin、Bonefos、十專来霉素、卡铂、放线菌素C(Cactinomycin)、卡培他滨、顺铂、骨膦、环磷酰胺、Cytadren、Cytoxan、放线菌素D、多西他赛、Doxyl、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、依西美坦、Femam、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、Halotestin、Herceptin、来曲唑、亚叶酸钙、Megace⑧、醋酸曱地孕酮、氨曱蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、Mutamycin、Navelbine⑧、Nolvadex、No穆trone⑧、Oncovin、Ostac⑧、紫杉醇、氨轻二磷酸二钠、Pharmorubicin、Platinol、泼尼松、Procytox⑧、Tamofen、Tamone、Tamoplex、他莫昔芬、Taxol、Taxotere⑧、司待曼布、遂替哌、Velbe⑧、Vepesid⑧、长春碱、长春新碱、长春烯碱、Xdoda⑧或其组合。在一些实施方案中，抗肺瘤剂包含单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或抗体的片段。示例性抗体包括但不限于，Rituxan、IDEC-C2B8、抗-CD20Mab、Panorex、3622W94、在腺癌上的抗-EGP40(17-1A)泛癌抗原(pancarcinomaantigen)Herceptin、Erbitux、抗-Her2、抗-EGFr、BEC2、抗-独特型-GD3表位、Ovarex、B43.13、抗-独特型CA125、4B5、抗-VEGF、RhuMAb、MDX-210、抗-HER2、MDX-22、MDX-220、MDX-447、MDX誦260、抗-GD-2、Quadramet、CYT画424、IDEC-Y2B8、Oncolym、Lym-l、SMARTM195、ATRAGEN、LDP-03、抗-CAMPATH、iort6、抗CD6、MDX-ll、OV103、Zenapax、抗-Tac、抗-IL-2受体、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、抗-组蛋白、Gliomab誦H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA676、Monopharm-C、抗陽FLK-2、SMART1D10、SMARTABL364、ImmuRAIT-CEA或其组合。在另外一个实施方案中，抗肿瘤剂包含另外类型的肿瘤细胞。在具体实施方案中，另外类型的肿瘤细胞是MCF-10A、MCF-10F、MCF-10-2A、MCF-12A、MCF-12F、ZR-75-l、ZR-75-30、UACC曙812、UACC-893、HCC38、HCC70、HCC202、HCC1007BL、HCC1008、HCC1143、HCC1187、HCC1187BL、HCC1395、HCC1569、HCC1599、HCC1599BL、HCC1806、HCC1937、HCC1937BL、HCC1954、HCC1954BL、HCC2157、Hs274.T、Hs281.T、Hs343.T、Hs362.T、Hs574.T、Hs579.Mg、Hs605.T、Hs742.T、Hs748.T、Hs875.T、MB〗57、SW527、184A1、184B5、MDA-MB-330、MDA-MB-415、MDA-MB-435S、MDA-MB-436、MDA画MB-453、MDA-MB-468RT4、BT-474、CAMA-1、MCF7[MCF-7]、MDA-MB-134画VI、MDA-MB-157、MDA-MB-175-VIIHTB-27MDA-MB-361、SK-BR-3或ME-180纟田胞，所有这些可从ATCC获得。在再进一步的实施方案中，抗肿瘤剂包含反义试剂，例如siRNA或发夹RNA分子，其减少在癌细胞中表达的基因的表达或功能。可以使用的示例性反义试剂包括针对粘蛋白、Ha-ras、VEGFR1或BRCA1的那些。此种试剂在美国专利号6,716,627(粘蛋白)、6,723,706(Ha-ras)、6,710,174(VEGFR1)以及美国专利公开号2004/0014051(BRCA1)中得到描述。在进一步的实施方案中，抗肿瘤剂包含受试者自体的细胞，例如免疫系统的细胞例如巨噬细胞、T细胞或树突。在一些实施方案中，细胞已用抗原例如肽或癌抗原进行处理，或已与来自患者的肿瘤细胞进行温育。在一个实施方案中，自体外周血淋巴细胞可以与SV-BR-1细胞混合且施用于受试者。此种淋巴细胞可以通过白细胞提取法(leukaphoresis)进行分离。可以使用的合适的自体细胞、关于其分离的方法、修饰所述细胞以改善其效力的方法和包含所述细胞的制剂在美国专利号6,277,368、6,451,316、5,843,435、5,928,639、6,368，593和6,207,147中以及国际PCT公开号WO04/021995和WO00/57705中得到描述。在本文描述的涉及癌症治疗的方法的一些实施方案中，受试者在用本发明的细胞治疗之前、同时或之后用针对癌症的辅助疗法进行治疗，所述辅助疗法例如外科手术、化学疗法、放射疗法或激素疗法或其组合。在其中癌症是乳腺癌的具体实施方案中，辅助疗法可以包含乳房保留外科手术(breast-sparingsurgery)，即去除癌症而不是乳房的手术，也称为乳房保留外科手术、乳房保存外科手术、乳房肿瘤切除术、乳房部分切除术、或部分乳房切除术。在另一个实施方案中，它包含乳房切除术。乳房切除术是去除乳房或尽可能多的乳房组织，并且在一些情况下还去除腋下的淋巴结的手术。在另外一个实施方案中，外科手术包含警戒淋巴结活组织检查，其中去除仅一个或少数淋巴结(警戒淋巴结)而不是去除更大量的腋下淋巴结。外科手术还可以包含改良彻底乳房切除术，其中外科医生去除整个乳房、腋下的大多数或所有淋巴结、和通常胸肌上的衬里。还可以去掉2个胸肌中的较小的以使得易于去除淋巴结。在具体实施方案中，辅助疗法包含放射疗法。放射疗法可以包含外照射，其中放射来自机器，或来自内照射(植入放射，其中放射源自直接放入乳房中的薄塑料管中放置的放射性材料。在另一个具体实施方案中，辅助疗法包含化学疗法。发现在肿瘤抑制中有帮助的化学治疗剂包括但不限于烷化剂(例如氮芥)、抗代谢物(例如嘧咬类似物)、放射性同位素(例如磷和碘)、混杂试剂(例如取代尿素)和自然产物(例如长春花生物碱和抗生素)。在具体实施方案中，化学治疗剂选自别嘌醇钠、甲磺酸多拉司琼、帕米膦酸钠、依替膦酸钠、氯康唑、阿法依伯汀、盐酸左旋咪唑、氨磷丁、盐酸格雷西隆、亚叶酸钙、沙格司亭、屈大麻酚、美司钠、非格司亭、盐酸匹鲁卡品、乙酸善锝定、右雷佐生、盐酸奥丹西隆、奥丹西隆、白消安、卡铂、顺铂、P塞替哌、盐酸美法仑、美法仑、环磷酰胺、异环磷酰胺、笨丁酸氮芥、盐酸氮芥、卡莫司汀、罗莫司丁、具有卡莫司汀植入的聚苯丙生20(polifeprosan20)、链脲霉素、盐酸阿霉素、硫酸博来霉素、盐酸柔红霉素、放线菌素D、柠檬酸柔红霉素(daunorucbicincitrate)、盐酸去甲柔毛霉素、plimycin、丝裂霉素、喷司他丁、米托蒽醌、戊柔比星、阿糖胞苷、磷酸氟达拉滨、氟尿苷、克拉屈滨、氨曱蝶呤、巯基嘌呤(mercaptipurine)、硫鸟嘌呤、卡培他滨、曱基睾酮、尼鲁米特、睾内酯、比卡鲁胺、氟他胺、阿那曲唑、柠檬酸托瑞米芬、雌氮芥磷酸钠、炔雌醇、雌二醇、酯化雌激素、缀合雌激素、醋酸亮丙瑞林、醋酸性瑞林、醋酸曱羟孕酮、醋酸甲地孕酮、盐酸左旋咪唑、阿地白介素、盐酸依立替康、达卡巴溱、天冬酰胺酶、磷酸依托泊芬、盐酸吉西他滨、六甲密胺、盐酸拓朴替康、羟基脲、干扰素a-2b、米托坦、盐酸丙卡巴肼、长春瑞宾、大肠杆菌L-天冬酰胺酶、欧文氏菌属(Erwinia)L-天冬酰胺酶、石克酸长春新石咸、地尼白介素(denileukindiftitox)、阿地白介素、利妥希玛、干扰素a-2a、紫杉醇、多西他赛、活BCG(膀胱内的)、硫酸长春碱、依托泊苷、维曱酸、替尼泊苷、卟吩姆钠、氟尿嘧啶、倍他米松磷酸酯钠和醋酸倍他米松、来曲唑、依托泊苷亚叶酸钙(citrororumfactor)、亚叶酸、亚叶酸4丐(calciumleucouorin)、5画氟尿嘧。定(5-fluorouncil)、亚得里亚霉素、环磷酰胺和双氯双氨铂(diaminodichloroplatinum),所述化学治疗剂与胸腺素al组合以有效减少所述患者中的化学疗法的所述副作用的量施用。在另一个具体实施方案中，辅助疗法包含激素疗法。激素疗法可以包含药物例如他莫昔芬的使用，其可以阻断天然激素如雌激素或可以包含阻止雌二醇合成的芳香酶抑制剂。可替代的，激素疗法可以包含去除受试者的卵巢，特别是如果受试者是仍未经历绝经的女性的话。如本文所使用的，"药学上可接受的载体"意指生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的一些例子是水、盐水、磷酸緩沖盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的物质的另外例子是湿润剂或小量辅助物质例如湿润或乳化剂、防腐剂或緩沖剂，其增强抗体的贮存期限或效力。本发明的组合物可以为多种形式，例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式依赖于预期的施用方式和治疗应用。一般优选的组合物是可注射或可输注溶液的形式，例如类似于用于人的被动免疫接种的那些的组合物。优选的施用方式是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在另一个实施方案中，抗体经由静脉内输注或注射进行施用。在另一个优选实施方案中，抗体经由肌内或皮下注射进行施用。治疗组合物一般必须在制备和贮存条件下是无菌的且是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳、分散体、脂质体或适合于高药浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以根据需要通过将所需量的抗ErbB2抗体掺入具有上文列举的成分之一或组合的合适溶剂中进行制备，随后过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物内进行制备，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自上文列出的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何另外所需成分的粉末。溶液的正确的流动性可以通过下述得到维持，例如使用涂层例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需颗粒大小和使用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来达到，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。本发明的抗体可以通过本领域已知的多种方法进行施用，尽管对于许多治疗应用，优选的施用途径/方式是皮下、肌内或静脉内输注。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将依赖于所需结果而变。在某些实施方案中，抗体组合物活性化合物可以用载体进行制备，所述载体将保护抗体免于快速释放，例如控制释放制剂，包括植入片、经皮贴剂和微嚢化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚肝、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸、壳聚糖和藻酸盐。用于制备此种制剂的许多方法是受专利保护的或本领域技术人员一般已知的。参见，例如，SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems(J.R.Robinson,编辑,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978)。抗ErbB2抗体。抗ErbB2抗体可以以来自加压包或喷雾器的气溶胶喷雾呈递的形式方便地递送给受试者，其借助于合适的推进剂，例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来测定。可以配制包含化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物的用于在吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶嚢和药液筒。Dellamary等人，(2004)./Co",ra/;95(3):489-500描述了用于抗体的肺递送的制剂。本发明还提供了适合于通过口部粘膜施用的组合物，其包含本文描述的抗ErbB2抗体。口部跨粘膜递送指递送纟某介物跨过口腔、咽腔或食管中的粘膜的递送，且可以例如与其中药物的吸收在小肠中发生的传统的口部递送形成对比。因此，其中抗ErbB2抗体通过口、舌下、牙龈、咽和/或食管粘膜吸收的施用途径全都包含在"口部跨粘膜递送"内，如那个术语在本文使用的。对于通过跨粘膜粘膜施用，抗ErbB2抗体可以例如配制成口香糖(参见美国专利号5,711,961)或口腔含化片剂(参见例如美国专利号5,298,256)。本发明还提供了适合于通过阴道粘膜施用的组合物，其包含本文描述的抗ErbB2抗体。本发明的抗ErbB2抗体可以配制成阴道栓剂、泡沫、乳膏、片剂、胶囊、软膏或凝胶。在某些实施方案中，包含抗ErbB2抗体的药物组合物用适合于待渗透的跨粘膜屏障的渗透剂进行配制。此种渗透剂是本领域一般已知的，且包括例如用于跨粘膜施用胆盐和梭链孢酸衍生物。在某些实施方案中，本发明的抗ErbB2抗体例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载体口部施用。化合物(若需要则和其他成分)还可以封入硬或软壳明胶胶嚢中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于口部治疗施用，抗ErbB2抗体可以与赋形剂一起掺入，且以可摄取片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶嚢、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能必须用阻止其失活的材料包被化合物，或使化合物与阻止其失活的材料共施用。另外的活性化合物也可以掺入组合物内。在某些实施方案中，本发明的抑制性抗ErbB2抗体与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用，所述治疗剂例如上文列出的那些。此种组合疗法可能需要较低剂量的抑制性抗ErbB2抗体以及共施用的试剂，从而避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。本发明的抑制性抗ErbB2抗体和包含其的组合物还可以与其他治疗方案组合施用，特别是与外科放射学和/或化学疗法处理组合。本发明的组合物可以包括"治疗有效量"或"预防有效量"的本发明的抗体或抗原结合部分。"治疗有效量"指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和重量以及抗体或抗体部分在受试者中引发所需应答的能力的因素而变。治疗有效量还是其中治疗有利作用超过抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。"预防有效量"指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在疾病前或在疾病的较早阶段时在受试者中使用，所以预防有效量可以小于治疗有效量。剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答(例如治疗或预防应答)。例如，可以施用快速灌注剂，或可以随着时间过去施用几次分份剂量，或可以如由治疗状况的紧急指出的按比例减少或增加剂量。为了易于施用和剂量的一致性，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。如本文所使用的，单位剂型指作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量适合的物理上不连续的单位；每个单位包含经计算以与所需药物载体结合产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于本发明的单位剂型的规格由下述指出且直接依赖下迷(a)抗ErbB2抗体或其部分的独特特征和待达到的特定治疗或预防作用，和(b)配制这种抗体用于处理受试者中的敏感性的领域中固有的限制。制性范围是0.025-50mg/kg,更优选0.1-50mg/kg,更优选0.1-25、0.1-10或0.1-3mg/kg。在一些实施方案中，制剂包含在20mM柠檬酸钠，pH5.5、140mMNaCl和0.2mg/ml聚山梨醇酯80的緩沖液中的5mg/ml抗体。应当指出剂量值可以依赖于待緩和的状况的类型和严重度而变。应进一步理解对于任何特定受试者，特定剂量方案应根据个体需要和个人施用或监督组合物的施用的专业判断随着时间过去进行调整，并且本文阐述的剂量范围仅是示例性的且不意欲限制所要求保护的组合物的范围或实践。或包含此种抗体的组合物的试剂盒。除抗体或组合物外，试剂盒可以包括诊断或治疗剂。试剂盒还可以包括用于在诊断或治疗法中使用的说明书。在另一个实施方案中，试剂盒包括抗体或包含其的组合物和可以在下文描述的方法中使用的诊断剂。在另一个优选实施方案中，试剂盒包括抗体或包含其的组合物和可以在下文描述的方法中使用的一种或多种治疗剂。使用的诊断法在另一个方面，本发明提供了诊断法。抗ErbB2抗体可以用于在体外或体内检测生物样品中的ErbB2。在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断有此需要的受试者中ErbB2表达细胞的存在或位置的方法，其包括下述步骤将抗体施用到受试者内，通过定位抗体结合于何处来测定ErbB2在受试者中的表达，使受试者中的表达与正常参考受试者或标准的那种比较，且诊断细胞的存在或定位。抗ErbB2抗体还可以用作增歹直才示^己。抗ErbB2抗体可以在常规免疫测定中使用，包括但不限于ELISA、RIA、流式细胞术、组织免疫组织化学、蛋白质印迹或免疫沉淀。本发明的抗ErbB2抗体可以用于检测来自人的ErbB2。在另一个实施方案中，抗ErbB2抗体可以用于检测来自猕猴或恒河猴的ErbB2。在另一个实施方案中，抗ErbB2抗体可以用于检测来自啮齿类动物例如小鼠和大鼠的ErbB2。本发明提供了用于检测生物样品中的ErbB2的方法，其包括使生物样品与本发明的抗ErbB2抗体接触且检测结合的抗体。在一个实施方案中，抗ErbB2抗体用可^r测标记直接进行标记。在另一个实施方案中，抗ErbB2抗体(第一种抗体)是未标记的且可以结合抗ErbB2抗体的第二种抗体或其他分子是标记的。如本领域技术人员众所周知的，选择能够特异性结合特定物种和种类的第一种抗体的第二种抗体。例如，如果抗ErbB2抗体是人IgG，那么第二种抗体可以是抗人-IgG。可以与抗体结合的其他分子包括但不限于A蛋白和G蛋白，这两者都例如从PierceChemicalCo商购可得。关于抗体或第二抗体的合适的标记已在上文公开，且包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三漆基胺(dichlorotnazinylamine)荧光素、丹石黄酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；且合适的放射性材料的例子包括1251、1311、"S和3h。在其他实施方案中，ErbB2可以在生物样品中通过竟争免疫测定进行测定，其中利用用可检测物质标记的ErbB2标准和未标记的抗ErbB2抗体。在这种测定中，将生物样品、标记的ErbB2标准和抗ErbB2抗体组合，且测定与未标记的抗体结合的标记的ErbB2标准的量。生物样品中的ErbB2的量和与抗ErbB2抗体结合的标记的ErbB2标准的量成反比。人们可以使用上文公开的免疫测定用于许多目的。例如，抗ErbB2抗体可以用于4企测培养细胞中的ErbB2。在另一个实施方案中，抗ErbB2法可以用于鉴定调节ErbB2蛋白质水平的化合物。根据这种方法，一种细胞样品用测试化合物处理一段时间，而另一种样品不予处理。如果测量ErbB2的总水平，那么将细胞裂解且使用上文描述的免疫测定之一测量总ErbB2水平。比较处理对未处理细胞中的ErbB2的总水平以测定测试化合物的作用。用于测量总ErbB2水平的优选免疫测定是流式细胞术或免疫组织化学。如果测量ErbB2的细胞表面水平，那么细胞不被裂解，且使用上文描述的免疫测定之一测量ErbB2的细胞表面水平。用于测定ErbB2的细胞表面水平的优选免疫测定包括下述步骤用可^r测标记例如生物素或1251标记细胞表面蛋白质，用抗ErbB2抗体使ErbB2免疫沉淀且随后检测标记的ErbB2。用于测定ErbB2的定位例如细胞表面水平的另一种优选免疫测定是通过使用免疫组织化学。检测ErbB2的细胞表面水平的优选免疫测定包括用合适的荧光团例如荧光素或藻红蛋白标记的抗ErbB2抗体的结合，且使用流式细胞术检测第一抗体。在另一个实施方案中，抗ErbB2抗体是未标记的且可以结合抗ErbB2抗体的第二抗体或其他分子是标记的。方法例如ELISA、RIA、流式细胞术、蛋白质印迹、免疫组织化学、整合膜蛋白质的细胞表面标记和免疫沉淀是本领域众所周知的。参见，例如Harlow和Lane,同上。此外，免疫测定可以按比例扩大用于高通量筛选以就ErbB2的活化或抑制测试大量化合物。本发明的抗ErbB2抗体还可以用于测定组织或衍生自组织的细胞中的ErbB2的水平。在一个实施方案中，抗ErbB2抗体用于测定ErbB2表达细胞向组织内的浸润，所述组织不表达ErbB2或与浸润细胞相比较以减少水平表达其。在一些实施方案中，组织是患病组织。在一些实施方案中，组织是组织活组织检查。在该方法的一些实施方案中，从受试者中切除组织或其活组织检查。组织或活组织检查随后在免疫测定中用于通过上文讨论的方法测定例如总ErbB2水平、ErbB2的细胞表面水平或ErbB2的定位。此种方法可以用于测定组织是否表达高水平的ErbB2，这可以指示组织是用抗ErbB2抗体治疗的耙。一些实施方案中，抗ErbB2抗体用于鉴定ErbB2表达细胞。使用本发明的人抗ErbB2抗体的一个优点是它们可以在体内安全地使用，而不在施用后引发针对抗体的相当大免疫应答，这与非人起源的抗体或与人源化或嵌合抗体不同。该方法包括下述步骤给需要此种诊断测试的受试者施用可4企测标记的抗ErbB2抗体或包含其的组合物，且对受试者实施成像分析以测定ErbB2表达组织的位置。成像分析是医学领域众所周知的，且包括但不限于x射线分析、磁共振成像(MRI)或计算机断层摄影术(CT)。抗体可以用适合于体内成像的任何试剂进行标记，例如造影剂，例如钡，其可以用于x射线分析，或磁造影剂，例如钆螯合物，其可以用于MRI或CT。其他标记试剂包括但不限于放射性同位素例如"Tc。在另一个实施方案中，抗ErbB2抗体将是未标记的，且将通过施用可才企测且可以结合抗ErbB2抗体的第二种抗体或其他分子进行成像。在另一个实施方案中，从受试者获得活组织检查以测定目的组织是否表达ErbB2。在一些实施方案中，可检测标记的抗ErbB2抗体包含荧光团。在某些实施方案中，荧光团选自近红外线荧光染料、二硝基苯基、荧光素及其衍生物、罗丹明、罗丹明的衍生物、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛(o-phthaldehyde)和荧光胺、德克萨斯红、罗丹明绿(RhodamineGreen)、Oregon绿、Cascade蓝(CascadeBlue)、藻红蛋白、CY3、CY5、CY2、CY7、香豆素、红外线40、MR200、IRD40、AlexaFluor、Cascade蓝、四曱基罗丹明(Tetmmethylrhodamine)、太平洋蓝(PacificBlue)、SYBR和BODIPY。在另一个实施方案中，荧光团包括下述化合物之一，其最大发射在括号中以nm指出，Cy2(506)、GFP(红移的(RedShifted))(507)、YO-PRO-l(509)、YOYO-l(509)、Calcein(517)、FITC(518)、FluorX(519)、Alexa(520)、罗丹明110(520)、5画FAM(522)、OregonGreen500(522)、OregonGreen488(524)、RiboGreen(525)、RhodamineGreen(527)、罗丹明123(529)、MagnesiumGreen(531)、CalciumGreen(533)、T〇-PRO-l(533)、TOTO-l(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPY(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3(570)、Alexa546(570)、TRITC(572)、MagnesiumOrange(575)、藻红蛋白R&B(575)、罗丹明鬼笔环肽(RhodaminePhalloidin)(575)、CalciumOrange(576)、PyroninY(580)、罗丹明B(580)、TAMRA(582)、RhodamineRed(590)、Cy3.5(596)、ROX(608)、CalciumCrimson(615)、Alexa594(615)、TexasRed(615)、尼罗红(NileRed)(628)、YO-PRO-3(631)、YOYO⑧醫3(631)、R-藻蓝蛋白(642)、C-藻蓝蛋白(648)、TO-PRO-3(660)、TOTO-3(660)、DiDDilC(5)(665)、Cy5TM(670)、Thiadicarbocyanine(671)和Cy5.5(694)。使用的治疗方法在另一个实施方案中，本发明提供了通过给有此需要的受试者施用把向结合剂和/或抗ErbB2抗体用于抑制ErbB2活性的方法。在另一个实施方案中，抗ErbB2抗体是人、嵌合或人源化抗体。在另一个优选实施方案中，ErbB2是人的且受试者是人受试者。可替代地，受试者可以是表达耙向结合剂和/或抗ErbB2抗体与之交叉反应的ErbB2的哺乳动物。靶向结合剂和/或抗体可以施用于表达抗体与之交叉反应的ErbB2的非人哺乳动物(即猕猴)，用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。此种动物^t型可以用于评估本发明的抗体的治疗功效。在一个实施方案中，本发明提供了通过给受试者施用治疗有效量的本发明的靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体来治疗或预防受试者中ErbB2介导的病症的方法。如本文所使用的，术语"ErbB2介导的病症"意欲包括这样的疾病和其他病症，其中患有病症的受试者中高或增加水平的ErbB2表达或活性的存在已显示负责病症的病理生理学，或怀疑负责病症的病理生理学，或是或怀疑是有助于病症恶化的因素。此种病症可以通过例如下述得到证明在患有病症的受试者的受累细胞或组织中在细胞表面上ErbB2表达或水平中的增加，或有助于病症的病理学或有助于病症的恶化的细胞类型例如癌细胞中ErbB2介导的活性中的增加。ErbB2水平中的增加可以例如使用抗ErbB2抗体进行冲企测。ErbB2活性中的增加可以通过增加的ErbB2磷酸化、MAPK途径的活化、p38-TSP-l途径的活化、PI3K途径的活化、CDC2的抑制及其组合进行检测。本发明的另一个方面提供了用于抑制有此需要的受试者中表达ErbB2的癌细胞的增殖的方法，该方法包括给所述受试者施用耙向结合剂和/或抗ErbB2抗体或其抗原结合部分的步骤，其中所述靶向结合剂或抗体或部分抑制ErbB2。另一个方面提供了用于抑制表达ErbB2的细胞中的ErbB2活性的方法，其包括使细胞与耙向结合剂、抗ErbB2抗体或其抗原结合部分接触，其中细胞中的ErbB2活性选自(a)ErbB2的磷酸化；(b)MAPK途径的活化；(c)p38-TSP-l途径的活化；(d)PI3K途径的活化；(e)CDC2的抑制；和(f)其组合。在另一个实施方案中，细胞在受试者中。靶向结合剂和/或抗体可以施用l次，但更优选施用多次。耙向结合剂和/或抗体可以从每天施用3次到每6个月或更长时间施用1次。施用可以在下述时间表上，例如每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每3天1次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2月1次、每3月l次和每6月1次。靶向结合剂和/或抗体还可以经由微泵连续施用。靶向结合剂和/或抗体可以经由口部、粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、肌内、腹膜内、目艮内、脊柱内、肠胃外、粘膜内或局部途径进行施用。靶向结合剂和/或抗体可以局部或全身施用。包含靶向结合剂和/或抗ErbB2抗体的治疗组合物可以例如口部、经鼻、阴道、口腔、直肠、经由眼或经由肺途径以多种药学上可接受的给药形式施用于受试者，这将是本领域技术人员熟悉的。例如，抗ErbB2抗体可以经由鼻途径使用鼻吹入器装置进行施用。这些的例子已用于预期用于鼻应用的商业粉末系统(例如FisonsLomudalSystem)。其他设备的细节可以在药学文献中找到(参见例如Bell,A.IntranasalDeliverydevices，inDrugDeliveryDevicesFundamentalsandApplications,TyleP.(编辑)，Dekker,NewYork,1988)。抗ErbB2抗体可以在冷冻干燥粉末制剂中施用于阴道。抗ErbB2抗体可以在阴道敷料器中施用，且一旦在阴道中，包含抗ErbB2抗体的制剂就通过按压敷料器上的注射器型活塞或类似释放机制得到释放。可替代地，抗ErbB2抗体可以使用粉末设备配制成粉末，配制成阴道栓剂或阴道环或阴道片剂或阴道凝胶。抗ErbB2抗体还可以在凝胶制剂中施用于眼。例如，在施用前，包含抗ErbB2抗体的制剂可以方便地包含在2区室单位剂量容器中，一个区室包含冷冻干燥的抗ErbB2抗体制剂且另一个区室包含生理盐水。在应用前，使2个区室混合且形成凝胶，这随后施用于眼。吸入器经由肺途径，经由配制成片剂或口腔含化贴剂的口腔途径，经由配制成栓剂的直肠途径；和以片剂、胶嚢或小丸的形式经由口部途径(所述组合物可以经由胃、小肠或结肠施用试剂)，所有这些都可以依照本领域技术人员众所周知的技术进行配制。抗体一般将如上所述作为药物组合物的部分进行施用。抗体的剂量一般将是0.1-100mg/kg,更优选0.5-50mg/kg,更优选1-20mg/kg,且甚至更优选l-10mg/kg。抗体的血清浓度可以通过本领域已知的任何方法进行测量。抗体与另外的治疗剂的共施用(组合疗法)包含施用包含抗ErbB2抗体和另外的治疗剂的药物组合物以及施用2种或更多分开的药物组合物，一种包含抗ErbB2抗体且另一种或多种包含另外的治疗剂。此外，尽管共施用或组合疗法一般意指抗体和另外的治疗剂彼此同时使用，但它还包含其中抗体和另外的治疗剂在不同时候施用的情况。例如，抗体可以每3天施用l次，而另外的治疗剂每天施用1次。可替代地，抗体可以在用另外的治疗剂治疗病症之前或之后进行施用，例如在受试者具有用另外的试剂失败的疗法后。类似地，抗ErbB2抗体的施用可以在其j也疗法如免疫疗法之前或之后进4亍施用。抗体和一种或多种另外的治疗剂(组合疗法)可以施用1次、2次或至少直至状况被治疗、减轻或治愈的时间段。优选地，组合疗法施用多次。组合疗法可以从每天施用3次到每6个月施用l次。施用可以在下述时间表上，例如每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每3天1次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2月1次、每3月1次和每6月l次，或可以经由微泵连续施用。组合疗法可以经由口部、粘膜、口腔、鼻内、吸入、静脉内、皮下、眼内、脊柱内、腹膜内、肌内、肠胃外、粘膜内或局部途径进行施用。在再进一步的实施方案中，抗ErbB2抗体用放射性标记、免疫毒素或毒素进行标记，或是包含毒性肽的融合蛋白。抗ErbB2抗体或抗ErbB2抗体融合蛋白使放射性标记、免疫毒素、毒素或毒性肽导向ErbB2表达细胞。在另一个实施方案中，放射性标记、免疫毒素、毒素或毒性肽在抗ErbB2抗体与细胞表面上的ErbB2结合后内在化。基因疗法本发明的核酸分子可以经由基因疗法施用于有此需要的受试者。疗法可以在体内或先体外后体内。在另一个实施方案中，编码重链和轻链的核酸分子施用于受试者。在更优选的实施方案中，核酸分子这样施用，从而使得它们稳定整合到B细胞的染色体内，因为这些细胞特化用于产生抗体。在另一个实施方案中，前体B细胞先体外后体内进行转染或感染且重新移植入有此需要的受试者内。在另一个实施方案中，前体B细胞或其他细胞使用已知感染目的细胞类型的病毒在体内进行感染。用于基因疗法的一般载体包括脂质体、质粒和病毒载体。示例性病毒载体是逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒。在体内或先体外后体内感染后，抗体表达水平可以通过从处理的受试者中获取样品和使用本领域已知的或本文讨论的任何免疫测定进行监控。在另一个实施方案中，基因治疗方法包括施用编码抗ErbB2抗体的重链或其抗原结合部分的分离的核酸分子和表达核酸分子的步骤。在另一个实施方案中，基因治疗方法包括施用编码抗ErbB2抗体的轻链或其抗原结合部分的分离的核酸分子和表达核酸分子的步骤。在更优选的方法中，基因治疗方法包括施用编码本发明的抗ErbB2抗体的重链或其抗原结合部分的分离的核酸分子和编码本发明的抗ErbB2抗体的轻链或其抗原结合部分的分离的核酸分子和表达核酸分子的步骤。基因治疗方法还可以包括施用另一种治疗剂例如抗癌剂的步骤。为了使本发明可以更好地理解，阐述了下述实施例。这些实施例仅为了举例说明的目的且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例1免疫接种和滴定免疫接种包含人ErbB2的细胞外结构域和人IgGl的Fc区的重组人ErbB2-ECD/Fcryl融合蛋白4寻自R&DSystems,Inc.(Minneapolis,顧目录弁1129-ER/CF)用于作为免疫原使用。针对ErbB2的单克隆抗体通过经由足垫途径注射顺次免疫XenoMouse小鼠(XenoMousestrainXM3B-3,Abgemx，Inc.Fremont,CA)得到开发。第一次注射用每只小鼠在TitermaxGold(Sigma,目录#T2684,批次#K1599)中的10重组人ErbB2-ECD/Fcyl。随后的10次加强用每只小鼠在15^1qCpG(ImmunEasyMouseAdjuvant,目录#303101;Qiagen)中的10fxg重组人ErbB2-ECD/Fcyl,与5|xlAdju-Phos(磷酸铝凝胶，目录#1452-250,HCIBiosector)混合。每次注射的总体积是50inl/小鼠，25pl/足垫。小鼠每周免疫2次进行5周且在第39天时进行融合。通过滴度选择动物用于收获免疫的XenoMouse小鼠在第8次加强后放血，且通过FACS(荧光激活细胞分选仪)分析测定血清中的抗ErbB2抗体滴度。为了这个目的，构建人ErbB2表达载体且转染小鼠前BB300.19细胞以表达人ErbB2蛋白质。人ErbB2cDNA通过RT-PCR衍生自人表皮样癌A431细胞(ATCC,目录弁CRL-1555),且通过HindIII和Notl内切核酸酶限制切割位点克隆到pCR3.1表达载体(Invitrogen，目录#K3000)内。表达载体包含编码全长人ErbB2的3768bp的插入片段。使用电穿孔法将上述质粒转染到B300.19细胞内。表达hErbB2蛋白质的稳定的B300.19克隆在。票呤霉素(2.5ug/ml)的存在下进行选择，且然后通过FACS用嵌合抗-hErbB2抗体(在本文中称为2C4，如CancerImmunol.Immunotherapy(2006)55:717-727中详述制备，名称为"HumanizationofarecombinantmonoclonalantibodytoproduceatherapeuticHERdimenzationinhibitor,pertuzumab")随后为山羊4元小鼠IgGPE(Caltag,目录存M30004-4)进行筛选。选择在FACS中给出最高Geomean的B300.19/hErbB2克隆#44用于血清滴度测定。来自免疫和放血小鼠的血清在FACS緩沖液(含2%FBS的PBS)中以1:50、1:250或1:1250稀度进行滴定。B300.19/hErbB2克隆弁44细胞(阳性细胞)和B300.19亲本细胞(阴性细胞)与连续稀释的血清温育1小时，且随后与Cy5-缀合的山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearchLabs/JIR,目录#109-176-098)温育另夕卜30分钟。抗ErbB2mAb2C4用作阳性对照，而内部(Gmix)产生的抗KLHGl抗体用作G1同种型对照。彻底洗涤后，将细胞重悬浮于FACS緩沖液中且在BDFACS仪器上进行分析。每种样品的Geomean在数据分析后进行测定且显示于下表2中。关于ErbB2阳性细胞的Geomean超过关于ErbB2阴性细胞的Geomean的比与针对ErbB2的特异性结合能力关联。阴性对照包括单独的Gl同种型对照抗KLHGmix、第二对照抗体山羊抗小鼠IgGCy5(JIR,目录#115-176-071)和山羊抗人IgGPE，给出小于1的Geomean比。然而阳性对照mAb2C4和来自所有10只免疫小鼠的血清给出2.98-7.55的比，因此所有小鼠都发展出针对人ErbB2的体液免疫应答。表2.血清滴度10只小鼠(XM3B-3品系)<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>实施例2淋巴细胞的回收、B细胞分离、融合和杂交瘤的产生从免疫小鼠中收获淋巴结(LN)且加工入3ml无菌FASC緩沖液(PBS,2%FBS)中。使LN细胞通过40nm细胞滤器过滤，以400g向下旋转(spindown)3分钟且重悬浮于3ml新鲜的FACS緩沖液中。计数细胞，且随后添加针对CD90(Pharmmgen,目录#553002)、CD4(Pharmingen,目录#553728)、CD8(Pharmingen,目录#553029)和IgM(Pharmingen，目录#555781)的生物素化的抗体。将细胞和上述抗体轻轻混合且在水上温育IO分钟。使细胞再次向下旋转且用FACS緩冲液洗涤1次。以4:1珠与靶细胞的比向细胞加入SADynal珠(M-280),且在室温下伴随旋转温育12分钟。将15ml管中的细胞/珠置于Dynal磁体的磁场中2分钟。将包含IgM-级分的上清液转移至新鲜管且将磁体步骤再重复1次。将细胞上清液转移至最后的管且计数IgM细胞且等分试样用于融合。融合通过使来自上文的洗涤的富集的B细胞和购自ATCC的非分泌骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞(目录#CRL1580)(Kearney等人，J.Immunol.123，1979,1548-1550)以1:1的比混合来进行。细胞混合物通过在800xg下离心轻轻形成沉淀。完全取出上清液后，细胞用2-4ml链霉蛋白酶(Pronase)溶液(Ca旧iochem,目录#53702;在PBS中0.5mg/ml)处理仅仅2分钟。随后加入3-5mlFBS以终止酶活性，且使用电促细胞融合溶液(ECFS:0.3M蔗糖、O.lmM乙酸镁、O.lmM乙酸钙，全部来自Sigma)将上清液调整至40ml总体积。离心后取出上清液且将细胞重悬浮于40mlECFS中。重复这个洗涤步骤且将细胞再次重悬浮于ECFS中至2xl06纟田胞/ml的浓度。4吏用融合发生器(型号ECM2001,Genetronic，Inc.，SanDiego，CA)根据标准仪器设置进行电促细胞融合。ECF后，从融合室中小心地取出细胞悬浮液且转移至包含相同体积的杂交瘤培养基的无菌管内，所述杂交瘤培养基包含DMEM(JRHBiosciences)、15%FBS(Hyclone)，补加有L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、OPI(草酰乙酸、丙酮酸、牛胰岛素)(全部来自Sigma)和IL-6(BoehringerMannheim)。细胞于37°C温育15-30分钟，且随后在400xg(1000rpm)下离心5分钟。随后将细胞轻轻重悬浮于杂交瘤选择培养基(补加有0.5xHA(Sigma,目录#A9666)的杂交瘤培养基)中,其基于总共2xl05B细胞/96孔板和200孔的最终铺平板。轻轻混合细胞且移液到96孔板内且允许生长。在第7或10天时，取出一半培养基，且细胞再补料杂交瘤选择培养基。实施例3通过FMAT/FACS筛选抗体在培养14天后，通过FMAT(荧光微体积测定技术(FluorometricMicrovolumeAssayTechnology))就ErbB2特异性抗体筛选杂交瘤上清液。简言之，使4275个B300.19/hErbB2(阳性细胞)或B300.19(ErbB2-阴性细胞)细胞与溶于15)ilFACS緩沖液中的400ng/mlCy5山羊抗人IgG(JIR，目录#109-176-098)混合，且随后与15pl杂交瘤上清液在室温下温育3小时。阳性对照抗体是抗hErbB2(2C4)，其用与SA-Cy5(JIR目录#016-170-084,350ng/ml)组合的Cy5山羊抗小鼠IgGy(JIR,目录#115-176-071)或山羊抗小鼠IgG-Biot(SouthernBiotechnology/SB目录#1030-08，400ng/ml)进行4全测。抗KLHGl抗体(Gmix,内部的)用作同种型对照。板在来自AppliedBiosystems的FMAT8100HTS系统上进行读数。在数据分析后测定荧光信号和计数，且鉴定了显示与ErbB2阳性细胞而不与阴性细胞结合的362个阳性杂交瘤。FMAT筛选中的362个阳性上清液通过FACS以2组进行进一步筛选，一組用于hlgG重链冲全测且另一组用于人Igk轻链;险测，以证实关于Igy和IgK链的全人组成。使2.5x105B300.19/hErbB2细胞或B300.19亲本细胞与在FACS緩沖液中以1:2稀释的杂交瘤上清液于4。C温育1小时，且随后用PBS进行洗涤。细胞随后与山羊抗人yCy5于4。C温育l小时用于Igy检测，或与山羊抗人kPE(SB目录#2063-09)于4。C温育1小时用于Igk检测。洗涤后，在FACS分析前使细胞在1%低聚甲醛/PBS中进行固定。1:50稀度的汇合血清用作阳性对照，而1:10稀释的Gmix(抗-KLHIgG)在测定中用作阴性同种型对照。阳性和阴性细胞之间的Geomean值的比进行制表且给出超过1.95的比的杂交瘤一见为命中(hit)。在这次筛选中证实了总共152种全人抗hErbB2IgG/k抗体。实施例4MCF7细胞中调蛋白-(3诱导的ErbB2磷酸化的抑制ErbB2通过与其他ErbB家族成员例如ErbB3二聚化在活化后是酪氨酸磷酸化的。与ErbB3结合的调蛋白-(3可以在人乳腺癌MCF7细胞中诱导ErbB2酪氨酸磷酸化，所述MCF7细胞表达ErbB2和ErbB3。为了鉴定阻断ErbB2活化的抗体，我们在基于细胞的ErbB2磷酸化测定中筛选了152种人ErbB2结合抗体。MCF7细胞以25,000细胞/孔接种在96孔板中且在完全生长培养基(10%FCS)中培养过夜。第二天，细胞培养板用PBS洗涤次，且用无酚红和无血清培养基替换培养基。细胞血清饥饿过夜，且随后在用10nM调蛋白-P处理IO分钟前，与和25|nl无酚红培养基混合的25^1杂交瘤上清液温育l小时。可替代地，细胞不血清饥饿但在调蛋白-(3处理前与杂交瘤上清液温育过夜(24小时)。为了制备细胞裂解物，细胞在水冷的PBS中洗涤2次，且与100^1/孔裂解緩沖液(50mMTris隱HClpH7.7、1%TrixtonX-IOO、10%甘油、100mMNaCl、2.5mMEDTA、10mMNaF、40ug/mlPMSF、luM胃酶抑制剂、0.5ug/ml亮抑酶肽、10ug/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、0.2mMNaV04、lmMNaMo04、5mMb-磷酸甘油)于4。C温育30分钟。磷-ErbB2水平使用来自R&Dsystems的人磷-ErbB2(Phosphor-ErbB2)ELISA试剂盒(人Phospho-ErbB2DuoSetIC,目录#DYC1768)根据所提供的规程进行测量。基于在不存在抗体的情况下未刺激的细胞和调蛋白刺激的细胞中的pErbB2水平计算抑制百分比。图1举例说明当它们与MCF7细胞预温育1小时对过夜温育24小时时，测试的152种抗体的中和活性的相关性。当细胞与上清液预温育l小时时，152种抗体中的51种给出超过30%的抑制。这些抗体可能通过阻断ErbB2与ErbB3的二聚化来抑制ErbB2磷酸化。当细胞与杂交瘤上清液预温育过夜时，明显更多的抗体显示超过30%的抑制。这些中的一些可能通过其他机制例如诱导ErbB2下调来达到这点。实施例5与CvnoErbB2的交叉反应性的测定为了测定这些抗体与非人灵长类动物猕猴ErbB2的物种交叉反应性，产生表达猕猴ErbB2的CH0-K1细胞。简言之，从猕猴卵巢组织获得cynoErbB2cDNA,且通过HindIII和Xbal限制性内切核酸酶位点克隆到pCR3.1表达载体内。包含3767bps的插入片段的表达载体cyno-ErbB2(FL)/pCr3.1使用Lipofectamine2000(Invitrogen,目录#11668)根据所提供的规程转染到CHO-kl细胞内。在lmg/ml的G418的存在下选择表达cyno-ErbB2的CHO-kl的稳定克隆。表达通过FACS使用小鼠抗人c-ErbB2/c-neu(Ab-2)(Oncogene,目录弁OP14)和山羊抗小鼠IgG-PE(Caltag,目录弁M30004-4)得到证实。CHO-Kl/cynoE4rbB2克隆#4用于测量人ErbB2结合抗体的交叉反应性。使200,000个CHO-Kl/cynoErbB2克隆#4或亲本CH0-K1细胞与1:2稀释的杂交瘤上清液或2|iig/ml阳性对照抗体Ab-2(Oncogene,目录弁OP14)于4。C温育1小时。细胞用PBS洗涤1次，且随后与第二检测抗体5pg/ml山羊抗人IgGCy5或山羊抗小鼠IgGCy5于4。C温育1小时。细胞用PBS洗涤3次，在r/。低聚曱醛/PBS中进行固定且随后通过FACS进行分析。对于每次染色，阳性和阴性细胞之间的Geomean值的比进行制表且超过1.95的比视为阳性的。发现8种抗体不与cynoErbB2交叉反应且从随后分析中排除。实施例6高抗原和有限抗原ELISAs表现cynoErbB2交叉反应性且当与细胞温育1小时或过夜时还显示ErbB2磷酸化^30。/。抑制的113种抗ErbB2抗体通过高抗原(HA)和有限抗原(LA)ELISAs进行进一步表征。HAELISA用包被在板上的高浓度的抗原来进行，并且是浓度依赖性反应；而LAELISA用包被在板上的有限量的抗原来进行，且因此是亲和力依赖性反应。可以由HA/LA分析达到抗体的相对亲和力分级。因为重组人ErbB2ECD-Fcyl融合蛋白不能用于这种目的，所以在内部产生人ErbB2ECD-myc/His融合蛋白。人ErbB2/ECDcDNA得自A431细胞，且通过Nhel和Xhol限制性内切核酸酶切割位点克隆到pSecTag2Hygro表达载体(Invitrogen，目录弁V910-20)内。表达载体huErbB2(ECD)/pSecTag2BHygro包含对于仅ErbB2(ECD)1956bp的插入片段大小和对于hErbB2(ECD)力口c-myc/His标记2034bp的插入片段大小。质粒使用293fectin(Invitrogen目录#12347-019)瞬时转染到293T悬浮细胞内。细胞在转染后用丁酸钠处理1天以加强表达水平。转染后4天，上清液在纯化前就ErbB2(ECD)表达进行测试。对于ELISA检测,1pg/ml山羊抗ErbB2(R&Dsystems,目录弁AF1129)用于包被板，lpg/ml小鼠抗ErbB2(R&Dsystems,目录#MAB1129)是第一检测抗体且第二抗体是山羊抗小鼠IgG-HRP(Caltag，目录#M30107)。收获上清液且浓缩5倍，且随后过夜透析到透析緩沖液(50mMNaH2P04，pH8,200mMNaCl)内。向上清液中加入咪唑至5mM的终浓度，并且使上清液与1/100体积的Ni-NTAsuperflow树脂混合物(Qiagen,目录#30430)在RT下温育3小时。树脂用包含50mMNaHP04、300mMNaCl和20mM咪唑的緩沖液进行洗涤，且随后用包含250mM咪唑、50mMNaHP04和300mMNaCl的洗脱緩沖液进行洗涤。纯化的蛋白质最后透析到PBS内以保存活性。纯化的蛋白质huErbB2(ECD)/c-myc-His具有655AAs,具有72.2kDa的理论MW,在4-20。/oTris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上运行到100kDa左右。蛋白质特性通过蛋白质印迹使用小鼠单克隆抗ErbB2(R&Dsystems,目录存MAB1129)随后为第二山羊抗小鼠IgG-HRP(Caltag，目录弁M30107)加以证实。对于HA,将溶于PBS中的Ojig/ml人ErbB2ECD-myc/His包被在ELISA板上于4。C过夜。对于LA,包被100、500、250、125、62和31ng/ml人ErbB2ECD-myc/His。将抗原包被的板洗涤3次，用1%脱脂乳/PBS在室温下封闭至少30分钟，且随后再洗涤3次。每个杂交瘤系样品在1。/o脱脂乳/PBS1:3中滴定，进行从1:25稀释开始的7个点。将连续稀释的杂交瘤样品或对照(Herceptin)转移至HA包被的板，且将l:25稀释的杂交瘤样品转移至LA包被的板。样品在板上在室温下温育过夜进行18.5小时。第二天，将板洗涤3次且与50)iil400ng/ml免疫纯的(immunopure)山羊抗人IgG(Fc)-HRP(Pierce目录#31416)在室温下温育l小时。随后，将板彻底洗涤且在纸巾上拍干以去除孔中残留的HRP。向每个孔中加入HRP底物TMB(增强的K-blueTMB，Neogen目录#308177)且温育30分钟。反应通过添加INHC1得到终止。在微量培养板阅读仪(TiterteckMultiskanAscent)上阅读在450nm处的光密度。杂交瘤上清液中ErbB2特异性抗体的浓度得自用已知浓度的Herceptin⑧在HAELISA中产生的标准曲线。对于每个杂交瘤样品将31ng/ml抗原时的LAOD信号针对来自HA的抗体浓度进行绘图，如图2中所示。与该图中右下角中的抗体相比较，左上角中的抗体具有相对高的亲和力。实施例7杂交瘤克隆基于来自cyno交叉反应性测试、ErbB2磷酸化抑制的测定和LA/HAELISAs的数据，选择31个杂交瘤系用于克隆。它们的活性概括于表3中。表3.选择用于克隆的杂交瘤系的初步表征数据<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>每个杂交瘤系中的细胞以1细胞/孔在FACSAria(BD)上分选到%孔板内且培养约2周。来自单个克隆的上清液通过在表达高水平的ErbB2的BT474细胞上的FMAT就ErbB2结合活性，并且还就人Igy和k链组成，以及通过ELISA就人IgM和'J、鼠IgM的存在进行筛选。对于FMAT,使在384孔FMAT板中在40plFACS緩沖液中的6000个BT474细胞(ATCC)与15pl上清液在室温下温育2小时，且随后在FMAT机器8200上读数前与10pl4.5吗/ml山羊抗人IgGCy5在室温下温育6小时。分析焚光和计数数据。Herceptin⑧在筛选中用作阳性对照。对于人抗体链组成分析，中等结合的96孔板(Coastar3368)用溶于PBS中的2|ig/ml山羊抗人IgGFc于4°C包被过夜，且用1%乳/PBS在室温下封闭30分钟。上清液在1。/。乳/PBS中1:5稀释且加入2个包被的ELISA板中，且在室温下温育1小时。随后添加在1。/q乳/PBS中250ng/ml的生物素化的山羊抗人k(Vector目录弁BA3060)或在1%乳/PBS中250ng/ml的生物素化的山羊抗人、(SouthernBiotech目录#2070-08),且在室温下温育1小时，随后与以在1。/。乳/PBS中l吗/ml的链霉抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物在室温下温育1小时。板在温育步骤之间彻底洗涤。添加50过氧化物酶底物TMB且在室温下温育30分钟，且用50^lMHCL猝灭酶反应。在微量培养板阅读仪(TiterteckMultiskanAscent)上阅读在450nm处的光密度。我们如下证实人IgM的不存在。中等结合的96孔板(Coastar3368)用在PBS中的1)ig/ml山羊抗人IgM于4°C包被过夜，且用1%乳/PBS在室温下封闭30分钟。上清液在1。/。乳/PBS中1:5稀释且加入包被的ELISA板中，且在室温下温育1小时。随后添加在1W乳/PBS中666ng/ml的驴抗人IgMPOD(AccurateChemical目录#JNH035043),且在室温下温育l小时。如上所述板通过添加POD底物进行显色。我们如下证实人IgM的不存在。中等结合的96孔板用在PBS中的1|ng/ml山羊抗人小鼠入(SouthernBiotech1060-01)于4。C包被过夜，且用1W乳/PBS在室温下封闭30分钟。上清液在l。/。乳/PBS中1:5稀释且加入包被的ELISA板中，且在室温下温育l小时。随后添加在1%乳/PBS中400ng/ml的山羊抗人IgG(Fc)POD(Pierce目录#31413),且在室温下温育1小时。如前所述板通过添加POD底物进行显色。在上文描述的ELISAs中，来自不含第一抗体的孔的信号用作背景，且给出为背景的3倍的信号的样品视为阳性的。通过FMAT证实与ErbB2天然结合且通过ELISAs证实对于人y链和k链阳性的单克隆抗体在克隆后得自20个杂交瘤系。测序来自每个亲本系的3个亚克隆。除非另有说明，所有3个亚克隆都是相同的。例如，亲本克隆1.14的亚克隆1.14.1、1.14.2和1.14.3全都具有相同的序列，且通过2数字亲本名称或3数字亚克隆名称可互换地提及。鉴定了11种独特的单克隆抗体且在基于细胞的功能测定中进行进一步表征。实施例8ErbB2单克隆抗体的结构分析测序了抗体的重链和轻链可变结构域。关于抗ErbB2抗体的全序列信息在具有关于每个Y和k链组合的核苷酸和氨基酸序列的序列表中提供。免疫球蛋白链的可变(v)区由多个种系DNA区段编码，其在B细胞个体发育期间连接成功能可变区(VhDJh或VKJK)。分析可变重序列以测定VH家族、D-区序列和J-区序列。随后翻译序列以测定原始氨基酸序列，且与种系VH、D和J-区序列比较以评估体细胞高变。类似地分析高变轻链序列。表4和表4(a)是比较抗体重链区域与其同源的种系重链区域的表。表5是比较抗体k轻链区域与其同源的种系轻链区域的表。表4和4(a)之间的差异是用于限定重链CDRls的定义。公开于表4(a)中的重链CDRls具有Kabat定义。可替代地，CDRls可以使用可替代的定义进行限定以便包括FR1序列的最后4个残基，如表4中所示。对ErbB2特异的20种个别抗体的分析指出它们中的一些是相同的，且仅11种独特的单克隆抗体由克隆得到11种抗体的8种在序列中是非常相似的，且得自相同的种系VH和VK基因。还应当理解在特定抗体在氨基酸水平上不同于其各自的种系序列的场合，抗体序列可以突变回种系序列。此种校正突变可以使用标准分子生物学技术在l、2、3或更多位置或突变位置的任何一个的组合处发生。作为非限制性例子，表4显示1.24.3的重链序列在氨基酸33处通过CDR1区中的T对S而不同于相应的种系序列。因此，编码1.24.3的重链的氨基酸或核苷酸序列可以进行修饰以改变T至S,以产生在突变位点处的种系序列。在另一个例子中，1.140.1的重链序列在氨基酸42处通过在FR2区中的R对G而不同于相应的种系序列。因此，编码1.140.1的重链的氨基酸或核苷酸序列可以进行修饰以改变R至G,以产生在突变位点处的种系序列。作为另一个非限制性例子，表5显示了1.140.1的轻链序列通过FR1区中的T至N突变(突变1),通过CDR1区中的F至L、F至Y和C至Y(突变2、3和4),通过FR2区中的R至K和N至K(突变5和6)以及通过CDR3区中的F至Y、G至S和S至T而不同于相应的种系序列。因此，编码1.140.1的轻链的氨基酸或核苷酸序列可以进行修饰以改变突变1,以产生在突变1的位点处的种系序列。进一步地，编码1.140.1的轻链的氨基酸或核苷酸序列可以进行修饰以改变突变2,以产生在突变2的位点处的种系序列。再进一步地，编码1.140.1的轻链的氨基酸或核苷酸序列可以进行修饰以改变突变3，以产生在突变3的位点处的种系序列。再次再进一步地，编码1.140.1的轻链的氨基酸或核普酸序列可以进行修饰以改变突变1、突变2、突变3、突变4、突变5和突变6，以产生在这些处的种系序列。下表6举例说明关于1.140来自种系的此种变异的位置。每行表示在由粗体类型指出的位置处种系和非种系残基的独特组合。表6还应用于抗体1.39,因为就种系突变而言，关于抗体1.39的轻链分析等同于1.140。此外，就种系突变而言，关于抗体1.96的轻链分析等同于1.140,除了抗体1.96具有在FR4中抗体序列和种系序列之间的差异。在这个例子中，抗体序列的L可以突变回F的种系序列，并且这个突变可以与表6中所示的任何组合相组合。在一个实施方案中，本发明的特征在于修饰CDR区即CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个氨基酸。在一个例子中，本文描述的抗体的重、轻或2条链的CDR3得到修饰。一般地，氨基酸用具有相似侧链的氨基酸进行置换(保守氨基酸置换)，回到种系，或可以用任何合适的氨基酸例如丙氨酸或亮氨酸进行置换。在一个实施方案中，1.24.3CDR3，QQYSSPFT(SEQIDNO:48)可以例如通过使CDR3序列突变成QQYYSPFT(SEQIDNO:49)在一个或多个氨基酸处向回修饰。在另一个实施方案中，本发明的特征在于修饰抗体以去除不成对的半胱氨酸。不成对的半胱氨酸的例子出现在抗体1.39.1中氨基酸38处，抗体1.96.1中氨基酸38处，和关于抗体1.140.1在氨基酸38处。这些半胱氨酸可以突变回种系，例如使C突变成Y或通过使C突变成任何合适的氨基酸例如丝氨酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表5:轻链分析<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage143</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage145</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage157</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage162</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage163</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage164</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table>实施例9ErbB2低表达MCF7细胞中调蛋白-(3诱导的ErbB2磷酸化和细胞增殖的抑制如实施例4中所述，杂交瘤上清液可以抑制MCF7细胞中调蛋白诱导的ErbB2磷酸化。使用纯化的单克隆抗体，测定ErbB2抗体的效力，还与2种抑制性抗体2C4和Herceptin⑧进行比较。简言之，MCF7细胞以20,000细胞/孔接种在96孔板中且在完全生长培养基(10%FCS)中培养过夜。第二天，细胞培养板用PBS洗涤1次，且用无酚红和无血清培养基替换培养基。细胞血清饥饿过夜，且随后在用10nM调蛋白-卩处理10分钟前，与在无血清培养基中从10昭/ml1:5滴定的mAbs、Herceptin⑧或2C4温育1小时。如实施例4中所述制备细胞裂解物，且使用来自RnDsystems的ELISA试剂盒(人磷-ErbB2DuoSetIC,目录#DYC1768)根据所提供的规程测量磷-ErbB2水平。基于在不存在抗体的情况下未刺激的细胞和调蛋白刺激的细胞中的pErbB2水平计算抑制百分比。使用PrismGmphpad软件对于每种抗体标绘剂量应答曲线。图3举例说明来自代表性实验的剂量应答曲线。EC50值得自非线性回归分析，且显示于表7中。2C4抑制ErbB2磷酸化而Herceptin⑧具有很少的作用。测试的本发明的11种单克隆抗体中的8种显示对于MCF7细胞中的ErbB2磷酸化的抑制活性。1.18.1看起来具有比2C4更佳的效力。表7.本发明的10种纯化的mAbs在抑制MCF7细胞中调蛋白诱导的ErbB2磷酸化方面的效力。167<table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage169</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>表10.本发明的8种抗体在抑制SKBR3细胞增殖方面的效力和功效<table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table>实施例11在BT474细胞中的ErbB2磷酸化抑制为了鉴定这些抗体在ErbB2高表达细胞系中的作用机制，本发明的抗体1.18.1连同Herceptin⑧和2C4就对BT474细胞中的组成型ErbB2磷酸化的作用进行测试。BT474细胞在第1天时以5000细胞/孔，在第2天和第3天时以10000细胞/孔，或在第4天时以20000细胞/孔接种在96孔培养板中在完全培养基中。细胞于37。C温育3-4小时且允许与板附着。单克隆抗体从10jLig/ml开始在完全培养基中1:5滴定，进行6个点，且随后加入细胞中。使细胞与单克隆抗体温育1-4天。在第5天时，如前所述细胞在补加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的緩冲液中进行裂解。细胞裂解物中的磷-ErbB2水平通过ELISA进行测定。细胞增殖通过CyQuant(Invitrogen)进行测量。根据在不存在抗体的情况下的pErbB2水平计算抑制百分比。还通过使磷-ErbB2水平对细胞数目标准化来计算磷-ErbB2/细胞。使用PrismGraphpad软件对于每种抗体标绘剂量应答曲线，且EC50值得自非线性回归分析。图7和8举例说明在不同时间点时的剂量应答。EC50和最大抑制百分比在表11中列出。单克隆Ab1.18.1在48小时时开始显示pErbB2的抑制且在72小时时达到最大抑制。然而，Herceptin⑧直至72小时时才显示出显著作用而2C4具有很少的作用。有趣的是，当磷-ErbB2水平通过细胞数目进行标准化时，ErbB2磷酸化经由1.18.1的抑制在48小时时达到最大值；而如先前公开的，Herceptin⑧看起来不抑制ErbB2的磷酸化。接下来，研究了在48小时后抗体中的7种对BT474细胞中的组成型ErbB2磷酸化的作用。简言之，将在50pl完全培养基中的IO，OOOBT474细胞接种在96孔板中，且于37。C培养3-4小时以与板附着。随后向板中加入在完全培养基中以2X终浓度制备的、50|Lil20ug/ml2C4、Herceptin⑧和本发明的抗ErbB2单克隆抗体，且与细胞温育48小时。制备细胞裂解物且如实施例4中所述通过ELISA测量磷-ErbB2水平。根据在不存在抗体的情况下的pErbB2水平计算抑制百分比。如表11中列出的，所有7种本发明的mAbs在48小时时都显示BT474细胞中ErbB2磷酸化的剂量依赖性抑制。与之相比，Herceptin⑧和2C4具有很少的作用。表11.本发明的7种抗体在48小时时在抑制BT474细胞中ErbB2磷酸化方面的效力<table>tableseeoriginaldocumentpage172</column></row><table>实施例12使用下述测定抗ErbB2抗体亲和力(A)中等分辨率Biacore分析8种抗ErbB2抗体的结合亲和力通过中等分辨率Biacore进行测量。所有实马全都使用Biacore2000仪器来进行。首先，使用常规胺偶联制备在3个CM5Biacore芯片上的12个高密度山羊a-人IgG抗体表面。随后，mAbs在包含100|ng/ml牛血清清蛋白(BSA)的HBS-P运行緩沖液中进行稀释，具体地mAb1.18.1至11pg/mL、mAb1.20.1至9.9pg/mL、mAb1.100.1至11^g/mL、mAb1.96.2至9.3|ig/mL、mAb1.140.1至9.2|tig/mL、mAbU4.1至9.3pg/mL、mAb1.39.1至10)ag/mL且mAb1.24.3至10ng/mL。在每个抗原注射循环前，每种mAb以100itiL/分钟流速捕获6-9秒。每次捕获注射后是2分钟洗涤步骤以稳定每个mAb基线。对于所有mAbs将纯化的人ErbB2(ECD)-cMycmis以307-4.80nM(2x连续稀释)的浓度范围注射90秒，随后为15分钟解离，除了其中随后为20分钟解离的mAbs1.39.1和1.24.3。所有样品都用散布的几个mAb捕获/緩沖注射循环进行随机注射用于双重参考。在每个循环后高密度山羊a-人抗体表面用146mM磷酸(pH1.5)的1次12秒脉沖进行再生。100fxL/分钟的流速用于所有注射循环。数据使用CLAMP拟合l:l相互作用模型。所得到的结合常数在下表中列出。MAbs以从最高到最低亲和力的顺序列出。表12U).通过中等分辨率Biacore分析的本发明的8种抗体针对人ErbB2的结合亲和力<table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>(B)高分辨率Biacore分析所有实验使用BiacoreT100仪器来进行。首先，使用常规胺偶联在2个CM5Biacore芯片上制备高密度山羊a人IgG抗体(CaltagHI0500)表面。每种mAb在包含100昭/ml牛血清清蛋白(BSA)的HBS-P运行緩沖液中进行稀释。MAb1.140稀释至5|ug/mL,mAb1.96.2至5.9|iig/mL,mAb1.39.1至8.7pg/mL,mAb2C4至2Kg/mL,和herceptin至4jag/mL。开发捕获水平规程用于所有5种mAbs。在每个抗原注射循环前，每种mAb以20^L/分钟流速捕获15-30秒。每次捕获注射后是5分钟洗涤步骤以稳定每个mAb基线。对于mAbs1.140、1.96.2和1.39.1将抗原hHer-2(ECD)cMyc(批次#452)以369—5.76nM(2x连续稀释)的浓度范围注射4分钟，随后为15分钟解离，并且对于mAb2C4和herceptin为650-10.2nM(2x连续稀释)的浓度范围，随后为25分钟解离。样品在上文描述的运行緩沖液中进行制备。所有样品都用散布的几个mAb捕获/緩沖注射循环进行随机注射用于双重参考。在每个循环后高密度山羊ct-人抗体表面用146mM磷酸(pH1.5)的1次15秒脉沖进行再生。50pL/分钟的流速用于所有注射循环。所有传感图(sensorgram)数据都使用CLAMP拟合1:1相互作用模型。所得到的结合常数在下表中列出。MAbs以从最高到最低亲和力的顺序列出。表12(b).通过高分辨率Biacore分析的本发明的3种抗体针对人ErbB2的结合亲和力样品k;,(M-'s-')k'i(s.')KD(nM)2C4105,881.21X1043.91X1CT、3.2herceptin602.34X1049.80X(T'4.21.1401101.64X1041.73X10-410.61.96.293].68X]04.94X10-41.6.39.1]201.60X1042.]4Xl(y413.4实施例13抗体的竟争装箱据报告2C4与ErbB2上的二聚化结构域结合，而Herceptin⑧与ErbB2的细胞外区域中的C末端结构域结合(参见在此引入作为参考的Franklin等人，CancerCell.2004Apr;5(4):317-28和Cho等人，Nature.2003Feb13;421(6924):756-60)。为了测定8种抗体的结合表位是否与关于2C4或Herceptin⑧的表位重叠，进行竟争装箱ELISA。Costar3695中等结合96孔板用在PBS中的0.5pg/mlHerc印tin⑧或2pg/ml2C4于4°C包被过夜。包被的板进行洗涤且随后用1%乳/PBS在室温(RT)下封闭30分钟。抗体滴定至1000ng/ml、100ng/ml和10ng/ml,174且与30ng/mlhErbB2(ECD)预温育2小时。将抗体/ErbB2混合物转移至封闭的板且在RT下温育1小时。为了检测结合的ErbB2，板进行洗涤且与ljag/ml山羊抗ErbB2(R&Dsystems,目录存AF1129)在RT下温育1小时。向板中加入第二抗体兔抗山羊IgGFcPOD(Pierce目录#31433，400ng/ml)且在RT下温育1小时。彻底洗涤后，加入底物TMB(Neogen)且与板在RT下温育10-18分钟。酶反应通过添加INHC1得到终止，并且在微量培养板阅读仪上阅读在450nm处的光密度。图9举例说明在本发明的8种抗ErbB2抗体、mAb1.71.3或内部产生的无关同种型对照mAb的存在下，ErbB2与Herceptin(A)和2C4(B)的结合能力。本发明的抗ErbB2抗体无一阻断ErbB2与2C4或Herceptin的结合，从而暗示抗体属于与2C4或Herceptin⑧不同的箱。本文的所有出版物、专利和专利申请都引入作为参考，其程度与每个个别出版物或专利申请特别并个别指出引入作为参考相同。前述详细描述仅为了理解清晰而给出并且不应理解由此有任何不必要的限制，因为修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。这并非承认本文提供的任何信息都是现有技术或与本发明有关，或特别或不明显参考的任何出版物是现有技术。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述，但将理解它能够进一步修饰，并且本申请意欲包含本发明的任何变异、用途或适应，其总的来说遵循本发明的原理，且包括来自本公开内容的此种背离，如在本发明所属领域内已知的或常规实践的范围内以及如可以应用于上文阐述和如下附加权利要求的范围中的基本特征中的。权利要求1.一种靶向结合剂，其与ErbB2特异性结合。2.根据权利要求1的把向结合剂，其中所述耙向结合剂具有至少一种下述性质(a)与人细胞结合；(b)与表达猕猴ErbB2的细胞结合；(c)与Herceptin⑧部分竟争但不与2C4竟争；(d)以小于50ng/ml的EC50抑制MCF7细胞中的ErbB2磷酸化；(e)以小于50ng/ml的EC50抑制SKBR3细胞中的细胞增殖；(f)以13.5nM或更小的KD与ErbB2结合；或(g)具有关于ErbB2的2.14x10-4s-l或更小的解离速率(koff)。3.权利要求2的靶向结合剂，其中所述靶向结合剂以13.5nM或更小的KD结合ErbB2且抑制ErbB2的活化。4.权利要求1的靶向结合剂，其中所述靶向结合剂是选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体的单克隆抗体。5.与人ErbB2特异性结合且抑制人ErbB2的靶向结合剂，其中所述靶向结合剂具有选自抗体的至少一种性质，所述抗体(a)与选自下述的抗体竟争与ErbB2的结合:1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.%、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)与选自下述的抗体竟争与ErbB2的结合:1.44.1、1.140、1.43、U4丄l.跳l、1.%、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1,20、1.39、1.24和1.71.3;(c)与选自下述的抗体结合相同的ErbB2表位1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1,24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(d)以与选自下述的抗体基本上相同的KD与ErbB2结合1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;和(e)以与选自下述的抗体基本上相同的解离速率与ErbB2结合1.44.1、1.40、1.43、.14.1、〗.00.〗、.96、1.18.、.20、.39、.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。6.特异性结合ErbB2的靶向结合剂，其中(a)所述靶向结合剂包含选自下述的抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;和/或(b)所述把向结合剂包含选自下述的抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列:1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。7.权利要求6的靶向结合剂，其中所述靶向结合剂选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。8.根据权利要求4的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自(a)包含SEQIDNO:2中所示的重链氨基酸序列、SEQIDNO:4中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(b)包含SEQIDNO:6中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:8中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(c)包含SEQIDNO:10中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:12中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(d)包含SEQIDNO:14中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:16中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(e)包含SEQIDNO:18中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:20中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(f)包含SEQIDNO:22中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:24中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(g)包含SEQIDNO:26中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:28中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(h)包含SEQIDNO:30中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:32中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(i)包含SEQIDNO:34中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:36中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；(j)包含SEQIDNO:38中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:40中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体；和(k)包含SEQIDNO:42中所示的重链氨基酸序列和SEQIDNO:44中所示的轻链氨基酸序列或两者的抗体。9.根据权利要求7的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体进一步包含SEQIDNO:46中所示的重链氨基酸序列、SEQIDNO:47中所示的轻链氨基酸序列或两者。10.根据权利要求9的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体可以来自任何同种型。11.根据权利要求4的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或部分包含利用人VH3-21基因、人VH3-7基因、人VH4-31基因或人VH3-13基因的重链。12.根据权利要求4的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或部分包含利用人VKB3基因、人VKL1基因、人VKA2基因或人VKAl基因的轻链。13.根据权利要求9的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或部分进一步包含利用人VKB3基因、人VKL1基因、人VKA2基因或人VKA1基因的轻链。14.根据权利要求4的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述VL结构域、所述VH结构域或两者在氨基酸序列中与下述的单克隆抗体的VL结构域、VH结构域或两者分别至少90%等同1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、l.跳l、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。15.特异性结合ErbB2的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含选自下述的抗体的FR1、FR2、FR3或FR4氨基酸序列中的一个或多个1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3。16.根据权利要求4的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含(a)与下述的单克隆抗体的重链氨基酸序列至少90%等同的重链氨基酸序列1.44.1、1,140、1.43、1,14.1、1,100,1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;(b)与下述的单克隆抗体的轻链氨基酸序列至少90%等同的轻链氨基酸序列1.44.1、1.140、1.43、1.14.1、1.100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.31.44.1、1140、1.43、1.14.1、1100.1、1.96、1.18.1、1.20、1.39、1.24和1.71.3;或(a)和(b)两者。17.根据权利要求4的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合部分选自Fab、Fab，、F(ab，)2、Fd、Fv、dAb、和互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv或scFv2)、嵌合抗体、双抗体、双特异性抗体和这样的多肽，其包含足以赋予与所述多肽特异性抗原结合的抗体的至少部分。18.—种组合物，其包含根据权利要求1-18中任一项的耙向结合剂和药学上可接受的载体。19.根据权利要求18的组合物，其包含另外的治疗或诊断剂。20.根据权利要求18的组合物，其进一步包含特异性结合ErbB2的抗体，其中所述抗体不与选自下述的抗体竟争与ErbB2的结合1.14.1、1.18.1、1.20.1、1.24.3、1.39.1、1.71.3、1.96.2、1.100.1和U40丄21.—种分离的细胞系，其生产根据权利要求1-18中任一项的把向结合剂。22.—种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求4的抗体的重链或其抗原结合部分、轻链或其抗原结合部分或两者的核苷酸序列。23.根据权利要求22的分离的核酸分子，其包含选自下述的核普酸序列(a)SEQIDNO:1的核苦酸序列；(b)编码SEQIDNO:2的核普酸序列；(c)SEQIDNO:3的核苦酸序列；(d)编码SEQIDNO:4的核苷酸序列；(e)SEQIDNO:5的核苦酸序列；(f)编码SEQIDNO:6的核苷酸序列；(g)SEQIDNO:7的核苦酸序列；(h)编码SEQIDNO:8的核苷酸序列；(i)SEQIDNO:9的核苦酸序列；(j)编码SEQIDNO:IO的核苷酸序列；(k)SEQIDNO:ll的核苷酸序列；(I)编码SEQIDNO:12的核苷酸序列；(m)SEQIDNO:13的核苷酸序列；(n)编码SEQIDNO:14的核苷酸序列；(o)SEQIDNO:15的核苷酸序列；(p)编码SEQIDNO:16的核普酸序列；(q)SEQIDNO:17的核苷酸序列；(r)编码SEQIDNO:18的核苷酸序列；(s)SEQIDNO:19的核苷酸序列；(t)编码SEQIDNO:20的核苦酸序列；(u)SEQIDNO:21的核苷酸序列；(v)编码SEQIDNO:22的核香酸序列；(w)SEQIDNO:23的核苷酸序列；(x)编码SEQIDNO:24的核苷酸序列；(y)SEQIDNO:25的核芬酸序列；(z)编码SEQIDNO:26的核苦酸序列；(aa)SEQIDNO:27的核苷酸序列;(bb)编码SEQIDNO:28的核苷酸序列；(cc)SEQIDNO:29的核苷酸序列；(dd)编码SEQIDNO:30的核苷酸序列；(ee)SEQIDNO:31的核苷酸序列；(ff)编码SEQIDNO:32的核苷酸序列；(gg)SEQIDNO:33的核苷酸序列;(hh)编码SEQIDNO:34的核普酸序列;(ii)SEQIDNO:35的核苷酸序列；(jj)编码SEQIDNO:36的核普酸序列；(kk)SEQIDNO:37的核普酸序列；(II)编码SEQIDNO:38的核苦酸序列；(mm)SEQIDNO:39的核苦酸序列；(mi)编码SEQIDNO:40的核苷酸序列；(oo)SEQIDNO:41的核苷酸序列；(pp)编码SEQIDNO:42的核苷酸序列；(qq)SEQIDNO:43的核苷酸序列；和(rr)编码SEQIDNO:44的核苦酸序列。24.权利要求23的分离的核酸分子，其进一步包含表达控制序列。25.—种包含根据权利要求22的核酸分子的载体，其中所述载体任选包含与所述核酸分子可操作地连接的表达控制序列。26.—种宿主细胞，其包含权利要求25的载体或根据权利要求22的核酸分子。27.—种用于生产靶向结合剂的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求26的宿主细胞和回收所述靶向结合剂。28.—种包含根据权利要求22的核酸的非人转基因动物或转基因植物，其中所述非人转基因动物或转基因植物表达所述核酸。29.—种用于分离与人ErbB2特异性结合的抗体或其抗原结合部分的方法，其包括从根据权利要求28的非人转基因动物或转基因植物中分离所迷抗体的步骤。30.—种用于制备与ErbB2特异性结合的人单克隆抗体的方法，其包括下述步骤i)用ErbB2、ErbB2的免疫原性部分或者表达ErbB2的细胞或组织免疫能够生产人抗体的非人转基因动物；ii)允许所迷转基因动物发动针对ErbB2的免疫应答；和回收所述抗体。31.—种分离的抗体，其通过权利要求30的方法产生。32.—种用于治疗、预防或减轻有此需要的受试者中ErbB2介导的病症的症状的方法，其包括给所述受试者施用根据权利要求1的靶向结合剂的步骤，其中所述耙向结合剂抑制ErbB2。33.—种用与ErbB2特异性结合的抗体或其抗原结合部分用于治疗、预防或减轻有此需要的受试者中ErbB2介导的病症的症状的方法，其包括下述步骤(a)施用有效量的编码重链或其抗原结合部分的分离的核酸分子，编码轻链或其抗原结合部分的分离的核酸分子，或编码轻链和重链或其抗原结合部分的核酸分子两者；和(b)表达所述核酸分子。34.根据权利要求32或33的方法，其中所述ErbB2介导的病症是癌症。35.根据权利要求34的方法，其中所述癌症选自乳腺、膀胱、肺、头、颈、前列腺、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰癌和成"交质细胞瘤。36.—种抑制有此需要的受试者中表达ErbB2的癌细胞增殖的方法，所述方法包括给所述受试者施用权利要求1的靶向结合剂的步骤。37.—种用于抑制表达ErbB2的细胞中的ErbB2活性的方法，其包括使所述细胞与权利要求1的耙向结合剂接触，其中所述细胞中的所述ErbB2活性选自(a)ErbB2的石舞酸4匕；(b)MAPK途径的活化；(c)PI3K途径的活化；(d)CDC2的抑制；和(e)其组合。38.—种用于调节表达ErbB2的细胞中的ErbB2活性的方法，其包括使所述细胞与权利要求1的靶向结合剂接触，其中所述细胞中的所述ErbB2活性是p38-TSP-l途径的活化。39.根据权利要求37的方法，其中所述细胞在受试者中。40.根据权利要求37的方法，其中所述细胞是癌细胞。41.根据权利要求37的方法，其中所述ErbB2的磷酸化被抑制48小时。全文摘要本发明涉及与ErbB2优选人ErbB2特异性结合的抗体，包括人抗体及其抗原结合部分。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分抑制ErbB2。本发明还涉及嵌合的、双特异性、衍生的抗体，单链抗体或融合蛋白的部分。本发明还涉及衍生自人抗ErbB2抗体的分离的重和轻链免疫球蛋白或其部分和编码此种免疫球蛋白的核酸分子。本发明还涉及使用抗体和组合物用于诊断和治疗的方法。本发明还提供使用编码构成人抗ErbB2抗体的重和/或轻免疫球蛋白分子的核酸分子的基因治疗方法。本发明还涉及包含本发明的核酸分子的转基因动物或植物。文档编号C07K16/32GK101522717SQ200780037095公开日2009年9月2日申请日期2007年8月2日优先权日2006年8月4日发明者I·富尔茨,J·S·康,J·董,M·希金森,S·A·卡蒂拉奇申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司