重组表皮生长因子egf及其制备方法

重组表皮生长因子egf及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了重组表皮生长因子EGF基因，它是人工体外合成的，以组氨酸标签（His6-Tag）-SUMO蛋白酶识别底物为蛋白质可溶性表达的辅助片段，以EGF为目的片段的融合表达蛋白质，并使EGF以无启动子的正确阅读框架与载体正序相连并转化进入表达菌种，最终构建与表达三种物质串联的融合蛋白。在咪唑存在下进行金属螯合介质纯化，一步获得90%纯度的融合蛋白质，利用高特异性和高活性SUMO蛋白酶对所纯化的融合蛋白质进行酶切，使标签部分HS与EGF目的蛋白解离，并利用金属螯合介质将标签部分与EGF目的蛋白分离。获得了纯度达95%的无首位Met的天然结构和活性2.2╳108IU/mg的目的蛋白的。每毫克费用由1.05元降至0.32元。
【专利说明】重组表皮生长因子EGF及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，具体涉及重组的表皮生长因子EGF基因、重组表皮生长因子EGF及其制备方法。
【背景技术】
[0002]早在60年代初Montalcini和Cohen教授在纯化小鼠颌下腺神经生长因子(NGF)时发现一组可促进新生小鼠提早开眼、长牙且对热稳定的多肽类物质。最早发现它具有抑制胃酸分泌作用，故又称抑胃素。随后将这一活性组份加入培养的皮肤表皮时发现，它可直接促进表皮生长，为此定名为表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)。1974年从人尿中提纯出人的表皮生长因子(hEGF)。
[0003]EGFCEpidermal Growth Factor),表皮生长因子,是人体内的一种活性物质，由53个氨基酸残基组成的肽类活性物质，分子量6201 Da，分子内有6个半胱氨酸组成的三对二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域。EGF无糖基部位，非常稳定，耐热耐酸，广泛存在于体液和多种腺体中，主要由颌下腺、十二指肠合成，在人体的绝大多数体液中均已发现，在乳汁、尿液、精液中的含量特异性地增高，但在血清中的浓度较低。
[0004]EGF能刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生的效果。对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。
[0005]EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效，EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，可刺激多种细胞的`增殖，主要是表皮细胞、内皮细胞。用于角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合取得了很好的疗效，Montalcini和Cohen教授因为发现表皮生长因子并分析其结构和作用机理，1986年诺贝尔生理学及医学获奖。
[0006]EGF能增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态。高活性的EGF才能促进皮肤细胞的分裂和生长，此外它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原白等)的合成与分泌、滋润皮肤，是决定肌肤活力和健康的源泉。
[0007]EGF主动与伤口附近细胞膜上的特异性受体相结合，从而激活蛋白酶，加快蛋白质的合成，促进成纤维细胞的生长，促进皮肤和粘膜创面愈合并养活疤痕收缩，快速高效修复创伤。应用于皮肤组织的各种损伤，去除暗疮、痤疮、去痣后的小缺损，换肤后的脱皮、发红以及果酸等使用后导致的皮肤灼伤、磨削后的表皮损伤修复等具有突出的效果。上海波恩(国际)斯诺美授权生物医学技术服务中心A80部EGF能促进表皮细胞增殖分化，使衰老死亡的细胞得以及时补充，使损伤的表皮得以即时修复，可用于对换肤、褪红、毛细血管扩张等各种不良肤质的调整，改善肌肤薄、粗糙、疤痕等不良状况，使肌肤恢复光洁和平滑。
[0008]促进成纤维细胞、表皮细胞代谢、增殖和生长，促进弹性纤维细胞的发育及增强其功能，激活老化细胞的再生，加速细胞的新陈代谢和更新，快速代谢老化角质，修复断裂的浅表皮成纤维细胞，从而消除皱纹。通过上海波恩(国际)斯诺美授权生物医学技术服务中心A80部EGF等活性因子促进真皮层内纤维母细胞的增殖，修复老化的胶原纤维与弹性纤维；更多地合成和分泌胶原蛋白、透明质酸等大分子；改善皮肤微循环，提供良好的营养环境，维持一定量的皮肤脂肪，还原肌肤弹性，使其均匀紧致，减少皱纹。
[0009]EGF能促进表皮组织上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞等多种细胞的生长、分裂，加快新陈代谢，增强其表皮细胞活性，从而使细胞保持质与量的完善，使皮肤皱纹消失，显示出紧实、柔嫩、光洁和富有弹性的健康美。促进细胞新陈代谢(抗衰老):EGF能够促进细胞的增殖、分化。上海波恩(国际)斯诺美授权生物医学技术服务中心A80部EGF能够使成熟细胞逆分化形成“干细胞岛”，同时遏制衰老基因的表达。EGF从根本上改变皮肤细胞构成，降低皮肤细胞平均年龄，令肌肤光洁靓丽。
[0010]对较黑肤色的皮肤和各类皮肤色素沉着，EGF可通过促进新生细胞来替代衰老细胞，以降低皮肤中黑色素和有色细胞的含量；并且可增加皮肤血流量，改善皮肤微循环，为表皮细胞提供良好的营养环境，防止代谢产物淤积，有效改善皮肤色泽，使较黑肤色和各类色素沉着的皮肤白皙完美，均匀靓丽。对较黑皮肤和各类皮肤色素沉着，加快细胞增生，促进皮下毛细血管网分布，促进血液循环，使皮肤黑色素加快排出，有效减少黑色素的沉积，起到美白淡斑的作用。
[0011]改善皮肤微循环(光洁)，促进透明质酸合成和分泌(滋润)=EGF能促进细胞外透明质酸、糖蛋白等大分子的合成和分泌，增强皮肤的亲水性，保持皮肤内水分。EGF能改善皮肤微循环，令气血通畅，防止代谢产物淤积，使皮肤富有营养。维持真皮内的水分；肌肤恢复健康，表皮内角质层水分保持能力增强，让肌肤滋润散发活力。
[0012]EGF是极为安全的，因为它是一种人体本身就能够产生的生物因子，在年轻的时候，人体自身能够产生足够多的EGF，促使表皮细胞生长，但随着年龄的减退，EGF的产生量逐步下降，因此表皮细胞的更新速度就越来越慢了。正是EGF为人体本身之组成部分，故没有任何毒副作用，十分安全。使用EGF护`肤品，相比于一些其它的抗皱方法，安全更是卓越的优点。
[0013]EGF在未来的市场上的应用将会非常的广泛，我们对EGF的基因进行了改造，使其与sumo载体相连接，最大化的简便了纯化的工艺与提高蛋白的回收率。

【发明内容】

[0014]本发明的目的是为了更加方便的进行表皮生长因子EGF的纯化，降低生产成本，以可溶性天然构象形式融合表达，提高EGF的活性，而提供一种重组的表皮生长因子EGF基因、重组表皮生长因子EGF及其制备方法。
[0015]重组的表皮生长因子EGF基因，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0016]重组的表皮生长因子EGF，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0017]重组的表皮生长因子EGF的制备方法，它包括:
1)人工合成序列表SEQID N0.1所不的基因；
2)插入表达载体中；
3)转染至大肠杆菌中表达；破碎细菌，取可溶性部分即为融合蛋白粗提物；
4)在咪唑存在下进行金属螯合介质纯化；5)用SUMO蛋白酶酶切，并利用金属螯合介质将标签部分与EGF目的蛋白分离、纯化；所述的步骤5)为:粗提物通过用20mM Tris-HCl, pH 8.0,0.15M NaCl，20mM咪唑缓冲液平衡过的1.6X20cm IMAC柱，并用含有0.15M NaCl的缓冲液洗脱，所述的缓冲液为:20mM Tris-HCl, pH 8.0 200mM咪唑；收集目的蛋白峰部分并进行10倍稀释，缓冲液为20mMTris-HCl, pH 8.0，加入1%的特异性高活性SUMO蛋白酶，于30°C水浴中酶切目的蛋白4hr，样品再次过IMAC液相色谱柱，收集流川部分再经过缓冲液20mM Tris-HCl, pH8.0, ImMEDTA平衡的DEAE-S印harose 4 Fast Flow柱，结合在层析柱上的EGF用含有0.5M NaCl的TE缓冲液20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA进行0-100%连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分；
所述的表达载体为携带T7强启动子且含有多克隆位点的表达载体；
所述的表达载体为pET28a ；
所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0018]本发明详述:本文中所使用术语“EGF”，是指能够在体内外发挥表皮生长功能的基因工程产品，根据本发明的优选实施方案，为忠实于天然EGF氨基酸序列，合成基因时特意设计将天然EGF首位氨基酸Asn的密码子AAT置于SUMO蛋白酶识别底物氨基酸序列Gly-Gly的密码子GGTGGT之后，所说的EGF是以不含Met为首位氨基酸残基的基因工程重组 EGF。
[0019]本文所使用的术语“EGF”是指经基因工程融合表达、简易工艺纯化、酶切去除辅助分子伴侣而获得的纯天然结构的产品，其生物活性由于表达形式的转变应等同于或高于现有工艺制备的产品。
[0020]其中为了基因连接方便在基因合成时于融合蛋白基因的5'末端添加了 NdeI限制性内切酶识别位点，并利用NdeI限制性内`切酶识别位点中的ATG作为首位启动密码子，翻译表达融合蛋白首位氨基酸Met。同时在融合的蛋白基因的3'端加入限制性内切酶EcoRI的识别序列GAATTC，以便使基因片段和载体连接时均形成粘性末端，利于基因连接。为使表达产物达到高效表达，将大肠杆菌偏性密码子引入到其中，以使产物适合在大肠杆菌中表达。
[0021]利用本发明方法制备的EGF与原工艺产物进行了活性对比，结果发现本发明专利制备的样品生物活性显著优于现有工艺产品。
[0022]本文中所使用术语“活性测定”是指利用中国生物制品规程所描述的EGF标准检测方法，即利用不同浓度的EGF促进体外培养的小鼠成纤维细胞Balb/c-3T3的增殖作用(参考中国药典附录(2005版，第三部)，抗EGF生物活性测定法，其活性单位以IU/ml表示)。
[0023]用于构建本发明的融合蛋白质的HS-EGF分子是以N端Met为起始的蛋白质分子，依次添加便于纯化的HIS6的基因序列和SUMO酶切识别底物基因序列，其后是EGF基因序列，并以终止密码子TAA结束。
[0024]本发明中使用通用的DNA合成仪在1000A固相载体上合成编码这些融合蛋白的核苷酸序列。为了便于与特定重组载体进行连接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入适当的核酸内切酶(如NdeI和EcoRI)酶切位点，并造成适于连接的粘性末端。可按照本领域技术人员已知的重组技术，克隆编码这些合成的阅读框架通畅的基因(或以其cDNA或基因组DNA形式)，DNA重组操作中，一般使用标准的基因克隆和亚克隆技术进行基因片段的转移和连接。使用限制性酶切法鉴定序列连接方向的正确性和可能的突变，最后以DNA测序进行序列确认。
[0025]通过技术人员计算机分析和圆二色谱检测证明EGF蛋白质分子是以正确的二硫键形式进行折叠的。
[0026]重组蛋白质基因将被可操纵地连接到适当的表达控制序列上，如连接到适于在大肠杆菌中使用的T7、trp或λ启动子、核糖体结合位点及转录终止信号上。可使用已知的转化方法，如适于原核细胞的氯化钙处理法将本发明的重组质粒转化到所选择的宿主细胞中。可基于质粒上所含抗生素抗性基因所赋予的抗生素抗性来选择被转化的阳性细胞。一旦表达了所需的融合蛋白质，即可按照本领域已知的方法分离并纯化该融合蛋白质。例如，可从发酵培养物中离心收集菌体细胞并用溶菌酶和超声波裂解之，然后超速离心并在低浓度磷酸盐(约20mM)溶液中加入饱和硫酸铵进行分步沉淀。依次经IMAC层析和离子交换层析(IEC)纯化所需的EGF重组蛋白质。
[0027]—般说来，使用聚丙烯酰胺凝胶以SDS-PAGE电泳法分析各柱层析洗脱部分，并以免疫印迹法监测之。对重组融合蛋白质纯化产物进行细胞增殖试验以检测重组EGF的生物学活性(具体操作见中国药典，2005版，第三部，附录XH)。
[0028]本发明提供了人工体外合成的，重组的表皮生长因子EGF基因，它是以组氨酸标签(His6-Tag)-SUM0蛋白酶识别底物(以下简称为:HS片段)为蛋白质可溶性表达的辅助片段，以EGF为目的片段的融合表达蛋白质，并使EGF以无启动子的正确阅读框架与载体正序相连并转化进入表达菌种，最终构建与表达三种物质串联的融合蛋白。在咪唑存在下进行金属螯合介质纯化，一步获得90%纯度的融合蛋白质，利用高特异性和高活性SUMO蛋白酶对所纯化的融合蛋白质进行酶切，使标签部分HS与EGF目的蛋白解离，并利用金属螯合介质将标签部分与EGF目的蛋白分离。获得了纯度达95%的无首位Met的天然结构和活性
2.2 X 108IU/mg的目的蛋`白的。每毫克费用由1.05元降至0.32元。
[0029]可将本发明的EGF蛋白质作为基本活性成分，并加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂，制成适于临床应用的药物组合物或美白化妆产品。所说的载体或赋形剂包括但不只限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根据所治疗的疾病的不同，可在本发明的药物组合物中加入一种或多种与本发明的蛋白质有辅助或协同作用的其他天然的、合成的或重组的活性化合物。另外，可在本发明的药物组合物中加入低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白质保护剂，以及聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂。
【专利附图】

【附图说明】
[0030]图1显示用于表达融合蛋白的重组质粒构建图。
【具体实施方式】
[0031]以下借助实施例进一步阐明本发明，但本领域技术人员可以意识到，这些实施例并不构成对本发明待批权利要求范围的限制。
[0032]实施例1 =HS-EGF表达载体和工程菌的制备 重组表达质粒的构建与鉴定a.基因合成:本发明中按照前文所述的设计理念进行酶切位点和HS-EGF全基因序列的设计并人工体外合成如下序列:
NdeI内切酶识别序列(CATATG) +His6+SUM0+EGF多肽基因+终止密码子(TAA) +EcoRI内切酶识别序列(GAATTC)，基因序列见SEQ ID NO: 1，本合成序列直接克隆入大连Takara公司提供的T载体中，并转化大肠杆菌JM109细菌，经PCR鉴定确定阳性克隆株，阳性克隆株扩大培养，常规分子克隆技术提取质粒DNA，利用Ndel、EcoRI双酶切本质粒和PET28a质粒，回收目的片段和PET28a质粒载体粘性末端片段，以正确的阅读框架在T4连接酶(Promega)存在下将目的片段插入到同样酶切的PET28a质粒载体中，构建融合蛋白双链表达基因并转化JM109工程菌。
[0033]b.经PCR鉴定确定阳性克隆株，阳性克隆株扩大培养，常规分子克隆技术提取质粒DNA，利用Ndel、EcoRI双酶切PET28a_HS_EGF质粒进行鉴定，然后阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，并将被转化的细菌培养于含卡那霉素(50μ g/ml)的LB培养基中，以扩增质粒DNA。培养完成后，破碎细胞，离心收集质粒并纯化质粒DNA测序，含有测序正确的质粒的大肠杆菌菌株即为工程菌株，SEQ ID NO:1显示了所测得的融合蛋白重组基因的核苷酸序列。图1显示了重组质粒pET28a-HS-EGF的构建。
[0034]实施例2:融合蛋白质的表达及EGF产物的纯化:
将携带重组基因质粒转化的大肠杆菌BL21 (DE3)(含有T7 RNA聚合酶基因)培养在含有卡那霉素(50yg/ml)的LB琼脂平皿上。培养后挑选卡那霉素抗性菌落，于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培养基中37 °C培养，当A_达到约0.4~0.6时加入ImM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度lmM)，37°C继续培养3-4小时，以诱导目的产物的表达。然后离心分离细胞和培养基，并将含有目的蛋白质的菌体中加入缓冲液成分，终浓度达50mM Tris-HCl, pH8.0,超声破碎，4°C离心(20，OOOg, 30分钟)，取可溶性部分即为融合蛋白粗提物(氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示)。
`[0035]粗提物通过用20mM Tris-HCl, pH 8.0，0.15M NaCl，20mM咪唑缓冲液平衡过的
1.6 X 20cm IMAC 柱(Pharmacia)，并用含有 0.15M NaCl 的缓冲液(20mM Tris-HCl, pH 8.0200mM咪唑)洗脱。收集目的蛋白峰部分并进行10倍稀释(缓冲液为20mM Tris-HCl, pH
8.0)，加入1%的特异性高活性SUMO蛋白酶，于30°C水浴中酶切目的蛋白4hr，样品再次过IMAC液相色谱柱，收集流川部分再经过缓冲液(20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA)平衡的DEAE-Sepharose 4 Fast Flow柱(Pharmacia),结合在层析柱上的EGF用含有0.5M NaCl 的TE缓冲液(20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA)进行0-100%连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分，于_20°C下储存备用。如此纯化的蛋白质纯度>95% (氨基酸序列见SEQ IDN0:3)。
[0036]实施例3:利用体外培养的小鼠成纤维细胞Balb/c_3T3测定EGF的生物学活性作用，(具体操作参考中国药典2005版，第三部附录XH)。
[0037]细胞增殖试验:
将培养的小鼠成纤维细胞Balb/c-3T3单层细胞经0.5%胰蛋白酶消化，吹打收集细胞悬液，利用细胞计数板记数后，调整细胞数量为60000个/ml，按照85 μ I/孔加入到96孔培养板中(每孔5000细胞)，5% C02，37°C条件下培养4h。调整制备的新、旧两种工艺制备的EGF起始浓度为lmg/ml，定量的样品经过滤除菌，按等倍稀释法将不同量的样品加入各细胞孔中，然后补足培养基，使之总体积为100 μ I, 5% C02，37°C条件下培养48h。然后弃去细胞板中上清液，每孔加入50 μ I染色液,室温放置30min后，用流水冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μ 1，室温放置5min，混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm出测定吸光度，记录测定结果。
[0038] 实验数据采用计算机程序进行参数回归计算:对各实验样品的各实验点OD值、预稀释倍数、样本梯度等数据采用计算机程序进行处理。分别计算各实验样品的半效稀释倍数，并计算50%效应点的浓度(见表1)。
【权利要求】
1.重组的表皮生长因子EGF基因，其碱基序列如序列表SEQID N0.1所示。
2.重组的表皮生长因子EGF，其碱基序列如序列表SEQID N0.3所示。
3.重组的表皮生长因子EGF的制备方法，它包括: 1)人工合成序列表SEQID N0.1所不的基因； 2)插入表达载体中； 3)转染至大肠杆菌中表达；破碎细菌，取可溶性部分即为融合蛋白粗提物； 4)在咪唑存在下进行金属螯合介质纯化； 5)用SUMO蛋白酶酶切，并利用金属螯合介质将标签部分与EGF目的蛋白分离、纯化。
4.根据权利要求3所述的重组的表皮生长因子EGF的制备方法，其特征在于:所述的表达载体为携带T7强启动子且含有多克隆位点的表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组的表皮生长因子EGF的制备方法，其特征在于:所述的表达载体为pET28a。
6.根据权利要求5所述的重组的表皮生长因子EGF的制备方法，其特征在于:所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。
7.根据权利要求3、4、5或6所述的重组的表皮生长因子EGF的制备方法，其特征在于:所述的步骤5)为:粗提物通过用20mM Tris-HCl, pH 8.0,0.15M NaCl,20mM咪唑缓冲液平衡过的1.6X20cm IMAC柱，并用含有0.15M NaCl的缓冲液洗脱，所述的缓冲液为:20mM Tris-HCl, pH 8.0 200mM咪唑；收集目的蛋白峰部分并进行10倍稀释，缓冲液为20mMTris-HCl, pH 8.0，加入1%的特异性高活性SUMO蛋白酶，于30°C水浴中酶切目的蛋白4hr，样品再次过IMAC液相色谱柱，收集流川部分再经过缓冲液20mM Tris-HCl, pH8.0, ImMEDTA平衡的DEAE-S印harose 4 Fast Flow柱，结合在层析柱上的EGF用含有0.5M NaCl的TE缓冲液20mM Tris-HCl, pH8.0, ImM EDTA进行0-100%连续梯度洗脱，并收集蛋白质各组分峰部分。
【文档编号】C07K14/485GK103834664SQ201410117214
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】张国利, 史飞, 刘雨玲, 李泽鸿, 田园, 于佳, 何苗 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所