专利名称：肝细胞生长因子的测定方法
技术领域：
本发明是一种生物医学中对肝细胞生长因子的测定方法。
背景技术：
肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)最初是从血清中分离出的一种能够刺激肝细胞增殖的多肽生长因子。研究结果表明，HGF是α、β链组成，含728氨基酸的异二聚体。
HGF的受体是由原癌基因c-met编码的跨膜氨酸蛋白的激酶。HGF通过与其受体c-Met相结合而发挥其生物学作用。HGF的主要作用包括1、作为有丝分裂原刺激细胞增殖生长；2、促进细胞的形态学分化；3、促进细胞的运动；4、抗致细胞凋亡的作用，延长细胞的存活；5、参与上皮细胞(如肾小管上皮细胞)的成管过程和器官的形成；6、能够加速某些癌细胞的浸润，参与肿瘤的转移。因此，HGF是具有多种生物活性作用的生长因子，其在机体器官生长发育、组织或脏器损伤的修复，以及肿瘤的转移和生长过程中都起着十分重要的作用。
体内HGF只产生于间质细胞和成纤维细胞等。HGF的受体主要分布于各脏器及其肿瘤组织内的上皮细胞中。在疾病状态下，如重症肝炎、肾功能衰竭及某些肿瘤，循环中HGF水平可发生显著的变化。因此，及时、准确地检测机体HGF浓度将有助于疾病的诊断，也为应用HGF治疗慢性肝炎、慢性肾功能衰竭提供可靠的实验依据。
三、技术内容1、技术问题本发明的目的是提供一种方便、可靠的肝细胞生长因子的测定方法。
2、技术方案本发明的特征在于测定的方法为首先建立抗肝细胞生长因子单克隆抗体和多克隆抗体，在此基础上应用酶联免疫检测方法测定肝细胞生长因子的浓度。肝细胞生长因子单克隆抗体的制法为以肝细胞生长因子多次免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞株融合，得到杂交瘤细胞株，再将杂交瘤细胞株植入小白鼠腹腔内，待1～2周腹水形成后，收集腹水，经离心、纯化后即得到抗人肝细胞生长因子单克隆抗体。酶联免疫检测方法为酶联吸附测定方法或酶联免疫印迹法。
3、技术效果
HGF是95Kd的糖蛋白，在正常循环血液及其它体液中含量甚低。应用酶联免疫检测方法(ELASA)可以有效地检测HGF水平。同时，抗HGF抗体还能够有效地抗HGF的生物活性，用于肿瘤的临床治疗。在疾病状态下，如重症肝炎，肾功能衰竭，循环中HGF水平可发生显著的变化。及时、准确地检测机体HGF浓度将有助于疾病的诊断，也为应用HGF治疗慢性肝炎、慢性肾功能不全提供可靠的实验依据。
具体实施例方式
实施例1抗人HGF单克隆抗体(简称单抗)的建立材料4～6周龄的Balb/c小鼠，不拘雌雄。骨髓瘤细胞株，人重组HGF(R & D Co.USA)。
方法以人重组HGF多次免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞株融合。经筛选后得10个杂交瘤细胞株，分别将杂交瘤细胞株植入小鼠腹腔内，待1～2周腹水形成后，收集腹水。经离心，纯化后即得到抗人HGF单抗。
抗HGF单抗的鉴定采用免疫印迹法(Western Blot)鉴定抗体的特异性。
实施例2应用抗人HGF单抗，建立检测HGF浓度的酶联免疫吸附测定(ELASA)。
1、材料HGF重组人HGF(Genotech Co.USA)，单抗及多克隆抗体，辣根过氧化酶、蛋白A，和标记辣根过氧化酶的蛋白A。
2、方法(A)酶与抗体的偶联将辣根过氧化酶溶于0.1M的碳酸缓冲液中(pH9.2)，加入新配制的过碘酸钠，再加抗HGF抗体，混匀后室温下避免光放置2h。加Sephadex G-25，以碳酸盐缓冲液流洗，再加新配制的NaBH4至洗脱物中，室下避光放置30min。加饱和过硫酸铵溶液，4℃振摇30min后，离心弃上清，TEN缓冲液溶解沉积，透析过液。酸出偶联物，加入适量牛血清的蛋白溶液，-20℃保存待用。
(B)检测HGF的ELASA方法用1μg/ml的单抗HGF单抗包被ELASA板放室温2h，磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)洗涤3遍后，加5％牛血清白蛋白封闭，室温下1h。PBS洗涤3遍后，加入不同浓度人HGF或待侧标本，室温孵育60min，PBS洗涤3次，加入标记的抗HGF多克隆抗体，继续在室温下作用60min，随后PBS洗涤3遍，加入200μl显色液，室温下作用10～20min，450μm波长下，ELASA仪比色，记录OD值。
4、结果本方法可以数异性地检测HGF，重复性好。其相关系数0.982，最低检测浓度为0.2μg/ml。
实施例3抗人HGF单抗中和HGF，封闭HGF的生物学作用。
1、材料人肾小管上皮细胞(HKC)，转化生长因子(TGFβ1，R & D Co，USA)，人HGF(Genotech Co.USA)，抗α平滑肌动蛋白抗体(αSMA，SigmaCo.USA)，抗人HGF抗体。
2、方法将5％小牛血清MEM培养中的HKC，换成无血清DMEM培养，加入TGFβ1的同时，加或不加不同浓度的抗HGF单抗，作用于2h后收集细胞于SDS标本缓冲液中，进行蛋白免疫印迹检测αSMA表述。
3、结果与对照组相比，TGFβ1能够刺激HKC表达αSMA，人HGF能够抑制TGFβ1诱导的HKC表达αSMA。经抗人HGF单抗孵育的人HGF加入培养液中，TGFβ仍然能够刺激HKC表达αSMA，说明，此时，抗人HGF单抗已经完全中和人HGF，使其失去抑制TGFβ1的作用。即使人HGF单抗能够封闭人HGF的生物学作用。
权利要求
1.一种肝细胞生长因子的测定方法，其特征在于测定的方法为首先建立抗肝细胞生长因子单克隆抗体和多克隆抗体，在此基础上应用酶联免疫检测方法测定肝细胞生长因子的浓度。
2.根据权利要求1所述的肝细胞生长因子的测定方法，其特征在于肝细胞生长因子单克隆抗体的制法为以肝细胞生长因子多次免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞株融合，得到杂交瘤细胞株，再将杂交瘤细胞株植入小白鼠腹腔内，待1～2周腹水形成后，收集腹水，经离心、纯化后即得到抗人肝细胞生长因子单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的肝细胞生长因子的测定方法，其特征在于酶联免疫检测方法为酶联吸附测定方法或酶联免疫印迹法。
全文摘要
肝细胞生长因子的测定方法是一种生物医学中对肝细胞生长因子进行方便、可靠的测定方法,该肝细胞生长因子的测定方法,其特征在于测定的方法为:首先建立抗肝细胞生长因子单克隆抗体和多克隆抗体,在此基础上应用酶联免疫检测方法测定肝细胞生长因子的浓度。肝细胞生长因子单克隆抗体的制法为:以肝细胞生长因子多次免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞株融合,得到杂交瘤细胞株,再将杂交瘤细胞株植入小白鼠腹腔内,待1～2周腹水形成后,收集腹水,经离心、纯化后即得到抗人肝细胞生长因子单克隆抗体。酶联免疫检测方法为酶联吸附测定方法或酶联免疫印迹法。
文档编号G01N33/68GK1376923SQ0211285
公开日2002年10月30日 申请日期2002年4月8日 优先权日2002年4月8日
发明者刘友华, 杨俊伟, 陈实平 申请人:刘友华, 杨俊伟, 陈实平