成纤维细胞生长因子-2结构类似物,其生产方法及应用的制作方法

专利名称：成纤维细胞生长因子-2结构类似物,其生产方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及成纤维细胞生长因子-2结构类似物及其生产方法，含有这些类似物及医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物，以及该组合物在治疗组织损伤中的应用。
多肽生长因子是细胞增殖和分化的激素样调节剂。已经从各种组织和细胞中分离并鉴定了许多生长因子，其中包括但不只限于表皮生长因子，血小板衍生的生长因子、神经生长因子、造血细胞生长因子、以及成纤维细胞生长因子。
成纤维细胞生长因子(FGF)最初是作为对BALB/c 3T3细胞具有生长促进活性的因子，从牛脑垂体组织中分离的(D.Gospodarowicz，Nature 249123，1974)。该分子对酸和温度敏感，并具有高的(碱性)等电点。后来发现从脑中分离的促细胞分裂因子与此前从脑垂体中分离的不同，因而基于它们具有相似的生物学活性和不同的等电点而分别称为酸性和碱性FGF(即aFGF和bFGF)。aFGF和bFGF是至少8种结构上相关的、具有肝素结合能力的分子家族的成员，它们可以选择性地激发包括中胚层细胞和神经外胚层细胞在内的许多细胞的生物学反应，这些细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞、肾上腺皮质细胞、成肌细胞及成骨细胞。已基于对细胞增殖和分化的调节活性及与FGF的序列同源性鉴定了另外7个FGF家族的成员，其中包括hst/k和int致癌基因，及称为FGF-5的前原癌基因。作为原始FGF家族成员，现将酸性和碱性FGF分别称为FGF-1和FGF-2，本说明书下文中将碱性成纤维细胞生长因子称为FGF-2。
除了刺激细胞生长外，FGF还可刺激许多类型的细胞以非有丝分裂方式发生不同的反应，例如促进细胞向受伤部位迁移(趋化因子活性)、促进新的血管生成、调节神经退化和存活性(神经营养活性)、调节内分泌功能以及刺激或抑制特异性细胞蛋白质表达、细胞外基质产生及细胞存活等(Baird，A.and Bohler，P.，Handbook of Exp.Pharmacol.，95(1)369-418，1990)。这些性质为使用FGF制备用来加速伤口愈合、神经组织修复、预防和治疗脑和心肌局部缺血(侧枝血管生成)的药物提供了基础。
牛FGF-2(bFGF-2)是具有154个的氨基酸的多肽。人FGF-2(hFGF-2)不同于bFGF-2在于其第121位氨基酸是苏氨酸(Thr)而不是丝氨酸(Ser)，第137位氨基酸是丝氨酸(Ser)而不是脯氨酸(Pro)。人或牛FGF-2分子可以包含7-11个氨基酸的N末端延伸部分，也可以是在N末端缺失1个或多个，例如大约4-30个氨基酸，并仍保留其生物学活性的分子。这些事实体现了FGF分子N末端的不均一性。
J.A.Abraham等人(Science 233545-548，1986；EMBOJ.，52523-2528，1986)首先克隆了牛/人FGF-2的核苷酸序列。在继后的许多研究中，为了进一步了解FGF分子结构与功能的关系，前体与产物的关系，以及分子的受体结合特性和三维空间结构(参见Eriksson，E.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883441-3445，1991；Zhu，H.et al.，Science25190-93，及美国专利5,491,220)已进行了大量工作。
为了改善野生型FGF分子的受体结合特异性，并进一步从中筛选适于作为FGF功能拮抗剂或激动剂的变异体，或者期望得到适于作为药物应用的抗聚合的和/或稳定化的变异体，已经在基础研究工作的基础上制备并公开了许多FGF突变体或结构类似物(例如参见美国专利5,175,147、5,288,704及欧洲专利申请EP-A 281,822和英国专利申请8821795.5)。日本专利公开号JP231428/86(相当于中国专利申请公开号CN101486A)公开了使用定点诱变技术分别将成熟的人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-2)序列第69和87位的半胱氨酸改变为丝氨酸，以期阻止分子间二硫键形成和多聚化作用。另外，文献还报道了用丝氨酸取代人白介素2(IL-2)中的特定半胱氨酸残基以有利于防止分子间聚合的方法(Science2241431，1984)。然而，丝氨酸是一种没有氨基基团的三碳原子氨基酸，所以难以使用某些多糖或纤维素或聚乙二醇与生物活性多肽分子的氨基反应基团结合，以便防止分子多聚化并提高其在水溶液中及在接受者体液内的稳定性。为此，有人提出将包括G-CSF和促红细胞生成素在内的生物学活性多肽分子中的一个或多个赖氨酸改变成其他氨基酸，以利于分子的聚乙二醇化(美国专利4,904,584)。
另一方面，虽然许多文献报道了在大肠杆菌中表达hFGF-2突变蛋白质的方法，但为了从大肠杆菌包含体中分离纯化所需的表达产物，往往因加入强蛋白质变性剂而导致产物失活。以前的研究工作表明，FGF-2如许多其他以重组技术得到的蛋白质一样，无论是在溶液状态下或冷冻干燥状态下，均很容易减低或丧失活性。因此，尽可能地减少原核细胞或酵母宿主体内包含体的形成数目，并增加可溶性部分中产物的得率是本领域亟待解决的问题。虽然Studier F.M.等人(Journal of Molecular Biology 189113-130，1983)首先发现利用T7启动子可有利于提高表达水平，但表达产物却缺乏足够的生物学活性(Paris，N.et al.，Biotechology and Applied Biochemistry 12436-449，1990)。此外，在我们的实验室进行的早期研究工作中发现，FGF分子与硫酸肝素的结合刚性大小和所使用的层析柱的组合次序，对分离和纯化宿主细胞可溶性部分中表达产物的收率具有很大影响。
本发明人从牛脑垂体中克隆了编码具有bFGF-2活性之多肽的DNA序列，并在大肠杆菌宿主中成功地表达了所说的多肽。该多肽产物是以N端上游区连接有LacZα之部分序列(约17个氨基酸)的“融合”蛋白质的形式被表达的。在此基础上，又经定点人工诱变，将bFGF-2编码序列中第121位丝氨酸和第137位脯氨酸密码子分别改变为苏氨酸和丝氨酸密码子，并删除bFGF-2 DNA编码序列之N末端上游非FGF结构基因的序列，从而得到编码hFGF-2)的DNA序列，并在原核宿主中高水平表达了hFGF-2。为了进一步改善hFGF与硫酸多糖结合的能力和稳定性，提高其对抗分子间聚合的能力，以及对低pH和热的耐受性，本发明对hFGF-2的一级结构进行了基因水平上的位点特异性修饰，用除半胱氨酸以外的其他氨基酸，较好是用精氨酸取代暴露于FGF-2分子表面的半胱氨酸，得到hFGF-2的结构类似物(以下有时简称FGF-2m)。经初步实验结果表明，该类似物具有较好的硫酸多糖结合刚性，以及对低pH和热的耐受性。
因此，本发明的一个目的是提供一种以融合蛋白质形成产生的，具有成纤维细胞生长因子活性的多肽，该多肽具有如

图1或图2所示的氨基酸序列。
根据本发明这一个目的的一个实施方案，其中所说的融合蛋白质包含实质上完整的人或牛FGF-2的氨基酸序列，并在其N端连接有大约17个氨基酸的非FGF-2结构蛋白质序列，所说的非结构蛋白质序列是由用于在原核宿主中启动表达的LacZα肽基因的部分序列编码的，其有利于FGF-2翻译的起始，提高可溶性部分中活性FGF-2的表达效率。
根据本发明这一目的的融合蛋白质形式的hFGF-2，其具有大约18.5KD的分子量，且等电点约为9.3-9.6。
根据本发明这一个目的的融合蛋白质形式的hFGF-2，该蛋白质是通过对相应的bFGF-2的DNA编码序列进行位点特异性诱变得到的。
本发明的再一个目的是提供一种hFGF-2的结构类似物或变异体(FGF-2m)，该类似物具有如图3所示的氨基酸序列。具体地说，该类似物与天然hFGF-2相比，位于其分子三维空间结构暴露部分第78位和96位上的两个半胱氨酸分别被碱性氨基酸特别是精氨酸或赖氨酸所取代。
本发明的再一个目的是提供生产具有成纤维细胞生长促进活性之多肽的方法，该方法包括(1)得到编码具有成纤维细胞生长因子-2之活性多肽的DNA序列；(2)对所说的DNA序列进行适当地修饰；(3)将经过修饰的DNA序列与适当的表达载体相连接；(4)用得到的重组表达载体转化适当的原核宿主并筛选被转化的重组体细胞；(5)在适于表达所说的具有成纤维细胞生长因子活性之多肽的条件下培养所说的被转化的细胞，并从培养基和细胞溶胞产物中分离和纯化所说的多肽。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的DNA序列为图1所示的DNA序列。
根据本发明的这一目的的一个实施方案，其中所说的对DNA编码序列的修饰是删除bFGF-2之DNA编码序列的N末端上游非FGF结构基因的序列。
根据本发明这一目的的一个实施方案，其中所说的对DNA编码序列的修饰是分别将编码牛FGF-2第121位丝氨酸的密码子改变为编码苏氨酸的密码子，并将编码bFGF-2第137脯氨酸的密码子改变为编码丝氨酸的密码子，从而得到如图2所示的DNA序列。
根据本发明这一目的的另一个实施方案，其中所说的对DNA编码序列的修饰是将编码人成纤维细胞生长因子-2第78和96位半胱氨酸的密码子改变为编码碱性氨基酸的密码子，特别是编码精氨酸或赖氨酸的密码子。
根据本发明的这一目的的这一个优选实施方案，其中所说的编码FGF-2结构类似物的DNA序列具有如图3所示的DNA序列。
根据本发明这一目的的优选实施方案，其中所说的克隆表达载体是pUC18和pKK123-33。
根据本发明这一目的的另一个优选实施方案，其中所说的原核宿主是大肠杆菌。
本发明的再一个目的是提供含有本发明具有人成纤维细胞生长因子-2活性的多肽以及医药上可接受之载体或赋形剂的药物组合物。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中除作为基本活性成分的人FGF-2或其结构类似物外，还可含有选自表皮生长因子、脑衍生的神经生长因子及神经生长因子的一种或多种其他生长因子。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的药物组合物还可含有选自稳定剂、活性蛋白质保护剂、皮肤渗透剂和自由基清除剂的一种或多种辅助成分。
根据这一优选实施方案，其中所说的稳定剂包括但不只限于聚乙二醇、羧甲基纤维素、硫酸多糖、硫酸葡聚糖的谷胱甘肽。
根据这一优选实施方案，其中所说的活性蛋白质保护剂包括但不只限于人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸及金属阳离子。并且其中优选的氨基酸是甘氨酸、丝氨酸或赖氨酸，且优选的金属阳离子是Zn2+、Mn2+、Mg2+和Cu2+。
根据这一优选方案，其中所说的皮肤渗透剂包括但不只限于二甲基亚砜或卓月桂氮卓酮，并且所说的自由基清除剂包括但不只限于超氧化物歧化酶及其衍生物。
本发明的再一个目的是涉及按本发明方法制备的具有人成纤维细胞生长刺激活性的多肽及含有该多肽的药物组合物在预防或治疗组织损伤中的应用。
根据本发明这一目的的优选实施方案，其中所说的受损伤的组织可以是皮肤组织、肌肉组织、粘膜组织、神经组织或骨组织。
图1显示编码bFGF-2的DNA序列及由其编码的相应的氨基酸序列。其中核苷酸位置1至51为编码大肠杆菌LacZα肽之一部分的核苷酸序列，下划线标示人与牛FGF-2序列的不同处；并且其中核苷酸位置52至516区为编码牛FGF-2的核苷酸序列。
图2显示编码hFGF-2的DNA序列及由该DNA序列编码的相应的hFGF-2的氨基酸序列。
图3显示编码hFGF-2结构类似物的DNA序列及由该DNA序列编码的相应的氨基酸序列。
图4显示重组表达质粒pUC18-bFGF-2的构建。
图5显示重组质粒M13mp19-bFGF-2的构建。
图6显示重组质粒M13mp19-hFGF-2的构建。
图7显示重组表达载体pUC18-hFGF-2的构建。
图8显示重组表达载体pUC18-bFGF-2m的构建。
图9显示重组表达载体pUC18-hFGF-2m的构建。
图10显示重组表达质粒pKK-bFGF-2的构建。
图11显示重组表达质粒pKK-hFGF-2的构建。
图12显示重组表达质粒pKK-bFGF-2m的构建。
图13显示重组表达质粒pKK-hFGF-2m的构建。
图14显示在非还原条件下，对按照本发明方法制备的FGF-2及其结构类似物所作十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的结果。其中泳道1和2分别显示从转化体pUC18-hFGF-2m和pKK-hFGF-2m得到的表达产物，泳道4-7分别显示从转化体pKK-hFGF-2、pKK-bFGF-2m、pKK-bFGF-2m纯化的蛋白质表达产物和Promega公司生产的rhFGF-2标准品，泳道3显示蛋白质分子量标准品。
图15显示使用纯化后的FGF-2及其突变分子(FGF-2m)与鼠抗人FGF-2单克隆抗体所作Western印迹分析的结果。其中泳道1-4分别是从重组体pKK-hFGF-2m、pKK-hFGF-2m、pKK-bFGF-2、pKK-hFGF-2表达的蛋白质产物，泳道5为rhbFGF标准品(Promage公司生产)，泳道6为重组体PUC18-hFGF-2m表达的蛋白质产物。
图16显示以3H掺入法检测的本发明的FGF-2结构类似物对低pH值的耐受性。
图17显示以3H掺入法检测的本发明的FGF-2结构类似物对升高的温度的耐受性。
本发明提供了新的、具有相对稳定的hFGF-2活性的多肽，其特征在于该多肽氨基酸一级结构中第78位和第96位上的半胱氨酸分别被选自精氨酸或赖氨酸的碱性氨基酸所取代。经过如此的取代后，一方面可以防止分子内和/或分子间形成二硫键，另一方面可以为对FGF-2分子进行聚乙二醇化均质修饰提供条件，从而大大提高DNA重组表达之蛋白质的活性保留时间和稳定性。以下详细描述本发明的优选实施方案。
为了制备本发明的FGF-2和其结构类似物，首先用本领域技术人员熟知的方法从牛或人脑垂体组织中制备总RNA，然后用oligo-dT纤维素进一步纯化制得mRNA。合成与FGF-2 mRNA 3′端部分序列互补的寡聚DNA片段，以mRNA为模板，在反转录酶的催化作用下制备bFGF-2的第一条cDNA链。然后以第一条cDNA链为模板，通过常规的PCR扩增技术制备编码bFGF-2的双链DNA。选择适当的克隆载体，如质粒DNA(如pUC18或pUC19)或噬菌体双链DNA(如M13噬菌体系列)或噬菌粒DNA(如Bluescript，pGEM，pUC118或pUC119)，经能产生平末端的限制性内切酶(如HincII或SmaI)消化后，在T4 DNA连接酶的作用下将PCR扩增得到的DNA连接到所选择的载体上。通过CaCl2介导或电穿孔法等常规方法将连接产物导入大肠杆菌宿主细胞中，然后在含Amp、IPTG、X-Gal的LB培养基(0.1％胰蛋白胨，0.05％酵母提取液，0.1％NaCl，pH7.2)的平皿上培养，得到相应的菌落或噬斑。将所得到的白色菌落或无色透明噬斑转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，对其进行变性处理以将DNA固定在膜上。然后在含有32P标记之探针(优选的探针序列为长达60bp并与bFGF-2编码序列完全互补的DNA片段)的溶液中保温该滤膜以形成膜上之DNA与探针之间的杂交体。例如可在含有6×SSC(1×SSC是将8.77g NaCL和4.41g柠檬酸钠溶解于1升水中而制成的)、1％SDS、100μg/ml鲑精子DNA和5×Denhardt′s试剂(含有0.1％牛血清白蛋白、各0.1％聚乙烯吡咯烷酮和FicoII)的溶液中，于65℃使膜上的DNA与探针杂交过夜。杂交后，洗掉非特异性吸附的部分，然后进行放射自显影，以鉴定与探针形成杂交体的克隆。重复这一步骤直至得到单一的已形成分子杂交体的克隆。用限制性酶Nco I消化杂交筛选到的重组体DNA，并对所得到的消化产物进行电泳分析，以确定插入有外源DNA的片段与已知的bFGF-2 cDNA大小完全一致。
然后测定如此得到之基因的碱基序列，以证实其是否与预期的编码具有bFGF-2活性之多肽的基因完全相同。在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，可以用常规方法从重组体大肠杆菌细胞中提取并用限制性酶消化所得到的质粒，分离其中的插入片段并将其亚克隆到M13噬菌体载体(本发明中优选的载体为M13mp19)中，然后用Sanger等人的双脱氧链终止法(T.Maniatis et al.，MolecularCloning，A laboratory Manual，2nd ed.，Chapter 13，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)测定被插入之片段的碱基序列。可以将如此得到之基因的碱基序列与所需的编码具有bFGF-2活性之多肽的基因(参见图2和3)碱基序列相比较，以进一步证实两者的序列完全相同。如果所获得的基因与报道的序列(J.A.Abraham et al.，Science，233545-548，1986)有差异，如部分序列的缺失或有错义突变或无义突变，可根据文献报道的已知序列合成相应的定向插入或定点诱变引物，通过含尿嘧啶(U)DNA单链模板法(Kunkel et al.，Methods Enzymol.，154367，1987；Kunkel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82488，1985)或PCR突变法将错误的序列诱变为正确的序列。
本发明人在成功地克隆了bFGF-2基因的基础上，比较了hFGF-2基因序列(J.A.Abraham et al.，EMBOJ.，52523-2528，1986)与克隆得到之bFGF-2基因(见图1)之间的差异，按照Kunkel等人所述的寡核苷酸介导的含尿嘧啶(U)单链模板法制备携带有bFGF-2基因的重组体M13mp19-bFGF-2，以其作为含尿嘧啶(U)的单链DNA模板，同时设计并合成将bFGF-2第121位丝氨酸(TCC)突变为苏氨酸(ACC)的引物P121以及将bFGF-2第137位脯氨酸(CCC)突变为丝氨酸(TCC)的引物P137。然后将制得的含U模板与两个诱变引物(P121和P137)一起退火，继而在DNA聚合酶I大片段(Klenow酶)以及T4 DNA连接酶的共同作用下，于12℃下反应过夜，并用所得反应混合物转化JM109感受态细胞。以PCR检出诱变法初步筛选，并经DNA序列分析进一步确证所选择得的重组体为在第121位和第137位均已突变为编码hFGF-2活性多肽的重组体，即M13mp19-hFGF-2。
本发明人在成功地克隆了牛/人FGF-2后，按照上述的寡核苷酸介导的含U单链DNA模板法进一步对FGF-2氨基酸序列中的个别氨基酸，特别是第78位和96位其侧链暴露在分子三维空间结构表面的半胱氨酸进行了位点特异性修饰，将这些编码半胱氨酸的密码子改变为编码碱性氨基酸，如精氨酸或赖氨酸，而不是结构上与半胱氨酸相似但不带巯基的丝氨酸的密码子。本发明优选的碱性氨基酸为精氨酸，并且优选的密码子为大肠杆菌偏爱的密码子CGT。
本发明人在成功地制备了牛/人FGF-2及其结构类似物之基因的基础上，进一步用适当的限制性内切酶消化并用T4 DNA连接酶将所需消化产物克隆到带有强启动子(lac、tac、trc、T7、PR、PL、lpp等)的大肠杆菌高效表达载体(如pUC18，pKK223-33，pBV220，pT7-7，pIN-III-OmpA)中。这里应特别强调指出的是，在本发明的早期工作中，FGF-2的表达产物是以融合的形式制备得到的，即为提高表达产物的可溶性组分的比例以及FGF-2的表达量，在FGF-2结构基因的上游区接上一个编码衍生于细菌细胞本身之蛋白质的序列。本发明优选的细菌细胞蛋白质序列为LacZα肽的N端前17个氨基酸序列。融合后该短肽对FGF-2的生物活性影响不大。为此目的优选的表达载体是pUC18。
另外，为了简化纯化步骤，进一步增加可溶性部分中活性多肽产物的得率，可在本发明的人/牛FGF-2或其结构类似物基因的N未端上连接一个分泌信号序列，并在该信号序列的5′端加入一个驱动表达产物向细胞周质中分泌的启动子，例如衍生于大肠杆菌表面膜蛋白(例如OmpA)、碱性磷酸酶(pho A)等的前导信号肽。
另外，为制备对人有较低或无抗原性的FGF-2及其结构类似物，可将FGF-2以非融合蛋白质的形式克隆到高效表达载体上，优选的表达载体为pKK223-3、pBV220、pT7-7，或者在融合序列与FGF-2或其结构类似物之间插入相应的较特异的蛋白酶水解位点，优选的蛋白酶水解位点为Xa的识别位点。
还需强调指出的是，为了尽可能地减少FGF-2及其结构类似物的表达产物形成无FGF-2生物学活性的不溶性形式的分子，可以采用非温控性的诱导产物表达机制。在使用适当的诱导物或在适当的诱导条件下并于较低温度下诱导FGF-2及其结构类似物之基因的表达时，本发明优选的诱导物为IPTG，优选的较低温度为25-30℃。如果选用的启动子受温度敏感型阻遏物(如Clts857)调控，可采用λ启动子PR及PL，在较低温度下提高pH值以使阻遏物失活，从而启动转录。在这种情况下，优选的较低温度为25-30℃，优选的pH值为8.5-9.0。
我们使用本发明的融合蛋白质形式的牛/人FGF-2制成外用药物，并没有发现因异源肽片段(约含17个氨基酸)所导致的包括抗原性反应的在内的任何不良反应。因此，以融合蛋白质形式或在非温度条件下表达牛/人FGF-2的方法也将包括在本发明的范围内。
将得到的hFGF-2基因或其突变序列插入到适当的质粒载体中并用所得到的重组载体转化适当的宿主细胞。然后在适于表达具有人成纤维细胞生长因子活性之多肽的通用条件下，培养所得到的转化体细胞。可在含有氨苄青霉素的LB培养基(0.1％胰蛋白胨、0.05％醇母提取物，0.1％NaCl，pH7.2)中将转化体培养过夜。培养后收获细胞，用超声波破碎细胞，离心分离细胞的可溶性部分并通过阳离子交换、肝素亲和以及凝胶过滤层析分离以纯化之，如此获得的牛/人FGF-2或其结构类似物产物具有天然FGF-2的生物学活性，且产物的纯度可达95％-99％。本发明所采用的离子交换介质包括但不只限于CM-Sepharose Fast Flow、SP-Sepharose Fast Flow或Bio-Rex70树脂，其中优选的是Bio-Rex 70树脂(Bio-Rad生产)。所采用的亲和层析介质包括但不只限于Heparin-Sepharose CL-6B或Heparin-HyperD(Bio-Rad Co.)，但优选的是Bio-Rex 70 Resin。所采用的凝胶过滤介质包括但不只限于Sephadex G75，Superdex 75 prep grade，其中优选的是Superdex 75 prep grade(由Pharmacia生产)。
可按照本领域已知的3H-胸腺嘧啶掺入法(Klagsburnet cl.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，82805-809，1985)或噻唑蓝(MTT)染色法(Armelin HA.，Pituitary extracts and steroidhormones in the control of 3T3 cell growth，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 702702-2706，1973)，使用重组大肠杆菌的提取物作为试验样品，以刺激指数(3H-TdR渗入法)或细胞最大半数增殖浓度(ED50)(MTT染色法)检测本发明的hFGF-2或其结构类似物的生物学活性。
使用3H掺入法或噻唑蓝(MTT)染色法测定FGF-2结构类似物在不同温度以及不同pH值下对BALB/c 3T3细胞的生长刺激活性，并使用如SDS-PAGE、Western Blot、HPLC等方法检测其理化性质。结果发现，对FGF-2进行上述的修饰可以使分子的稳定性和对抗多聚化的能力得以明显提高，从而使本发明的FGF-2及其结构类似物广泛应用于临床预防和/或治疗目的成为可能。
近年来，已就FGF-2分子的结构-功能关系，特别是三维空间结构对FGF-2活性及稳定性的影响进行了大量研究。例如自八十年代所进行的许多FGF-2分子一级结构分析表明了N未端氨基酸序列的多样性。同时还有许多研究者对处于FGF三维空间结构中表面暴露位置上的半胱氨酸对分子的稳定性和多聚化的影响、分子中某些片段的缺失对其生物学活性的增强或减弱作用、以及分子表面环(surface loop)区域中一个或多个氨基酸的取代对分子聚乙二醇化作用的影响等进行了许多深入的研究。这些研究为将已发现对许多组织，特别是对神经组织细胞具有生长促进作用的FGF用于临床治疗目的提供了依据。
本发明人在成功地克隆了牛/人FGF-2后，进一步对FGF-2氨基酸序中的个别氨酸酸，特别是第78位和96位其侧链暴露于分子三维空间结构表面的半胱氨酸进行了位点特异性修饰，将这些半胱氨酸分别改变为碱性氨基酸，如精氨酸或赖氨酸，而不是改变为结构上与半胱氨酸相似但不带巯基的丝氨酸。结果令人惊奇地发现，对FGF-2进行这样的修饰使分子的稳定性和对抗多聚化的能力得以明显提高，从而进一步增强了我们将本发明的FGF-2和其结构类似物广泛应用于临床预防和/或治疗目的的信心。
另外，本发明人还对FGF-2及其结构类似物的分离与纯化进行了有益的改进。可以以不同方式联合使用各种常规层析技术从培养的转化体细胞和/或培养基中纯化本发明具有FGF-2活性的多肽或其结构类似物。例如可在破碎细胞后溶解所需的多肽，然后从溶胞物中层析纯化所需的目的产物。所使用的层析方法包括但不只限于离子交换层析、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析和亲合层析。其中亲和层析包括但不只限于金属离子例如铜或锌铬合的亲和柱层析和结合了对FGF-2有高度亲和力之硫酸肝素的Sepharose柱层析。
用于本发明的疏水柱层析介质是可共价连接正(异)丁基、辛烷基和苯基等的琼脂糖树脂，例如可以是购自Phamacia Co.Sweden的Butyl Sepharose Phenyl SepharoseCL-4B等。可以使用本领域已知的方法通过1-氯-2，3-环氧丙烷或2，3-二溴丙醇作为间隔臂，将上述基团共价结合到Sepharose固相基质上。在以疏水相互作用层析分离FGF-2或其结构类似物时，可以使用等度或梯度洗脱，但较好是使用选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液，硝酸盐缓冲液的梯度缓冲盐溶液，以50-600cm/小时的流速进行洗脱。使用的浓度梯度一般为3.5-0M，洗脱液的pH范围为6-9。此外，疏水相互作用层析也可以使用其他类型的固相基质，例如Sephadex微晶纤维素或其他无机刚性基质。所使用的配基也可以是聚乙二醇和带多醚键的其他类型的固相基质。
为进行金属络合物亲和层析，可以使用偶联有Zn2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+等金属离子的固相树脂，但较好是偶联Zn2+的Sepharose或Sephadex羧甲基纤维素树脂柱(例如购自Pharmacia Co.，Sweden的Chelating SepharoseFast Flow)。可在大约pH7-9条件下，以大约250-370cm/小时的流速进行选脱。可使用含有NaCl浓度梯度的洗脱液进行洗脱。
用于分离FGF-2的最重要的层析基质是携带共价交联的硫酸多糖，或琼脂糖、葡聚糖或纤维素的基质，例如产品名为Sepharose-CL 6B或Sepharose 6 Fast Flow，或购自Cellulofine的亲和层析树脂。可用NaCl梯度洗脱液进行洗脱。我们依次使用疏水相互作用层析-金属络合物亲合层析-硫酸多糖亲合层析纯化按本发明方法制备的FGF-2或其结构类似物，产物纯度达到98％以上。
在某些表达系统中，所表达的FGF-2或其类似物在重组体细胞中是以不可溶性包含体的形成积聚的。在这种情况下，可在回收并用温和的变性剂(例如尿素)溶解后，立即除去变性剂以使FGF-2或其结构类似物重新折叠并恢复其原有活性，然后再基本上按前述方法进行层析分离，以得到具有所需活性的多肽。
本发明进一步涉及含有FGF-2或FGF-2m的药物组合物，制备该药物组合物的方法，以及该药物组合物在治疗组织损伤中应用。可以使用按照本发明所述方法制备的FGF或FGF-2m作为主要成分，与药学上可接受的赋形剂或稀释剂，以及其他辅助成分相混合，制成适于临床治疗应用的药物组合物。可以按照医药工业领域已知的方法将本发明的药物组合物配制成可供静脉内、肌肉内、腹腔内、脑脊髓腔内注射的注射液，或者适于口服给药的片剂、溶液剂，以及适于外用的喷雾剂、乳剂、软膏、悬浮剂或栓剂。
在制备适于胃肠道外途径给药的溶液时，所使用的辅助成分可以包括稀释剂或赋形剂，例如可使用无菌水、等渗NaCl或蔗糖溶液或低浓度(例如1-10mM)PBS作为稀释剂和赋形剂。可以使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用选自人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸例如甘氨酸或丝氨酸或赖氨酸及金属阳离子例如Zn2+、Mn2+、Mg2+或Cu2+的一种或多种物质作为活性蛋白质保护剂。可经冷冻干燥，将本发明的药物组合物制成冻干粉末，使用时加入稀释剂重新配制并尽快使用之。特别是在使用本发明的FGF结构类似物作为基本活性成分的情况下，可以使用选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、硫酸多糖、肝素、多聚赖氨酸等高分子化合物，以及可与FGF分子中的半胱氨酸形成二硫键的谷胱甘肽作为稳定剂，用以防止FGF分子在溶液中或病人血流中被迅速降解，或在储存期间发生分子多聚化而减少或丧失其生物学活性。在制备适于口服给药的片剂、粉未剂或微胶囊剂时，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维素等作为赋形剂，另外其中还可以加入蛋白酶抑制剂。可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分制备微胶囊，或脂质体包囊剂。
在局部外用的情况下，最好将本发明的FGF类似物加于含水介质中，与上述各种适用的辅助成分及适当的皮肤渗透剂混合，按已知方法制成喷雾剂。在制备喷雾剂时最好使用可以在皮肤或创伤表面形成保护膜并具有稳定功能的基质成分。另外，也可以将本发明含有FGF-2或其结构类似物的药物组合物加在化妆品工业中已知的必要基质中制成皮肤保护剂，例如制成乳剂、霜剂、洗剂、面膜、软膏等形式的皮肤保护剂。另外，还可以在这些皮肤保护剂基质中加入自由基清除剂例如超氧化物歧化酶(SOD)和其衍生物，以及选自二甲基亚砜和卓月桂氮卓酮等的皮肤渗透剂。这样的皮肤保护剂除具有常规化妆品的功能外，还具有预防和/或治疗局部，特别是身体暴露部位组织损伤和/或感染的功能，以及刺激局部组织中纤维细胞和上皮细胞增殖，防止皮肤老化和皱缩的功能。
最后还应指出的是，根据使用目的的不同，本发明的药物组合物中除含有作为主要活性成分的FGF-2或FGF-2m外，还可含有其他相关的生物学活性蛋白质，例如表皮因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经生长因子(BDNF)，这些活性因子可与FGF-2协同作用，进一步提高本发明药物组合物的治疗效果。
以下借助实施例并参照附图进一步举例描述本发明，这些实施例并不以任何方式限定本发明待批权利要求的范围。
实施例1编码人FGF-2活性多肽之cDNA的制备本实施例描述编码hFGF-2活性多肽之DNA序列的制备方法。
1.分离编码bFGF-2活性多肽的mRNA。取牛脑垂体组织于液氮环境下捣碎，并悬浮于RNA提取缓冲液(含有0.14M NaCL，1.5mM MgCL2，10mM Tris-HCL(pH8.6)，0.5％NP-40，1mM二硫苏糖醇(DTT)和1000单位胎盘RNA酶抑制剂)中，向悬液内加入5倍体积的硫氰酸胍匀浆缓冲液(4.0M硫氰酸胍、01mM Tris-HCL、1％β-巯基乙醇)后，用Polytron匀浆机(Brinkmann公司生产)高速匀浆2分钟。向匀浆液内加入十二烷基肌氨酸钠至终浓度为0.5％，5000g离心10分钟后将所得上清移入装有5.7M CsCl、0.01M EDTA(pH7.5)垫层的干净离心管的顶部，使用SW60转头以4000rpm离心12小时后得到RNA沉淀物。可以直接使用所得到的RNA，或者可以通过Oligo-dT柱(Pharmacia)纯化得到mRNA(T.Maniatis，et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd ed.，Chapter 7，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)。
2.cDNA的制备。根据文献中已公开的bFGF-2 mRNA之5′端编码区和3′端非编码区的碱基序列(AbrahamJ.A.et al.，Science 233545-548，1986)，设计并合成一对PCR扩增引物，即P55′CATGGCCGCCGGGAGCATC 3′和P35′CATGGATGTAGTTAATCTG 3′。
使用按上述方法制得的mRNA作为模板，以P3作为引物，在鼠源反转录酶(Promega公司生产)的作用下，由4种核苷酸合成bFGF-2的第一条cDNA链。然后以P5和P3为引物，以第一条cDNA链为模板，经35轮PCR循环(92℃变性1分钟，50℃退失1分钟，72℃延伸1分钟)制得bFGF cDNA的扩增产物。其中使用的PCR反应混合物为50ul总反应体积中含有20pmol上述引物，2μlTaq聚合酶、5μl 10×缓冲溶液，各5μl(250uM)dNTP，并加蒸馏水至50μl。
然后用限制性核酸内切酶Hinc II消化克隆载体pUC18(Promega公司生产)得到线性化的平端载体，向此消化产物中加入0.1ug上述扩增产物和1ul T4 DNA连接酶，于14℃下连接过夜。连接后，用所得反应混合物转化经CaCl2处理的大肠杆菌JM109感受态细胞。然后，利用已知的α-互补筛选法筛选出携带已被插入之基因的白色菌落。用EcoRI和AccI切割所得菌落的质粒DNA，从中鉴定出能切下正向插入约0.67Kb DNA片段的克隆，并将其定名为pUC18-bFGF-2(参见图4)。
3.hFGF-2基因的制备。根据编码人FGF-2的DNA序列(Abraham J.A.et al.，EMBO J.52523-2528，1986)，在已制备的hFGF-2基因序列的基础上设计并合成下列两个合成寡核苷酸序列，其中一个是诱导hFGF-2基因序列中编码第121位丝氨酸的密码子(TCC)改变为编码苏氨酸的密码子(ACC)引物P1215′TCCTAGGAAATACACCAGTTGGTAT 3’；另一个是诱导hFGF-2基因序列中编码第137位脯氨酸的密码子(CCC)改变为编码丝氨酸的密码子(TCC)的引物P1375′TATAAACTTGGATCCAAAACGGGG 3′。同时，按照Picard等人(Nucleic Acids Research 222587-2591，1989)中所述的原则和方法，设计并合成检出第121和第137位氨基酸突变的5′端检出引物P121s。5′TCAAAGAAATACA 3′和P137s5′TATAAACTTCCAT 3′。
为了对牛FGF-2进行位点特异性诱变，首先从按前述方法制得的包含bFGF-2编码序列的重组体pUC18-bFGF-2中切下大约1.0kb的EcoRI-Hind III片段，借助T4 DNA连接酶将该片段连接到M13mp19噬菌体载体(Pharmacia生产)上，然后用所得到的重组噬菌体载体M13mp19-bFGF-2转化大肠杆菌JM109，以制备用于以PCR方法检测突变的双链DNA模板和用于序列分析的单链DNA。
然后按照Kunkel T.A.等人(Methods Enzymol，154367，1987；KunkelT.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488，1985)所述的方法，制备重组体M13mp19-bFGF-2的含尿嘧啶的单链DNA模板，同时加入已在T4噬菌体多核苷酸激酶作用下未端磷酸化的引物P121和P137并与之退火。向退火混合物中加入Klenow酶、T4 DNA连接酶以及ATP和dNTP(四种核苷酸)，于16℃下保温过夜。然后用所得到的反应混合物转化大肠杆菌JM109的感受态细胞，得到含有复制型(双链)DNA的转化体细胞。
培养并增殖转化体细胞后从中挑选数个菌落，用碱裂解法提取复制型DNA，从而完成由bFGF-2到hFGF-2的诱变(参见图6)。
然后，按照文献中已描述的方法(Picard V.et al.，Nucleic Acids Research 222587-2591；Newton C.R.et al.，Nucleic Acids Research 172503-2515，1989)，以PCR技术检验是否已发生所预期的点突变。该方法中，使用上述双链DNA作模板，在前述引物对P121s和P3，以及P137s和P3的引导下进行PCR扩增。将扩增产物加于1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳分离，结果可见同时存在有扩增到600bp及550bp的重组体，从而证实bFGF-2第121位和第137位氨基酸已突变为hFGF-2的相应氨基酸。为了进一步证实已发生了上述正确突变，使用荧光素标记的通用引物，以Sanger等人的双脱氧链终止法(Sanger.F.et al.，J.Mol.Biol.94441，1975)测定突变分子的DNA序列，结果显示PCR方法检出的经诱变的DNA序列携带所需的突变序列(参见图2)。
4.对人/牛FGF-2基因序列的定点诱变。基本上按照上述方法对人或牛FGF-2的DNA编码序列进行定点诱变以将编码第78和第96位半胱氨酸的密码子(TGT)改变为编码精氨酸的密码子(CGT)。为此目的，分别设计并合成两个用于诱变的寡核苷酸引物P785′ATCAAAGGAGTGCGTGCAAACCGT3′和P965′CTAGCTTCTAAACGTGTTACAGAC3′。
同时设计并合成两个以PCR方法检测相应突变的检测引物P78s5′ATCAAAGGAGTGC 3′和P96s5′CTAGCTTCTAAAC 3′。
然后分别制备M13mp19-hFGF-2转化体的含尿嘧啶单链模板，使用M13mp19作为载体，按照上文第3部分中所述的方法制备携带编码第78和第96精氨酸密码子之hFGF-2及bFGF-2结构类似物编码序列的大肠杆菌JM109转化体细胞，并将其它名为M13mp19-hFGF-2m和M13mp19-bFGF-2m。经核苷酸序列分析，证实所筛选到的重组体携带有所需的FGF-2m的基因序列。
实施例2野生型FGF-2及FGF-2结构类似物之表达载体的构建为了构建用于在原核宿主细胞中表达野生型FGF-2或FGF-2结构类似物的重组表达质粒，首先用限制性内切酶EcoR I和Hind III从如上得到的转化体所携带的重组质粒中切下约1.0kb的编码人或牛FGF-2或其结构类似物的DNA片段，使用T4 DNA连接酶将该DNA片断连接到用同样酶切割的表达载体pUC18上。将所得重组质粒转化到大肠杆菌JM109感受细胞后，得到分别包含FGF-2和FGF-2m的重组体细胞。各重组质粒的构建参见图4-9。
为了构建以非融合蛋白形式表达野生型FGF及其结构类似物的重组体，合成用于PCR扩增的引物PE5′GAATTCCATGGCCGCCGGGAGCATC 3′和PP5′CCTGCAGTTATCAGCTAGACAT 3′，使用按上述方法制得的已经过适当修饰的编码人FGF-2或FGF-2m的DNA序列编码区作为模板，以PCR方法得到已删除了非FGF-2或其结构类似物编码区的DNA编码序列。用限制性内切酶EcoR I和Pst I切出带有粘性未端的片段(约0.47kb)后，将该片段连接到用同样酶切割的带有强启动子(tac)及转录终止序列的表达质粒pKK223-3(Pharmacia公司生产)上，得到分别定名为pKK-bFGF-2、pKK-hFGF-2、pKK-bFGF-2m和pKK-hFGF-2m的重组表达质粒(参见图10-13)。将如此制得的重组表达质粒分别转化到感受态大肠杆菌JM109细胞中，得到相应的转化体细胞。
已按照用于专利程序微生物保藏布达佩斯条约的规定于1996年12月27日将本发明的大肠杆菌JM109pUC18-hFGF-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其保藏登记为CGMCC No.0286。
实施例3FGF-2及其结构类似物蛋白质的表达和纯化为了在摇瓶培养条件下在大肠杆菌宿主细胞内表达并产生本发明的FGF-2和其结构类似物，分别将携带pUC18-bFGF-2、pUC18-hFGF-2、pUC18-bFGF-2m、pUC18-hFGF-2m、pKK-bFGF-2、pKK-bFGF-2m、pKK-hFGF-2、pKK-hFGF-2m的JM109转化体划线接种于含有100ug/1ml氨苄青霉素的LB固体培养基(1.0g胰蛋白胨、0.5g醇母提取物、1.0g NaCL、1.5g琼脂糖溶于100ml蒸馏水中经高压灭菌配制而成)上，于37℃下培养过夜。过夜后，挑取阳性菌落并分别接种于5ml LB液培养基中，30℃下振荡培养12小时，得到种子培养物。用10mMPBS按1∶100比例稀释该种子培养物后，加入含500mlLB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的2.5升培养瓶中，于30℃下振荡培养5小时。然后向其中加入300uMIPTG，在30℃下继续振荡(200rpm)培养6小时，以促进FGF-2或其类似物的产生。
收集如此得到的培养液，于4℃下以8000rpm离心10分钟收获细胞。按10ml/g湿重的量向收获的细胞中加入菌体裂解缓冲液(每升含0.1M NaCl、10mM EDTA和20mM磷酸盐缓冲液(PB)，pH7.0)，使用高压匀浆器(Shp 60/60)，以20-25MPa的初始压力和50-60MPa的终压力裂解细胞。4℃下，以18,500rpm离心30分钟并收集上清液。
将所得上清液加于已用菌体裂解缓冲液平衡过的Bio-Rex 70树脂(Bio-Rad生产)装填的层析柱(3cm×5cm)上进行离子交换层析，首先用上述柱平衡缓冲液洗脱，当280nm吸收值为零时，换用洗脱缓冲液(每升含0.6MNaCl、20mM PB，pH7.0)洗脱含FGF-2活性的粗提物。将此粗提物过已用平衡缓冲液(0.6mM NaCl，20mMPB，pH7.0)平衡过的Heparin Hyper-D(BiO-Rad公司生产)肝素亲和层析柱(5cm×3cm)。对于野生型FGF-2，用1.0M NaCl+20mM PB(pH7.0)溶液继续洗脱肝素结合能力较弱的杂蛋白，然后换用2.0M NaCl+20mM PB(pH7.0)溶液洗脱含FGF-2活性的蛋白质。对于FGF-2m，则使用1.5-2.5M NaCl梯度进行洗脱。最后，再将通过肝素亲和柱洗脱的洗脱物加于已用1.0M NaCl+20mM PB(pH6.5)平衡过的Superdex 75凝胶过滤柱(80cm×1.6cm)上并收集具有最大吸收(280nm)的峰值部分，得到纯度达95％以上的本发明的FGF-2和FGF-2m表达产物。
为了证实如此纯化的FGF-2或FGF-2结构类似物的均质性和免疫活性，对洗脱的活性组分进行非还原SDS-PAGE电泳分析(见图4)和Western印迹分析。在首先以10mA恒定电流电泳分离3小时后，以大约8mA/cm2的恒定电流将电泳分离的样品电转移到硝酸纤维素膜上并用封闭缓冲液(10mM PBS(pH7.4)+0.5％Tween 20+1％BSA)处理30分钟，然后加入溶于漂洗缓冲液的鼠抗人FGF-2单克隆抗体(Promega生产)，37℃下振荡2小时。用漂洗液(10mM PBS(pH7.4)+0.5％Tween 20)洗3次(10分钟/次)后，再加入溶于封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG(Promega生产)，并于37℃下保温2小时。保温后将滤膜用漂洗液洗3次(10分钟/次)。然后加入底物缓冲液(0.1M PBS(pH6.0)+1mg DAB+10ul H2O)，直到显现出清晰的条带后加入50mM EDTA终止反应，并记录如图15所示的结果。
实施例4FGF-2m(FGF-2结构类似物)的体外生物活性检测使用培养的成纤维细胞，以3H渗入法检测按本发明方法制备的FGF-2m在试验条件下刺激静止的BALB/c 3T3成纤维细胞中DNA合成的能力。
简单的说，将大约105个BALB/c 3T3成纤维细胞(由中国医学科学院药物研究所提供)接种于3ml含10％胎牛血清的DMEM培养基中。于37℃在5％ CO2保温箱中培养24小时后，用新鲜DMEM培养基稀释培养物，使血清的终浓度变为1％。继续培养3天后，向培养物中加入本发明的FGF-2或FGF-2m，以及对照物(DMEM培养物或羟基脲)，和3H标记的胸腺嘧啶(3H-TdR)(终浓度为2μC/ml)。37℃保温24小时后，用冷生理盐水洗细胞3次。离心后向细胞沉淀物内加入10％三氯乙酸以沉淀蛋白质。再次用生理盐水洗2次，并加入乙醇-乙醚洗一次。用甲酸消化沉淀物后取0.1ml加于4ml闪烁瓶内测定放射活性。按下列公式计算FGF对成纤维细胞DNA合成的刺激指数。
得到如下列表1所示的结果。
表1人FGF-2和FGF-2对体外小鼠3T3细胞3H-TdR掺入的影响处理细胞3H-TdR掺入(CPM)刺激指数P值培养基 15,078 1.00-羟荃脲*15,105 1.00-FGF-2 25,126 1.68 ＜0.05FGF-2m 26,328 1.72 ＜0.01
*因为已知羟基脲完全抑制胸腺嘧啶的掺入，所以这一对照物将进一步证实3H-TdR掺入法检测细胞内DNA合成的确切性。
从上列表1所示的结果可以看出，按本发明方法制得的FGF-2和FGF-2m可于体外有效地刺激小鼠成纤维细胞的DNA合成，进而刺激细胞的生长和增殖。
实施例5FGF-2m对大鼠皮肤组织损伤的修复作用使用下述材料和方法，体内检测FGF-2m对大鼠局部皮肤组织损伤的修复作用，并与FGF-2相比较。同时观察本发明的含FGF-2药物组合物在治疗组织损伤应用中的积极效果。
1.动物模型的制备选取体重约为230-250g的健康雄性Wistar大鼠(12周龄)20只，实验前将动物单笼喂养1周。浅麻醉状态下剃除动物背部约4cm×5cm范围的毛，于背部中线两侧距离约0.9cm处各无菌切割直径约1.8cm的园形创面，并破环少许肌肉组织，以造成典型的刀伤创面。
2.试验样品的配制按常规方法配制含下列成分的本发明药组合物溶液人FGF-2m(或FGF-2) 105单位聚乙二醇400 20.0mg抗坏血酸 1.0mg硫酸肝素 0.5mg加0.9％NaCl 至100.0ml上述成分混匀后装入无菌玻璃瓶内4℃下保存备用。在同样条件下配制只含有FGF-2m(或FGF-2)的同浓度水溶液作为阳性对照样品。以含有其他各种成分而不含FGF-2m(或FGF-2)的组合物用为阴性对照样品。所有组合物样品中的FGF-2m(或FGF-2)均在冻干状态下4℃放置30天后使用。
3.动物分组和给药方式将20只已造成创伤的大鼠动物模型随机分成4组，每组5只，共10个创面。从创伤的第0天开始并于伤后第1、3、5、7天在每个创伤部位用1ml注射器滴加约0.15ml各种试验和对照样品。第1组动物接受阳性对照样品(Promega公司生产)，第2组接受本发明制备的FGF-2，第3组接受本发明的FGF-2m，第4组接受阴性对照样品。FGF的用药剂量约为每次每个伤口100单位，隔日给药一次。滴药后5分钟用无菌纱布包扎伤口。
4.结果用药后次日肉眼观察伤口局部肉芽组织生长情况，测量并记录创面面积，以估测上皮组织生长速率。另外，于伤后第3、5、7天用药前从创面中心部位剪取愈伤组织进行活体组织检查，并于第7天后检测愈合组织的抗张力强度(结果未示出)。
结果发现，2个实验组和阳性对照组均表现出明显的伤口愈合促进作用。第3天投用FGF-2的(第1，2，3组)大鼠伤口处有薄层肉芽组织生成，创缘皮肤收缩明显。伤后第7天各实验组动物的创面均被肉芽填充，而阴性对照组(第4组)则只见有很少的薄层肉芽生成。结果如下列表2中所示。
表2 FGF-2和FGF-2m对小鼠创伤修复的影响实验样品 伤口面积(cm2) (平均值±DS)0天1天3天5天7天阳性对照2.52.09±0.281.4±0.281.30±0.25 0.90±0.20FGF-2 2.51.86±0.331.51±0.19 1.43±0.10 0.83±0.14FGF-2m 2.51.80±0.141.24±0.29 1.81±0.05*0.44±0.06*阴性对照2.52.14±0.341.85±0.41 1.53±0.24 1.14±0.35*与FGF-2和阳性对照样比相比差异显著，P＜0.05，与阴性对照组相比差异性特别显著，P＜0.01。
从上表可以看出，在加入适当的稳定剂的情况下，本发明的FGF-2m(冻冷干燥制品)在经过30天低温储存后，与按本发明方法生产的FGF-2相比较好地保留了促进纤维组织再生的生物学活性。
实施例6FGF-2m和FGF-2对猪皮肤组织损伤的修复作用使用下述材料和方法，体内检测FGF-2m对猪局部皮肤组织损伤的修复作用，并观察本发明的含FGF-2m的药物组合物在治疗应用中的积极效果。
1.动物模型的制备选取体重约10-20Kg的北京小型猪(由中国农科学院动物中心提供)8只(雄性5只，雌性3只)。实验前单笼喂养1周。于浅醉状态下剃除背部35cm×25cm范围的毛，无菌条件下沿脊柱两侧相距约2.0cm的对称部位用手术刀切割直径约1.8cm的园形创面。每只动物背部共造成两排各5个创面。
2.试验样品的配制按常规方法配制含下列成分的本发明药物组合物喷雾剂人FGF-2m(或FGF-2)105单位羟丙基纤维素 20.0mg胶原蛋白 40.0mg1％ZnSo4溶液 0.2ml肝素钠 20.0ug加0.9％NaCl 至100.0ml上述成分混匀装入消毒过的喷雾容器内，置4℃下保存30天后使用。用于对照实验的其他只含FGF-2或不含FGF-2的样品也在同样条件下配制并储存。
3.动物分组和给药方式将8只已造成创伤的动物随机分成4组，每组2只，共20个创面。从创伤的第0天开始，并于伤后第1、5、7、10和14天在每个创伤部位用喷雾容器喷洒约0.2ml各种试验和对照样品。A组动物接受磺胺嘧啶银(SD-Ag)治疗，B组接受本发明的FGF-2，C组接受本发明的FGF-2m，D组接受阴性对照样品，即不含FGF-2或FGF-2m而只含其他辅助成分的组合物。FGF的用药剂量约为每次每个伤品约100单位，隔日给药一次。给药后5分钟用无菌纱布包扎伤口。
4.结果用药后次日肉眼观察伤口局部肉芽组织生长情况，测量并记录创面面积，以估测上皮组织再生速率。分别于第3、7、10和14天处死2只动物。平均分割每个创面，其中1/2经福尔马林溶液固定后进行显微镜检查、组织化学检查和特殊染色检查，另外1/2经福尔马林固定后进行抗张强度测定。
创伤后第3天可见B和C组创面微红，无分泌物，而D组则可见明显的红肿并有粘性分泌物，伤后第7天B和C组有80％创面被肉芽组织填充，创面面积由2.5cm2分别缩小为0.54和0.50cm2。伤后第10天，B和C创面已完全被肉芽组织填充，去掉部分创面痂皮后可见整个创面已基本上皮化生。第10天A和D组仍有10％的创面未愈合，创面面积分别为0.62和0.92cm2(参见表3)。
表3 FGF-2和FGF-2m对猪皮肤损伤修复的影响实验样品 伤后不同创面面积(CM2) (平均值±SD)0天 5天 7天 10天 14天A(SD-Ag) 2.5 1.86±0.45 1.54±0.52 0.62±0.35 0.17±0.09B(FGF-2) 2.5 0.69±0.41 0.54±0.52 0.08±0.06 0.00C(FGF-2m)2.5 0.82±0.29 0.50±0.32 0.32±0.40 0.02±0.02D(阴性对照) 2.5 2.25±0.33 1.74±0.14 0.92±0.29 ±0.03愈伤组织经HE染色后于光学显微镜下观察，可见使用bFGF-2(B组)和FGF-2m(C组)治疗的创面于第3天开始有明显的毛细血管胚芽生长，成纤维细胞数目增多且生长活跃。第7天时这些组织学特征与两个对照组的区别十分显著。第7-14天B组和C组均可见有新生上皮及毛囊生长。另外，特殊组织染色显示FGF-2治疗组的创面肉芽组织中胶原纤维和弹性纤维含量显著高于对照组。
权利要求
1.以融合蛋白质形式产生的，具有成纤维细胞生长因子活性的如图2所示的氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1的多肽，其包含完整的人碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列，并在N端连接有17个氨基酸的非结构蛋白质序列，所说的非结构蛋白质序列是由用于在原核宿主中启动表达的LacZ基因的部分序列编码的。
3.根据权利要求1的以融合蛋白质形式产生的多肽，其具有18.5KD的分子量和在9.3-9.6范围内的等电点。
4.生产如权利要求1所述多肽的方法，该方法包括(1)得到编码牛碱性成纤维细胞生长因子的DNA序列；(2)对所说的DNA序列进行适当地修饰，得到编码如权利要求1所述的DNA序列；(3)将经过修饰的DNA序列与适当的表达载体相连接；(4)用所得到的重组表达载体转化适当的原核宿主并筛选被转化的重组体细胞；(5)在适于表达所说的具有成纤维细胞生长因子活性之多肽的条件下培养上述被转化的细胞，并从培养基和细胞裂解产物中分离和纯化所说的多肽。
5.根据权利要求4的方法，其中所说的修饰是将编码牛FGF-2第121位丝氨酸的密码子改变为编码苏氨酸的密码子，并将编码牛FGF-2第137位脯氨酸的密码子改变为编码丝氨酸的密码子。
6.根据权利要求4的方法，其中所说(3)中的表达载体是PUC18或PKK-123-33。
7.根据权利要求4的方法，其中所说的原核宿主是大肠杆菌。
8.包含如权利要求1所述的多肽及其他辅助成份和医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
9.根据权利要求8的药物组合物，其中除含有作为基本活性成分的如权利要求1所述的多肽外，还可含有选自表皮生长因子、脑衍生的神经生长因子和神经生长因子的一种或多种其他生长因子。
10.根据权利要求8的药物组合物，其中还可含有选有自稳定剂、活性蛋白质保护剂、皮肤渗透剂、自由基清除剂及蛋白酶抑制的一种或多种辅助成分。
11.根据权利要求10的药物组合物，其中所说的稳定剂选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、抗坏血酸、硫酸多糖、肝素、多聚赖氨酸和谷胱甘肽、多元醇。
12.根据权利要求10的药物组合物，其中所说的活性蛋白质保护剂选自人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸及金属阳离子。
13.根据权利要求10的药物组合物，其中所说的皮肤渗透剂选自卓月桂氮卓酮或其衍生物及二甲基亚砜。
14.根据权利要求8的药物组合物在治疗组织损伤中的应用。
15.根据权利要求14的应用，其中所说的组织损伤是皮肤组织、肌肉组织、粘膜组织、神经组织或骨组织的损伤。
16.根据权利要求8的药物组合物作为皮肤保护剂的应用。
全文摘要
本发明提供了成纤维细胞生长因子－2的结构类似物及其生产方法，含有这些类似物及医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物，以及该组合物在治疗组织损伤中的应用。本发明的FGF－2结构类似物与天然的人FGF－2相比具有较好的储存稳定性，以及对温度和pH的耐受性。
文档编号C07K14/50GK1500809SQ0011739
公开日2004年6月2日 申请日期1996年12月27日 优先权日1996年12月27日
发明者林剑, 赵利淦, 刘小青, 林 剑 申请人:暨南大学生物工程研究所