专利名称：稳定化的成纤维细胞生长因子组合物及其生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种稳定化的成纤维细胞生长因子(下文简称为FGF)或其突变蛋白的组合物及其生产方法。
FGF最初是作为对纤维母细胞如BALB/c3T3细胞表现有生长促进作用的因子被分离的(Gospodarowicz，Nature249123，1974)。目前已经知道FGF几乎对所有中胚分化的细胞均有生长促进作用。根据等电点可将FGF粗略地分为两类碱性FGF(下文简称bFGF)和酸性FGF(下文简称aFGF)。因为对内皮细胞有强生长促进作用和血纤维蛋白溶酶原激活性诱导作用，这两种类型的FGF都可能用作血管形成促进剂、创伤治疗药物、及血栓形成和动脉硬化的预防和治疗药物。
虽然已用常规方法由动物器官如牛垂体中纯化了FGF，甚至纯化到单一物质水平，但这种常规方法存在某些缺点，如生产量有限以及因其是由异种动物衍生的而可能出现不期望的抗原性。目前已发展了一种大量生产FGF的方法，其中包括利用DNA重组技术在微生物或动物细胞内表达克隆的人FGF基因(参见FEBSLetters，213189-194，1987和欧洲专利公开237，966号)。
在水溶液中FGF将迅速丧失其活性，而且减压冻干亦容易降低其生物学活性。再者，当长期使用(如通静脉点滴)FGF时，将不可避免地在给药期间降低其效力，从而造成严重问题。
据报导，可通过给予某种氨基葡萄糖多聚物(glycosaminoglycan)如肝素来防止FGF失活(JournalofGellularphysiology，128475，1986)，但因为肝素有很强的抗凝血活性，故很难用于注射等方法。
为了改善FGF在溶液中及冻干条件下的稳定性，已研究了可配制成注射剂的各种物质，但迄今尚无找到满意的稳定化方法，仍有待建立这样一种方法。
基于这些情况，本发明人进行了一系列研究并发现使FGF或其突变蛋白与硫酸葡萄糖多聚物如存在于水溶液中的硫酸葡萄糖接触，可显著地提高FGF或其突变蛋白的稳定性。
本发明提供了(1)一种稳定化的组合物，其包含(a)FGF或其突变蛋白及(b)硫酸葡萄糖多聚物(2)一种生产稳定化的组合物的方法，其包括使FGF或其突变蛋白与水溶液中的硫酸葡萄糖多聚物接触;以及(3)一种稳定FGF或其突变蛋白的方法，其包括使FGF或其突变蛋白与水溶液中的硫酸葡萄糖多聚物接触。
用于本发明的FGF可以是碱性FGF(下文简称bFGF)或酸性FGF(下文简称aFGF)。
作为本发明之FGF的例子，可提到的有哺乳动物衍生的FGF哺乳动物包括人、猴、猪、牛、羊和马。
所说的FGF包括由已发现含有FGF之各种器官如脑或垂体中提取的FGF以及由DNA重组技术产生的FGF。
作为所说的FGF的例子，可提到的有DNA重组技术产生的FGF(PCT国际专利公开WO/87/01728号;FEBSLetter，213189-194，1987;欧洲专利公开237，966号)。
在本说明书中，有时将重组人碱性FGF简称为rhbFGF。
本发明中FGF突变蛋白基本上指改变了原始肽链或蛋白质顺序所产生的氨基酸顺序;所说的改变包括插入氨基酸、某些组成氨基酸被删去或被其他氨基酸取代。
插入氨基酸包括至少插入一个氨基酸。
删去组成氨基酸包括至少删去一个bFGF构成氨基酸。
构成氨基酸被其他氨基酸取代包括至少有一个组成氨基酸被其他氨基酸取代。
有至少一个加到bFGF上之氨基酸的突变蛋白中，所说的至少一个氨基酸不包括起始密码的蛋氨酸，它是用于表达肽链和信号肽的的。
插入的氨基酸的数目至少是1个，但只要不丧失bFGF特性，其可以是任何数目。优选的氨基酸应包括一些蛋白质的某些或全部氨基酸顺序。具有该顺序的蛋白质是与bFGF同源的并表现有与bFGF相似的活性。
删去至少一个bFGF构成氨基酸的突变蛋白中缺失的bFGF组成氨基酸的数目，只要不丧失bFGF的特征，其可以是任何数目。
这种删去组成氨基酸的例子，可以是氨基末端或羧基末端的缺失;即缺失人bFGF氨基末端中的10个残基;
Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser
人bFGF氨基末端中的14个残基Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro人bFGF氨基末端中的41个残基123441Met-Pro-Ala-Leu-…-Val人bFGF羧基末端中的61个残基8788146147Lys-Cys-……-Lys-Ser此外，作为组成氨基酸被删除的该突变蛋白的例子，有一种bFGF突变蛋白的缺少羧基末端7-46氨基酸残基。
删去氨基酸顺序时，最好是分别在rhbFGF第102、106、115、119、124、130和138位氨基酸处开始的氨基酸顺序。
这些氨基酸顺序可以被另一氨基酸取代。
在取代前已有至少1个被其他氨基酸取代之bFGF组成氨基酸的突变蛋白中，只要不丧失bFGF的任何特性，取代bFGF-构成氨基酸的数目可以是任何数目。
作为取代前的组成氨基酸，其可以是半胱氨酸和除半胱氨酸以外的氨基酸。其中优选的是半胱氨酸。上述除半胱氨酸以外的组成氨基酸可以是天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸等。
当取代前的组成氨基酸是半胱氨酸时，取代的氨基酸最好是中性氨基酸。这些中性氨基酸包括甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸和蛋氨酸;其中优选的是丝氨酸和苏氨酸。
当取代前组成氨基酸是半胱氨酸以外的任何一氨基酸时，其他取代的氨基酸应选择在疏水性、亲水性或电荷等性质上与取代前的氨基酸不同的氨基酸。
当取代前的组成氨基酸是天冬氨酸时，取代的氨基酸包括天冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和精氨酸;优选的是天冬酰胺和精氨酸。
当取代前的氨基酸的精氨酸时，取代的氨基酸包括谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸;其中优选的是谷氨酰胺。
当取代前的组成氨基酸是甘氨酸时，取代的氨基酸包括苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸和精氨酸;其中优选的是苏氨酸。
当取代前的组成氨基酸是丝氨酸时，取代的氨基酸包括蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和天冬氨酸;其中优选的是蛋氨酸。
当取代前的组成氨基酸是缬氨酸时，取代的氨基酸包括丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸和天冬氨酸;其中优选的是丝氨酸。
作为取代前的组成氨基酸，优选的是天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
作为取代的氨基酸，优选的是天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
作为有关突变蛋白中取代的优选方案，最好用丝氨酸取代半胱氨酸(即半胱氨酸被丝氨酸取代)。
在所说的取代中，可发生不少于两处的取代，最好是两或三处取代。
本发明的突变蛋白可联合有2或3处上述的插入、删除和取代。
作为突变蛋白，优选的是其中至少有一个人碱性FGF的组成氨基酸已被其他氨基酸取代的突变蛋白。
除常规DNA重组技术外，还可使用定点突变法产生本发明的突变蛋白。所说的技术是已知的，并已在GeneticEngineering(Lather，R.F和Lecoq，J.P.，AcademicPresspp31-50，1983)中作过描述，在GeneticFngineeringPrinciplesandMethods(Smith，M.andGillan，S.，PlenumPress，Vol.3，pp1-32，1981)中描述了寡核甘酸定点突变技术。
可按下述步骤产生编码本发明突变蛋白的结构基因，例如(a)使诱变寡核甘酸引物与FGF结构基因的一条单链DNA杂交(所说的引物互补于链内包含将被取代之半胱氨酸密码子的区域或互补于包含与该密码配对之反密码的区域，但其中会发生一个错误配对，即该密码与另一氨基酸的密码错配，或者使该密码与另一反密码错配。
(b)使用DNA聚合酶延长引物以形成一突变的异源双链，以及(c)复制该突变的异源双链。
然后分离携带突变基因的噬菌体DNA，并将其插入质粒中。
使用质粒转化宿主细胞，得到转化株。
将所说的转化株在培养基内培养，以使之产生突变蛋白。
用于本发明之FGF突变蛋白的例子包括BiophsicalResearchCommunications，151701-708(1988)，欧洲专利公开281，822号、欧洲专利公开288，687号(欧洲专利申请88103047.2号，相当于日本专利申请50249号/1988)、欧洲专利申请89101162.9号(1988年1月24日提交)等所述的突变蛋白。
可用于本发明的硫酸多聚葡萄糖包括硫酸葡聚糖(dextransulfate)，硫酸环糊精、硫酸β-1，3多聚葡萄糖。所说的葡萄糖是-D-葡萄糖聚合物的一种硫酸酯衍生物。所说的硫酸葡聚糖硫的含量最好不小于3%(W/W)，特别优选的含量是大约12至20%(W/W)，更进一步的优选范围是16-20%(W/W)。尤其优选的是葡聚糖。
用于本发明的硫酸葡萄糖包括葡聚糖的硫酸酯，葡聚糖是借助微生物如肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的作用由蔗糖产生的。硫酸葡聚糖是葡聚糖的硫酸酯，其基本结构是α-(1-6)键，且硫含量一般不少于12%左右。最好为大约16-20%。平均分子量范围约1，000至4，000，000最佳范围为大约3，000至1000，000，而且硫酸葡聚糖是很易溶于水的。硫酸葡聚糖是一种已知化合物，其可用已知方法产生。
本发明所用硫酸环糊精中环糊精的例子包括借助微生物如浸麻芽孢杆菌(Bacillusmacerans)的作用由淀粉产生的环糊精。环糊精(由多个α(1-4)键连接的D-葡萄糖分子构成的一种环结构)，可按成环D-葡萄糖分子的数目分为多种类型α型(6个分子)、β型(7个分子)、γ型(8个分子)，及其他类型。上述的任何一种类型都可用于本发明。
硫酸环糊精是由这些环糊精的硫酸酯化作用产生的酯，该硫酸酯化作用是按照已知的方法进行的。硫酸酯化方法的例子包括美国专利2，923，704号和日本专利申请公开36422号/1975中描述的方法。
硫酸环糊精的硫含量一般在3%(W/W)以上，最好是大约12-24%(W/W)。硫酸环糊精具有很易溶于水的特性。
按硫含量计算，用于本发明之硫酸环糊精硫酸化的程度可处于超过12%(W/W)的任何水平;其中最好是含有大约16-21%(W/W)硫的硫酸环糊精。再者，可使用具有不同硫酸酯化程度之硫酸环糊精的混合物，也可使用纯化到单一硫酸酯化程度的单一硫酸环糊精。可通过将含有硫酸环糊精之碱金属盐的反应混合物浓缩至于，将所得浓缩物溶解在水中并将该水溶液与亲水溶剂混合完成纯化过程以分离所需的产物。
用于本发明之硫酸β-1，3-葡聚糖中β-1，3-葡聚糖的例子有由产碱杆菌属或土壤杆菌属微生物产生的直链β-1，3-葡聚糖，β-1，3-葡聚糖也可以是呈低分子量聚合物形式的，如有经水解长直链β-1，3-葡聚糖而得到的直链β-1，3-葡聚糖结构。
已知凝胶多糖Curdlan(也称为可热凝胶化多糖PS〔〔thermogelablepolysaccharidepS〕，购自WakoPureChenicalIndustries有限公司〕是一种非水溶性的可热凝胶化的、不分支的葡萄糖聚合物，其仅具有直链β-1，3-葡聚糖键，并由属于产碱杆菌属或土壤杆菌属的微生物菌株产生(日本专利公开7000号/1968，32673号/1973和32674号/1973)。凝胶多糖生产菌粪产碱杆菌变种myxogenesNTK-u菌株、放射土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)菌株和放射土壤杆菌U-19菌株分别列于1982年第15版美国典型培养物菌株分类目录(AmericanTypeCultureCollectionCatalogueofStrains)中ATCC-21680、ATCC-6466和ATCC-21679号下。
日本专利申请公开83798号/1980中已详细描述了凝胶多糖部分水解物(低分子量衍生物)的性质及其生产方法。
所说的直链β-1，3-葡聚糖是由下列结构通式代表的化合物
(Ⅰ)其中n代表由40至大约1000的整数。
上述β-1，3葡聚糖可具有低于1000的任何平均聚合度(DP)。特别推荐DP范围为6至大约300的部分水解物，且最好是DP为15至大约200的部分水解物。
应提到的是，式(Ⅰ)中的n和DP之间有DP-2＝n的关系。
本发明所用直链β-1，3-葡聚糖的硫酸酯是这些β-1，3葡聚糖或其较低分子量聚合物的未端单糖或中间单糖中3个羟基发生磺化反应而形成的酯;一般使用平均取代度(DS)为每单糖单位0.5至3的酯，最好使用DS为1至2的酯。
可使硫酸化剂如氯磺酸或硫酐与一种有机碱的复合物，如吡啶、二甲基甲酰胺、三甲胺或二甲胺作用于β-1，3-葡聚糖，完成β-1，3-葡聚糖或其低分子量聚合物的硫酸酯化作用(JournalofBiologicalChernistry，2392986，1964)。
用于本发明的硫酸β-1，3-葡聚糖很易溶于水，且具有很低的毒性。
β-1，3-葡聚糖硫酸酯的硫含量一般在5%(W/W)以上最好为约10-24%(W/W)，且很易溶于水。
用于本发明的硫酸葡萄糖聚合物对温血动物的毒性很低，因此用于本发明的FGF或其突变蛋白组合物对温血动物具有可安全地口服或胃肠道外途径给药的优点。
用于本发明的硫酸葡萄糖聚合物可以是游离状态或某种盐形式的。作为盐，可以是钠盐、钾盐、铵盐、三甲基铵盐等。
当使硫酸葡萄糖聚合物与水溶液中的FGF或其突变蛋白接触时可首先加入游离状态的硫酸葡萄糖聚合物，然后加入足够量的碱或酸调整pH。加入一种碱后，硫酸葡糖聚可在水溶液中形成盐，或以游离硫酸葡聚糖与呈盐形式之硫酸葡聚糖混合物共存。
当使本发明的FGF或其突变蛋白与水溶液中的硫酸葡萄糖聚合物接触时，最好在二元或三元羧酸存在下进行，以得到更为稳定的FGF或其突变蛋白。
二元羧酸的例子包括酒石酸、马来酸、苹果酸、富马酸等。
三元羧酸的例子包括柠檬酸、异柠檬酸等。
上述羟酸可以是游离的或呈盐形式的。也可以将游离羧酸加到水溶液中，再向其中加入足够量的碱或酸以调整pH。加入碱后，硫酸葡聚糖可在水溶液中形成盐，或以游离硫酸葡聚糖与呈盐形式之硫酸葡聚糖混合物共存。
当使FGF或其突变蛋白与水溶液中的硫酸葡聚糖接触时，硫酸葡聚糖的量相对于1摩尔FGF或其突变蛋白为大约0.1至100摩尔，最好为大约0.5至4摩尔。
水溶液中葡聚糖的优选浓度为大约0.0005至5%(W/V)，最好为大约0.01至1%(W/V)。
水溶液中FGF的优选浓度范围为大约0.0005至5%(W/V)，最好为大约0.01至1%(W/V)。
羧酸的量，如作为其在水溶液中的浓度较好范围为1mM至1M，最好是10mM至500mM。
为了使FGF或其突变蛋白在水溶液中与硫酸葡萄糖多聚物接触并进一步与羧酸接触，只要使这些材料在水溶液中混合即可达到目的。
对于水溶液，可使用任何适于注射的水溶液;特别是可使用蒸馏水、生理盐水及葡萄糖溶液。本发明中也可使用磷酸盐缓冲液、Tris-羟甲基-氨基甲烷-HCl缓冲液等缓冲液作为水溶液。
当FGF或其突变蛋白、硫酸葡萄糖多聚物和羧酸混合时，它们可分别为水溶液状态，或将这些固态材料混合后溶于水。可在0至40℃的温度范围内，3至10最好5至9的pH范围内混合这些材料。混匀所需的时间一般为大约1至30分钟。
借助上述方法，即可制得FGF或其突变蛋白的稳定化的组合物。
可以证实，在所说的稳定化的FGF或其突变蛋白的组合物中，FGF或其突变蛋白与硫酸葡聚糖以一定比例结合在一起形成了一种复合物;可以根据需要分离FGF或其突变蛋白的复合物。分离和收集的方法包括使用Sephadex或TSK凝胶的凝胶过滤法、使用DEAE-或CM-Toyopearl的离子交换层析法，以及等电点分离法。因此，可按照需要分离并收集FGF或其突变蛋白的复合物，或者可直接使用未经分离的组合物。
如此得到的复合物是由FGF或其突变蛋白与硫酸葡萄糖多聚物以大约1∶0.5至1∶5的比例形成的复合物。应注意的是，所说的复合物在高浓度盐(如1MNaCl)存在下会发生解离;分离过程中必须避免使用有高离子强度的溶剂。
如此便得到了稳定化的FGF或其突变蛋白的组合物。因此，如下述工作实施例中所显示的，本发明的组合物对热、pH和蛋白酶是稳定的。
特别是本发明的组合物在酸性、碱性以及中性条件下都是稳定的。
FGF或其突变蛋白的组合物可安全地直接经口服或非胃肠道途径用于温血动物(如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫)，或者加在与医药上可接受的载体、赋形剂或稀释剂构成的医药组合物(如注射剂，片剂、胶囊、溶液、软膏)中给药。
所说的制剂最好是注射液形式的，如用于注射的溶液、冷冻制剂或冻干制剂。
可按照已知的医药生产方法，使用医学上可接受的添加剂、稀释剂、佐剂等将所说的组合物配制成医药组合物。
将组合物配制成可注射的水溶液时，可按标准方法使用水作为溶剂(如蒸馏水)、水溶性溶剂(如生理盐水、林格氏液)或油性溶剂(如芝麻油、橄榄油)等溶剂，或必要时使用助溶剂(如水杨酸钠、乙酸钠)、缓冲液(如柠檬酸钠、甘油)、等渗剂(如葡萄糖、转化糖)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇)、防腐剂(如苯甲醇、苯酚)或止痛剂(如氯化苯甲烃胺、盐酸普鲁卡因)等添加剂制备所需的溶液。
如将所说的组合物配制成用于注射的固体制剂时，如可使用稀释剂(如蒸馏水、生理盐水、葡萄糖)、赋形剂(如羧甲基纤维素(CMC)、精氨酸钠)、防腐剂(如苯甲醇、氯化苯甲烃铵、苯酚)或止痛剂(如葡萄糖、葡糖酸钙、盐酸普鲁卡因)以常规方法生产所需的制剂。
另外，将所说的组合物配制成医药制剂时，可加入单糖(如葡萄糖)、氨基酸、各种盐和人血清白蛋白;也可以加入等渗剂、pH调节剂、止痛剂、防腐剂等以制备FGF或其突变蛋白的稳定的和有效的制剂。
按上述方法制得的FGF或其突变蛋白的组合物具有成纤维细胞生长促进作用及其他作用，十分稳定而且毒性很低;因此，可将其用作烧伤、创伤、手术后组织的愈合促进剂，或基于其血管形成作用，用作血栓形成或动脉硬化的治疗药物。
该组合物也可以用作细胞生长加速剂。
根据本发明的FGF或其突变蛋白的组合物，当作为上述医药使用时，可以适当剂量对上述温血动物给药，根据给病途径及症状等，按FGF或其突变蛋白的剂量计算，每天给药量为大约1-100μg/Kg体重。
根据本发明的FGF或其突变蛋白的组合物，当其用作加速细胞生长的试剂时，最好将其加到培养基中，以便其含量按FGF或其突变蛋白的量计算达到每升培养基0.01至10μg，最好是每升培养基0.1至10μg。
因为可以按上述方法使FGF或其突变蛋白与水溶液中的硫酸葡聚糖接触来稳定之并能够获得稳定化的FGF或其突变蛋白的组合物，所以有可能将FGF或其突变蛋白配制成同时稳定维持其作用的医药制剂。
另外，因为与肝素相比硫酸葡萄糖多聚物的抗凝血作用较弱，故使用本发明的组合物不会有抗凝血作用方面的麻烦。
使FGF或其突变蛋白在水溶液中与硫酸葡聚糖接触，即可得到FGF或其突变蛋白的稳定化的组合物。可将FGF或其突变蛋白的稳定化的组合物配制成保持了FGF或其突变蛋白之作用的医药组合物。
图1显示了编码人bFGF的碱基顺序及由之推导出的氨基酸顺序。
图2显示了rhbFGF突变蛋白CS23之组合物和实施例12中所得低分子量肝素的凝胶过滤图形。
用于下述工作实施例中的重组人碱性FGF(以下缩写为rhbFGF)是按欧洲专利公开(以下简称EP公开)237，966号中所述的方法产生的。因此，所说的rhbFGF是按照EP公开237，966号的实施例1。3和6或8中所述方法，使用大肠杆菌K12MM294/pTB669(IFO14532，FEPMBP-1281)的转化株产生并纯化的。
用于下述实施例中的重组人碱性FGF突变蛋白CS23(以下也简称为rhbFGF突变蛋白CS23)是按照EP公开281，822的实施例7和24、EP公开288，687号(EP申请88103047.2号，相当于日本专利申请50249号/1988)的参考实施例10，或BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，151701-708(1988)中所述的方法产生的。因此，已按照下述参考实施例1至3中所述的方法(所用方法与上述参考文献中所述方法相同)，使用转化株大肠杆菌MM294/pTB762(IFO14613，FERMBP-1645)制得了所说的rhbFGF突变蛋白CS23。
上述转化株大肠杆菌K12MM294/pTB669(携带用于下述参考实施例1的质粒pTB669)和大肠杆菌MM294/pTB762(见下述参考实施例3)已寄存在InstituteforFermentation，Osaka(IFO)，Japan和
FermentationResearchInstitute，AgencyofIndustrialScienceandTechnology，MinistryofInoternationalTradeandIndustry(FRI)，Japan。它们的寄存登记号与寄存日期如表1所示。对于于寄存在FRI的样品，开始是用FERMP号代表其寄存登记号。后按照布达佩斯条约改变寄存并已用FERMBP号代表寄存登记号。
表1转化体IFOFR1FERMP-8918大肠杆菌K12IFO14532FERMBP-1281MM294/pTB669(1986年8月11日)(1986年8月21日)FERMp-9409大肠杆菌IFO14613FERMBP-1645MM294/pTB762(1987年5月27日)(1987年6月11日)大肠杆菌K12MM294/pTB669和大肠杆菌K12MM294/pTB762也已分别在1987年2月26日和1988年2月9日寄存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号分别为CCTCCM87005，CCTCCM88005。
上述或下列参考实例所述的人bFGF氨基酸顺序内氨基酸编号中，图1所示人bFGF氨基酸顺序N未端的Met定为第一个氨基酸。
参考实施例1含突变蛋白编码碱基顺序之重组DNA的产生(1)人bFGF基因之M13载体的克隆用限制性酶EcoRI和BamHI消化按欧洲专利公开237，966号实施例3制得的质粒pTB669。用限制性酶EcoRI和BamHI消化噬菌体载体M13mp8(J.Messing，MethodsinEnzymology，10120-78，1983)复制形式(RF)DNA，并与消化pTB669得到的人bFGFDNA片段混合。然后借助T4DNA连接酶使混合物连接在一起;将连接的DNA转化到大肠杆菌JM105菌株可感染细胞内;使用Xgal作为指示剂，将所得转化株接种在平皿上(J.Messing等，NucleicAcidsResearch，9309-321，1981);挑出含有重组噬菌体的噬斑(白色噬斑);用双脱氧核甘酸合成链终止法〔J.Messing等，NNucleicAcidsResearch9309，1981)测定重组区的碱基顺序，借以证实已成功地插入了人bFGFDNA。
由该M13-Po克隆纯化单股噬菌体DNA，然后将其作为模板用于合成寡核甘酸定点诱变。
(2)位点特异性诱变在0.1mM三磷酸腺甘(ATP)、50mM Tris-(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl，pH8.0)，10mM MgCl2、5mM二硫苏糖醇(DTT)和9单位T4激酶存在下，在50μl总反应体积中，37℃用T4激酶将40微微摩尔合成寡核甘酸5′＞CGTTCTTGCTGTAGAGCCGCT＜3′(第26位的Cys改变为Ser的引物，其中Rsa I的识别顺序已消失)处理1小时。将该激酶处理的引物(12微微摩尔)在50μl含有50mM NaCl、1.0mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM MgCl2和10mM β-巯基乙醇的混合物中于67℃加热5分钟，于42℃加热25分钟，从而使引物与5μg单股(ss)M13-PO DNA杂交。然后在冰上冷却退火的混合物，并将其加到50μl含0.5mM三磷酸脱氧核甘酸(dNTP)、80mM Tris-HCl(pH7.4)、8mM MgCl2、100mM NaCl、9单位DNA聚合酶I Klenow片段、0.5mM ATP和2单位T4 DNA连接酶的反应混合物中，使反应于37℃进行3小时，再于25℃进行2小时，然后加入2μ10.2mM EDTA终止反应。用反应产物转化可感染的JM105细胞;使如此得到的转化株生长过夜，然后从培养物上清液中分离ssDNA。使用该ssDNA作模板进行第2轮引物延伸，将凝胶纯化的RF型DNA转化到可感染的JM 105细胞中，将所得转化细胞散布在琼脂平皿上培养过夜，得到噬菌斑。
(3)定点诱变重复上面(2)的方法，但所用的合成寡核甘酸引物是5′＞AACGATTAGCGCTCACTCC＜3′其改变是半胱氨酸-70-编码密码子变为编码丝氨酸的密码子(产生了限制性内切酶HaeⅡ的识别顺序)。
(4)定点诱变重复上面(2)所述的方法，但所用的合成寡核甘酸引物是5′＞GTAACAGACTTAGAAGCTAGT＜3′其改变是半胱氨酸-88-编码密码子变为编码丝氨酸的密码子(产生了限制性内切酶AluⅠ的识别顺序)。
(5)定点诱变重复上面(2)中所述的方法＝但所用的合成寡核甘酸引物是5′＞TCGAAGAAGAAAGACTCATCC＜3′其改变是使半胱氨酸-93-编码密码子变为编码丝氨酸的密码子(产生了限制性内切酶HinfⅠ的识别顺序)。
(6)产生诱变之噬斑的筛选和鉴定将含突变之M13-PO噬斑的各平皿(见上述(1))和2个含未突变之M13-PO噬菌斑的平皿冷却到4℃，每个平皿的噬斑转移到2个园形硝酸纤维素滤膜上，其中对于第一个滤膜，是将干滤膜在琼脂平皿上放置5分钟，对于第二个滤膜则放置15分钟。然后将滤膜在浸于0.2NNaOH、1.5MNaCl和0.2%TritonX-100中的厚滤纸上放置5分钟，再使之在浸于0.5MTris-HCl(pH7.5)和1.5MNaCl内的滤纸上放置5分钟以上，以中和之。按同样方法将滤膜在浸于2×SSC(标准柠檬酸钠)中的滤纸上洗2次，并在真空烘箱内于80℃下干燥2小时。两个互相重迭的滤膜与10ml(每个滤膜)pH值为7.0的DNA杂交缓冲溶液(5×SSC)于55℃预杂交4小时，所说的杂交缓冲溶液含有4×Denhardt′s溶液(聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%)、0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)、50mM磷酸钠缓冲溶液(pH值为7.0)和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105Cpm/ml寡核甘酸引物于42℃杂交24小时。在含有0.1%SDS和较少量SSC的洗涤溶液中于50℃下将滤膜洗30分钟。然后，先用含有2×SSC的缓冲溶液洗滤膜，使用盖氏(Gejger)计数仪检测含未突变M13-PO噬斑之对照滤膜上的放射活性。逐步降低SSC浓度，反复洗对照滤膜，直到该滤膜不再留有可测出的放射性。使用的SSC浓度最小为0.1×SSC。将滤膜风干，并进行放射自显影(-70℃下对胶片曝光2-3天)。使用激酶处理的寡核酸探针筛选10，000个突变的M13-PO噬斑和1100个未突变的对照噬斑。对照噬斑均未与探针杂交，而有3至110个突变的M13-PO噬斑与探针杂交。
取1个突变的M13-PO噬斑，并接种于JM105培养基中由上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀中制取双股(ds)DNA。使用适当的寡核甘酸引物和ssDNA分析碱基顺序。
结果，分别证实TGC(Cys-26)密码子已改变为TCT(Ser)密码子;TGT(Cys-70)密码子变为AGC(Ser)密码子;TGT(Cys-88)密码子变为TCT(Ser)密码子;TGT(Cys-93)密码子变为TCT(Ser)密码子。
经突变的M13-PO噬菌体中，将其中密码子Cys-26已变为Ser编码密码子的噬菌体定名为M13-P1;将其中密码Cys-70已变为Ser编码密码子的噬菌体定名为M13-P2，将其中密码子Cys-88已变为Sev编码密码子的噬菌体定名为M13-P3;并将其中密码子Cys-92已变为Ser编码密码子的噬菌体定名为M13-P4。
参考实施例2产生诱变之噬菌体的筛选和鉴定将含有参考实施例1中制得的突变M13-P2噬菌斑的各平皿和2个含有参考实施例1中制得之未突变M13-P2噬菌体噬斑的平皿冷却到4℃，并将每个平皿中的噬斑转移到2个园形硝酸纤维素滤膜上，方法是对于第一个滤膜使放置在琼脂平皿上的干滤膜保持5分钟，对于第二个滤膜则保持15分钟。然后使滤膜在浸于0.2N NaOH、1.5M NaCl和0.2%Triton X-100内的厚滤纸上放置5分钟，然后移到浸于0.5MTris-HCl(pH7.5)和1.5M NaCl内的滤纸上放置5分钟以上以中和之。将滤膜放在浸于2×SSC(标准柠檬酸钠)内的滤纸上以同样方法洗两次，并放在真空烘箱内于80℃下干燥2小时。于55℃下使那些相互重迭的滤膜在10ml/升pH值为7.0的DNA杂交缓冲溶液(5×SSC)中预杂交4小时，所说的DNA杂交缓冲溶液含有4×Denhard′t溶液(聚乙烯吡咯烷酮，Ficoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%)、0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)、50mM磷酸钠缓冲溶液(其pH值为7.0)和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核甘酸引物在42℃下杂交24小时。每一滤膜在含有0.1%SDS和较低量之SSC的洗涤用缓冲溶液中于50℃下洗30分钟。然后先用含有2×SSC的缓冲溶液中洗滤膜;使用盖氏计数仪检测含有未突变M13-P2噬斑之对照滤膜上的放射活性。随着逐步降低SSC浓度，反复洗涤这些滤膜，直到对照滤膜上不再留有可检测到的放射活性。所用的SSC浓度最低为0.1×SSC。将滤膜风干并进行放射自显影(于-70℃下对胶片曝光2至3天)。使用激酶处理的寡核甘酸探针筛选10，000个突变的M13-P2噬斑和100个未突变的对照噬斑。对照噬斑均未与探针杂交，而有3至10个突变的M13-P2噬斑与探针杂交。
取一个突变的M13-P2噬斑，并接种于JM105培养基中。由所得上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀中制取双股(ds)DNA。使用适当的寡核甘酸引物和ssDNA分析碱基顺序。
结果，分别证实TGC(Cys-26)密码子已改变为TCT(Ser)密码子;TGT(Cys-88)密码子变为TCT(Ser)密码子;且TGT(Cys-93)密码子变为TCT(Ser)密码子。
突变的M13-P2噬菌体中，将其中第26位和70位Cys密码子已变为编码Ser之密码子的噬菌体定名为M13-P12;将其中密码子Cys-70和Cys-88已变为编码Ser之密码子的噬菌体定名为M13-P23;并将其中密码子Cys-70和Cys-93已变为编码Ser之密码子的噬菌体定名为M13-P24。
参考实施例3编码人bFGF突变型之基因在大肠杆菌内的表达(1)表达人bFGF突变蛋白之质粒pTB762的构建使用限制性内切酶EcoRI和PstⅠ切割参考实施例2中制得的M13-P23复制型(RF)，以得到含有人bFGF突变蛋白编码区的约0.5KbDNA片段。
另外，使用EcoRI-PstⅠ切割含有trp启动子的质粒ptrp781(Kurokawa，T.等，NucleicAcidsResearch，113077-3085，1983)DNA，以分离出含有trp启动子、四环素抗性基因和质粒复制起始位点的约3.2KbDNA片段。通过T4DNA连接酶反应将上述含有编码人bFGF突变蛋白之基因区的0.5KbEcoRI-PstⅠDNA片段与该3.2KbDNA片段连接在一起，以构建表达人bFGF突变型的质粒pTB762。
使用该质粒pTB762转化大肠杆菌MM294，从而得到携带含突变蛋白CS23编码基因之质粒pTB762的大肠杆菌菌株MM294/pTB762(IFO14613，FERMBP-1645)。
(2)细菌细胞抽提物的制备将上述转化株培养在含有1%葡萄糖、0.4%酪蛋白水解物和8μg/ml四环素的M9培养基中，当Klett值变为大约200时，加入浓度达25μg/ml的3β-吲哚丙烯酸，然后再培养4小时以上。培养后，收集细菌细胞并悬浮于含有1/20量20mMTris-HCl(pH7.6)的10%蔗糖溶液中。向该悬浮液内加入苯甲基磺酰氟(PMSF)浓度达1mM，EDTA达10mM、NaCl达0.1M、盐酸亚精胺达10mM及溶菌酶达100μg/ml(各数字均为终浓度值)，将混合物于0℃下放置45分钟，然后超声处理30秒钟。将该溶液以18，000rpm离心(Sorval离心机，SS34旋子)30分钟得到上清液，然后即可用作细菌细胞抽提物。
(3)细菌细胞抽提物的人bFGF活性以每小井2×103细胞的量，将小鼠BALB/C3T3细胞接种到Nunc 96小井微量滴定板(平底)的各小井内并培养之，其中每小井各装有0.2ml含5%胎牛血清的DMEM培养基。第二天更换含0.5%胎牛血清的DMEM培养基。培养3天后，向各小井内加入10μl已预先用含0.5%BSA之DME培养基作5倍系列稀释的细菌细胞抽提物继续培养。20小时后，向各小井内加入2μl3H-Tdr(5Ci/mmol，0.5mci/ml RCC Amersham)。6小时后，经用含有0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA的磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理以使细胞脱壁，并使用Titertech细胞收获器将细胞收集到玻璃滤器上，然后使用闪烁计数仪测定细胞摄入的3H-Tdr量。
结果可见得自大肠杆菌MM294/pTB762的细菌细胞抽提物具有FGF活性。
如此得到其中人bFGF的70和83位Cys已被Ser取代的rhbFGF突变蛋白CS23。
(4)使上述(3)中得到的25ml抽提物(由500ml培养物制得)通过已用20mMTris-HCl，pH7.4(在0.2MNaCl溶液中)平衡过的DEAE纤维素(DE52，Whatman，UK)柱(2cm×10cm)，以从抽提物中除去核酸成分。合并柱的流出物和用20mMTris-HCl(pH7.4，在0.5MNaCl溶液中)洗柱的洗出液(即通过DEAE柱的60ml部分)。
使该部分通过装有肝素的ShodexAF-pakHR-984柱(8mmID×5cm，日本ShowaDenko公司生产)进行高效液相层析(Gilson，法国)。先用20mMTris-HCl溶液(pH7.4)，然后用20mMTris-HCl(pH7.4)，0.5MNaCl溶液洗柱，再用20mMTris-HCl(pH7.4)，0.5M至2MNaCl梯度进行线性梯度洗脱(体积60ml，流速1.0ml/分)。
发现在第15至25分钟洗脱的峰值部分含有rhbFGF突变蛋白CS23;收集该部分。基于日本TakaraShuzo有限公司生产之牛脑FGF标准样品(纯度95%以上)的FGF活性，计算出该部分的比活性为1.1mgFGF蛋白/mg蛋白质。
参考实施例4β-环糊精十四烷基磺酸酯钠盐的制备(a)5gβ(-环糊精溶解在250ml二甲基甲酰胺中。在5分钟内向该溶液中加入15g三氧化硫-三甲胺配盐，同时于70℃下搅拌该溶液，然后于恒温下继续搅拌16小时。冷却后向混合物内加入250ml乙醇，然后移去上清液，收集不溶性材料，并用小量乙醇洗涤之。将沉淀溶解于250ml水中并过滤不溶性物质。向滤出液内加入75ml30%(W/V)乙酸钠的水溶液，并于室温下搅拌1小时。
(b)在减压下将如上述方法制得的含β环糊精十四烷基磺酸酯之钠盐的反应混合物浓缩至干。将浓缩物溶解在75ml水中。向该溶液内加入150ml乙醇，并移去上清液收集胶质固体物。加入30ml乙醇后磨碎胶质固体物，然后经过滤收集并干燥，得到10.3g目的化合物。
元素分析(分子式为C42H56O77S14Na14)计算值C，19.68;H2.20;S，17.51(%)测定值C，20.67;H，3.40;S，16.29(%)〔α〕22D+83.5°(C＝1.55，水)水含量1.5%(W/W)(KarlFischers方法)参考实施例5将2.9g平均聚合度为540的β-1，3-葡聚糖(凝胶多糖)悬浮于100ml二甲基甲酰胺中。向该悬液内加入由13.5g氯磺酸和11.7g三乙胺合成的12.5g三乙胺-磺酸，然后在冰水浴中搅拌下反应24小时。使反应混合物对0.5M碳酸氢铵充分透析，然后冻干得到4.4g目的产物。如此制得的β-1，3-葡聚糖硫酸酯的铵盐平均取代度(DS)为1.04(硫含量为12.7%)。
参考实施例6用90%甲酸部分水解(95℃，40分钟)平均聚合度为540的β-1，3葡聚糖得到2.5gβ-1，3-葡聚糖低分子量聚合物(平均聚合度6)，并将其悬浮于150ml二甲基甲酰胺中。向该悬液内加入50g三乙胺-磺酸，然后在冰水浴中搅拌下反应24小时。使反应混合物通过已用0.02M碳酸氢铵平衡的床体积为2.5l的SephadexG-25(细粒的)柱进行凝胶过滤。用苯酚磺酸法分析洗脱物的糖含量。然后合并各含糖部分并冻干，得到5.6gβ-1，3-葡聚糖硫酸酯。如此得到的所需产物的DS值为1.12(硫含量为13.3%)。
参考实施例7用90%甲酸部分水解(90℃，40分钟)平均聚合度为540的β-1，3-葡聚糖，将所得2.5gβ-1，3-葡聚糖低分子量聚合物(平均聚合度为26)悬浮于150ml二甲基甲酰胺中。向该悬液内加入50g三乙胺-磺酸，然后在冰水浴中搅拌下反应24小时。按参考实施例6中所述的同样方法处理反应混合物，得到6.1gβ-1，3-葡聚糖硫酸酯的铵盐。如所制得的所需产物DS值为1.22(硫含量为14.0%)。
参考实施例8用85%甲酸部分水解(80℃，30分钟)平均聚合度为540的β-1，3-葡聚糖，并将所得2.5gβ-1，3-葡聚糖低分子量聚合物(平均聚合度为131)悬浮于100ml二甲基甲酰胺中。向该悬浮液内加入12.5g三乙胺-磺酸，然后在冰水浴中搅拌下反应24小时。使反应混合物对0.5M碳酸氢铵充分透析，然后冻干得到3.9gβ-1，3-葡聚糖硫酸酯的铵盐。如此制得的所需产物的DS为1.46(硫含量为15.4%)。
参考实施例9按下面(1)或(2)中所述的方法，在下列实施例中检测FGF活性。
(1)将悬浮于含5%小牛血清之DMEM培养基内的小鼠BALB/c3T3细胞，以每小井0.2ml(2×103个细胞)的量接种于Nunc 96小井微量滴定极(平底)中并培养之。第二天更换含0.5%的小牛血清的DMEM培养基。培养3天后，向各小井内加入10μl预先用含0.5%BSA之DME培养基5倍分步系列稀释的细菌细胞抽提物继续培养。20小时后，每小井各加2μl3H-Tdr(5Ci/mmol，0.5mci/ml RCC Amersham)。6小时后，经用含0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA的磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理以使细胞脱壁，并借助Titertech细胞收获器将细胞收获到玻璃滤器上，然后使用闪烁计数器测定细胞摄入的3H-Tdr量。
(2)将预先用含有10%小牛血清之DMEM培养基依次稀释(每次稀释2倍)的样品，以每小井50μl的量加到Nunc 96小井微量滴定极(平底)的各小井内，然后将购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的胎牛心脏内皮细胞(CRL 1395)以每小井50μl(2×103个细胞)的量接种到各小井内并培养3天。每小井再加入20μl MTT溶液(5mg/ml PBS，Sigma)。4.5小时后，加入100μl 10%SDS-0.01N HCl并将平板在保温箱内放置过夜，然后使用Titertech Multiscan测定590nm处吸光率(Tada等，Journal of Immunological Methods，931157，1986)。
实施例1向含有10%胎牛血清的DulbeccoMEM培养基(Virology8396，1959)内加入终浓度为10μg/ml的rhbFGF，再加入硫酸葡聚糖的盐至终浓度达到25μg/ml，并于37℃下保温24小时。硫酸葡聚糖的盐是平均分子量分别为
5，000、7，500或500，000的钠盐。作为对照组，是在同样培养基内未加入硫酸葡聚糖钠。表2中显示了24小时后保留的活性。对照组基本上没有FGF活性，而试验组则稳定地保留了FGF活性。
表2添加剂保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖钠100(平均分子量5，000)硫酸葡聚糖钠100(平均分子量，7，500)硫酸葡聚糖钠100(平均分子量500，000)未加4实施例2向含有10%胎牛血清的DulbeccoMEM培养基内加入rhbFGF突变蛋白CS23达终浓度为10μg/ml，再加入硫酸葡聚糖的盐使之达到终浓度为25μg/ml，于37℃下将培养基保温24小时。硫酸葡聚糖的盐是平均分子量分别为5，0007，500或500，000的钠盐。作为对照组，使用了未加硫酸葡聚糖钠的同种培养基。表3中显示了24小时后保留的活性。对照组中，基本上没有保留活性，而试验组则稳定地保留了FGF活性。
表3添加剂保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖钠93(平均分子量5，000)硫酸葡聚糖钠100(平均分子量7，500硫酸葡聚糖钠100(平均分子量500，000)未加6实施例3向20mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)内加入rhbFGF使之终浓度达到10μg/ml，再加入不同比例的硫酸葡聚糖钠(平均分子量7，500;硫含量17.4%)，然后于37℃下保温72小时。所加硫酸葡聚糖钠的量，相对于rhbFGF，浓度分别达到0至16M。作为对照，使用了不含硫酸葡聚糖的同种培养基。表4中显示了72小时后保留的活性。
表4rhbFGF/硫酸葡聚糖保留的FGF活性(%)钠的摩尔比例1∶0＜31∶0.25151∶1991∶4951∶16100实施例4向20mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)内加入rhbFGF使之终浓度达到10μg/ml，再加硫酸葡聚糖钠和/或柠檬酸钠然后冷冻干燥。硫酸葡聚糖钠(平均分子量7，500，硫含量17.4%)浓度为25μg/ml，而柠檬酸钠浓度为50mM。加入蒸馏水重新配制冻干的材料，然后测定其保留活性。结果如表5所示。
表5添加剂保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖钠100柠檬酸钠48硫酸葡聚糖钠+柠檬酸钠97未加6实施例5向20mM磷酸缓冲溶液(pH7.4)内加入rhbFGF使之终浓度达到10μg/ml，再加入硫酸葡聚糖钠(平均分子量7，500;硫含量17.4%)终浓度为25μg/ml，然后于37℃下保温72小时。另一方面，代替上述硫酸葡聚糖钠，向上述磷酸盐缓冲液内单独或与硫酸葡聚糖钠(25μg/ml)混合加入终浓度达0.4M的柠檬酸钠、苹果酸钠、马来酸钠、富马酸钠或酒石酸钠，然后于37℃下保温24小时。表6中显示了72小时后的保留活性。
表6添加剂保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖钠91柠檬酸钠72柠檬酸钠+硫酸葡聚糖钠100苹果酸钠40苹果酸钠+硫酸葡聚糖钠93马来酸钠54马来酸钠+硫酸葡聚糖钠94富马酸钠35富马酸钠+硫酸葡聚糖钠90酒石酸钾钠63酒石酸钾钠+硫酸葡聚糖钠97未加2实施例6向50mM柠檬酸钠溶液(pH7.4)内加入浓度达100μg/ml的rhbFGF，再向混合物内加入硫酸葡聚糖的盐使之终浓度达到40μg/ml(摩尔比1∶1)，然后于56℃下保温30分钟。所用硫酸葡聚糖的盐为平均分子量7，500的钠盐。以未添加硫酸葡聚糖的一组作为对照。表7列出30分钟后保留的活性。由表7中所示的结果证市，对照组的FGF活性几乎几乎完全丧失，而硫酸葡聚糖组中即使在高温下仍稳定地保留了FGF活性。
表7添加剂保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖钠100(平均分子量7，500)未加11实施例7向2mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)内加入浓度达100μg/ml的参考实施例3中制得的rhbFGF突变蛋白CS23。再向该混合物中加入平均分子量为7，500的硫酸葡聚糖钠至终浓度为46μg/ml(摩尔比1∶1)，然后于37℃，pH3.0、5.0、7.4或9.7等不同pH条件下保温2小时。表8显示了保温2小时后保留的FGF活性。
由表8所示的结果可以看出，对照组在各PH条件下FGF活性均显著降低，但硫酸葡聚糖组的FGF活性则保持在高水平。
表8添加剂PH保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖钠3.080硫酸葡聚糖钠5.0100硫酸葡聚糖钠7.4100硫酸葡聚糖钠9.787未加3.030未加5.045未加7.460未加9.728实施例8向8mMHCl中加入参考实施例3中制得的rhbFGF突变蛋白CS23及平均分子量为7，500的硫酸葡聚糖钠，终浓度分别为100μg/ml和94μg/ml(摩尔比1∶1)，然后加入胃蛋白酶达4μg/ml(终pH2.1)。对照组未添加硫酸葡聚糖钠。反应混合物于37℃保温30分钟，并测定保留的FGF活性(表9)。对照组中几乎失去所有rhbFGF突变蛋白CS23的活性，而硫酸葡聚糖钠组虽经胃蛋白酶消化仍可稳定地保留FGF活性。
表9添加剂保留的FGF活性(%)硫酸葡聚糖钠98未加2实施例9向20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中加入参考实施例3中制得的rhbFGF突变蛋白MS23，终浓度为100μg/ml，再向该混合物中加入平均分子量为7，500的硫酸葡聚糖钠达94μg/ml(摩尔比1∶1)，然后加入终浓度达4μg/ml的胰蛋白酶或α-胰凝乳蛋白酶。该混合物于37℃保温16小时。用未添加硫酸葡聚糖的一组作为对照。对照组几乎没有保留的rhbFGF突变蛋白CS23的活性，但存在胰蛋白酶或α-胰凝乳蛋白酶的硫酸葡聚糖钠组仍稳定地保留了活性(表10)。
表10酶添加剂保留的FGF活性(%)胰蛋白酶硫酸葡聚糖钠95胰蛋白酶未加4α-胰凝乳蛋白酶硫酸葡聚糖钠92α-胰凝乳蛋白酶未加6
实施例10向含有10%胎牛血清的DulbeccoMEM培养基内加浓度达10μg/ml的rhbFGF，再向该混合物中加入终浓度达500μg/ml参考实施例4中制得的β-环糊精十四烷基硫酸钠盐或参考实施例5至8中制得的β-1，3-葡聚糖硫酸的铵盐，然后于37℃保温24小时。所用β-1，3-葡聚糖硫酸酯的铵盐的平均聚合度为6(硫含量13.5%)、26(硫含量为14.0%131(硫含量为15.4%)或540(硫含量为12.7%)。以未添加硫酸化葡聚糖的一组作为对照组。表11中显示了保温24小时后保留的FGF活性。对照组中几乎丧失了所有FGF活性，但β-环糊精硫酸酯或β-1，3-葡聚糖硫酸酯组中则稳定地保留了FGF活性。
表11添加剂保留的FGF活性(%)β-环糊精十二烷基硫酸酯钠盐100β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐75(平均聚合度6)β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐100(平均聚合度26)β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐100(平均聚合度131)β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐100(平均聚合度540)未加4
实施例11向含有10%胎牛血清的Dulbecco′sMEM培养基内加入浓度达10μg/ml的rhbFGF突变蛋白CS23，再向该混合物中加入终浓度达500μg/ml的参考实施例4中制得的β-环糊精十四烷基硫酸酯钠盐或参考实施例5至8中制得的β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐。然后于37℃下保温24小时。所用的β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐平均聚合度为6(硫含量13.5%)、26(硫含量14.0%)、131(硫含量15.4%)或540(硫含量12.7%)。将未添加硫酸化葡聚糖的一组作为对照组。表12显示保温24小时后保留的FGF活性。对照组中几乎失去所有FGF活性，但加有β-环糊精硫酸酯或β-1，3-葡聚糖硫酸酯组则稳定地保留了FGF活性。
表12添加剂保留的FGF活性(%)β-环糊精十四烷基硫酸酯钠盐100β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐100(平均聚合度6)β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐100(平均聚合度26)β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐100(平均聚合度131)β-1，3-葡聚糖硫酸酯铵盐100(平均聚合度540)未加6
实施例12按1∶1的体积比混合得自参考实施例3的rhbFGF突变蛋白CS23(980μg/ml)和平均分子量为7，500的葡聚糖硫酸酯钠。将200μl等份的组合物加到TSK-凝胶3000SW(日本Tosoh公司)柱(0.75×60cm)上，并用含有0.1M Na2SO4的0.1M磷酸盐缓冲液(PH6.0)洗柱，流速为1.0ml/分。测230nm吸光率监测蛋白质。混合物产生两个峰(见图2)峰Ⅰ(用Ⅰ标出)和峰Ⅱ(用Ⅱ标出)。分别收集和分析两个峰证明峰Ⅰ为含rhbFGF突变蛋白CS23和葡聚糖硫酸酯钠盐(1∶4)的复合物，峰Ⅱ是葡聚糖硫酸酯钠盐。
由图2估计上述复合物的分子量约为45，000。
实施例13制备含0.5mgrhbFGF、0.23mg葡聚糖硫酸酯钠盐、15mg柠檬酸钠稳定的注射用水溶液(pH7.4)。
实施例14制备含0.5mgrhbFGF突变蛋白CS23、0.23mg葡聚糖硫酸酯钠盐、15mg柠檬酸钠的稳定的注射用水溶液(pH7.4)。
权利要求
1.生产含(a)成纤维细胞生长因子(FGF)或其突变蛋白和(b)硫酸葡萄糖多聚物之稳定化组合物的方法，其包括使FGF或其突态蛋白与硫酸葡萄糖多聚物在含水介质上接触。
2.根据权利要求1的方法，其中组合物包含FGF或其突变蛋白与硫酸葡萄糖的复合物。
3.根据权利要求1的方法，其包含FGF突变蛋白和葡聚糖硫酸酯。
4.根据权利要求1的方法，其中FGF突变蛋白是其中至少一个人碱性FGF组成氨基酸被其他氨基酸取代的突变蛋白。
5.根据权利要求4的方法，其中突变蛋白是rhbFGF突变蛋白CS23，该突变蛋白中人bFGF之70位和88位的半胱氨酸被丝氨酸取代。
6.根据权利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物硫含量不少于约3%(W/W)。
7.根据权利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物的硫含量不少于约12至20%(W/W)。
8.根据权利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物(glucan sulfate)是葡聚糖硫酸酯((dextran sulfate)。
9.根据权利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是环糊精硫酸酯。
10.根据权利要求1的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是β-1，3-葡聚糖硫酸酯。
11.根据权利要求1的方法，其进一步包含二或三元羧酸。
12.根据权利要求1的方法，其包括制备进一步含有医药上可接受之载体、赋形剂或其稀释剂的医药组合物的方法。
13.根据权利要求1的方法，其中组合物是注射剂、注射用溶液、冷冻制剂或冻干制剂形式的。
14.根据权利要求13的方法，其中组合物是呈注射剂形式的。
15.一种稳定成纤维细胞生长因子(FGF)或其突变蛋白的方法，其包括使FGF或其突变蛋白与硫酸葡萄糖多聚物在水溶液中接触。
16.根据权利要求15的方法，其中使FGF突变蛋白与硫酸葡萄糖多聚物接触。
17.根据权利要求15的方法，其中FGF突变蛋白是其中至少一个人碱性FGF组成氨基酸被其他氨基酸取代的突变蛋白。
18.根据权利要求17的方法，其中突变蛋白是rhb突变蛋白CS23，该突变蛋白中人bFGF之70和88位的半胱氨酸被丝氨酸取代。
19.根据权利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物的硫含量不少于大约3%(W/W)。
20.根据权利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物的硫含量大约为12至20%(W/W)。
21.根据权利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是葡聚糖硫酸酯(dextran sulfate)。
22.根据权利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是环糊精硫酸酯。
23.根据权利要求15的方法，其中硫酸葡萄糖多聚物是β-1，3-葡聚糖硫酸酯。
24.根据权利要求15的方法，其进一步包含二或三元羧酸。
全文摘要
将成纤维细胞生长因子(FGF)或其突变蛋白在水溶液中与硫酸葡萄糖多聚物接触而使FGF或其突变蛋白稳定化。由此得到的由(a)FGF或其突变蛋白和(b)硫酸葡萄糖多聚物构成的组合物得以稳定化，因而能够很方便地作为药物用于温血动物。
文档编号A61K31/715GK1038765SQ8910397
公开日1990年1月17日 申请日期1989年6月5日 优先权日1988年6月6日
发明者加藤光一, 河原贤治, 锻治尾知子 申请人:武田药品工业株式会社