一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法。是以γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、牛磺酸、N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)为主要原料，N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)为交联剂，过硫酸铵或过硫酸钾为引发剂，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)为促进剂。本发明主要采用半互穿网络技术，制备方法包括γ-PGA-S72单体的合成、温敏水凝胶生物载体的制备、温敏水凝胶生物载体的纯化和温敏水凝胶生物载体与生长因子的结合四个步骤。本发明的原料来源丰富、制备方法简单。本发明的结合生长因子型温敏水凝胶具有良好的生物相容性，在组织工程支架、生物药物载体、生物粘合剂和创伤敷料等生物医疗领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法
[0001] 【【技术领域】】:本发明涉及生物材料、组织工程和高分子材料领域，具体涉及一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法。
[0002]【【背景技术】】:生物医学组织工程是一个涉及细胞生物学、材料科学、反应器工程和临床医学的多学科交叉研究领域。其目的在于构建新的组织和器官。最初认为，所谓组织工程就是将细胞置于适合的反应器条件下进行三维培养，使其构建成为组织，并进而发展成为人体器官的替代物。组织工程的三要素就是支架材料、种子细胞和生长因子。
[0003]用于组织工程的支架材料必须具有良好的生物相容性；良好的细胞亲和性；合适的生物降解性和降解速率；可负载生长因子及传递生物信号等特点。目前可用于组织工程的支架材料有:无机材料，羟基磷灰石、磷酸钙；天然高分子材料，壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、丝胶、聚谷氨酸；合成材料，聚乳酸、聚己内酯等。
[0004]水凝胶是一类引起组织工程领域极大关注的生物材料。因为水凝胶具有高度的生物相容性以及可与软组织媲美的机械特性。水凝胶是以水为分散介质的凝胶，在具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀形成交联聚合物。
[0005]聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有温度敏感性，其LCST约为32 °C。Okano等根据PNIPAAm的疏-亲水性间可逆变化的特性，将PNIPAAm以共价键形式固定在聚苯乙烯板(TCPS)表面进行细胞培养。37°C时细胞在TCPS表面粘附增殖，当温度由37°C降至32°C时，TCPS由疏水性转化为亲水性，即接枝有PNIPAAm的TCPS吸水膨胀，整体细胞群则在保持细胞间连接状态下以片状的形态得以脱附，这种方法经济、方便，可以更好地保持细胞的分化特性及细胞的完整性。然而此类凝胶存在机械性能差、易碎、生物相容性差等缺点，不利于在组织工程等领域应用。
[0006]Y-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和Y-羧基以酰胺键的方式缩合而成的一种多肽型高分子。Y-PGA具有良好的生物相容性和生物降解性，可单独使用或者与传统的组织工程材料结合用于组织修复，引入Y -PGA可改善材料的细胞亲和性，更有利于细胞的粘附和增殖；也可用于药物载体提供药物缓释性和靶向性。
[0007]干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度的自我复制能力、高度增殖和多向分化性能，可分化成多种功能细胞及组织器官，在治疗各种细胞损伤性疾病等方面拥有极强的优越性。胚胎干细胞(ES)/诱导多能干细胞(iPS)比其它干细胞更为原始，其扩增能力更强，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。但是胚胎干细胞面临着伦理道德和法律问题，使得iPS细胞的出现，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响。
[0008]细胞生长因子在促进干细胞自我更新和定向分化的过程中扮演着重要的角色，但是生长因子都是分子量不大的可溶性多肽，对于微环境中的PH值变化、有机溶剂、超声波及酶等都非常敏感，易于变性或降解，而且生长因子的半衰期较短，如果采用传统的将生长因子加入细胞培养液的方式，其诱导作用将很快失效；同时，过量的生长因子加入会导致细胞的癌变。因此，细胞支架材料设计必须能够稳定生长因子的活性并达到对其控制释放的目的。肝素和硫酸化蛋白多糖等通过静电相互作用来保持生长因子在体内的稳定性。据报道肝素、硫酸化蛋白多糖和合成的类肝素都具有保护生长因子活性的作用，因为当硫酸化多糖和生长因子相结合时，多糖中的硫酸化基团首先和生长因子中的碱性氨基酸残基相结合，使其不被迅速降解。因此肝素与类肝素物质通过与生长因子的特异结合性，控制其缓慢释放，从而更好地发挥生长因子对细胞的诱导及刺激分化作用。硫酸化的Y-PGA与肝素结构类似，同时是一种微生物发酵产物、可降解、降解产物无毒，无异源病毒污染，并且比肝素使用更加安全、可靠。所以可采用Y-PGA-S72作为温敏水凝胶载体中保护生长因子活性和控制释放生长因子的大分子物质，制备功能性生物载体。
[0009]查阅国内外文献发现，目前尚无将Y -PGA-S72和PNIPAAm相结合的报导。本发明综合考虑了 Y-PGA-S72的生物相容性和能够保护生长因子缓慢释放的特点，采用半互穿网络技术，将Y-PGA-S72引入到PNIPAAm水凝胶网络中，制备得到结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，提高传统水凝胶的生物相容性、温度响应性、细胞片层脱附和保护并缓慢释放生长因子等特性。
[0010]【
【发明内容】
】:为了克服目前水凝胶存在的生物相容性不足的问题，本发明目的在于设计一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，使该凝胶具有高透明性、快速温度响应性、良好的生物相容性、保护生长因子缓慢释放的特性和细胞片层脱附的功能。[0011]为实现上述目的，本发明提供了一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，包括下述步骤:
[0012]I) Y -PGA-S72单体的合成:将Y -聚谷氨酸和牛磺酸在室温下溶解于0.5M的碳酸氢钠溶液中，待溶解完全后将反应液至于4°C的水浴中冷却降温，待冷却后加入缩合剂EDC -HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得Y -PGA-S72单体；
[0013]2)凝胶的制备:将NIPAAm和Y -PGA-S72溶解于去离子水中，PNIPAAm和
Y-PGA-S72单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为3~5%和2~8%，20~25°C搅拌25~45min至完全溶解,将反应液置于冰水浴中冷却降温至O~4°C,加入质量百分比浓度为2~6%的交联剂搅拌均匀，在N2保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.5~2%的引发剂水溶液，搅拌5~15min后，向混合液中加入促进剂50~120 μ L,搅拌30~60s,将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20~25°C，24~48h后停止反应；
[0014]3)凝胶的纯化:将反应后的产物用直径为18mm的打孔器进行打孔，浸泡于去离子水中7~10天，每间隔6~8小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体；
[0015]4)与生长因子的结合:将步骤3所得的温敏水凝胶置于体积浓度为75%的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1 % BSA的PBS溶液中4°C IOh,之后用PBS冲洗3次，制得结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。
[0016]所述的N-异丙基丙烯酰胺单体分子结构中存在着一定比例的疏水基团(异丙基，-CH(CH3)2)和亲水基团(酰胺基团，-C0-NH-)，它们会竞争性地和水分子产生氢键作用力。在较低温度下及外界温度小于PNIPAAm的低临界溶解温度(LCST ^ 32°C )时，PNIPAAm与水分子之间的相互作用力主要体现为酰胺基团和水分子之间的氢键作用，此时分子链呈现伸展的线团构象，随着温度升高，当T > LCST时，部分与水分子形成的氢键被破坏，PNIPAAm大分子内酰胺键之间会形成氢键，形成疏水层，将水分子排出。由于PNIPAAm在人体生理温度附近(LCST~320C )表现出优良的温度响应性，使得它在组织工程温敏支架材料中得到广泛的应用。
[0017]所述的Y-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和Y-羧基以酰胺键的方式缩合成的一种多肽型高分子，Y-PGA的分子链上含有大量的活性较高游离侧链羧基(-C00H)，使得它具有极好的吸水保湿性，易于与一些药物形成稳定的复合物，是一类理想的可生物降解的生物医用高分子材料。
[0018]所述的Y-PGA-S72单体中磺酸基团(-SO3H)和羧基(-C00H)的相对含量之比恰好对碱性成纤维细胞生长因子bFGF具有良好的保护和缓慢释放的功能，对细胞的增殖有很大的促进作用。
[0019]所述的交联剂是N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，所述的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述的促进剂为N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺。
[0020]所述的水凝胶溶胀后外观为透明状，当外界温度升至31~35°C后，水凝胶立刻由透明色变为乳白色。
[0021]根据上述结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，于37°C条件下凝胶表面接种小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)，细胞数量随Y-PGA-S72单体含量的增加而增加。并能够在结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面培养iPS细胞，使得iPS细胞能够呈现弱贴壁的拟胚体样细胞生长，利于 保持iPS细胞的全能性。
[0022]本发明的原理是:N-异丙基丙烯酰胺单体在引发剂和催化剂的氧化还原作用下，分子结构中的双键打开聚合；由于Y-PGA_S72分子链中的羧基基团和磺酸基团的比例恰好适合与生长因子中阳离子氨基酸结合，从而对凝胶起到了增强生物相容性和保护缓慢释放生长因子的作用。而在聚合过程中加入Y-PGA-S72后，由于Y-PGA-S72为水溶性的分子链并没有双键并不发生聚合，反应完成后只是穿插在聚N-异丙基丙烯酰胺形成的高分子三维网络中，形成了半互穿的结构，又由于Y-PGA-S72分子链中含有极性亲水基团(如-C00H、-SO3H)，可以和酰胺键形成氢键，因此不易从凝胶三维网络中渗出，从仿生构思和网络设计的角度出发，结合生长因子型温敏水凝胶生物载体可以提高温敏水凝胶的生物功能性，将温敏脱附和控制释放生长因子的特性相结合，制备新一代干细胞培养支架材料。
[0023]与其他凝胶及其制备方法相比，本发明具有如下有益效果:
[0024](I)本发明结合生长因子型温敏水凝胶生物载体制备过程操作简便可控，水相反应无毒无害，具有较高的实用价值；
[0025](2)本发明所制备的结合生长因子型温敏水凝胶生物载体具有高的溶胀度、良好的细胞相容性和良好的保护缓慢释放碱性成纤维细胞生长因子bFGF的性能，可应用于细胞培养支架、药物载体、创伤敷料等方面；
[0026](3)本发明所制备的结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的溶胀度和细胞相容性可以通过调节Y-PGA-S72的含量来实现。并能够在结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面培养iPS细胞，使得iPS细胞能够呈现弱贴壁的拟胚体样细胞生长，利于保持iPS细胞的全能性。【【专利附图】
【附图说明】】:
[0027]图1为结合生长因子型温敏水凝胶生物载体制备机理
[0028]图2为实例I结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的SEM图
[0029]图3为小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)在实例I结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面生长5天的倒置显微镜图
[0030]图4为iPS细胞在实例2结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面生长3天的倒置显微镜图
【【具体实施方式】】:
[0031]实施例1:
[0032]I) y -PGA-S72单体的合成:将645mg Y -聚谷氨酸和626mg牛磺酸在室温下溶解于30ml0.5M碳 酸氢钠溶液，待溶解完全后将反应液置于4°C的冰水浴中降温冷却，待冷却后加入1917mg缩合剂EDC -HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得Y-PGA-S72;
[0033]2)温敏水凝胶生物载体的制备:将3.39g NIPAAm和0.2712gy -PGA-S72溶解于去离子水中，25°C搅拌30min至完全溶解，将反应液置于冰水浴中冷却降温至4°C，加入
0.139g交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺搅拌均匀，在N2保护和磁力搅拌下加入0.0678g引发剂过硫酸铵水溶液，搅拌15min后，向混合液中加入促进剂50 μ L，搅拌30s，将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在25°C，48h后停止反应；
[0034]3)温敏水凝胶生物载体的纯化:将反应后的产物用直径为18_的打孔器进行打孔，浸泡于无离子水中7天，每间隔6小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体；
[0035]4)将步骤3所得的温敏水凝胶生物载体置于体积浓度为75%的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1 % BSA的PBS溶液中4°C IOh,之后用PBS冲洗3次，制得所述的结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。
[0036]5)将步骤4所得的温敏水凝胶生物载体进行小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)接种，细胞的接种密度密度是2X104cellS/mL。
[0037]实施例2:
[0038]I) y -PGA-S72单体的合成:将645mg Y -聚谷氨酸和626mg牛磺酸在室温下溶解于30ml0.5M碳酸氢钠溶液，待溶解完全后将反应液置于4°C的冰水浴中降温冷却，待冷却后加入1917mg缩合剂EDC -HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得Y-PGA-S72;
[0039]2)温敏水凝胶生物载体的制备:将3.39g NIPAAm和0.1695g y -PGA-S72溶解于去离子水中，20°C搅拌45min至完全溶解，将反应液置于冰水浴中冷却降温至4°C，加入
0.139g交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺搅拌均匀，在N2保护下和磁力搅拌下加入0.0678g弓丨发剂过硫酸铵水溶液，搅拌15min后，向混合液中加入促进剂50 μ L，搅拌30s，将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20°C，30h后停止反应；
[0040]3)温敏水凝胶生物载体的纯化:将反应后的产物用直径为18_的打孔器进行打孔，浸泡于无离子水中10天，每间隔5小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体。
[0041]4)将步骤3所得的温敏水凝胶生物载体置于体积浓度为75%的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1 % BSA的PBS溶液中4°C IOh,之后用PBS冲洗3次，制得所述的结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。[0042]5)将步骤4所得的温敏水凝胶生物载体进行iPS细胞接种。
【权利要求】
1.一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 1)Y-PGA-S72单体的合成:将Y-聚谷氨酸和牛磺酸在室温下溶解于0.5M碳酸氢纳溶液中，待溶解完全后将反应液直于4 C的冰水浴中冷却降温，待冷却后加入缩合剂EDC -HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得Y -PGA-S72单体； 2)温敏水凝胶生物载体的制备JfNIPAAn^PY-PGA-S72溶解于去离子水中，NIPAAm和Y-PGA-S72单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为3~5%和2~8%，20~25°C搅拌25~45min至完全溶解，将反应液置于冰水浴中冷却降温至O~4°C，加入质量百分比浓度为2~6%的交联剂搅拌均匀，在N2保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.5~2%的引发剂水溶液，搅拌5~15min后，向混合液中加入促进剂50~120 μ L,搅拌30~60s,将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20~25°C，24~48h后停止反应； 3)温敏水凝胶生物载体的纯化:将反应后的产物用直径为18_的打孔器进行打孔，浸泡于去离子水中7~10天，每间隔6~8小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体； 4)温敏水凝胶生物载体与生长因子的结合:将步骤3所得的温敏水凝胶置于体积浓度为75%的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1 % BSA的PBS溶液中4°C IOh,之后用PBS冲洗3次，制得结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。
2.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于:所述的N-异丙基丙烯酰胺单体分子结构中存在着一定比例的疏水基团异丙基-CH(CH3)2,以及亲水基团酰胺基团-CO-NH-，它们会竞争性地和水分子产生氢键作用力。在较低温度下及外界温度小于PNIPAAm的低临界溶解温度LCST 乂 32°C时，PNIPAAm与水分子之间的相互作用力主要体现为酰胺基团和水分子之间的氢键作用，此时分子链呈现伸展的线团构象，随着温度升高，当T > LCST时，部分与水分子形成的氢键被破坏，PNIPAAm大分子内酰胺键之间会形成氢键，形成疏水层，将水分子排出。由于PNIPAAm在人体生理温度附近LCST ^ 32°C表现出优良的温度响应性，使得它在组织工程温敏支架材料中得到广泛的应用。
3.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于:所述的Y-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和Y-羧基以酰胺键的方式缩合成的一种多肽型高分子，Y -PGA的分子链上含有大量的活性较高游离侧链羧基-COOH，使得它具有极好的吸水保湿性，易于与一些药物形成稳定的复合物，是一类理想的可生物降解的生物医用高分子材料。
4.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于:所述的Y -PGA-S72单体中磺酸基团-SO3H和羧基-COOH的相对含量之比恰好适合与生长因子中阳离子氨基酸结合，从而对温敏水凝胶生物载体起到了增强生物相容性和保护缓慢释放生长因子的作用。
5.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于:所述的交联剂是N，N-亚甲基双丙烯酰胺，所述的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述的促进剂为N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺。
6.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于:所述的水凝胶溶胀后外观为透明状，当外界温度升至31~35°C后，水凝胶立刻由透明色变为乳白色。
7.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于:根据上述结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，于37°C条件下凝胶表面接种小鼠胚胎成纤维细胞，细胞数量随Y-PGA-S72单体含量的增加而增加。并能够在结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面培养iPS细胞，使得iPS细胞能够通过水凝胶的亲疏水性自动脱附，从而避免了酶对细胞增殖和分化的影响。
【文档编号】A61L27/16GK103948962SQ201410201006
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】杨宁, 石璐, 张鲁杰, 张 浩 申请人:天津工业大学