纤连蛋白:生长因子嵌合物的制作方法

专利名称：纤连蛋白:生长因子嵌合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质复合物，该复合物具有能够结合和激活纤连蛋白的生长因子受体和整联蛋白受体的相应结构域。在特定的实施方案中，本发明涉及嵌合蛋白，该蛋白包括生长因子如胰岛素样生长因子I (IGF-1)、胰岛素样生长因子II (IGF-II)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或者角质形成细胞生长因子(KGF)受体结合域和纤连蛋白(FN)的整联蛋白受体结合结构域。更特别地，本发明涉及刺激细胞迁移的蛋白复合物以及促进或诱导细胞迁移和/或增殖的组合物和方法。这些组合物和方法可用于伤口愈合、组织工程，美容和治疗处理，如皮肤置换和皮肤补充和烧伤治疗等需要表皮细胞迁移和/或增殖的情况。在其他实施方案中，本发明提供的治疗方法涉及预防或抑制癌细胞转移特别是乳腺癌。
背景技术：
已知有很多肽生长因子参与范围广泛的细胞过程，包括增生、DNA合成、分化、细胞周期进展以及凋亡抑制，这些肽生长因子包括胰岛素样生长因子(IGF，例如IGF-I和 IGF-II) (Jones&Clemmons, 1995，Endocrine Rev. 16 3;ffood&Yee, 2000, J. MammaryGland Biology and Neoplasia 5 I)、EGF(Heldin et al, 1981, Science 4 I 122)、bFGF(Taraboletti. et al, 1997, Cell Growth. Differ. 8 471)以及 KGF(Marchese etal, 1990, J. Cell Physiol. 144 326)。这些作用是通过分别结合到其同族(cognate)酪氨酸激酶连接的细胞表面受体I型IGF受体(IGF-IR)、EGF受体、bFGF受体和KGF受体来介导的。IGF同样也受一个特异性结合蛋白质家族严密调控，该家族名为IGFBP，其主要作用是结合游离的IGF，因此能够稳定IGF的半衰期、特异性和活性(Clemmons，1998，Mol. Cell.Endocrinol. 140 19)。纤连蛋白是存在于所有脊椎动物中的高分子量粘着糖蛋白。纤连蛋白在细胞粘附、细胞形态和表面结构中发挥作用。它的主要功能似乎是在发育、组织修复和伤口愈合、细胞生长调控和分化中参与细胞迁移(Alitalo&Vaheri, 1982，Adv. Cancer Res. 37 I II; Yamada, 1983, Annu. Rev. Biochem. 62 761;Hynes, 1985, Annu. Rev. Cell Biol. I 67)。纤连蛋白多态性取决于对单个纤连蛋白初级转录物的三个区域(ED-A、ED-B和IIICS)的可变剪接模式(Petersen et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 137; Schwarzbauer etal.，1983，Cell 35 421;Komblihtt et al.，1984，Nucleic Acids Res. 12 5853)。纤连蛋白的确切组成依赖于组织类型和/或细胞环境。在人类中，可能有20种不同形式的纤连蛋白，大部分是来源于一些3型模块的可变剪接(Potts and Campbell, 1994, Curr. Opin. CellBiol. 6 648)。纤连蛋白剪接变体的表达似乎是发育调控和组织特异性的。纤连蛋白能够结合很多胞外分子，包括肝素、胶原和透明质酸。纤连蛋白通过结合细胞外基质的不同组分以及在细胞表面的膜结合纤连蛋白受体(整联蛋白)来组织细胞-细胞相互作用和与细胞外基质的细胞相互作用。然而，生长因子和纤连蛋白在蛋白复合物中对于刺激生物学反应如细胞迁移和/或增殖的相对贡献以及他们的相应结构域仍然还不清楚。
发明概述本发明人发现包含生长因子如IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF或KGF和FN的合成的嵌合物形式的蛋白质复合物通过结合和协同激活同族生长因子受体和FN结合整联蛋白受体来刺激细胞迁移和/或增殖。因此，本发明广泛涉及分离的蛋白质复合物，其包括生长因子结构域的受体结合结构域和至少一个纤连蛋白结构域，该纤连蛋白结构域能够结合整联蛋白受体，其中所述分离的蛋白质复合物能够共激活所述生长因子和整联蛋白受体，从而引发生物学反应。在第一方面，本发明提供了一种合成的嵌合蛋白形式的分离的蛋白质复合物，其包含如下的氨基酸序列(i)生长因子或生长因子的能够结合同族生长因子受体的至少一个结构域；(ii)纤连蛋白或者包含纤连蛋白的至少一个整联蛋白结合结构域的纤连蛋白片 段。优选地，根据上述方面，所述生长因子是IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF或KGF。优选地，所述整联蛋白受体是α 或α 4整联蛋白。本发明的该方面也设想了合成的嵌合蛋白中的一或多个额外的纤连蛋白片段的
氨基酸序列。本发明的该方面还包括对应于上述(i )和(ii )的氨基酸序列以及对应于所述一 或多个额外的纤连蛋白片段的氨基酸序列的氨基酸缺失、添加、取代和/或突变。在第二方面，本发明提供了编码第一方面的分离的蛋白质复合物的分离的核酸。在第三方面，本发明提供了包含第二方面的分离的核酸的遗传构建体，所述核酸在表达载体中可操作地与一或多个调控序列连接。优选地,所述遗传构建体是表达构建体。
在第四方面，本发明提供了包含第三方面的遗传构建体的宿主细胞。在第五方面，本发明提供了药物组合物，其包含第一方面的分离的蛋白质复合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。本发明的该方面还设想了药物组合物，其包含第四方面所述的宿主细胞，所述细胞表达所述合成的一或多种蛋白质。在第六方面，本发明提供了第一方面所述的合成蛋白质的特异性抗体。在第七方面，本发明提供了促进细胞迁移的方法，包括使用合成的蛋白质结合生长因子受体和整联蛋白受体的步骤。优选地，所述生长因子受体是IGF-IR、EGF受体、bFGF受体或KGF受体。优选地，所述整联蛋白受体是α I或α 4整联蛋白。在一个优选实施方案中，本发明的该方面涉及在哺乳动物、优选人中促进或诱导上皮/角质形成细胞/成纤维细胞细胞迁移和/或增殖以促进伤口愈合。优选地，所述合成的蛋白质是根据本发明第一方面的蛋白质。在第八方面，本发明提供了阻止细胞迁移和/或增殖的方法，包括阻止、抑制或以其他方式减少含有生长因子和纤连蛋白的复合物结合生长因子受体和整联蛋白受体的步骤。优选地，所述生长因子受体是IGF-IR、EGF受体、bFGF受体或KGF受体。
优选地，所述整联蛋白受体是α 或α 4整联蛋白。在一个优选实施方案中，本发明的该方面涉及在哺乳动物优选人中阻止或抑制转移性癌细胞迁移和/或增殖。本发明这个方面的一个特殊例子是阻止或抑制乳腺癌转移。本发明的第七方面和第八方面也可能包括预防性和治疗性方法。在第九方面，本发明提供了第一方面的分离的蛋白质复合物产生分子的用途，所述分子是(i)包含生长因子和纤连蛋白的蛋白质复合物的激动剂；或
(ii)包含生长因子和纤连蛋白的蛋白质复合物的拮抗剂。在一个实施方案中，本发明提供了第一方面的合成的蛋白质产生分子的用途，所述分子是(i ) IGF-I: FN、IGF-II: FN、EGF: FN、bFGF: FN、KGF: FN 或 IGF-I: IGFBP: FN 蛋白质复合物的激动剂；或(i i ) IGF-I: FN、IGF-II: FN、EGF: FN、bFGF: FN、KGF: FN 或 IGF-I: IGFBP: FN 蛋白质复合物的拮抗剂。根据本发明的该方面所产生的激动剂和拮抗剂可能对于促进伤口愈合、组织工程、皮肤再生和/或阻止癌细胞转移或过度增生性皮肤疾病如疤痕和牛皮癣等有着特定效力。在第十方面，本发明提供了包含第一方面的分离的蛋白质复合物的生物材料。在特殊的实施方案中，所述生物材料可以是外科手术植入物、支架、假体、伤口或烧伤敷药等，其适当地用本发明的分离的蛋白质复合物浸溃、包被或以其他方式包含本发明的分离的蛋白质复合物。附图
简述图I :(A)人纤连蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)，(B)成熟IGF-I的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，(C)成熟IGF-II的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)，(D)成熟EGF的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)，(E)成熟bFGF的氨基酸序列(SEQ ID NO :5)，(F)成熟KGF的氨基酸序列(SEQ ID NO :6)，和(G)优选的接头序列(SEQ ID NO :7_12)。图2 :IGF-I、IGFBP和FN蛋白质复合物刺激乳腺癌细胞迁移。MCF-10A细胞接种于被FN (I μ g/mL)包被的Transwells，在IGFBP-3或5存在下增高结合前的IGF-I的浓度。让细胞迁移5小时。响应每个处理的穿越膜的细胞数目表示为只迁移到FN的细胞百分比(SFM)。MCF-10数据汇集自每个重复实验的四个孔中检测的三个处理实验。误差条表示SEM。SFM=无血清培养基。发明详述本发明产生于发现了包含生长因子如IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF或KGF和FN的合成嵌合物通过与其同族生长因子受体和FN结合整联蛋白受体结合并对细胞迁移发挥生物学作用，所述受体由应答细胞表达。更特别地，这种双重结合事件协同刺激细胞迁移和/或增殖。这些稳定的、具有生物学活性的单链嵌合分子至少包含生长因子的最小结构域或区域，其能结合其同族受体，以及一或多个FN III型结构域，所述FN III型结构域至少包含FN的整联蛋白结合结构域。
这个发现致使本发明人提供了一种分离的蛋白质复合物，所述复合物至少包含IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF或KGF的最小结构域或区域，其例如能够结合其同族受体以及FN的整联蛋白结合结构域。更特别地，可能产生包含这些结构域的单链、连续蛋白质。此类蛋白质复合物以单链合成蛋白形式存在，协同结合或共连接其同族受体和FN结合整联蛋白受体，因此此类蛋白质复合物是促进细胞迁移和/或增殖以及伤口愈合的有效物质。相似地，阻止同族受体和FN结合整联蛋白受体共连接可用于阻止癌细胞转移。在本说明书中，除非另外指明，“包含”是包括性的而不是排除性的，因此指定的整体或整体群可以包括一或多个未指定的整体或整体群。在特定的生长因子受体结合结构域和整联蛋白结合结构域内容中，此类结构域可包括所述结构域的氨基酸序列，连同其他的所需的额外氨基酸。也应当理解，这种结构域可以基本上由所述结构域的氨基酸序列以及不超过10个、优选不超过5个或更优选不超过4个、3个、2个或I个额外氨基酸组成。 也应当理解，这种结构域可以由所述结构域的氨基酸序列组成，而不含有任何的额外氨基酸。在本发明中，“分离的”是指从其天然状态下移出或以其他方式进行了人工操作。分离的材料实质上或基本上是不含正常在天然状态下与之伴随的成分或者被操作使处于人工状态下，并与正常在天然状态下与之伴随的成分在一起。分离的材料可以以天然、化学合成或重组形式存在。在本文使用的“合成”是指不是天然发生的，而是通过人为技术干涉制备的。在合成蛋白和核酸的文中，其涵盖由重组、化学合成或本领域已知的技术组合所产生的分子。“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或者非天然氨基酸，本领域中已知的D-或L-氨基酸。术语“蛋白质”还包括和涵盖本领域中常用的术语如“糖蛋白”、“月旨蛋白”等。“肽”指的是具有少于50个氨基酸的蛋白质。“多肽”是指具有50个或更多氨基酸的蛋白质。如前所述，在一个特定方面，本发明提供了合成嵌合蛋白质形式的分离的蛋白质复合物，其包含如下的氨基酸序列(i)生长因子，或生长因子的能够结合同族生长因子受体的至少一个结构域；(ii)纤连蛋白，或者至少包含纤连蛋白的整联蛋白结合结构域的纤连蛋白片段。本文所用的“嵌合蛋白”包括连续的氨基酸序列，所述氨基酸来源于纤连蛋白的整联蛋白受体结合结构域，任选的存在纤连蛋白的额外结构域，以及生长因子或至少生长因子的受体结合结构域。在本文使用的“生长因子”是生物学活性蛋白，其能够在体内和/或体外调节细胞生长、分化、存活和/或迁移。7]\ 例性的生长因子包括但不限于 IGF (Jones&Clemmons, 1995, Endocrine Rev. 16 3;Wood&Yee, 2000, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 5 I;Keisset al.，1994，Hormone Research 41 66)，如 IGF-I(UniProtKB/Swiss-Prot:#P05019，成熟的蛋白质包括完整序列的第49-118位氨基酸残基)和IGF-II (UniProtKB/Swiss-Prot :#P01344,成熟的蛋白质包括完整序列的第25-91位氨基酸残基)，VEGF(Neufeld et al. , 1999,FASEB J. 13 9-22)，PDGF (Heldin, 1992，EMBO J. 114251-4259)，EGF(Heldin et al.，1981，Science 4 1122-1 123;UniProtKB/SwiSS-Prot:#P01133，成熟的蛋白包括完整序列的第971-1023位氨基酸残基)，成纤维细胞生长因子(FGF;Nurcombe et al, 2000, J. Biol. Chem. 275 30009-30018)，bFGF (Taraboletti et al., 1997,CelI Growth. Differ. 8 471-479;UniProtKB/Swiss-Prot :#P09038,成熟的蛋白包括完整序列的第143-288位氨基酸残基)，骨桥蛋白(Nam et al. , 2000, Endocrinol. 141 1100),凝血酶敏感蛋白-I (Namet al, 2000,如前)，生腱蛋白-C(Arai et al, 1996, J. Biol. Chem. 271 6099)，PAI-I (Nam et al, 1997, Endocrinol. 138 2972),纤溶酶原(Campbell et al, 1998, Am.J. Physiol. 275E321)，纤维蛋白原(Campbell et al, 1999, J. Biol. Chem 274 30215)，纤维蛋白(Campbell et al, 1999,如前)，转铁蛋白(Weinzimer et al, 2001, J.Clin. Endocrinol.Metab.86 1806)和 GF(Marchese et al, 1990, J. CellPhysiol. 144326-32;UniProtKB/Swiss_Prot:#P21781，成熟的蛋白包含完整序列第 32-194位氨基酸残基)。本发明的合成嵌合蛋白形式的分离的蛋白质复合物包含生长因子或生长因子的能够结合同族生长因子受体的至少一个结构域。在本文中，“结构域”是指至少能够结合同族生长因子受体的生长因子的部分或区域。通常，尽管不是必需的，所述同族生长因子受体由细胞表达，并且所述生长因子的至少一个结构域与所述同族生长因子受体的结合和连接会引起细胞应答如细胞生长、分化、存活和/或迁移。特别对于IGF-I，所述结构域合适地包含氨基酸残基24，该残基不是亮氨酸残基。典型地，所述残基是酪氨酸。特别对于IGF-II，所述结构域合适地包含氨基酸残基27，该残基不是亮氨酸残基。 典型地，所述残基是酪氨酸。特别对于IGF-I，在一个实施方案中，所述结构域由IGF-I的1_70位残基组成。在另一个实施方案中，所述结构域由IGF-I的4-70位残基组成。同样可以理解的是，本发明的分离的蛋白质复合物中的另一组分至少是纤连蛋白的整联蛋白结合结构域。优选地，整联蛋白受体是α I或者α 4整联蛋白。虽然不希望被任何特定理论约束，提出合成嵌合蛋白能够共连接和共激活所述生长因子的同族受体和纤连蛋白的整联蛋白受体，从而刺激、诱导、增加或以其他方式促进细胞迁移。本发明的嵌合蛋白的一个优点是它们容易由化学合成或重组方法产生，并且预期在体内更稳定，因为它们并不依赖于维持蛋白-蛋白相互作用，而这种相互作用在非共价键结合的寡聚蛋白质复合物中是必需的。在这方面，虽然包括IGF-I的受体结合结构域的分离的蛋白质复合物也包括IGFBP，但根据上述作用模式，IGFBP优选不存在于IGF-I/FN合成嵌合物中。在其他实施方案中，本发明提供了分离的蛋白质复合物，如合成的嵌合蛋白质形、式，包括IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF或KGF和FN或至少包含FN的整联蛋白结合结构域的FN片段。优选地，所述整联蛋白受体是α I或α 4整联蛋白受体。在本文中，“片段”指的是纤连蛋白的结构域、亚序列或部分。片段优选由成熟纤连蛋白序列的少于500、少于400、少于300或更优选大约80-280个连续氨基酸构成。同时也包括了纤连蛋白的多个片段。纤连蛋白的整联蛋白结合结构域合适地包括RGD序列。该RGD序列位于纤连蛋白III型结构域8-10中(纤连蛋白序列的1266-1536位氨基酸)。更具体地，RGD序列位于纤连蛋白III型结构域10中，由纤连蛋白序列的1447-1536位氨基酸定义，尽管二级整联蛋白结合位点可能跨过更大的8-10结构域区域。相应地，在一个特定实施方案中，合成的嵌合物包括纤连蛋白片段，所述片段包含 RGD序列，其中所述片段包括或者是由纤连蛋白氨基酸序列的1447-1536位氨基酸的至少6个、至少10个、至少20个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个或者全部氨基酸组成。在另一个特定的实施方案中，合成的嵌合物包括纤连蛋白片段，所述片段包含RGD序列，所述片段包括或者是由纤连蛋白氨基酸序列的1266-1536位氨基酸的至少6个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少260
个或者全部氨基酸组成。在另一个特定的实施方案中，合成的嵌合物包括纤连蛋白片段，所述片段含有根据前面实施方案所述的RGD序列，其中所述合成的嵌合物还包括纤连蛋白氨基酸序列的至少10个、20个、50个、100个、200个、300个、500个、800个或1000个氨基酸，例如1266位残基的N端和/或1536位残基的C端。因此，所述合成的嵌合物可以包括纤连蛋白I型和/或II型结构域，例如包括或由纤连蛋白氨基酸序列50-273位氨基酸的至少6个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个或全部氨基酸组成的纤连蛋白片段。同样在另一个特定的实施方案中，合成的嵌合物包括含有或由纤连蛋白氨基酸序列1173-1536位氨基酸的至少6个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个或全部氨基酸组成的纤连蛋白片段。上述纤维连接蛋白序列编号是参考图I所示的纤连蛋白序列产生的。该纤连蛋白序列来源于UniPiOtKB蛋白质数据库，蛋白质登录号为Ρ02751。表I中列举了纤连蛋白结构域和区域。优选地，合成的嵌合物包括纤连蛋白或片段，所述片段包含整联蛋白结合结构域而不含有IGFBP氨基酸序列。优选地，本文前述的合成的嵌合蛋白还包括“接头序列”，该序列位于生长因子序列和纤连蛋白氨基酸序列之间并且连续。在一个实施方案中，所述接头序列包括一或多个甘氨酸残基和一或多个丝氨酸残基。接头序列的特定实例选自但不限于=Gly4 Ser(SEQ ID NO:7) ;Gly4 Ser3(SEQ IDNO:8) ; (Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:9)和(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO: 10)。在另一个实施方案中，接头序列包括纤维蛋白溶酶裂解识别位点(Sakiyama-Elbert et al, 2001, FASEB 15 1300),例如以下序列Leu He Lys Met Lys Pro (SEQ ID N0:11)。在另一个实施方案中，接头序列包括胶原酶-3裂解识别位点(Kim&Healy，2003, Biomacromolecules 4 1214),例如以下序列 Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys (SEQ ID NO:12)。本发明还延伸到本发明所述的合成嵌合蛋白质生物学活性片段的应用以及本文列举的特定生长因子受体结合结构域和整联蛋白结合结构域的生物学活性片段的应用。在一个实施方案中，所述“生物学活性片段”具有其衍生自的蛋白质的不少于10%、优选不少于25%、更优选不少于50%以及甚至更优选不少于75%、80%、85%、90%或95%的生物
学活性。在另一个实施方案中，所述“生物学活性片段”具有其衍生自的蛋白质的不少于10%、优选不少于25%、更优选不少于50%以及甚至更优选不少于75%、80%、85%、90%或95%的
连续氨基酸序列。本发明还考虑了变体蛋白质复合物。典型地，涉及蛋白质时，“变体”蛋白质具有一或多个被不同氨基酸置换的氨基酸。本领域已知一些氨基酸能够被变为其他具有大致相似性质的氨基酸，而不会改变蛋白质的活性特性(保守取代)。参考序列如生长因子、生长因子的受体结合结构域、纤连蛋白的整联蛋白结合结构域、IGFBP的一或多个氨基酸残基或者合成嵌合蛋白中的一或多个对应残基可以被修饰或缺失，或者加入额外序列，而不会实质上改变本发明分离的蛋白质复合物的生物学活性。在一个实施方案中，蛋白质变体与参考氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%或85%以及更优选至少90%、95%、98%或99%序列相同性。优选地，序列相同性超过至少60%，更优选超过至少75%，更优选超过至少90%或更优选超过至少95%、98%或者实质上就是全长的参考序列。为了确定序列相同性百分比，可以使用计算机执行算法(Geneworks programby Intelligenetics;GAP, BESTFIT, FAST A 和 TFASTA, Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7. 0, Genetics Computer Group, WI, USA)或检测以及由任意选择的不同方法产生的最佳比对(即在对比窗口中具有最高百分比同源性)进行氨基酸和/或核苷酸序列的最佳比对。关于BLAST程序家族的参考文献可见例如Altschul et al, 1997, Nucl.Acids Res. 25 3389。在另一例子中，“序列相同性”可以理解为由DNASIS计算机程序计算得到的“匹配百分比”(windows 版本 2. 5,得自 Hitachi Software engineering Co. , Ltd. , South SanFrancisco, California, USA)。有关序列分析的详细讨论可见于CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYEds. Ausubel et al. (John ffiley&Sons Inc NY, 1995-1999)的 19. 3 单兀。本发明还考虑了生长因子的受体结合结构域、纤连蛋白的整联蛋白结合结构域或者包含其的分离蛋白质复合物的衍生物。
如本文所用，本发明的“衍生”蛋白是被改变的蛋白，例如通过与其他化学部分的添加、缀合或复合或者通过本领域中已知的翻译后修饰技术进行。氨基酸的“添加”可以包括将多肽或其变体与其他多肽或蛋白融合。所述其他蛋白例如可以协助纯化蛋白质。例如，这包括聚组氨酸标签，麦芽糖结合蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)，蛋白质A，或谷胱甘肽S-转移酶(GST)。本发明所考虑的其他衍生物包括但不限于侧链修饰，在肽、多肽或蛋白质合成过程中掺入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交联剂和对本发明的多肽、片段和变体施加构象约束的其他方法。本发明所考虑的侧链修饰的例子包括氨基修饰，如用乙酸酐酰化，用丁二酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基的酰化，用甲基乙酰亚胺酯进行酰胺化，用氰酸酯氨甲酰化氨基，用5-磷酸吡哆醒吡哆醒化赖氨酸,之后再用NaBH4还原,通过和醒反应之后用NaBH4还原来进行还原烷基化，以及用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯基化。 羧基基团可以通过O-酰基异脲形成、然后再衍生成相应的酰胺来进行碳二亚胺活化而修饰。精氨酸残基的胍基可以通过与试剂如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛与乙二醛形成杂环缩合产物而修饰。巯基可以通过如将过甲酸氧化成磺基丙氨酸、使用4-氯汞基苯磺酸、4-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基酚、氯化苯汞以及其他汞制剂形成汞制剂衍生物、与其他巯基化合物形成混合二硫化物、通过与马来酰亚胺、马来酸酐或其他取代的马来酰亚胺反应、与碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化和在碱性pH下与氰酸酯氨甲酰化的方法而修饰。色氨酸残基可以被修饰，例如通过用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰齒化物的吲哚环烷基化或通过用N-溴代丁二酰亚胺氧化进行。酪氨酸残基可以通过与四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而被修饰。组氨酸残基的咪唑环可以通过用焦碳酸二乙酯乙氧羰基化或用碘乙酸衍生物烷基化而修饰。在多肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-庚酸、t_ 丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D异构体。适合蛋白质化学衍生化的方法的例子见CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCEEds. Coligan et. al. , John ffiley&Sons NY(1995-2001)的第 15 章。分离的蛋白质复合物及其各个蛋白质组分(包括片段、变体、衍生物及同源物)可以通过本领域已知的任何合适方法制备。在一个实施方案中，本发明的蛋白质可通过化学合成生产。化学合成技术在本领域中是已知的，本领域技术人员可以参考CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds.Coligan et. al.，John ffiley&Sons NY(1995-2001)第 18 章中合适的方法学。在另一个实施方案中，蛋白质可以制备为重组蛋白。重组蛋白的生产在本领域中是已知的，本领域技术人员可以参考标准步骤，例如 Sambrook et al. , MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press, 1989)所述，尤其是第 16 和 17 节!CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY Eds. Ausubel et al. , (John ffiley&Sons, Inc. 1995-1999),尤其是第 10 和16 章；和 CURRENT PROTO⑶LS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al. , (Johnffiley&Sons, Inc. 1995-1999)，尤其是第 1、5 和 6 章。在一个实施方案中，通过如下方法产生重组蛋白，所述方法包括步骤(i)制备表达构建体，其包括编码所述蛋白质的核酸，该核酸在表达载体中与一或多个调节核苷酸序列可操作的连接；(ii)用所述表达构建体转染或转化宿主细胞；和(iii)在所述宿主细胞中表达所述重组蛋白。“表达载体”可以是自我复制的染色体外载体如质粒，或者是整合进宿主基因组的载体。 “可操作连接”或“可操作联系”是指所述调控核苷酸序列处于与本发明的重组核酸相对的位置，以起始、调节或以其他方式控制核酸转录或翻译核酸编码的蛋白。通常调控核苷酸序列是适合于宿主细胞表达的。对于许多宿主细胞，本领域已知很多类型的合适的表达载体和合适的调控序列。典型地，所述一或多个调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、剪接供体/受体序列以及增强子或激活子序列。组成型启动子(如CMV、RSV、腺病毒、SV40以及人类延长因子启动子)和诱导型/抑制型启动子(如tet-抑制型启动子和IPTG-、金属硫蛋白-或蜕皮激素-诱导型启动子)在本领域中是已知的并且考虑在本发明中。启动子也可以是杂合启动子，其组合了一种以上的启动子的元件。表达构建体还可以包括融合配偶体(典型地是由表达载体所提供)由此本发明的重组蛋白表达为与所述融合配偶体的融合蛋白。融合配偶体的主要优点是他们有助于所述融合蛋白的鉴别和/或纯化。融合蛋白的已知例子包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fe部分、麦芽糖结合蛋白(MBP)以及六组氨酸(HIS6),其特别用于通过亲和层析分离融合蛋白。为了通过亲和层析纯化融合蛋白，用于亲和层析的相关基质分别为谷胱甘肽_、直链淀粉-和镍-或钴-缀合树脂。许多此类的基质是以“试剂盒”形式提供，如QIAexpress 系统(Qiagen),可使用HIS6融合配偶体和Pharmacia GST纯化系统。在一些情况下，融合配偶体还可具有蛋白酶切割位点，如Xa因子或凝血酶，这可以使相关蛋白酶部分地消化本发明的融合蛋白，因此释放本发明的重组多肽。释放的蛋白质可以通过后续的层析分离方法将其从融合配偶体中分离。本发明的融合配偶体还包括“表位标签”，其通常是短肽序列，针对所述短肽序列可获得特异性抗体。可以获得特异性单克隆抗体的表位标签的已知例子包括c-myc、血凝素和FLAG标签。适于表达的宿主细胞可以是但不限于原核或真核细胞，如大肠杆菌(如DH5ci )、酵母细胞、使用杆状病毒表达系统的Sf9细胞、CHO细胞、COS、CV-1、NIH3T3和293细胞。表达构建体还可以包括一或多个选择标记核苷酸序列，其使转化的宿主细胞对于选择剂具有抗性。可用于选择转化细菌的选择标记包括bla、kanR和tetR,而转化的真核细胞可以通过但不限于如潮霉素、G418和嘌呤霉素等标记来选择。关于将遗传材料引入到宿主细胞，术语“转化”和“转染”一般是用于描述将遗传材料导入到宿主细胞。有很多已知方法可以将外源遗传材料导入到宿主细胞中，包括但不限于磷酸I丐沉淀、电穿孔、lipofectamine、Iipofectin和其他亲脂剂传送、磷酸I丐沉淀、DEAE-Dextran转染、微粒轰击、显微注射和原生质体融合。本发明提供了编码本发明的合成的嵌合蛋白的分离的核酸，包括其变体及同源物。本文所用术语“核酸”是指单链或双链mRNA、RNA、cRNA、RNAi和DNA，包括cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂种。“多核苷酸”是具有80或更多个连续核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”含有少于80个连续核苷酸。“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，适当地被标记以例如在Northern或Southern印迹中检测互补序列。“引物”通常是单链寡核苷酸，优选具有15-50个连续核苷酸，其能够与互补核酸“模板”退火并在如Taq聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶或Sequenase 等DNA聚合酶作用下以模板依赖性方式延伸。本发明的合成核酸可以通过化学合成方法产生或者通过利用核酸序列扩增技术的重组方法产生,或通过其组合产生,这些本领域已熟知。本发明所述的化学合成引物和寡核苷酸、合成物以及相关技术可典型在大多数实 验室获得或者可以购自商业来源。本领域技术人员已知合适的核酸扩增技术，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)和如Ausubel et al.如前所述第15章所述的连接酶链反应(LCR),如美国专利 5，422，252 描述的链置换扩增(SDA)，如 Liu et al.，，1996，J. Am. Chem. Soc. 1181587、国际申请 WO 92/01813 和 WO 97/19193 所述的滚环复制(RCR)，如 Sooknanan etal. , 1994, Biotechniques 17 1077所述的基于核酸序列的扩增(NASBA)以及如Tyagi etal. , 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 5395 所述的 Q-β 复制酶扩增。优选的核酸序列扩增技术是PCR。如本文所用，“扩增产物”是指由核酸扩增技术产生的核酸产物。在本发明核酸的产生和表达中，也存在着密码子序列冗余方面的优势，以至于本文所举例的核酸可以在不改变编码的氨基酸序列的情况下进行修饰。在特定实施方案中，根据宿主细胞的偏好“密码子使用”来优化核酸，以用于重组表达，正如本领域所已知的。这可以有效地为特定生物体或其细胞“定制”最优表达的核酸，其中偏好密码子使用影响蛋白表达。因此，本发明包括与本文举例的核酸同源的合成核酸。在一个实施方案中，核酸同源物与本文所述的编码任一个合成的嵌合蛋白构建体的核酸具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%序列相同性。优选地，序列相同性超过至少70%、更优选至少80%、甚至优选至少90%、95%或有益地基本上是本发明编码核酸的全长。
在另一个实施方案中，在高严格性条件下，核酸同源物能与编码任一本文所述的合成的嵌合蛋白质构建体的核酸杂交。本文使用的“杂交”用于表明至少部分互补的核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA双链体。杂交的序列通过互补嘌呤和嘧啶之间的碱基配对发生，这在本领域中也是已知的。在这方面，可以认定修饰的嘌呤(例如肌苷、甲基肌苷和甲基腺嘌呤)和修饰的嘧啶(硫基尿嘧啶和甲基胞嘧啶)同样也可以参与碱基配对。本文使用的“严格性”是指温度和离子强度条件以及在杂交时是否存在某些有机溶剂和/或去污剂。严格性越高，杂交核苷酸序列之间也就需要越高的互补性水平。“严格性条件”是指只有具有高互补碱基频率的核酸杂交的那些条件。 本文的高严格性条件包括和涵盖(i )至少约31%v/v至至少约50%v/v的甲酸胺和至少约O. OlM至至少约O. 15M的盐用于在42°C杂交，以及至少约O. OlM至至少约O. 15M的盐用于在42°C洗脱；(ii)l%BSA, ImM EDTA，0.5M NaHPO4 (pH 7· 2)，7%SDS 在 65°C杂交，和(a)0. Ix SSC、
O.1%SDS 或(b)0. 5%BSA、lmM EDTA、40mM NaHPO4 (pH 7. 2)、1%SDS 在高于 65°C 的温度洗脱大约I个小时，以及(iii)在 68°C或高于 68°C下用 O. 2x SSC、O. 1%SDS 洗脱约 20 分钟。通常，洗脱在Tm=69. 3+0. 41 (G+C)%_12°C进行。通常，双链DNA的Tm随错配碱基数每升高1%降低约rc。尽管如此，本领域熟知上述严格性条件，例如在Ausubel et al.如前第2. 9和
2.10章中描述，尤其是2. 9. I页至2. 9. 20页。本发明还考虑了针对本发明的合成嵌合蛋白包括嵌合蛋白或其片段、变体和/或衍生物的抗体。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆的。可以找到可用于抗体生产、纯化和使用的已知方案，例如在 Coligan et al, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Johnffiley&Sons NY, 1991-1994)第 2 章以及 Harlow, E. &Lane, D. Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory,1988。通常，本发明的抗体与本发明的多肽、片段、变体或衍生物结合或缀合。例如，抗体可以包括多克隆抗体。此类抗体可以通过例如将本发明的多肽、片段、变体或衍生物注射到生产物种中来制备，所述物种可以包括小鼠或兔，以获得多克隆抗血清。生产多克隆抗体的方法为本领域技术人员熟知。能够使用的示例性方法例如描述于Coligan et a I.，CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，如前和 Harlow&Lane, 1988，如前。作为在生产物种中获得的多克隆抗血清的替代，也可以使用标准方法来生产单克隆抗体，例如Kohler&Milstein (1975，Nature 256,495)所述或通过其更多近期的修改方法，例如在 Coligan et al.，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 如前所述，通过使来源于生产物种的脾细胞或其他抗体生产细胞永生化，然后将接种一或多种本发明的多肽、片段、变体或衍生物来进行。包括在本发明范围内的抗体包括如前所述的多克隆或单克隆抗体的Fe或Fab片段。或者，抗体可包括针对本发明蛋白的单链Fv抗体(scFv)。此类scFv可以例如根据美国专利5，091，513、欧洲专利239，400或町扯6伙1^18丨6丨11(1991，恥忉代349 293)的文章描述的方法制备。可以在抗体或抗体片段上连接标记。标记可以选自下组，包括发色团，催化剂，酶，荧光团，化学发光分子，镧系离子如铕(Eu34)，放射性同位素，和直接可视标记。在直接可视标记中，可使用胶体金属或非金属粒子，染料颗粒，酶或底物，有机聚合物，乳胶颗粒，脂质体，或其他含有产生信号的物质的小泡等。有很多可以用作标记的酶在美国专利4，366，241、美国专利4，843，000和美国专利4，849，338中揭示。本发明可以使用的酶标记包括碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，荧光素酶，b-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，溶菌酶，苹果酸脱氢酶等。这些酶标记可以单独使用或与第二种酶在溶液中组合使用。例如，荧光团可以是但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)，俄勒R绿，四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITL)，别藻蓝蛋白(APC)和R-藻红蛋白(RPE)。 本发明还提供了药物组合物，其包括本发明的分离的蛋白质复合物，包括其变体和衍生物。此类分离的蛋白质复合物可以是任何形式，包括但不限于本发明的合成嵌合蛋白质。本发明的药物组合物可以用于促进或以其他方式便于细胞迁移、组织再生和伤口愈合。或者，可以施用药物组合物通过阻止或抑制肿瘤细胞迁移到第二部位来预防肿瘤转移。该组合物根据需要可用于治疗性或预防性治疗。例如，药物组合物可以以治疗或化妆品制品的形式应用于皮肤修复、伤口愈合、烧伤愈合和其他皮肤病学治疗。在这方面，药物组合物可以与生物材料、生物聚合物、无机材料如羟基磷灰石或其衍生物、外科植入物、假体、伤口或烧伤敷药、绷带、压缩物等(其适当地用药物组合物浸溃、包被或以其他方式包含所述药物组合物)共同施用或作为其成分。合适地，所述药物组合物包括合适的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。优选所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂适合于给哺乳动物、更优选人类施用。“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指固体或液体填充物、稀释剂或包囊化物质，其能够安全地全身性施用。根据施用的特定途径，本领域已知的很多载体都可以使用。这些载体可以选自以下组，包括糖，淀粉，纤维素及其衍生物，麦芽，明胶，滑石粉，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，褐藻酸，磷酸盐缓冲溶液，乳化剂，等渗盐水和盐如无机酸盐包括氢氯化物、溴化物和硫酸盐，有机酸如乙酸、丙酸和丙二酸和无热原水。一篇描述药学上可接受载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991)。可以使用任何安全施用途径以提供给患者本发明的组合物。例如，口服，直肠，胃肠外，舌下，口腔，静脉，关节内，肌肉，皮内，皮下，吸入，眼内，腹膜内，脑室内，透皮等都可使用。剂型包括片剂，分散剂，悬液，注射剂，溶液，糖浆，锭剂，胶囊，栓剂，气溶胶，贴剂等。这些剂型也包括注射或移植控制释放装置，所述装置专门为该目的而设计或者其他以这种方式作用的改进的移植物形式。治疗剂的控制释放可能例如通过用疏水聚合物包被而实现，所述疏水聚合物包括丙烯酸树脂，蜡，高级脂肪醇，聚乳酸和聚羟基酸和某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。此外，还可以使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球实现控制释放。上述组合物可以以与所述剂型相容的方式施用，并且以药学有效量施用。在本发明中，施用给患者的剂量应在一段合适的时间内在患者中实现有益的应答。药物的施用量可以取决于待治疗的个体，包括其年龄、性别、体重以及一般健康状况和取决于医生所判断的因素。至于用于伤口愈合的药物组合物，特别的参考文献是美国专利5，936，064和国际公开 WO 99/62536。本发明的药物组合物还可以包括表达载体如病毒载体如痘苗以及能用于基因治疗的病毒载体。后者包括腺病毒和腺病毒相关病毒(AAV)如Braun-Falco etal. (1999, Gene Ther. 〃6 432)所述、逆转录病毒和慢病毒载体如Buchshacher etal. (2000, Blood 95 2499)所述、衍生于单纯疱疹病毒和巨细胞病毒的载体。在Stone etal. (2000, J. Endocrinol. 164 103)中全面概述了用于内分泌基因治疗的病毒载体。本发明还可以利用特定的表达载体，该载体能够将基因表达靶向表皮细胞，例如美国专利5，958，764所述，以及用于体内伤口愈合应用，例如美国专利5，962，427所述。本发明提供了使用分离的蛋白质复合物(包括本发明的合成的嵌合蛋白)进行治疗的方法。这些方法特别地旨在对哺乳动物、更特别地对人进行治疗性和/或预防性治疗。然而,本发明的治疗应用也可以用于哺乳动物如家养动物和伴侣动物,表演动物如马，骆驼和灰狗，牲畜，实验动物和用作异种移植的细胞、器官和组织来源的动物。本发明还涉及美容治疗方法，其中施用分离的蛋白质复合物，包括本发明的合成的嵌合蛋白，以改善或提高皮肤质量或皮肤外观。这种治疗可能包括预防或补救皮肤疾病如牛皮癣和增生性疤痕，这些疾病是由于皮肤细胞异常增殖所造成的。或者，还考虑到治疗方法，即通过阻断肿瘤细胞向第二部位迁移而预防或抑制肿瘤转移。另外，还考虑了通过阻断细胞增殖来治疗癌症的方法。在特定实施方案中，治疗性和/或预防性治疗可以利用分离的蛋白质复合物，包括本发明的合成的嵌合蛋白，与下述联合使用或作为下述的成分生物材料，生物聚合物，无机材料如氟羟基磷灰石，手术植入物，假体，伤口或烧伤敷药，绷带，压缩物等，其适当地用所述分离的蛋白质复合物浸溃、包被或以其他方式包含所述分离的蛋白质复合物。此类方法包括施用之前定义的药物组合物，可以通过如美国专利6，090, 790所述微针注射到特定组织位点，如美国专利6，054，122所述的局部药膏、洗剂或密封敷药应用于伤口、烧伤或溃疡或如国际公开WO 99/47070所述的释放组合物的移植物进行。在这方面同样可适用基因治疗，如根据美国专利5，929，040和美国专利5，962，427中的方法。也还存在为了创建皮肤替代品而对皮肤细胞进行遗传修饰的方法，如遗传工程化所需生长因子表达(Supp et al. , 2000, J. Invest. Dermatol. 114 5)。对于这个领域的综述的例子见 Bevan et al. (Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16231)。、
同样考虑了用转染或转化细胞“种植”受体，如国际公开WO 99/1 1789所述。这些方法可用于刺激细胞迁移，因此能够促进或促使伤口和烧伤愈合，修复皮肤病变如溃瘍，组织置换和移植如通过体外培养自体皮肤，内部器官如肾脏和肺的重新上皮化以及修复损伤的神经组织。
皮肤置换治疗在本领域中是熟知的，其可以使用共培养的上皮/角质形成细胞系，如Kehe et al. (1999, Arch. Dermatol. Res. 291 600)所述或者体外培养原代(通常是自体)表皮、真皮和/或角质形成细胞。这些技术还可利用工程化的生物材料和合成的聚合物“支架”。该领域综述的例子通常在Terskikh&Vasiliev (1999, Int. Rev. Cytol. 18841)和Eaglestein&Falanga(1998, Cutis 62 I)中提供。更特别地，用于颅面手术中口腔粘膜替代物的生产在Izumi et al. (2000, J.Dent. Res. 79 798)中描述。胎儿角质形成细胞和皮肤成纤维细胞可以在体外扩增以产生用于移植的皮肤以治疗皮肤病变，如Fauza et al. (J. Pediatr. Surg. 33 357)所述，而来源于真皮的皮肤替代物和体外在透明质酸衍生的生物材料上培养的表皮皮肤元件已经示出在治疗烧伤中可能是有用的(Zacchi et al, 1998, J. Biomed. Mater. Res. 40 187)。同样考虑了聚合物支架，其目的在于促进皮肤置换工程，如Sheridan etal. (2000, J. Control Release 14 91)和 Fauza et al. (1998,如前)所述，还考虑了作为用于将皮肤细胞递送至伤口和烧伤部位的药物的微球(LaFrance&Armstrong, 1999, TissueEng. 5 153)。本发明还涉及分离的蛋白质复合物(包括本发明的合成的嵌合蛋白)用于鉴定、筛选、设计或以其他方式生产包含生长因子和纤连蛋白的复合物的拮抗剂或激动剂的用途，所述复合物如 IGF-I: FN、IGF-II: FN、EGF: FN、bFGF: FN、KGF: FN 或 IGF-I: IGFBP: FN 复合物。此类药物可以是“模拟物”。本文使用的术语“模拟物”是指被设计用于模拟蛋白质或多肽的特定功能区的分子，其范围包括术语“激动剂”、“类似物”和“拮抗剂”等本领域已知的术语。在一个实施方案中，生产了模拟通过IGF-I:FN、IGF-II :FN、EGF: FN、bFGF: FN、KGF:FN或IGF-I:IGFBP:FN复合物与同族生长因子受体和FN受体结合的激动剂。这些分子可以用作伤口愈合、皮肤再生等所需的细胞迁移的刺激物。在另一个实施方案中，生产了阻止或抑制通过IGF-I:FN、IGF-II :FN、EGF: FN、bFGF: FN、KGF: FN或IGF-I: IGFBP: FN复合物与同族生长因子受体和整联蛋白受体结合的拮抗剂。这些分子可以用作细胞迁移和/或细胞增殖的抑制剂，因此可构成有用的抗肿瘤剂，也能治疗由异常细胞增殖导致的皮肤疾病如牛皮癣和增生性疤痕。上述模拟物、激动剂、拮抗剂和类似物可能是具有所需生物学活性和半衰期的肽、多肽或其他有机分子，优选有机小分子。计算机辅助结构数据库搜索越来越多地被用于鉴定模拟物的方法。从原理上说，数据库搜索方法可适于鉴定模拟物，这些方法可参见国际公开WO 94/18232(旨在生产HIV抗原模拟物)、美国专利5，752，019以及国际公开WO 97/41526(旨在鉴定EPO模拟物)。其他方法包括多种鉴定分子相互作用的生物物理学技术。这例如可以根据候选分子是否影响 IGF-I: FN、IGF-II: FN,EGF: FN,bFGF: FN,KGF: FN 或 IGF-I: IGFBP: FN 复合物的形成来筛选候选分子。CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al, (Johnffiley&Sons, 1997)第20章提供了适用这些潜在有用技术的方法，如竞争性放射配体结合测定(对于相关方法参见Upton et al, 1999,如前)，分析性超离心，微量热法，表面等离子体共振和基于光学生物传感器的方法。因此，本发明可以更容易理解和实施，本领域技术人员可参考下列非限制性实施例。
实施例实施例I IGF-I、IGFBP和FN刺激细胞迁移MCF-IOA 细胞接种于包被了 FN(lug/mL)的 Transwells 中，在 IGFBP-3 或 IGFBP-5存在的情况下提高结合前IGF-I的浓度。让细胞迁移5小时。然后应答每个治疗的穿越膜的细胞数目表示为只在FN上迁移的细胞百分比(SFM)。MCF-IO数据汇集自每个复制实验的四个孔中检测的三个处理实验并且示于图2。误差条表示SEM。SFM=无血清培养基。相比起只含有FN的对照孔，IGF-I: FN、IGF-I: IGFBP-3: FN和IGF-I: IGFBP-5: FN能够显著地提高迁移(相比FN对照孔，应答分别为153. 7+/-7. 3%、192. 5+/-6. 8%和187. 5+/-6. 5%)(p〈0. 05)。MCF7-10A 细胞对于 IGF-I IGFBP-3 :FN 和 IGF-I IGFBP-5 :FN 处理的应答也显著高于IGFBP或者IGF-I单独和FN (p〈0. 05)获得的那些。这数据表明，最大应答发生于当三聚体IGF-I IGFBP-3/5 :FN复合物存在时。这意味着含有连接到FN的IGF-I的嵌合物激活FN结合整联蛋白以及同族生长因子受体。实施例2合成的嵌合纤连蛋白生长因子蛋白本文提供了本发明的合成的嵌合蛋白的例子，所述嵌合蛋白是FN:生长因子(例如 IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF 和 KGF)的嵌合物形式。合成的嵌合蛋白质包括任何全长或截短形式的FN，所述FN与生长因子融合，有或者没有氨基酸残基修饰。此外，FN和生长因子的融合可以使用或者不使用不同的肽接头。设计了一系列嵌合表达构建体，其中不同长度的FN蛋白与全长的成熟IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF或KGF蛋白、或者所述IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF或KGF蛋白的能结合同族生长因子受体的至少一个结构域相连接。在各种情况下，所述FN片段优选通过接头与所述 IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF 或 KGF 序列相连，所述接头例如是 Gly4 Ser (SEQ ID NO: 7)接头、Gly4 Ser3(SEQ ID NO:8)接头、(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:9)接头或者(Gly4 Ser)4(SEQIDNO: 10)接头。示例性的合成的嵌合蛋白包括但不限于A)FN III 型结构域 8[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF，bFGF 或者 KGF);B)FN III 型结构域 8-9[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF，bFGF 或者 KGF);C) FN 111型结构域8-10[接头]生长因子(16 -1，16 -1146 沘 6 或者1 卩);D)FN III 型结构域 9[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF，bFGF 或者 KGF);E) FN 111型结构域9-10[接头]生长因子(16 -1，16 -1146 沘 6 或者1 卩);F)FN III 型结构域 10[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF，bFGF 或者 KGF);
G)FN I型结构域1-5[接头]FN III型结构域8[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；H)FN I型结构域1-5[接头]FN III型结构域8-9[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；I)FN I型结构域1-5[接头]FN III型结构域8-10[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；J)FN I型结构域1-5[接头]FN III型结构域9[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；K)FN I型结构域1-5[接头]FN III型结构域9-10[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；
L)FN I型结构域1-5[接头]FN III型结构域10[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；M)FN I型结构域4-5[接头]FN III型结构域8[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；N)FN I型结构域4-5[接头]FN III型结构域8-9[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；O)FN I型结构域4-5[接头]FN III型结构域8-10[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；P)FN I型结构域4-5[接头]FN III型结构域9[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；Q)FN I型结构域4-5[接头]FN III型结构域9-10[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF, bFGF 或者 KGF)；R)FN I型结构域4-5[接头]FN III型结构域10[接头]生长因子(IGF-I，IGF-II，EGF，bFGF 或者 KGF )。人FN、IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF和KGF基因DNA序列(分别为SEQ ID N0:l_6)在草地夜蛾(Spodoptera frugiperla)中针对表达进行了密码子优化。然后编码序列可以克隆进表达载体中，所述载体整合了多组氨酸亲和标签以辅助纯化嵌合物(例如pIB/V5-His表达载体(Invitrogen))。编码如上所述氨基酸接头的核苷酸序列可通过定点诱变PCR插入。将Asn加入到所述接头序列的C端可以用于产生Asn-Gly基序，Gly是生长因子蛋白的第一个氨基酸。所述基序能使羟胺诱导生长因子蛋白从嵌合物裂解。所得构建体将编码不同长度的FN蛋白，所述FN蛋白通过接头和全长的成熟IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF 或 KGF 蛋白或者所述 IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF 或 KGF 蛋白的能结合同族生长因子受体的至少一个结构域相连。对所有构建体的DNA序列进行确认以确保维持所需DNA序列的保真度。pIB V5-His载体的克隆可以用于转染Sf9昆虫细胞，在条件培养基中利用免疫印迹检测瞬时表达的分泌蛋白。简单而言，在还原性条件下，在SDS-PAGE上分析样本，利用半干转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用多克隆抗-FN抗体处理该膜，然后可以使用增强型化学荧光观察靶蛋白。嵌合蛋白的纯化基于Ni-NTA Superflow琼脂糖(QIAGEN，澳大利亚)亲和层析法，根据厂商指导进行。通过SDS-PAGE纯化方法以及使用多克隆抗-FN抗体(Calbiochem)的western印迹分析来监测嵌合蛋白。细胞，例如MCF-IOA细胞，MCF-7细胞以及分离的人上皮细胞，角质形成细胞和成纤维细胞都可以用于检测合成的嵌合蛋白对于细胞迁移和/或增殖的作用。例如，细胞迁移的检测可以使用Transwell 迁移分析，而细胞增殖则可以通过本领域已知的细胞增殖测定方法来确定。该详细说明书的目的在于描述本发明的优选实施方案而不是将本发明限制为任何一个实施方案或特定特征集合。因此本领域技术人员根据本文内容可以知道，可以对所举出的特定实施方案进行各种修饰和改变而不背离本发明的范围。本文引用的所有计算机程序、算法、专利和科学文献均援弓I加入本文。表I纤连蛋白结构域和区域 位置__im_
50-9041纤连蛋白I型I
95-13844纤连蛋白I型2
139-18244纤连蛋白I型3
184-22845纤连蛋白I型4
229-27345纤连蛋白I型5
306-34540纤连蛋白I型6
355-40349纤连蛋白II型I
415-46349纤连蛋白II型2
468-51144纤连蛋白I型7
516-55843纤连蛋白I型8
559-60244纤连蛋白I型9
607-69993纤连蛋白III型I
720-80990纤连蛋白III型权利要求
1.一种合成的嵌合蛋白形式的分离的蛋白质复合物，包含如下的氨基酸序列 (i)生长因子或所述生长因子的能够结合同族生长因子受体的至少一个结构域；和 (ii)一或多个III型纤连蛋白(FN)结构域，其至少包括FN的整联蛋白结合结构域。
2.权利要求I的分离的蛋白质复合物，其中所述生长因子选自胰岛素样生长因子I(IGF-1)、胰岛素样生长因子II (IGF-II)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
3.权利要求I或2的分离的蛋白质复合物，其中所述整联蛋白结合结构域是αI整联蛋白结合结构域或α4整联蛋白结合结构域。
4.权利要求I或2的分离的蛋白质复合物，其中所述一或多个III型FN结构域包含FN序列(SEQ ID NO 1)的第1266-1536位氨基酸。
5.权利要求I或2的分离的蛋白质复合物，其中所述一或多个III型FN结构域包含FN序列(SEQ ID Ν0:1)的第1447-1536位氨基酸。
6.权利要求I或2的分离的蛋白质复合物，其中所述一或多个III型FN结构域包含FN序列(SEQ ID NO 1)的第1173-1536位氨基酸。
7.权利要求1-6任一项的分离的蛋白质复合物，其不包含IGFBP氨基酸序列。
8.前述权利要求任一项的分离的蛋白质复合物，进一步包含FN的额外片段。
9.权利要求8的分离的蛋白质复合物，其中所述FN的额外片段包括FN序列(SEQIDNO 1)的第50-273位氨基酸。
10.权利要求8的分离的蛋白质复合物，其中所述FN的额外片段包括FN序列(SEQIDNO 1)的第184-273位氨基酸。
11.前述权利要求任一项的分离的蛋白质复合物，进一步包括至少一个接头序列。
12.权利要求11的分离的蛋白质复合物，其中所述接头序列包含蛋白酶切割位点。
13.权利要求11的分离的蛋白质复合物，其中所述接头序列选自(i)Gly4Ser (SEQ ID NO:7);(ii)Gly4Ser3(SEQ ID NO:8);(iii)(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:9);(iv)(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:10);(v)LeuHe Lys Met Lys Pro (SEQ ID NO: 11);和(vi)GlnPro Gln Gly Leu Ala Lys(SEQ ID NO:12)。
14.一种编码前述权利要求任一项的分离的蛋白质复合物的分离的核酸。
15.一种遗传构建体，其包含权利要求14的分离的核酸，所述核酸在载体中可操作地与一或多个调控核苷酸序列连接。
16.权利要求15的遗传构建体，其是表达构建体，其中所述分离的核酸与启动子可操作地连接。
17.—种宿主细胞，包含权利要求15的遗传构建体。
18.—种药物组合物，包含权利要求1-13任一项的分离的蛋白质复合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
19.一种外科手术植入物、支架或假体，其用权利要求1-13任一项的分离的蛋白质复合物浸溃、包被或以其他方式包含权利要求1-13任一项的分离的蛋白质复合物。
20.一种伤口或烧伤敷药，其包含权利要求1-13任一项的分离的蛋白质复合物。
21.一种促进细胞迁移和/或增殖的方法，包括使用权利要求1-13任一项的分离的蛋白质复合物与细胞表达的生长因子受体和整联蛋白受体结合以此诱导、增强或以其他方式促进所述细胞迁移和/或增殖的步骤。
22.权利要求21的方法，其中所述分离的蛋白质复合物施用给动物以促进原位细胞迁移和/或增殖。
23.权利要求21的方法，用于预防或治疗性地诱导、增强或以其他方式促进上皮细胞迁移和/或增殖，从而促进伤口原位愈合。
24.权利要求22或23的方法，其中所述动物是人。
25.权利要求21的方法，其中所述分离的蛋白质复合物在体外施用于一或多种细胞或组织。
全文摘要
本发明提供了分离的蛋白质复合物，该复合物包含细胞因子如IGF-I、IGF-II、EGF、bFGF或KGF和纤连蛋白，或其至少能够结合和激活生长因子受体和纤连蛋白的整联蛋白受体结合结构域的结构域。这些蛋白复合物包括合成的蛋白，其中生长因子和纤连蛋白序列通过接头序列相连。本发明还提供了这些蛋白复合物在伤口愈合、组织工程、美容和治疗处理例如皮肤置换和皮肤补充和烧伤治疗等需要进行细胞迁移中刺激或诱导细胞迁移和/或增殖的应用。在其他实施方案中，本发明提供了对于癌细胞转移、特别是乳腺癌的抑制。
文档编号C07K14/65GK102725308SQ201080062313
公开日2012年10月10日 申请日期2010年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者D·范隆科胡伊恩, Z·厄普顿 申请人:昆士兰技术大学