专利名称：抑制细胞生长的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体地说涉及癌症研究领域。特别地，本发明涉及包含 ZNFN3A1 小干扰 RNA(small interfering RNA) (siRNA)的组合物。
背景技术：
肝细胞癌(HCC)是五种最常见的癌症之一，是世界上癌症死亡的第四大主因。尽管最新的医学发展已经在诊断疾病方面取得了很大进展，仍有大量患有HCC的病人在晚期才被诊断出来。大多数病人由于严重的肝功能障碍、散布的和/或多发的肿瘤，或高复发率而没有通过外科切除术来治疗。因此开发高效的化学治疗药物和预防策略是紧迫关切的事情。
发明内容
本发明基于一项令人惊讶的发现，即针对ZNFN3A1而加以选择的小干扰 RNA(siRNA)能有效地抑制各种癌细胞的细胞生长，包括那些参与HCC的癌细胞。本发明提供抑制细胞生长的方法。提供的方法包括那些包括用包含ZNFN3A1小干扰RNA(SiRNA)的组合物接触细胞的方法。本发明还提供抑制个体的肿瘤细胞生长的方法。 这种方法包括向个体施用包含ZNFN3A1小干扰RNA(siRNA)的组合物。本发明的另一个方面提供在生物样品的细胞中抑制ZNFN3A1基因的表达的方法。可以通过以足够抑制ZNFN3A1 基因表达的数量将双链核糖核酸(RNA)分子导入到细胞中来抑制基因的表达。本发明的另一个方面涉及包括核酸序列和载体的产品，和涉及包含它们的组合物，在例如所提供的方法中是有用的。在提供的产品之中包括siRNA分子，当被导入到表达所述基因的细胞中时具有抑制ZNFN3A1基因的表达的性质。在这样的分子之中，包括那些包含有义链和反义链的分子，其中有义链包含相应于ZNFN3A1目标序列的核糖核苷酸序列，其中反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列。所述分子的有义链和反义链相互杂交以形成双链分子。此处使用的术语“有机体”是指任何由至少一个细胞组成的活体。活有机体可以简单到，例如，单个真核细胞，或复杂到如哺乳动物，包括人类。此处使用的术语“生物样品”是指整个有机体或其组织、细胞或组成部分的子集 (例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿、 阴道液和精液)。“生物样品”进一步指从整个有机体或其细胞、组织或组成部分的子集制备出的组织勻浆、溶胞产物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生物样品”是指一种有机体已经在其中繁殖了的、包含细胞组分例如蛋白质或多核苷酸的培养基，例如营养肉汤或凝胶。本发明以抑制细胞生长的方法为特色。通过用ZNFN3A1小干扰RNA(SiRNA)的组合物接触细胞来抑制细胞生长。ZNFN3A1是在肿瘤，例如肝细胞癌或直肠腺癌中过量表达的锌指蛋白。通过本发明可以抑制表达ZNFN3A1的细胞的生长。进一步用转染增强剂接触细胞。可体外、体内或回体(ex vivo)提供细胞。个体是哺乳动物，例如，人类、非人灵长类、 小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。所述细胞是肝细胞或结肠细胞。做为选择，所述细胞是肿瘤细胞(即，癌细胞)例如结直肠癌细胞或肝癌细胞。例如，所述细胞是结直肠腺癌细胞或肝细胞癌细胞。抑制细胞生长意思是与未处理的细胞相比，被处理的细胞以更低的速率增殖、或具有降低了的生活力。通过本领域已知的增殖分析来测量细胞生长。术语“siRNA”是指阻止目标mRNA的翻译的双链RNA分子。使用将siRNA导入细胞的标准技术，包括那些把用于转录RNA的DNA作为模板的技术。siRNA包括有义ZNFN3A1 核酸序列、反义ZNFN3A1核酸序列、或两者。构建siRNA，以使单个转录产物兼备来自目标基因的有义序列和互补的反义序列，例如发夹序列。本方法被用于改变细胞中的基因表达，在所述细胞中作为例如细胞的恶性转化的结果，ZNFN3A1的表达是上调的。在目标细胞中所述SiRNA与ZNFN3A1转录产物的结合导致细胞ZNFN3A1生产的减少。寡核苷酸的长度至少为10个核苷酸，也可以与自然发生的 ZNFN3A1转录产物一样长。优选的，寡核苷酸长度为19-25个核苷酸。最优选的，寡核苷酸长度小于75、50或25个核苷酸。抑制哺乳动物细胞中ZNFN3A1表达的ZNFN3AlsiRNA寡核苷酸的实例包括包含目标序列的寡核苷酸，例如，SEQ ID NO :1的451-471、532-552、623-643、 625-645,636-656,726-746,923-943,1065-1085 和 1258-1278 位核苷酸。具有在靶细胞中抑制基因表达的能力的双链RNA的设计方法是已知的。(例如参见，美国专利No. 6，506，559，将其作为参考完全引用)。例如，设计siRNA的计算机程序可以从Ambion 网站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)获得。计算机程序根据以下方案选择用于siRNA合成的核苷酸序列。siRNA目标位点的选择1.从转录产物的AUG起始密码子开始，向下游扫描AA 二核苷酸序列。记录每个 AA的发生和3'相邻的19个核苷酸，以作为潜在的siRNA目标位点。Tuschal等建议不将 siRNA设计至5'和3'非翻译区(UTR)和接近起始密码子的区域(75个碱基内)，因为这些可能较富含调节蛋白结合位点。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。2.将所述潜在的目标位点与适当的基因组数据库(人类、小鼠、大鼠等)进行比较，并排除考虑任何与其他编码序列具有显著同源性的目标序列。我们建议利用BLAST，其可以在 NCBI 服务器上找到www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/3.选择合格的目标序列用于合成。沿着需评估的基因的长度方向选择几个目标序列是一般性的方法。也被包括在本发明中的是包括目标序列的核酸序列的分离的多核苷酸，所述目标序列例如，SEQ ID NO :1 的 451-471 (SEQ ID NO 58)、532-552 (SEQ ID NO 60) ,623-643 (SEQ ID NO 61),625-645(SEQ ID NO 62),636-656(SEQ ID NO 63),726-746(SEQ ID NO :64)、 923-943 (SEQ ID NO :66)、1065-1085 (SEQ ID NO 68)和 1258-1278 (SEQ IDNO 69)位核苷酸，或与 SEQ ID NO 1 的 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、726-746、923-943、 1065-1085和1258-1278位核苷酸的核酸序列互补的多核苷酸。此处使用的“分离的核酸” 是从其原始环境(例如，如果是自然发生的，指自然环境)移出了的、因而从其自然状态中被综合地改变了的核酸。在本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA和其衍生物。当所述分离的核酸是RNA或其衍生物时，在核苷酸序列中碱基“t”应当被替换为“U”。此处使用的术语 “互补”是指在多核苷酸的核苷酸单位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”意思是在两个多肽或化合物、或相关的多肽或化合物，或它们的组合之间物理的或化学的相互作用。在适当的条件下互补的核酸序列杂交形成包含很少或不包含错配的稳定的双链体。此外，本发明的分离的核苷酸的有义链和反义链可以通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。在一个优选的实施方式中，这种双链体每10个配对中包含不超过1个错配。在特别优选的实施方式中，当所述双链体的链完全互补时，这种双链体不包含错配。所述多核苷酸的长度小于1622个核苷酸。例如，所述多核苷酸长度小于500、200或75个核苷酸。本发明还包括包含此处描述的一个或多个核酸的载体，和包含所述载体的细胞。本发明的分离的核酸对于针对ZNFN3A1的siRNA或编码所述siRNA的DNA是有用的。当所述核酸用于siRNA或其编码DNA时，有义链优选的长于19个核苷酸，更优选的长于21个核苷酸。本发明某种程度上基于这种发现，编码锌指蛋白ZNFN3A1的基因与在非癌性肝组织中相比、在肝细胞癌(HCC)中是过量表达的。ZNFN3A1 cDNA长度是1622个核苷酸。1284 大小的ORF编码了具有锌指基序的4 个氨基酸的蛋白质。ZNFN3A1的核酸和多肽序列在表1和表2中显示。在表1中，5'和3'非翻译区用斜体表示，起始和终止密码子用粗体表示。ZNFN3A1蛋白的亚细胞定位在细胞周期进展期间和根据培养细胞的密度发生变化。 当细胞处于中期到晚期S期、或细胞在稀疏条件下培养时，ZNFN3A1蛋白在核中积聚。而当细胞处于细胞周期的其他期、或以密集条件生长时，ZNFN3A1蛋白位于细胞质中以及位于核中。ZNFN3A1在体内与ΚΙΑΑ00Μ蛋白和RNA聚合酶II形成三元复合物，三元复合物通过直接与5’侧翼区的元件“5’-CCCTCC-3”’结合来活化下游基因包括表皮生长因子受体(EGFR) 的转录。
权利要求
1.抑制个体肿瘤细胞生长的方法，包括向所述个体施用包含ZNFN3A1小干扰 RNA(siRNA)的组合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述siRNA包含有义ZNFN3A1核酸和反义ZNFN3A1核酸。
3.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞或肝癌细胞。
4.权利要求3所述的方法，其中所述结直肠癌细胞是腺癌细胞。
5.权利要求3所述的方法，其中所述肝癌细胞是肝细胞癌细胞。
6.权利要求2所述的方法，所述siRNA是特异于ZNFN3A1靶点的，所述ZNFN3A1靶点选自 SEQ ID NO :1 的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、7洸-746、 923-943、1065-1085 或 1258-1278。
7.权利要求6所述的方法，所述siRNA具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是相应于选自 SEQ ID NO 1 的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、7洸-746、 923-943、1065-1085或1258-1278的序列的核糖核苷酸序列，[B]是由3到23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，和[A’ ]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。
8.权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含转染增强剂。
9.一种分离的多核苷酸，包含有义链核酸和反义链核酸的组合，其中分别地，所述有义链核酸包含选自 SEQ ID NO 1 的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、 726-746,923-943,1065-1085或1258-1278的核苷酸序列，所述反义链核酸由其互补序列组成。
10.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸和反义链核酸在同一条链上。
11.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸由短于约100个核苷酸的核苷酸序列组成。
12.权利要求11所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸短于约75个核苷酸。
13.权利要求12所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸短于约50个核苷酸。
14.权利要求13所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸短于约25个核苷酸。
15.权利要求14所述的分离的多核苷酸，其中所述有义链核酸长度在约19到约25个核苷酸之间。
16.包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含有义链核酸和反义链核酸的组合，其中分别地，所述有义链核酸包含选自SEQ ID NO :1的核苷酸451-471、532-552、623-643、 625-645,636-656,726-746,923-943,1065-1085 或 1258-1278 的核苷酸序列，所述反义链核酸由其互补序列组成。
17.权利要求16所述的载体，其中所述多核苷酸具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中 [A]是选自 SEQ ID NO :1 的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、7洸-746、 923-943、1065-1085 或 1258-1278 的核苷酸序列，[B]是由3到23个核苷酸组成的核苷酸序列，和[A’ ]是由[A]的互补序列组成的核苷酸序列。
18.包含至少一个siRNA的组合物，所述siRNA包含有义链核酸和反义链核酸的组合，其中分别地，所述有义链核酸包含相应于选自SEQ ID N0:1的核苷酸451-471、532-552、 623-643,625-645,636-656,726-746,923-943,1065-1085 或 1258-1278 的序列的核糖核苷酸序列，所述反义链序列由其互补序列组成。
19.包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含相应于ZNFN3A1目标序列的核糖核苷酸序列，和其中反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链相互杂交形成所述双链分子，和其中当被导入到表达ZNFN3A1基因的细胞中时，所述双链分子抑制所述基因的表达。
20.权利要求19所述的双链分子，其中所述ZNFN3A1目标序列包含来自SEQID NO 1 的至少约10个连续的核苷酸。
21.权利要求20所述的双链分子，其中所述ZNFN3A1目标序列包含来自SEQID NO 1 的约19个到约25个连续的核苷酸。
22.权利要求21所述的双链分子，其中所述ZNFN3A1目标序列选自SEQID N0:1的核苷酸 451-471、532-552、623-643、625-645、636-656、7洸-746、923-943、1065-1085 或 1258-1278o
23.权利要求19所述的双链分子，其中单个核糖核苷酸转录产物包含所述有义链和所述反义链，所述双链分子进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。
24.权利要求19所述的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约100个核苷酸的寡核苷酸。
25.权利要求M所述的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约75个核苷酸的寡核苷酸。
26.权利要求25所述的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约50个核苷酸的寡核苷酸。
27.权利要求沈所述的双链分子，其中所述双链分子是长度小于约25个核苷酸的寡核苷酸。
28.权利要求27所述的双链多核苷酸，其中所述双链分子是长度在约19个和约25个核苷酸之间的寡核苷酸。
29.编码权利要求19所述的双链分子的载体。
30.权利要求四所述的载体，其中所述载体编码具有二级结构的转录产物，其中所述转录产物包含有义链和反义链。
31.权利要求30所述的载体，其中所述转录产物进一步包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列。
32.在生物样品的细胞中抑制ZNFN3A1基因的表达的方法，所述方法包括将核糖核酸 (RNA)以足够抑制ZNFN3A1基因的表达的数量导入到细胞中，其中所述RNA是包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含相应于ZNFN3A1目标序列的核糖核苷酸序列，和其中所述反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义和所述反义核糖核苷酸链相互杂交形成所述双链分子，和其中当被导入到表达ZNFN3A1基因的细胞中时， 所述双链分子抑制所述基因的表达。
全文摘要
本发明记载了一种通过用ZNFN3A1 siRNA的组合物接触细胞来抑制癌细胞的生长的方法。本发明还包含治疗癌症的方法。本发明还记载了产品，包含核酸序列和载体，以及包含它们的组合物，其在本发明提供的方法中是有用的。本发明还提供一种抑制肿瘤细胞的方法，所述肿瘤细胞例如肝癌或结肠癌细胞，特别是HCC或结直肠腺癌细胞。
文档编号C12N15/12GK102172408SQ201110103198
公开日2011年9月7日 申请日期2004年2月27日 优先权日2003年2月28日
发明者中村佑辅, 古川洋一 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司