专利名称：一种抑制肝癌细胞生长的短肽系列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术医药领域，本发明更具体涉及了一种抑制肝癌细胞生长的短肽系列 及其应用。
技术背景在癌症发生与治疗的过程中，化学治疗一直属于主体部分。现有的临床使用的化疗药物， 如环磷酰胺、顺铂、阿糖胞苷、阿霉素和长春新碱等，它们主要是用来破坏细胞的周期的， RNA、 DNA和蛋白质都是此类药物的靶向目标。这些化疗药物，其本身都有自己的毒性，不管 是一种化疗药物单独使用还是几种化疗药物结合运用在临床治疗上，其在对癌症有明显疗效， 杀伤杀死癌细胞的同时，也会损害病人的正常细胞。化疗药物的副作用最普遍的就是对病人 的骨髓产生极度抑制，造成病人的极大痛苦，甚至引起死亡。到目前，除了早发现癌症病情 并实行手术切除肿瘤包块外，对于已经扩散的肿瘤仍没有特效药物去治疗[Cancer Biology癌 生物学，R.J.B金著，刘以训主译，科学出版社，2002]，现有临床上用于癌症治疗的药物 大都是化合物，而短肽在癌症方面的直接治疗上的应用尚无文献报道。 发明内容本发明目的是针对上述问题，提供一种抑制肝癌细胞生长的短肽系列及其应用。本发明的一种抑制肝癌细胞生长的短肽，其特征在于组成短肽的氨基酸主序列〈1〉和编 码短肽的核苷酸主序列〈2〉如下<1> J-Val-B-Trp-0-Arg其中，J代表氨基酸Pro, Asn或His; B代表氨基酸Ser或Gin; 0代表氨基酸Leu或Thr; <2> caq gtt或gtc或gta或gtg gam tgg ctn cgt或cgc或cgg或cga 其中，H代表核苷酸G,A或C; Q代表核苷酸G，T或C; M代表核苷酸A或G; N代表核苷酸C， A， G或T;所述短肽的氨基酸主序列为氨基酸位置固定的主序列，其间隔的位置选择排列相对 应的氨基酸。本发明的抑制肝癌细胞生长的短肽片段，其氨基酸主序列具有与该短肽氨基酸主序列》 70%的相同性，》90%的相似性，片段为把所述的6个氨基酸的序列从任意位置截取成3个 或4个或5个氨基酸组成的与所述短肽具有同样生物活性的短肽。本发明的抑制肝癌细胞生长的短肽类似物具有与所述短肽相同的生物活性，所述类似物 是指在用所述短肽和另一种化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。本发明的抑制肝癌细胞生长的短肽衍生物，其氨基酸序列具有与短肽氨基酸主序列》 70%的相同性，》90%的相似性，该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者 几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述短肽具有同样生物活性的短肽。本发明的抑制肝癌细胞生长的短肽变体，其氨基酸序列具有与短肽氨基酸主序列》70% 的相同性，》90%的相似性，该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸 序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任 一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。本发明的短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有 治疗人实体肿瘤癌细胞增殖的肝癌癌细胞无限增殖引发的一切癌症、诊断与检测癌症的发生 以及癌症发生的恶性程度药物的应用。本发明的短肽或核苷酸用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物 或者检测试剂的应用。本发明的显著优点是本发明的短肽来自于运用生物信息学的方法把国际蛋白质数据库 的蛋白进行序列比对，筛选出来的一种新型的具有活性功能的生物活性肽，运用本发明的短 肽抑制或杀伤癌细胞的同时对正常细胞无显著伤害作用，解决了现有癌症药物在抑制或杀死 癌细胞的同时对人体正常细胞也有严重伤害的缺陷。
具体实施方式
短肽的制备方法采用化学合成的方法，即本领域熟知的已经非常成熟的固相肽合成方法， 既可以采用Boc方法也可以采用Fmoc方法。具体做法就是将被保护的氨基酸逐个偶联到惰性 固相载体上去，然后利用强酸将肽链从载体上裂解下来，同时去除侧链保护。短肽的氨基酸主序列为氨基酸位置固定的主序列，其间隔的位置选择排列相对应的氨基 酸，例如，在J位置的氨基酸有3种Pro， Asn或His，此3种氨基酸都可以单一地安放在〈1〉 中J的位置上，不管选择其中任何一种，该短肽仍具有其原有的生物活性，即抑制恶性肝肿 瘤细胞增长，同样地B和0所代表的位置的氨基酸也有如此特性。核苷酸采用人工合成方法制备；编码短肽的核苷酸包含下组中的一种(a) 编码具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸；(b) 与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；(c) 与(a)或(b)中所述核苷酸有》75%相同性的核苷酸；该核苷酸基本由编码具有〈1〉氨基酸序列短肽的核苷酸组成，本发明的核苷酸序列包括〈2〉中的核苷酸序列，其形式为DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。 DNA可以是单链的也可 以是双链的。编码短肽的编码区序列可以和〈2〉中的核苷酸相同，也可以不同，称为变异体， 其中变异体是指具有编码〈1〉中的氨基酸序列的编码，但可以和〈2〉中的核苷酸不同。变异体 可以是一个或几个核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸序列，但不会改变编码〈1〉中氨基酸序列 的短肽的活性功能。该短肽或核苷酸的"变体"是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列 或编码它的核苷酸序列。改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插 入、添加或替换。变体可具有"保守性"改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的 结构或化学性质，也可以有"非保守性"改变，其中替换的氨基酸不具有与原氨基酸相类似 的结构或化学性质。"缺失"是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或几个氨基酸或核苷酸的 缺失；"插入"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中间任意位置插入一个或几个氨基酸；"添 加"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一个或几个氨基酸；"替换"是指用不 同的氨基酸或核苷酸替换一个或几个氨基酸或核苷酸。该短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有抑制与 治疗包括但不限于下述疾病的药物的用途1.实体肿瘤癌症肝癌以及其他的恶性细胞增殖类型的癌症疾病。在计算短肽片段、短肽衍生物和短肽变体的氨基酸主序列具有与短肽氨基酸主序列的相 同性和相似性时，"相同性百分率"是指两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同的百 分率。根据Cluster法(Higging D. G. & Sharp P. M. ， Gene 1988， 73:234-237 )通过检査 所有配对之间的距离将各组序列排列成簇，然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列 如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算_序列A与序列B之间匹配的残基个数X 100%序列A的残基个数_序列A中间隔的残基个数-序列B中间隔的残基个数 "相似性"是指在确定两条氨基酸序列比对中相同氨基酸序列位置确定后，在相同氨基 酸之间排列的对应的氨基酸的保守性取代程度。根据生物信息技术领域周知的氨基酸得分PAM 250 scoring matrix (Dayhoff, M. Schwartz, R. M. and Orcutt, B. C. Atlas of Protein Structure 1978, 345-352; DeLisi, C. and Kanehisa, M. Mathematical Biosciences 1984.69: 77-85; Schwartz, R. M. and Dayhoff, M. O. Atlas of Protein Structure, 1979. 353-358)，当相对应的不同氨基酸比 较得分》0时，该两个氨基酸相似；当不同氨基酸得分<0时，两个氨基酸不相似。两个氨 基酸序列如序列C和序列D之间的相似性百分率通过下式计算(序列C与序列D之间匹配的残基个数+序列C与序列D之间相似的残基个数)X 100% 序列C的残基个数-序列C中间隔的残基个数-序列D中间隔的残基个数 其中，序列C中间隔的残基个数和序列D中间隔的残基个数都不包括相似氨基酸的个数。下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列所有列举实施例所涉及的所有合成短肽都具有本发明涉及的药物功能而不 限于所列举功能。实施例l抑制肝癌细胞的试验(合成本发明涉及的短肽Pro-Val-Ser-Trp-Leu-Arg)人肝癌细胞系H印g2细胞的培养是用含有10%新生牛血清的RPMI 1640培养基来培养， 以5Xl()5/孔的细胞密度种植入96孔细胞板，24小时后，把本发明涉及的短肽按照不同的浓 度加入到细胞培养板中，以等体积的PBS为对照组，24、 48、 72小时后用MTT方法检验活细 胞成活率，给药组和对照组比较，获得肝癌细胞的抑制率可达71%。实施例2抑制肝癌细胞的试验(合成本发明涉及的短肽Pro-Val-Ser;^Trp-Leu-Arg)人肝癌细胞系Bel-7402细胞的培养是用含有10%新生牛血清的RPMI 1640培养基来培 养，以5乂105/孔的细胞密度种植入96孔细胞板，24小时后，把本发明涉及的短肽按照不同 的浓度加入到细胞培养板中，以等体积的PBS为对照组，24、 48、 72小时后用MTT方法检验 活细胞成活率，给药组和对照组比较，获得肝癌细胞的抑制率可达75%。核苷酸或氨基酸序列表 〈110〉福州大学<120>—种抑制肝癌细胞生长的短肽系列及其应用<160〉 17<210〉 1<211〉 6<212〉 PRT<213〉人工序列<220>〈223> J代表氨基酸Pro, Asn或His; B代表氨基酸Ser或Gin; 0代表氨基酸Leu或Thr <400> 1J-Va卜B-Trp-O-Arg<210> 2 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 2caq gtg gam tgg ctn cgs〈210> 3 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c， a， g或t〈400> 3caq gtg gam tgg ctn egg<210> 4 〈211> 18 〈212> DNA 〈213>人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 4caq gtg gam tgg ctn cgc<210> 5 <211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; ra代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 5caq gtg gam tgg ctn cgt〈210> 6 〈211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 6caq gta gam tgg ctn cga〈210> 7 〈211〉 18 〈212〉薩 〈213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400〉 7caq gta gam tgg ctn egg〈210〉 8 〈211〉 18 <212>画 〈213〉人工序列 <220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 8caq gts gam tgg ctn cgc〈210〉 9 〈211〉 18 〈212〉腿 〈213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 9caq gta gam tgg ctn cgt<210〉 10 〈211〉 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220>〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400〉 10caq gtc gam tgg ctn cga〈210〉 11 <211〉 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 11caq gtc gam tgg ctn egg〈210〉 12 〈211〉 18 <212〉 ■ <213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g,t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400〉 12caq gtc gam tgg ctn cgc〈210〉 13 〈211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g，a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c,a， g或t 〈400> 13caq gtc gam tgg ctn cgt<210〉 14 〈211〉 18 <212> ■ <213〉人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t 〈400> 14caq gtt gam tgg ctn cga〈210〉 15 〈211〉 18 〈212>腿 〈213>人工序列 〈220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 15caq gtt gam tgg ctn egg 〈210〉 16〈211〉 18 〈212>醒 <213>人工序列 <220〉〈223〉h代表核苷酸g,a或c; q代表核苷酸g，t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 16caq. gtt gam tgg ctn cgc<210> 17 〈211〉 18 〈212>薩 <213>人工序列 〈220〉〈223〉 h代表核苷酸g, a或c; q代表核苷酸g， t或c; m代表核苷酸a或g; n代表核苷酸c，a， g或t <400> 2caq gtt gam tgg ctn cgt
权利要求
1.一种抑制肝癌细胞生长的短肽，其特征在于组成短肽的氨基酸主序列<1>和编码短肽的核苷酸主序列<2>如下<1>J-Val-B-Trp-O-Arg其中，J代表氨基酸Pro，Asn或His；B代表氨基酸Ser或Gln；O代表氨基酸Leu或Thr；<2>CAQ GTT或GTC或GTA或GTG GAM TGG CTN CGT或CGC或CGG或CGA其中，H代表核苷酸G，A或C；Q代表核苷酸G，T或C；M代表核苷酸A或G；N代表核苷酸C，A，G或T；所述短肽的氨基酸主序列为氨基酸位置固定的主序列，其间隔的位置选择排列相对应的氨基酸。
2. —种如权利要求1所述的抑制肝癌细胞生长的短肽片段，其特征在于短肽片段的氨基酸主序列具有与所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述片段为把 所述的6个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或4个或5个氨基酸组成的与所述短肽 具有同样生物活性的短肽。
3. —种如权利要求1所述的抑制肝癌细胞生长的短肽类似物，其特征在于所述短肽类似 物具有与所述短肽相同的生物活性，所述类似物是指在用所述短肽和另一种化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多fik序 列或蛋白质。
4. 一种如权利要求1所述的抑制肝癌细胞生长的短肽衍生物，其特征在于所述短肽衍生 物的氨基酸主序列具有与所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述 衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的 基团取代后与所述短肽具有同样生物活性的短肽。
5. —种如权利要求1所述的抑制肝癌细胞生长的短肽变体，其特征在于所述短肽变体的氨基酸主序列具有与所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述变体 是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列，所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨 基酸或核苷酸，或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。
6. 根据权利要求l、 2、 3、 4或5所述的一种抑制肝癌细胞生长的短肽，其特征在于所述编码短肽的核苷酸包含下组中的一种(a) 编码具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸；(b) 与(a)所述核苷酸互补的核苷酸；(c)与(a)或(b)中所述核苷酸有》75y。相同性的核苷酸； 所述核苷人工合成方法制备。
7. 根据权利要求6所述的抑制肝癌细胞生长的短肽，其特征在于所述的短肽采用化学合 成方法制备；所述核苷酸采用人工合成方法制备。
8. —种如权利要求l、 2、 3、 4或5所述的抑制肝癌细胞生长的短肽的应用，其特征在于 所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有治疗 实体肿瘤人肝癌癌细胞无限增殖引发的癌症、诊断与检测肝癌症的发生以及癌症发生的 恶性程度药物的应用。
9. 一种如权利要求6所述的抑制肝癌细胞生长的短肽的应用，其特征在于所述核苷酸用 于制备具有治疗人实体肿瘤癌细胞增殖的肝癌癌症、诊断与检测肝癌症的发生以及癌症 发生的恶性程度药物的应用。
10. —种如权利要求6所述的抑制肝癌细胞生长的短肽的应用，其特征在于所述短肽或核苷酸用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物或者检测试剂的应 用。
全文摘要
本发明提供一种抑制肝癌细胞生长的短肽系列及其应用，该短肽的短肽片段、类似物、衍生物、变体的氨基酸主序列具有与该短肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性；短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有治疗治疗人实体肿瘤癌细胞增殖的肝癌癌症、诊断与检测癌症的发生以及癌症发生的恶性程度药物的应用，短肽或核苷酸用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物或者检测试剂的应用。该技术能够解决现有癌症药物在抑制或杀死癌细胞的同时对人体正常细胞也有严重伤害的缺陷。
文档编号A61K48/00GK101235079SQ200810070699
公开日2008年8月6日 申请日期2008年3月4日 优先权日2008年3月4日
发明者昊 李, 饶平凡 申请人:福州大学