专利名称：抑制癌细胞生长的短肽及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抑制癌细胞生长的短肽及其编码基因与应用。
背景技术：
癌症，也称为恶性肿瘤，是由于细胞增殖与凋亡的精准调控机制失常所引起的疾病，癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统扩散或转移到身体其他器官。癌症已经成为全球人类健康的首要杀手之一，据世界卫生组织(WorldHealth Organization, WHO) 2010年发表的公告，全球每年有1200万人被确诊为癌症，760万人死于癌症。若不加控制，预计到2030年每年癌症死亡人数有可能达到1700万人，且大多数发生在中低收入的发展中国家。WHO统计数据表明，2005年我国有189. 2万人死于癌症，其中118. 2万人为70岁以下，胃癌为最高发癌症种类，而近年来我国癌症发病更是逐渐趋于低龄化。发现并发展新的癌症治疗的药物，对于社会的稳定，人民健康生活质量的提高，社会经济发展都具有良好的推动作用。目前，用于临床的癌症药物种类繁多，但多数抗癌药物在抑制癌症细胞生长的同时，对于人体正常组织也有一定的损害，使癌症病人在治疗癌症过程中承受巨大的生理和心理的折磨。癌症细胞的调控机制失常往往是由于一些重要调控基因的失活造成的。目前，已经发现的抑癌基因根据其 在细胞中的失活机理可简单的分为两类。I型抑癌基因是指其在DNA层面上，基因发生突变而丧失抑制细胞生长作用的基因。II型抑癌基因是一种新颖的抑癌基因，它们在正常细胞中存在一定水平的表达，具有一定的功能，而在肿瘤细胞中DNA并没有发生改变，而其基因的转录和翻译在不同程度上下调，从而丧失抑制细胞生长的作用。II型抑癌基因对于正常细胞和个别的癌症细胞并没有明显的抑制作用，而对于大多数癌症细胞具有很明显的抑制和诱导细胞凋亡的作用。因此，II型抑癌基因中具有抑癌作用的短肽将有望成为新型的抗癌新药。来自人类蛋白的短肽，在细胞中能够被多种酶降解代谢为天然氨基酸，对人体没有毒性，也不会造成累计效应。由于II型抑癌基因的自身特点，对正常细胞不产生抑制作用，来自II型抑癌基因的短肽将不会对正常细胞或人体正常器官组织产生副作用，减少治疗过程对癌症病人造成的痛苦。因此，来自II型抑癌基因的抑癌短肽有望成为一种新型的绿色仿生药物。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种多肽。本发明提供的多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。所述多肽的编码基因也是本发明保护的范围。所述编码基因为如下I)-3)中任一所述的DNA分子I)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)在严格条件下可与I)限定的DNA序列杂交且编码具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的 多肽的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的多肽的DNA分子。上述严格条件可为在0.1 X SSPE (或0.1 X SSC)，0.1 % SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗膜。含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也在本发明保护的范围。所述重组载体为将所述多肽的编码基因插入pcDNA3.1-BFPC-1inker中，得到表达所述多肽的重组载体。所述pcDNA3.1-BFPC-1inker按照如下方法制备I)在pcDNA3.1载体的NotI和ClaI酶切位点间插入Tag BFP编码基因(序列3)，得到重组载体pcDNA3.1-BFPC ；2)在步骤I)得到的重组载体pcDNA3.1-BFPCLinkerClaI和BspEI酶切位点间插A Linker 基因的 DNA 片段(序列 6)，得到载体 pcDNA3. 1-BFPC-linker。所述转基因细胞系是将所述的重组载体导入到宿主细胞中得到的转基因细胞系，所述宿主细胞具体为子宫颈癌细胞，所述子宫颈癌细胞尤其优选为HeLa细胞。扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也是本发明保护的范围，所述引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5。所述多肽、所述多肽的编码基因、所述重组载体或所述转基因细胞系在制备预防和/或治疗肿瘤的产品的应用；或所述多肽、所述多肽的编码基因、所述重组载体或所述转基因细胞系在制备抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡产品中的应用。所述抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡体现在如下I)-5)中的任意一种I)降低肿瘤细胞线粒体膜电位、促进磷酯酰丝氨酸外翻、激活细胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶(caspase)和促进肿瘤细胞死亡；2)促进肿瘤细胞死亡；3)降低肿瘤细胞线粒体膜电位；4)促进磷酯酰丝氨酸外翻；5)激活细胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶(caspase)；
所述肿瘤细胞具体为子宫颈癌细胞，所述子宫颈癌细胞尤其优选为HeLa细胞；所述产品为药物。本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤生长产品。本发明提供的产品，其活性成分为所述多肽、所述多肽的编码基因、所述重组载体或所述转基因细胞系。本发明的实验证明，本发明通过对II型抑癌基因功能区域的研究，发现一种可以抑制人类癌细胞的生长并诱导细胞凋亡的三十七肽，通过对HeLa细胞的施用实验，发现该短肽能够造成人类子宫颈癌细胞HeLa细胞的凋亡，因此该短肽可能成为良好的低副作用的抗癌药物。
图1为短肽引起人类子宫颈癌细胞HeLa细胞线粒体膜电位的降低图2为短肽诱导人类子宫颈癌细胞HeLa细胞的凋亡图3为短肽诱导细胞死亡的死亡率统计
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、短肽的获得
本发明所用短肽序列来自一种人类第二类肿瘤抑制因子，其DNA片段可以通过以人类肝脏cDNA文库为模板的PCR扩增获得。以人类肝脏cDNA文库为模板，以h2cm7-N/h2cm7-C为引物，进行PCR扩增，得到该短肽基因片段的PCR产物，该基因片段两端分别带有BspEI和XbaI酶切位点。h2cm7-N :5，-CGATTCTCCGGACGCAGTGACCAGGTCAGAGAT-3，(序列 4)；h2cm7-C :5，-CTAGTCTAGATTATTGCTTTTGTCGCTTGTTTC-3’ (序列 5)。具体PCR反应体系如下
人类肝脏cDNA文库0.5 ^iL
正向引物2.5 ^iL(IpM)
反向引物2.5 ^iL(IpM)
2XPfu MasterMix25 [iL (购于天根生化科技有限公司)
H2O_19 uL_
50 JiL反应条件940C 5min2 94°C 40sec3 60°C 40sec4 72 °C 45min72 °C 30min
4 °C IOmin2, 3,4 为 cycle 反应需要 30cycles得到136bp的PCR产物，经过测序该PCR产物具有序列表中序列I所示的核苷酸，其编码的多肽具有序列表中序列2所示的氨基酸，将该多肽命名为REVC37。也可人工合成序列I作为模板，以h2cm7_N和h2cm7_C为引物，同样得到136bp的PCR 产物 REVC37。也可直接人工合成序列2作为REVC37。实施例2、短肽REVC37的功能鉴定一、含有短肽REVC37基因序列的重组载体的构建1、融合Tag BFP荧光蛋白载体pcDNA3.1-BFPC的构建I) Tag BFP基因片段的制备Tag BFP根据Gene Bank的序列由博迈德科技发展有限公司全基因合成。Tag BFP的Gene Bank号为ABP88744.1 (核苷酸序列为序列3)。以全基因合成得到的含有Tag BFP序列的质粒为模板(也可人工合成序列3作为模板)，以BFP-N/BFP-C为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物即为Tag BFP基因片段，该基因片段两端分别带有NotI和ClaI酶切位点。BFP-N :5’ -TAATGCGGCCGCATGAGCGAGCTGATTAAGGAG-3’
`
BFP-C :5’ -ACATATCGATATTAAGCTTGTGCCCCAGTT-3’具体PCR扩增反应体系
Tag BFP模板基因I队(20 ng)
正向引物2.5 ^iL(IpM)
反向引物2.5 ^iL(IpM)
2XPfu MasterMix25 [iL (购于天根生化科技有限公司)
H2O_19 uL_
50 JiLPCR反应条件94°C 5min2 94°C 40sec3 60°C 40sec4 72。。1. 5min72 °C 30min4 °C IOmin2, 3,4 为 cycle 反应需要 30cycles得到731bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，即为Tag BFP基因片段。2)融合Tag BFP荧光蛋白载体的构建将步骤I)得到的Tag BFP基因片段经过NotI和ClaI酶切，得到酶切产物，将该酶切产物与经过同样酶切得到的pcDNA3.1载体(购自Invitrogen，产品目录号为V860-20)连接，得到连接产物，取5 u L连接产物加入大肠杆菌TOPlO感受态细胞中(购于天根生化科技有限公司)，冰浴30min，42°C热击90s，冰浴5min，加入Iml LB培养基，37°C温箱温浴lh，涂布于Amp+平板，37°C温箱培育过夜，得到转化子。挑取转化子的单克隆接种于LB液体培养基培养并提取质粒，将该质粒用NotI和ClaI酶切，能得到731bp核苷酸片段的为阳性质粒，选择阳性质粒使用T7和BGHrev通用引物进行测序，测序结果与Tag BFP编码基因相符的即为构建成功的质粒，该质粒为在pcDNA3.1载体的NotI和ClaI酶切位点间插入Tag BFP编码基因(序列3)的重组载体，将该重组载体记作pcDNA3.1-BFPC0上述酶切反应体系如下
权利要求
1.一种多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
2.权利要求1所述多肽的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)在严格条件下可与I)限定的DNA序列杂交且编码具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的多肽的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且编码具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的多肽的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将权利要求1所述多肽的编码基因插入pcDNA3.1-BFPC-1inker中，得到表达所述多肽的重组载体。
6.根据权利要求4所述的转基因细胞系，其特征在于所述转基因细胞系是将权利要求5所述的重组载体导入到宿主细胞中得到的转基因细胞系，所述宿主细胞具体为子宫颈癌细胞，所述子宫颈癌细胞尤其优选为HeLa细胞。
7.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任一片段的引物对，所述引物对的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，所述引物对中的另一条弓I物的核苷酸序列为序列表中的序列5。
8.权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述多肽的编码基因、权利要求4或5所述重组载体或权利要求4或6所述转基因细胞系在制备预防和/或治疗肿瘤的产品的应用；或权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述多肽的编码基因、权利要求4或5所述重组载体或权利要求4或6所述转基因细胞系在制备抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡体现在如下I)-5)中的任意一种1)降低肿瘤细胞线粒体膜电位、促进磷酯酰丝氨酸外翻、激活细胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶和促进肿瘤细胞死亡；2)促进肿瘤细胞死亡；3)降低肿瘤细胞线粒体膜电位；4)促进磷酯酰丝氨酸外翻；5)激活细胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶；所述肿瘤细胞具体为子宫颈癌细胞，所述子宫颈癌细胞尤其优选为HeLa细胞。
10.一种抑制肿瘤生长产品，其活性成分为权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述多肽的编码基因、权利要求4或5所述重组载体或权利要求4或6所述转基因细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种抑制癌细胞生长的短肽及其编码基因与应用。本发明提供的多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制肿瘤细胞生长和/或促进肿瘤细胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。本发明的实验证明，本发明提供的多肽能够造成人类子宫颈癌细胞HeLa细胞的凋亡，因此该短肽可能成为良好的低副作用的抗癌药物。
文档编号C07K14/47GK103030688SQ20111029791
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者夏斌, 林坚, 任晓白, 魏贺佳 申请人:北京大学