肝细胞生长因子(hgf)的结合蛋白质的制作方法

专利名称：：肝细胞生长因子(hgf)的结合蛋白质的制作方法
技术领域：
：本发明的
技术领域：
涉及分子生物学、免疫学和肿瘤学。更具体地说，本发明的
技术领域：
为与人肝细胞生长因子(HGF)结合的基于抗体的结合蛋白质。
背景技术：
：肝细胞生长因子(HGF)，也被称为扩散因子(ScatterFactor,SF)，是一种主要由间充质细胞产生的多功能异源二聚体蛋白质，并且是表达Met酪氨酸激酶受体的细胞的效应器(参见Bottaro等人(1991)SCIENCE251:802-804，Rubin等人(1993)BI0CHIM.BIOPHYS.ACTA1155:357-371)。人Met受体还^皮称为"c-Met"。成熟的HGF包含两个多肽链，即，ot链和P链。已经公开的研究指出，cc链包含HGF的c-Met受体结合域。当HGF与其同源受体结合时，HGF调节了多种细胞活性。HGF-Met信号传导通路在肝再生、伤口愈合、神经再生、血管发生和恶性肿瘤中起作用。例如参见Cao等人(200DPR0C.NATL.ACAD.SCI.USA98:7443—7448，Burgess等人(2006)CANCERRES.66:1721-1729，以及美国专利序号5，997，868和5，707，624。研究者已经开发出了许多HGF调节剂(包括抗体)来治疗涉及HGF活性的多种紊乱，例如某些HGF响应的癌症(HGFresponsivecancer)。例如参见国际专利申请公开序号WO2005/017107。图1示意性地显示了所有抗体所共有的基本结构。抗体是含有4条多肽链的多聚体蛋白质。其中的2条多肽链被称为重链或H链，另外2条多肽链被称为轻链或L链。通过链间的二疏键连接免疫球蛋白的重链和轻链。通过多个链间二硫键连接免疫球蛋白的重链。轻链由1个可变区(图1中的和1个恒定区(图1中的构成，而重链由1个可变区(图1中的VH)和至少3个恒定区(图1中的CHi、CH2和CH3)构成。可变区决定了抗体的特异性，而恒定区则包含其他功能。氨基酸和结构信息表明，每个可变区都包含3个超变区(也称为互补性决定区或CDR)，其侧翼是4个相对保守的框架区或FR。所述的3个CDR(分别称为CDRbCDR2和CDR3)决定了单个抗体的结合特异性。当将抗体用作诊断剂和治疗剂时，通常理想的是产生包含对于目标分子最高度的结合特异性和亲和力的抗体。据信，可变区的差异对抗体的特异性和亲和力包含深远的影响。美国专利序号5，707，624描述了抗HGF的抗体在治疗卡波西肉瘤中的用途。类似的，美国专利序号5，997，868描述了通过向待治疗患者施用抗HGF的抗体，从而阻断内源HGF促进肿瘤中血管发生的能力的胂瘤治疗。最近，研究者提出，与HGF的P链结合的抗体包含成为患有HGF依赖的肿瘤患者的治疗剂的潜力(Burgess(2006)同上)。然而，仍需要可以被用作治疗剂和诊断剂的其他HGF调节剂。发明概述本发明部分地基于特异性地结合HGF(特别是人HGF)的结合蛋白质家族的发现。所述结合蛋白质是基于抗体的，以至于其包含基于特异性地结合HGF的抗体家族的CDR的抗原(即，HGF)结合位点。所述CDR赋予了所述结合蛋白质对HGF的结合特异性。所述结合蛋白质可以用作诊断剂和治疗剂。当将所述结合蛋白质用作治疗剂时，将该结合蛋白质改造(例如人源化)，从而减小或消除在施用至接受者(例如人)时诱导针对所述结合蛋白质的免疫应答的风险。所述结合蛋白质中和了HGF的活性，因此可以被用作治疗剂。在某些实施方案中，所述的结合蛋白质抑制HGF与其同源受体(c-Met)结合，由此中和了HGF的活性。在其他实施方案中，所述的结合蛋白质与HGF结合，并中和其生物活性，但不抑制HGF与c-Met受体的结合。由于HGF涉及癌细胞的生长和增殖，因此所述结合蛋白质可用于抑制癌细胞的增殖。此外，当用施用至哺乳动物时，所述的结合蛋白质能够抑制或减少哺乳动物中肿瘤的生长。通过下文所述的附图、发明详述和权利要求的描述，清楚明白地显示本发明的这些和其他方面以及优点。参见以下附图可以更彻底地理解本发明。图1是典型抗体的示意性代表的图。图2为显示如下氨基酸序列的示意图，所述的氨基酸序列定义了抗体的完整的免疫球蛋白重链可变区，其中所述的抗体用1A3、1D3、1F3、2B8、2F8、3A12、3B6和3D11表示。每个抗体的氨基酸序列都与另一抗体的氨基酸序列比对，并且在方框中限定了定义信号肽、CDRi、CDR2和CDR3的区域。不带方框的序列表示FR序列。图3为显示图2中显示的每个免疫球蛋白重链可变区序列的CDRhCDR2和CDR3序列的示意图。图4为显示如下氨基酸序列的示意图，所述的氨基酸序列定义了抗体1A3、1D3、1F3、2B8、2F8、3A12、3B6和3D11的完整的免疫球蛋白轻链可变区。每个抗体的氨基酸序列都与另一抗体的氨基酸序列比对，并且在方框中限定了定义信号肽、CDRi、CDR2和CDR3的区域。不带方框的序列表示FR序列。图5为显示图4中显示出的每个免疫球蛋白轻链可变区序列的CDR,、CDR2和CDR3序列的示意图。图6为由测定U87MG异种移植模型中抗HGF的抗体1D3、1F3、1A3和2B8的肿瘤抑制活性的试验中所得的结果的汇总图。菱形对应于PBS;三角形对应于抗HGF的抗体1A3;X对应于抗HGF的抗体1D3;方形对应于抗HGF的抗体1F3;而圆形对应于抗HGF的抗体2B8。图7为由测定U118异种移植模型中抗HGF的抗体1D3、1F3、1A3和2B8的肿瘤抑制活性的试验中所得的结果的汇总图。菱形对应于IgG;方形对应于抗HGF的抗体1F3;三角形对应于抗HGF的抗体1D3;X对应于抗HGF的抗体1A3;而圆形对应于抗HGF的抗体2B8。图8为一个表，该表总结了抗原结合亲和力以及人HGF与嵌合的2B8抗体、嵌合的/人源化的2B8抗体或人源化的2B8抗体之间相互作用的动力学的表面等离子共振数据。该表列出了所测试的多对Kappa轻链和IgGl重链。在3个独立的试验中，对这些列出的包含标准偏差(STDEV)的抗体进行分析。图9为总结试验数据的柱状图，表明Hu2B8结合与小鼠单克隆抗体2B8相互排斥的表位。将人源化的或嵌合的2B8捕获在抗人的Fc的芯片上。然后，将HGF与人源化的或嵌合的2B8结合。测定小鼠2B8或对照抗体(多克隆的山羊抗HGF的抗体)与被捕获的HGF结合的能力。人源化的2B8抗体和嵌合的2B8都抑制鼠2B8与HGF的结合。白色的柱对应于嵌合的2B8抗体；灰色的柱对应于人源化Hu2B8抗体(Kappa可变区Kvl-39.1和重链可变区Hv5-51.1);黑色的柱对应于人源化Hu2B8抗体(Kappa可变区Kv3-15.1和重链可变区Hv5-51.1)。发明详述本发明部分地基于特异性地结合HGF并中和HGF(特别是人HGF)的活性的结合蛋白质家族的发现。所述结合蛋白质可用于许多诊断和治疗应用。所述的结合蛋白质基于就其结合HGF并中和HGF的活性的能力而被选择的某些单克隆抗体的抗原结合位点。具体而言，所述的结合蛋白质包含多个免疫球蛋白可变区CDR序列，其一起定义了用于HGF的结合位点。考虑到这些抗体的中和活性，它们特别适用于介导HGF应答细胞(例如癌细胞)的生长和/或增殖。当将所述的结合蛋白质用作治疗剂时，可以对其改造，从而最小化或消除在施用至接受者时诱导针对所述结合蛋白质的免疫应答的风险。此外，根据具体的应用，包括将所述结合蛋白质与其他部分(例如可检测的标签(如放射性标签)和效应器分子(如其他蛋白质和基于小分子的治疗剂))缀合。下文将对本发明的这些特征和方面中的每一个进行详细的说明。I一结合HGF的结合蛋白质在一个方面中，本发明提供一种结合人HGF的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含(i)包含结构CDRu-CDR『CDRu的免疫球蛋白轻链可变区；和(U)包含3个互补性决定区(CDR)的免疫球蛋白重链可变区，其中所述的免疫球蛋白轻链可变区和所迷的免疫球蛋白重链可变区一起定义了用于结合人HGF的单个结合位点。CDRu包含氨基酸序列XJ^erXJJJJAXwXuXuXuXnXi"其中氨基酸X!为Arg、Lys或Ser，乂2为Ala或Thr,X4isGlu、Gin或Ser，Xs为Asn、Asp或Ser,X6为Ile或Val，X7为Asp、Lys、Ser、Val或Tyr，Xs为肽键或Tyr，X,为肽键或Asp,Xw为肽键或Gly，Xu为肽键或Asn,X"为肽鍵、lie或Ser,Xu为Asn或Tyr，X"为Ile、Leu、Met或Val,X15为Ala、Asn、His或Ser。CDRt2包含氨基酸序列X16XX18X19X2。X21X22，其中氨基酸X16为Ala、Asp、Arg、Gly或Val，X"为Ala、Thr或Val,X"为Asn、Ser或Thr,乂19为Arg、Asn、Lys、或His,Xs。为Leu或Arg，Xn为Ala、Asn、Glu、Val或Pro,X^为Asp、Ser或Thr。CDRu包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X28ProX3。Thr，其中氨基酸X23为Leu、Gly或Gln，X24为His或Gln，X25为Phe、Ser、Trp或Tyr，X"为Asp、Ile、Ser、Trp或Tyr，乂27为Gly、Glu、Asn或Ser，乂28为Asp、Asn、Phe、Thr或Tyr,Xso为Leu、Phe、Pro或Tyr。在其他方面中，本发明提供一种结合人HGF的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含(i)包含结构CDRfCDRH广CDRH3的免疫球蛋白重链可变区；和(ii)包含3个互补性决定区(CDR)的免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区和所述的免疫球蛋白轻链可变区一起定义了用于结合人HGF的单个结合位点。CDR^包含氨基酸序列XJyrX3X4X5，其中氨基酸Xi为Asp、Asn、Ser或Thr，X;为Phe、Ser、Trp或Tyr,X"为Ile、Leu或Met，Xs为Asn、His或Ser。CDRH2包含氨基酸序列X6neX8X9X1QXGlyX!3X14X15TyrX17X18X19X2。X21X22，其中氨基酸Xs为Lys、Gln、Glu、Val或Tyr，Xs为Asn、Gly、Ser、Trp或Tyr，X,为Ala、Pro或Ser,X^为Gly或Thr，Xn为肽键、Asp、Asn、Gly或Ser,Xu为Asp、Asn、His、或Ser，X14为Ser或Thr,X!s为Asn或Tyr，乂17为Asn或Pro,X18为Ala、Asp、Gly、Gln、Glu、Pro或Ser，X!9为Asn、Lys、Met或Ser，乂20为Leu、Phe或Val，X"为Lys、Met或Gin,X22为Asp、Gly或Ser。CDRH3包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X28X29X3。X31X32X33X34Tyr,其中氨基酸X23为Arg、Asn、Gin或Glu，X"为Gly、Leu、Arg、或Tyr,X"为肽键、Asp或Gly，X26为肽键或Gly，X27为肽键或Tyr，Xu为肽键、Leu或Tyr，X"为肽键、Gly、Uu、Arg或Val,又3。为肽键、Asp、Gly或Glu，X^为肽键、Asn、Arg、Ser或Tyr，乂32为肽键、Ala、Gly、lie或Tyr，X"为Met或Phe，X34为Ala或Asp。应该理解，所述结合蛋白质包含如上所述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链或其片段。此外，应该理解，所述结合蛋白质可以为完整的抗体或其抗原结合片段、或生物合成的抗体位点。在某些实施方案中，在免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的CDR序列中插入框架区(FR)。在某些其他的实施方案中，将免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的CDR序列插入人或人源化的框架区之间。在另一方面，本发明提供一种特异性地结合人HGF的分离的结合蛋白质。该结合蛋白质包含(a)包含结构CDRl!-CDRl2-CDRl3的免疫球蛋白轻链可变区；和(b)免疫球蛋白重链可变区，其中所述的免疫球蛋白轻链可变区和所述的免疫球蛋白重链可变区一起定义了用于结合人HGF的单个结合位点。CDRu包含选自SEQIDNO.8(1A3)、SEQIDNO.18(2B8)、SEQIDNO.28(2F8)、SEQIDNO.38(3B6)、SEQIDNO.48(3D11)、SEQIDNO.58(1D3)、SEQIDNO.68(1F3)和SEQIDNO.78(3A12)中的序列。CDRl2包含逸自SEQIDNO.9(1A3)、SEQIDNO.19(2B8)、SEQIDNO.29(2F8)、SEQIDNO.39(3B6)、SEQIDNO.49(3D11)、SEQIDNO.59(1D3)、SEQIDNO.69(1F3)、SEQIDNO.79(3A12)和SEQIDNO.206(LRMR2B8LC)中的序列。CDRL3包含选自SEQIDNO.10(1A3)、SEQIDNO.20(2B8)、SEQIDNO.30(2F8)、SEQIDNO.40(3B6)、SEQIDNO.50(3D11)、SEQIDNO.60(1D3)、SEQIDNO.70(1F3)和SEQIDNO.80(3A12)中的序列。在整个说明书和权利要求书中，由具体的SEQIDNO.所表示的序列后为被括在括号中的抗体，该抗体为具体序列的来源。例如，SEQIDNO.8(1A3)表示，SEQIDNO.8的序列基于抗体1A3中的序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDRu、CDRu和CDRu，其中CDRU包含SEQIDNO.8(1A3)所示的序列，CDRL2包含SEQIDNO.9(1A3)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.10(1A3)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDRU、CDRl2和CDRL3,其中CDRu包含SEQIDNO.18(2B8)所示的序列，CDRu包含SEQIDNO.19(2B8)或SEQIDNO.206(LRMR2B8LC)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.20(2B8)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDRU、CDRU和CDRu,其中CDRU包含SEQIDNO.28(2F8)所示的序列,CDRL2包含SEQIDNO.29(2F8)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.30(2F8)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDRU、CDRU和CDRu，其中CDRU包含SEQIDNO.38(3B6)所示的序列，CDRL2包含SEQIDNO.39(3B6)所示的序列，而CDRL3包含SEQIDNO.40(3B6)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDRU、CDRU和CDRu,其中CDRU包含SEQIDNO.48(3D11)所示的序列，CDRL2包含SEQIDNO.49(3D11)所示的序列，而CDRu包含SEQIDNO.50(3D11)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDRL1、CDRu和CDRl"其中CDRL1包含SEQIDNO.58(1D3)所示的序列,CDRu包含SEQIDNO.59(1D3)所示的序列，而CDIU3包含SEQIDNO.60(1D3)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDRu、CDRu和CDRu,其中CDRU包含SEQIDNO.68(1F3)所示的序列,CDRl2包含SEQIDNO.69(1F3)所示的序列，而CDRl3包含SEQIDNO.70(1F3)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDRu、CDRl2和CDRu，其中CDRu包含SEQIDNO.78(3A12)所示的序列,CDRU包含SEQIDNO.79(3A12)所示的序列，而CDRl3包含SEQIDNO.80(3A12)所示的序列。在以上所述的实施方案中的每个实施方案中，优选地将所迷CDRU、CDRu和CDRu序列插入人或人源化的免疫球蛋白FR之间。应该理解，所述结合蛋白质可以为完整的抗体、其抗原结合片段或生物合成的抗体位点。在另一方面，本发明提供一种结合人HGF的分离的结合蛋白质。该结合蛋白质包含(a)包含结构CDRH1-CDRH广CDRH3的免疫球蛋白重链可变区；和(b)免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白重链可变区和所述的免疫球蛋白轻链可变区一起定义了用于结合人HGF的单个结合位点。CDIU包含选自SEQIDNO.5(1A3)、SEQIDNO.15(2B8)、SEQIDNO.25(2F8)、SEQIDNO.35(3B6)、SEQIDNO.45(3D11),SEQIDNO.55(1D3)、SEQIDNO.65(1F3)和SEQIDNO.75(3A12)中的序列；CDRh2包含逸自SEQIDNO.6(U3)、SEQIDNO.16(2B8)、SEQIDNO.26(2F8)、SEQIDNO.36(3B6)、SEQIDNO.46(3D11)、SEQIDNO.56(1D3)、SEQIDNO.66(1F3)、SEQIDNO.76(3A12)、SEQIDNO.202(Hu2B8Hvlf.1)，SEQIDNO.203(Hu2B8Hv5a.1或Hu2B8Hv5-51.1)、SEQIDNO.204(LR2B8HC)和SEQIDNO.205(LRMR2B8HC)中的序列;以及CDRh3包含逸自SEQIDNO.7(1A3)、SEQIDNO.17(2B8)、SEQIDNO.27(2F8)、SEQIDNO.37(3B6)、SEQIDNO.47(3D11)、SEQIDNO.57(1D3)、SEQIDNO.67(1F3)和SEQIDNO.77(3A12)中的序列。在一个实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDI^、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.5(1A3)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.6(1A3)所示的序列;以及CDRh3包含SEQIDNO.7(1A3)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO15(2B8)所示的序列；CDiU包含SEQIDNO.16(2B8)、SEQIDNO.202(Hu2B8Hvlf.1)、SEQIDNO.203(Hu2B8Hv5a.1或Hu2B8Hv5-51.1)、SEQIDNO.204(LR2B8HC)或SEQIDNO.205(LRMR2B8HC)所示的序列；以及CDR^包含SEQIDNO.17(2B8)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDRH1、CDRm和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.25(2F8)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.26(2F8)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDN0.27(2F8)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.35(3B6)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.36(3B6)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.37(3B6)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.45(3D11)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.46(3D11)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.47(3D11)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.55(1D3)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.56(1D3)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.57(1D3)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDRH1、CDRh,和CDRH3,其中CDRH1包含SEQIDNO.65(1F3)所示的序列;CDRH2包含SEQIDNO.66(1F3)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.67(1F3)所示的序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDRH1、CDRm和CDRH3，其中CDRH1包含SEQIDNO.75(3A12)所示的序列；CDRH2包含SEQIDNO.76(3A12)所示的序列；以及CDRh3包含SEQIDNO.77(3A12)所示的序列。在以上所述的实施方案中的每个实施方案中，优选地将所述CDRH1、CDRh2和CDRh3序列插入人或人源化的免疫球蛋白FR之间。应该理解，所述结合蛋白质可以为完整的抗体、其抗原结合片段或生物合成的抗体4立点。在另一方面，本发明提供一种结合人HGF的结合蛋白质。该结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区选自SEQIDNO.2(1A3)的残基20-141、SEQIDNO.12(2B8)的残基20-137、SEQIDNO.22(2F8)的残基20-137、SEQIDNO.32(3B6)的残基20-139、SEQIDNO.42(3D11)的残基20-132、SEQIDNO.52(1D3)的残基20-141、SEQIDNO.62(1F3)的残基20-141以及SEQIDNO.72(3A12)的残基20-141，所述的免疫球蛋白轻链可变区选自SEQIDNO.4(1A3)的残基21-127、SEQIDNO.14(2B8)的残基21-127、SEQIDNO.24(2F8)的残基20-131、SEQIDNO.34(3B6)的残基23-129、SEQIDNO.44(3D11)的残基23—128、SEQIDNO.54(1D3)的残基21-127、SEQIDNO.64(1F3)的残基21-127、以及SEQIDNO.74(3A12)的残基21-127。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.2(1A3)的残基20-141的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.4(U3)的残基21-127的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.12(2B8)的残基20-137的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDN0，14(2B8)的残基21-127的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.22(2F8)的残基20-137的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.24(2F8)的残基20-131的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.32(3B6)的残基20-139的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.34(3B6)的残基23-129的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.42(3D11)的残基20-132的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.44(3D11)的残基23-128的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.52(1D3)的残基20-141的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.54(1D3)的残基21-127的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.62(1F3)的残基20-141的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.64(1F3)的残基21-127的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述的免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.72(3A12)的残基20-141的氨基酸序列，所述的免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.74(3A12)的残基21-127的氨基酸序列。在以上所述的实施方案中的每个实施方案中，所述结合蛋白质为完整的抗体、其抗原结合片段或生物合成的抗体位点。在另一方面，本发明提供一种结合人HGF的分离的结合蛋白质。该结合蛋白质包含(i)免疫球蛋白轻链可变区，其选自SEQIDNO.173(Hu2B8Kvl-39.1轻链可变区)、SEQIDNO.179(Hu2B8Kv3-15.1轻链可变区)、SEQIDNO.193(LR2B8LC轻链可变区)以及SEQIDNO.199(LRMR2B8LC轻链可变区)；以及(ii)免疫球蛋白重链可变区，其选自SEQIDNO.159(Hu2B8Hvlf.1重链可变区)，SEQIDNO.165(Hu2B8Hv5a.1重链可变区)，SEQIDNO.169(Hu2B8Hv5-51.1重链可变区)，SEQIDNO.183(LR2B8HC重链可变区)以及SEQIDNO.189(LRMR2B8LC轻链可变区)。所述结合蛋白质可以是完整的抗体、其抗原结合片段或生物合成的抗体位点。在另一方面，本发明提供一种结合人HGF的分离的结合蛋白质。该结合蛋白质包含(i)免疫球蛋白轻链，其选自SEQIDNO.177(Hu2B8Kvl-39.1+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因2))、SEQIDNO.181(Hu2B8Kv3-15.1+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因2))、SEQIDNO.197(LR2B8LC+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因l))以及SEQIDNO.201(LRMR2B8LC十Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因l));以及(ii)免疫球蛋白重链，其选自SEQIDNO.163(Hu2B8Hvlf.1+IgGl恒定区(Glm(17，1)同种异型))、SEQIDNO.167(Hu2B8Hv5a.1+IgGl恒定区(Glm(17,1)同种异型))、SEQIDNO.171(Hu2B8Hv5-51.1+IgGl恒定区(Glm(17，1)同种异型))、SEQIDNO.187(LR2B8HC+IgGl恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因1))以及SEQIDNO.191(LRMR2B8HC+IgGl恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因1))。所述结合蛋白质可以是完整的抗体、其抗原结合片段或生物合成的抗体位点。在另一方面，本发明提供一种结合还原的人HGF的分离的结合蛋白质。该结合蛋白质包含(i)包含3个CDR的免疫球蛋白轻链可变区，以及(iU包含3个CDR的免疫球蛋白重链可变区。CDR通常被插在FR之间。免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的CDR—起定义了结合还原的人HGF的结合位点(例如还原的HGF的ot链)。还原的HGF是指使用足以还原oc链和P链之间二硫键的量的还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇或谷胱甘肽)处理的HGF。示例性的浓度包括，例如100mM的DTT和5%的2-巯基乙醇。在某些实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含选自CDRU、CDRu和CDRu中的至少1个CDR。备选地，所述结合蛋白质包含2个CDR，例如CDRu和CDRu、或CDRu和CDRu、或CDRu和CDRu。备选地，所述结合蛋白质包含所有的3个CDR，即，CDRU、CDRL2和CDRL3。CDRU包含氨基酸序列X^SerXJsX^XJJwXnX12XX"X15，其中氨基酸X!为Arg或Lys，X2为Ala或Thr,X^为Glu或Gln，Xs为Asn、Ser或Asp,Xs为lie或Val，乂7为Tyr、Asp或Lys，Xs为肽键或Tyr，X,为肽键或Asp，X^为肽键或Gly，Xu为肽键或Asn，Xu为肽键或Ser，X"为Asn或Tyr,X"为lie或Leu,X15为Ala、Asn或Ser。CDRU包含氨基酸序列X16XXlsX19LeuX21X22,其中氨基酸X"为Ala、Asp、Val或Arg，X17为Ala或Val,Xu为Asn、Ser或Thr，乂19为Arg、Asn或His,X21为Ala、Glu、Val或Pro,X22为Asp或Ser。CDR"包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X28ProX3。Thr，其中氨基酸X"为Leu或Gln，X"为His或Gin,X"为Phe、Ser或Tyr，X"为Asp、lie或Trp,X"为Gly或Gln，乂28为Asp、Phe或Thr，X3。为Phe、Pro或Tyr。在另一实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含选自CDRH1、CDIU和CDR们中的至少l个CDR。备选地，所述结合蛋白质包含2个CDR，例如CDRm和CDRH2、或CDRm和CDRh3、或CDIW和CDRH3。备选地，所述结合蛋白质包含所有的3个CDR，即，CDRH1、CDRh2和CDRh3。CDRH1包含氨基酸序列XJyrX^X"其中氨基酸X:为Asp、Asn、Ser或Thr，Xs为Phe、Trp或Tyr，X^为lie或Met,X5为Asn、His或Ser。CDRH2包含氨基酸序列XJleXsX9GlyXGlyX13X14X15TyrXX18X19X2。LysX22，其中氨基酸乂6为Lys、Gln或Tyr，Xs为Gly、Ser或Tyr，X9为Pro或Ser，Xu为Asp、Gly或Ser，Xn为Asp或Ser,X"为Ser或Thr,X"为Asn或Tyr,X"为Asn或Pro,Xs为Ala、Asp、Gly或Glu，X"为Asn、Met或Ser，X2。为Phe或Val，X22为Asp或Gly。CDRH3包含氨基酸序列X23X24X25X26X27M29X3DX31X32X33AspTyr,其中氨基酸X"为Arg或Gln，X24为Gly或Leu,X"为Asp、Gly或肽键，Xw为Gly或肽键，X"为肽键或Tyr，义28为Leu、肽键或Tyr，X"为Gly、Arg或Leu，义30为Asp、Gly或Glu,Xu为Tyr、Arg或Asn,X"Ala、Gly或Tyr，X"为Met或Phe。应该理解，所述结合蛋白质包含如上所述的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链或其片段。此外，应该理解，所述结合蛋白质为完整的抗体或其抗原结合片段、或生物合成的抗体位点。在某些实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含(i)CDR"，其具有选自SEQIDNO.8(1A3)、SEQIDNO.28(2F8)、SEQIDNO.38(3B6)、SEQIDNO.58(1D3)和SEQIDNO.68(1F3)的序列,(ii)CDRL2，其具有选自SEQIDNO.9(1A3)、SEQIDNO.29(2F8)、SEQIDNO.39(3B6)、SEQIDNO.59(1D3)和SEQIDNO.69(1F3)的序列，以及(iii)CDRL3，其具有选自SEQIDNO.10(1A3)、SEQIDNO.30(2F8)、SEQIDNO.40(3B6)、SEQIDNO.60(1D3)和SEQIDNO.70(1F3)的序列。可以将CDR序列插入人或人源化的FR之间。在其他实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含选自SEQIDNO.4(1A3)的残基21—127、SEQIDNO.24(2F8)的残基20-131、SEQIDNO.34(3B6)的残基23-129、SEQIDNO.54(1D3)的残基21-127以及SEQIDNO.64(1F3)的残基21-127中的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述结合蛋白质包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含(i)CDRH1,其具有选自SEQIDNO.5(1A3)、SEQIDNO.25(2F8)、SEQIDNO.35(3B6)、SEQIDNO.55(1D3)和SEQIDNO.65(1F3)的序列，(ii)CDRH2，其具有选自SEQIDNO.6(U3)、SEQIDNO.26(2F8)、SEQIDNO.36(3B6)、SEQIDNO.56(1D3)和SEQIDNO.66(1F3)的序列,以及(iii)CDRH3，其具有选自SEQIDNO.7(1A3)、SEQIDNO.27(2F8)、SEQIDNO.37(3B6)、SEQIDNO.57(1D3)和SEQIDNO.67(1F3)的序列。可以将CDR序列插入人或人源化的FR之间。在另一实施方案中，所述的免疫J求蛋白重链可变区包含选自SEQIDNO.2(1A3)的残基20-141、SEQIDNO.22.(2F8)的残基20-137、SEQIDNO.32(3B6)的残基20—139、SEQIDNO.52(1D3)的残基20—141以及SEQIDNO.62(1F3)的残基20-141中的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供一种分离的结合蛋白质，其结合人HGF，并且包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区。所述分离的结合蛋白质与至少1种参照抗体竟争性地结合HGF,其中所述参照抗体选自(i)具有SEQIDNO.24(2F8)的残基20-131的免疫球蛋白轻链可变区和SEQIDNO.22(2F8)的残基20-137的免疫球蛋白重链可变区的抗体，(ii)具有SEQIDNO.34(3B6)的残基23-129的免疫球蛋白轻链可变区和SEQIDNO.32(3B6)的残基20-139的免疫球蛋白重链可变区的抗体，以及(iii)具有SEQIDNO.44(3D11)的残基23-128的免疫球蛋白轻链可变区和SEQIDNO.42(3D11)的残基20-132的免疫球蛋白重链可变区的抗体。在某些条件下，所述结合蛋白质结合与参照抗体之一相同的HGF相表位。应该理解，上文所讨论的每种结合蛋白质都可以是完整的抗体，例如单克隆抗体。备选地，所述结合蛋白质可以为抗体的抗原结合片段，或者可以为生物合成的抗体结合位点。抗体片段包括Fab、Fab'、(FabOs或Fv片段。用于制备这种抗体片段的技术是本领域的技术人员已知的。多种生物合成的抗体结合位点是本领域已知的，其包括，例如单一的Fv或sFv分子，例如美国专利序号5，476，786所述。其他生物合成的抗体结合位点包括双特异性或双功能性的结合蛋白质，例如双特异性或双功能性的抗体，其为结合至少两种不同的抗原的抗体或抗体片段。例如，双特异性结合蛋白质可以结合HGF(例如人HGF)和其他目的抗原。用于制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的，其包括，例如通过融合杂交瘤或通过连接Fab'片段。例如参见Songsivilai等人(1990)CLIN.EXP.IMMUNOL.79:315-325;Kostelny等人(1992)J.IMMUNOL.148:1547-1553。本发明的结合蛋白质可以与包含在561位置处的半胱氨酸被精氨酸取代或者在555位置处的甘氨酸被谷氨酸取代的hHGF结合。在另一方面中，本法提供一种分离的结合蛋白质，其与人HGF结合的kd是4.QxlG5s^或更低、3.Qxl(T5s—i或更低、或者2.0x10—5s_1或更低。所述分离的蛋白质与人HGF结合的L是5.Oxl(T5s—工至0.5xl0一5s—丄、4.OxlO-5s—i至1.Oxl05s—1、或3.0x10—5s—i至1.5xl0—5s1。在另一方面中，本发明提供一种分离的结合蛋白质，其与人HGF结合的K。是100pM或更低、2GpM或更低、1QpM或更低、或者5pM或更低。所述分离的蛋白质与人HGF结合的K。是100pM至5pM、20pM至5pM、15pM至10pM、20pM至10pM、或者15pM至5pM。除非另作说明外，通过实施例6中所述的方法和条件来测定K。值。在另一方面，本法提供一种分离的结合人HGF的结合蛋白质，其中所述的抗体在37。C下与人HGF结合的K。比在"。C下与人HGF结合的L低。所述结合蛋白质任选地在37。C下，以低于5pM的L与人HGF结合。在其他方面和实施方案中，所述结合蛋白质抑制hHGF与c-Met的结合。例如，当采用实施例7(a)中所述的方案进行测定时，所述结合蛋白质的ICs。(最大抑制的50%时的浓度)至少为约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0nM。在某些其他的实施方案中，通过使用实施例7(b)所述的方法，所述结合蛋白质中和引入到4MBr-5细胞(ATCC，CatalogNo.CCL208)中的HGFBrdU。当使用实施例7(b)中所述的方案进行分析时，所述结合蛋白质的ICs。为50nM或更低、优选为45、40、35、30、25、20、15、10、5、1、0.5nM或更低。在某些其他的实施方案中，通过使用实施例9中所述的分析，所述结合蛋白质可用于抑制PC-3细胞(ATCC,Manassus，VACatalogNo.CRL-1435)中HGF刺激的c-Met磷酸化。使用实施例9中所述的分析，所述结合蛋白质以2nM或更低的ICs。(参见表8)来抑制PC-3细胞中HGF刺激(1.25nM)的c-Met磷酸化。II—结合蛋白质的制备可以使用本领域已知的方法以多种方式制备本发明的结合蛋白质。例如，通过使用市售的合成仪器以及本文所提供的序列信息化学合成编码轻链可变区和重链可变区的DM分子。可以将这种合成的DNA分子连接至其他合适的核苷酸序列，例如包括编码序列的恒定区和表达控制序列，从而制备出编码所需结合蛋白质的常规基因表达构建体。制备所定义的基因构建体的方法为本领域的常规技术。备选地，可以使用合成的核酸探针通过常规的杂交技术或PCR技术由杂交瘤中克隆出本文所提供的序列，其中所述核酸探针的序列基于本文所提供的序列信息或者关于杂交瘤细胞中编码小鼠抗体的重链和轻链的基因的现有技术的序列信息。这种探针的制备和使用是本领域的普通技术。可以将编码所需的结合蛋白质的核酸引入(连接)到表达载体中，入到宿主细胞中。示例性的宿主细胞包括，例如大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细月包(例如HepG2)和骨髓瘤细胞，这些细胞都不会另外产生免疫球蛋白。可以在允许宿主细胞表达目的基因(例如表达免疫球蛋白轻链可变区或重链可变区的基因)的条件下培养经转染的宿主细胞。使用本领域已知的技术收获所得的表达产物。具体的表达和纯化条件根据所使用的表达系统而改变。例如，如果在大肠杆菌中表达基因，首先要将该基因克隆到表达载体中。通过将工程改造的基因置于合适的细菌启动子(例如Trp或Tac)和信号序列(例如编码蛋白质A的片段B(FB)的序列)的下游来实现该过程。.4曰iU上士—、丄.1,AAl^A体内累积，并且可以通过弗氏压碎器(Frenchpress)或超声波法在破碎细胞后收获。然后，溶解折射体，并使用已经针对其他重组蛋白质建立的方法重折叠和剪切表达的蛋白质。如果在真核宿主细胞(例如骨髓瘤细胞或CHO细胞)中表达工程基因，首先将该工程基因插入到包含合适的真核启动子、分泌信号、免疫球蛋白增强子和多个内含子的表达载体中。该表达载体任选地包含编码所有恒定区或部分恒定区的序列，从而使整个或部分的重链或轻链被表达。可以使用已经建立的转染方法将所述的基因构建体转染到骨髓瘤细胞或CHO细胞中。这种转染细胞能够表达VL或VH片段、Vl-Vh的异源二聚体、Vf、或VfVH单链多肽、完整的免疫球蛋白重链或轻链、或其部分，其中每一个都可以与包含另一功能(例如细胞毒性)的蛋白质结构域相连。III—结合蛋白质的修饰应该理解，根据所述结合蛋白质的目的用途，可以对该结合蛋白质进行修饰，从而优化其性能。例如，当所述结合蛋白质用作治疗剂时，可以对该结合蛋白质进行修饰，以减少其在目的接受者中的免疫原性。备选地或另外地，可以将所述结合蛋白质与另一蛋白质或肽(例如生长因子、细胞因子或细胞毒素)融合或偶联。可以使用本领域已知的常规的基因操作技术来实现这种修饰。用于减小抗体和抗体片段的抗原性的多种技术是本领域中已知的。这些技术可用于减小或消除本发明的结合蛋白质的抗原性。例如，当将所述结合蛋白质施用至人时，优选地对该结合蛋白质进行改造，以减少其在人体中的抗原性。该过程通常^:称为人源化过程。优选地，人源化的结合蛋白质对抗原的亲和力与其衍生而来的、原始的非人源化的结合蛋白质对抗原的亲和力相同或基本相同。在一个公知的人源化方法中，产生嵌合蛋白质，其中来自一种物种(例如小鼠)的抗体的免疫球蛋白恒定区被得自第二种不同的物种(例如人)的免疫球蛋白恒定区所取代。在该实施例中，所得的抗体为小鼠-人的嵌合体，其中人恒定区序列的免疫原性在原则上比对应的小鼠的序列的免疫原性要小。这种抗体工程学在(例如)Morrison等人(1984)PROC.NAT.ACAD.SCI.81:6851-6855;Neuberger等人(1984)NATURE312:604-608;以及美国专利序号6，893，625(Robinson)、5,500,362(Robinson)和4，816，567(Cabilly)中有所描述。在另一方法(称为CDR移植)中，将目的抗体的轻链可变区CDR和重链可变区的CDR移植到另一种抗体的框架(FR)中。例如，将小鼠CDR移植到人FR序列中。在一些实施方案中，将抗HGF的抗体的轻链和重链可变区的CDR移植到人FR或共有人FR中。为了形成共有人FR，比对来自多个人重链或轻链的氨基酸序列的FR，以确定共有的氨基酸序列。CDR移植在例如美国专利序号7，022，500(Queen)、6,982,321(Winter)、6,180,370(Queen)、6,054,297(Carter)、5，693，762(Queen)、5,859,205(Adair)、5,693,761(Queen)、5,565,332(Hoogenboom)、5,585,089(Queen)、5，530，101(Queen)中；以及Jones等人(1986)NATURE321:522-525;Riechmann等人(1988)NATURE332:323-327;Verhoeyen等人(1988)SCIENCE239:1534-1536;和Winter(1998)FEBSLETT430:92-94中有所描述。在被称为"超级人源化"的方法中，通过移植的另一种形式来产生其中人免疫原性被减小或消除的抗体。在超级人源化中，基于人CDR与待人源化的小鼠抗体的CDR的结构相似度，从一组人种系的基因中选择人FR序列。该方法在，例如美国专利序号6，881，557(Foote)和Tan等人(2002)J.IMMUNOL169:1119-1125中有所描述。其他减小免疫原性的方法包括用于产生人源化抗体的称为为"改开"、"高度嵌合(hyperchimerization)，，或"镶饰(veneering)/重塑(resurfacing)"的技术。例如参见Vaswami等人(1998)ANNALSOFALLERGY,ASTHMA,&IMMUNOL.81:105;Roguska等人(1996)PROT.ENGINEERS895-904;以及美国专利序号6，072，035(Hardman)。在镶饰/重塑方法中，小鼠抗体中接近表面的氨基酸残基被在人抗体中相同位置处更频繁出现的氨基酸残基所取代。这种抗体重塑技术在，例如美国专利序号5,639，641(Pedersen)中有所描述。一种用于将小鼠抗体转化成适于人类医药用途形式的示例性方法被称为ACTIVMABTM技术(Vaccinex公司，Rochester,NY)，该技术涉及在哺乳动物细胞中表达抗体的以痘苗病毒为基础的载体。据称，将产生免疫球蛋白重链和轻链的高水平的组合多样性。例如参见美国专利序号6，706，477(Zauderer)、6，800，442(Zauderer)和6，872，518(Zauderer)。另一种用于将小鼠抗体转化成适于人类使用的形式的示例性方法为由KaloBiosPharmaceuticals公司(PaloAlto，CA)商业化实施的技术。该技术涉及使用专有的人"受体"库来产生用于进行抗体筛选的"表位汇集"库用于将小鼠抗体修饰成适于人类医药用途形式的另一种示例性方法为HUMANENGINEERING(服7"技术，该技术是由X0MA(US)LLC公司商业化实施。例如参见国际申请公开序号WO93/11794以及美国专利序号5,766,886、5,770,196、5，821，123和5,869，619。目的结合蛋白质的人免疫原性。此外，在小鼠中产生完整的人抗体是可能的。在该方法中，使用转基因小鼠制备人抗体，所述转基因小鼠中产生小鼠抗体的基因被产生人抗体的基因的实质性部分所取代。这种小鼠产生了人免疫球蛋白分子而不产生小鼠免疫球蛋白分子。例如参见W0"/24893(Jacobovitz等人)和Mendez等人(1997)NATUREGENETICS15:146-156。可以使用以下方法来产生完整的人抗HGF的单克隆抗体。使用目的抗原(例如HGF)免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。然后，从所述小鼠中获得该小鼠的淋巴细胞，之后将其与骨髓类细胞系融合，从而制备永生化杂交瘤细胞系。筛选并选择该杂交瘤细胞系，从而鉴定出产生HGF特异性抗体的杂交瘤细胞系。根据本发明的结合蛋白质的目的用途，将该结合蛋白质与其他分子缀合。例如，如果所述结合蛋白质用作治疗剂，则随后将该结合蛋白质与另一试剂(例如介导或另外促进治疗的效应器分子)缀合。就所述的效应器为非基于蛋白质的试剂(例如小分子药物、放射性标签或放射性毒素)的情况，那么可以使用标准的体内偶联化学法将该试剂与所述结合蛋白质化学偶联。另一方面，如果所述的效应器分子为蛋白质或肽(例如酶、受体、毒素、生长因子、细胞因子或其他免疫调节剂)，那么可以使用体内偶联化学法使所述结合蛋白质与效应器化学偶联，或者可以使所述结合蛋白质与效应器偶联形成融合蛋白质。可以使用与部分II中讨论的方法相似的技术来构建和表达融合蛋白质。IV—结合蛋白质的用途本文所述结合蛋白质可以用作诊断剂或治疗剂。(1)治疗应用由于本发明的结合蛋白质中和HGF的活性，所以其可以用于多种治疗应用中。例如，本发明的某些结合蛋白质可用于预防或治疗高增殖疾病或紊乱(例如多种形式的癌症)。可以使用所述结合蛋白质来抑制或减少肿瘤细胞的增殖。在该方法中，将所述的肺瘤细胞暴露于治疗有效量的结合蛋白质中，从而抑制或减少肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中，所述结合蛋白质抑制肿瘤细胞增殖至少为50%、60°/。、70°/。、80%、90%、95%或100%。在某些实施方案中，所述结合蛋白质用于抑制或减少肿瘤细胞的增殖，其中所述结合蛋白质降低了hHGF与c-Met的结合能力。在其他实施方案中，即使在所述结合蛋白质结合hHGF但没有实质性地抑制hHGF与c-Met的结合时，所述结合蛋白质用于抑制或减少肿瘤细胞的增殖，如表5和6中的抗体3B6所示。此外，所迷结合蛋白质可用于抑制或减慢哺乳动物中肿瘤的生长或发展。在该方法中，向哺乳动物施用有效量的所述结合蛋白质，从而抑制或减慢哺乳动物中肿瘤的生长。因此，所述结合蛋白质可用于治疗，例如哺乳动物中的肿瘤。所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的所述结合蛋白质。所述结合蛋白质可以单独施用或者与另一种药物活性分子组合施用，以便治疗肿瘤。包括本发明的结合蛋白质可用于治疗多种HGF应答紊乱，包括例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、肝癌、胃癌、食道癌、肾癌、鼻咽癌、胰腺癌、间皮瘤、黑素瘤和成胶质细胞瘤中的HGF应答肿瘤细胞。如本文所用，"治疗"、"疗法"和"治疗处理"是指对治疗哺乳动物(特别是人)中疾病状态的的治疗处理，包括(a)预防疾病状态在哺乳动物中发生，特别是在该哺乳动物倾向于发生疾病状态但是还没有被诊断出具有该疾病状态时；(b)抑制疾病状态，即，停止疾病状态的发展；和/或(c)减轻疾病状态，即，使疾病状态消退。总体而言，活性成分的治疗有效量的范围是约0.lmg/kg至约100mg/kg,任选地是约1mg/kg至约100mg/kg,任选地是约1mg/kg至10mg/kg。施用量取决于多种因素，例如待治疗的疾病或适应症的类型和程度、具体患者的总体健康状态、所递送的结合蛋白质的相对生物学效力、结合蛋白质的剂型、剂型中赋形剂的存在和种类、以及施用途径。为了快速达到所需的血液水平或组织水平，将初始施用剂量提高到最高水平的范围以外，或者使初始施用剂量低于最佳剂量并在治疗过程中根据具体的状况使每日施用剂量逐渐增加。例如在经设计由0.5mg/kg至20mg/kg范围的常规的I期剂量递增研究中，优化人的剂量。用药频率根据诸如施用途径、剂量和在治疗的疾病状态的因素而变化。示例性的用药频率为每天1次、每周1次和每2周1次。优选的施用途径为肠胃外施用，例如静脉内输注。基于单克隆抗体的药物的配制是本领域的普通技术。在本发明的一些实施方案中，将所述结合蛋白质(例如单克隆抗体)冻干，并在施用时，将其在緩沖盐水中重构。所述结合蛋白质可以单独施用，或者与其他的药物活性组分组合施用。所述的其他活性组分(例如免疫调节剂)可以与所述结合蛋白质一起施用，或者可以在所述结合蛋白质之前或之后施用。包含治疗用途的结合蛋白质的制剂通常含有与可药用的载体组合的结合蛋白质。如本文使用的，"可药用的载体"是指緩冲剂、载体和赋形剂，在可靠的医学判断(soundmedicaljudgment)范围内，所述的緩冲剂、载体和赋形剂适用于与人和动物组织相接触而没有过多的毒性、刺激、变态反应或者其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称。从与制剂中其他组分相容的意义上说，所述的载体应该是"可接受的"，并且对接受者是无害的。就这一点而言，可药用的载体旨在包括任何及所有的与药物施用方式相兼容的緩沖剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的这些介质和试剂的使用是本领域已知的。所述的制剂可以方便地以剂量单位的形式存在，并且可以通过任何合适的方法(包括药剂学领域中已知的任何方法)制备。应该将本发明的药物组合物制成与其计划的施用途径相兼容。施用途径的实例包括肠胃外施用或非肠胃外施用，例如静脉内施用、皮内施用、吸入施用、透皮施用(局部)、透粘膜施用和直肠施用。可以通过药学领i或中已^口的寸壬叶可方、法(侈'J:i口在Remington'sPharmaceuticalSciences:18thed.(MackPublishingCompany,1990)中所述的方法)制备用于口腔施用或肠胃外施用的溶液。适用于口腔施用的制剂为以下形式分离的单位，例如注射剂、胶嚢、明胶胶嚢、袋装(sachet)、片剂、药片或锭剂，每一种分离的单位中都含有预定量的结合蛋白质；粉末或颗粒组合物；在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；水包油的乳液或油包水的乳液。适用于肠胃外施用的制剂包括，例如以下成分无菌稀释液，例如用于注射的水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂；抗菌剂，例如苯曱醇或羟苯曱酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚石克酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；緩冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可以使用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)来调节pH。肠胃外施用的制备物可以被封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量的小瓶中。大体上，适用于注射用途的组合物包括水性溶液(在可溶于水的情况下)或分散液、以及用于即时制备无菌注射溶液或分散液的粉末。对于静脉内施用而言，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐緩沖液(PBS)。其在生产和储存的条件下应该是稳定的，并且应该;故保存起来以防止诸如细菌和真菌之类的微生物的污染。所述的载体可以是含有，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、以及它们的合适的混合物的溶剂或分散介质。药物制剂优选为无菌的。例如通过无菌过滤膜的过滤进行灭菌。在冻干所述组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后进行^吏用了上述方法的灭菌。一旦配制成药物组合物，其就可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或者脱水或冻干的粉末的形式储存在，例如小瓶中。(2)诊断性应用无论何时将所述结合蛋白用于体外或体内的诊断，通常用可检测的部分直接标记或间接标记该结合蛋白质。可检测的部分是能够直接或间接产生可检测的信号的任何部分。例如，可检测的部分可以为放射性同位素，如3氢(3H)、14碳(14C)、32磷(32P)、35硫(35S)或125碘(1251);荧光化合物或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素；酶，如碱性磷酸酶、p半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶；自旋探针，如自S走标记；或有色颗粒，如乳胶或金颗粒。应该理解，4吏用本领域中已知的多种方法(例如，在Hunter等人(1962)NATURE144:945;David等人(1974)BIOCHEMISTRY13:1014;Pain等人(1981)J.IMMUNOL.METH.40:219;以及Nygren(1982)J.HIST0CHEM.ANDCYT0CHEM.30:407中所述的方法)将结合蛋白质与可检测的部分缀合。通过例如目测或者通过分光光度计或其他检测仪来检测所述的标记。示例性的免疫分析法包括，例如夹心免疫分析法、竟争性免疫分析法、免疫组4t方法。在夹心免疫分析法中，使用了两种与分析物或目的抗原结合的抗体，例如，其中一种抗体被固定到固体支持物上，而另一种抗体游离在溶液中并用可检测的部分标记。当将含有抗原的样品引入到该体系中时，该抗原既与固定化的抗体结合又与标记的抗体结合，从而在支持物的表面上形成了"夹心，，免疫复合物。通过洗去未结合的样品成分和多余的标记抗体来检测复合的蛋白质，并测定支持物表面上的蛋白质复合的标记抗体的量。备选地，通过用与游离抗体结合的可检测部分标记的第三抗体来检测游离于溶液中的抗体。免疫学分析的设计、理论和方案的详细综述可以在许多文章中找到，包括Butt等人(1984)PRACTICALIMMUNOLOGY,MarcelDekker，NewYork;Harlow等人，编辑(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYAPPROACH,ColdSpringHarborLaboratory;以及Diamandis等人，编辑(1996)IMMUNOASSAY,AcademicPress,Boston。本发明包括标记的结合蛋白质可以用作体内的显像剂，因此，结合蛋白质将显像剂靶向接受者体内的目的特定组织。用于体内显像的优选的远距离可检测部分包括反射性原子锝—99ra(99mTc),其为一种半衰期为约6小时的y发射体。还可以在体内显像中使用的非放射性部分包括硝基氧自旋标记、以及镧系元素和过渡金属离子，所有这些物质都能够诱导原位质子弛豫。除了免疫显像外，可以在标准的放射免疫治疗方法中使用复合的放射性部分，从而破坏靶细胞。用于高剂量放射免疫治疗的优选的核普酸包括放射性原子"钇(,t)、131碘(1311)或"!铟(mIn)。可以使用显像领域中已知的偶联技术，用mI、mIn和99mTc来标记结合蛋白质。类似的，用于制备和施用显像剂以及捕荻和处理图像的方法在显像领域中是已知的，因此在本文中不再详述。类似的，用于进行基于抗体的免疫治疗的方法在本领域中是已知的。例如参见美国专利序号5，534，254。在整个说明书中，当将组合物描述成具有、包含或含有具体成分时，包括组合物也基本由所述的成分组成或由所述的成分组成。类似的，当将方法描述成具有、包括或包含具体的处理步骤时，该方法也基本由所述的处理步骤组成或由所述的处理步骤组成。除非另作说明，否则步骤的次序或用于进行某些操作的次序是不重要的，只要本发明可操作的即可。此外，除非另作说明，否则可以同时实施两个或多个步骤或操作。实施例以下实施例讨论了多种抗hHGF单克隆抗体的制备和特性。实施例l一抗hHGF的单克隆抗体的制备本实施例描述了一定量抗hHGF的单克隆抗体的制备。根据多位点重复免疫(RIMMS)方法，由MBS公司(Portland,ME)进行免疫、融合和初筛。使用重组人HGF(R&DSystems,Minneapolis,MN;CatalogNo.294-HGN-025)免疫5只AJ小鼠和5只Balb/c小鼠。选择在酶联免疫吸附检测(ELISA)中其血清显示出最高抗HGF活性的2只小鼠用于随后的融合。收集来自适合小鼠的脾和淋巴结。然后收集B细胞，并使其与骨髓瘤细胞系融合。在一个或多个平板上对融合产物进行系列稀释，直至接近成克隆性。通过ELISA，就结合hHGF对来自所得的融合物的上清液进行筛选。被鉴定为包含针对HGF的抗体的上清液，通过如以下实施例所述的体内功能测试进一步表征。选择一组杂交瘤，并对该杂交瘤亚克隆并扩增。然后，通过在标准条件下，在ProteinA/G树脂上的亲和层析纯化单克隆抗体。实施例2—抗hHGF的单克隆抗体的序列分析本实施例描述了实施例1中制备的抗MGF的单克隆抗体的同种型和序列分析。a.HGF的鼠单克隆抗体同种型的测定4吏用IsoStripMouseMonoclonalAntibodyIsotyping试齐寸盒(RocheAppliedScience)，根据制造商提供的说明书测定每种单克隆抗体的轻链种类和重链的同种型。蛋白重链。b.编码免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列的测使用RNeasyMiniprep试剂盒(QiagenVenlo，TheNetherlands)，根据制造商提供的说明书从每种单克隆杂交瘤细胞系中提取总RNA。使用BDSMARTRACEcDNAAmplification试剂盒(Clontech)，根据制造商提供的说明书，使用寡核苷酸引物BDSMARTIIA(5'aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg3')(SEQIDNO.85)和5'-RACECDS引物(5'tttttttUttttttUUttttttvn3、其中v=a、g或c而n-a、g、c或t)(SEQIDNO.86)生成全长的第一链cDNA，以进行5'RACE(cDNA末端快速扩增)。使用ExpandHigh-FidelityPCRSystem(RocheAppliedScience),根据制造商提供的说明书通过PCR(聚合酶链式反应)来扩增免疫球蛋白Kappa链的可变区和重链(IgGl)的可变区。使用5'寡核苦酸引物混合物UniversalPrimerMixA(5'87)与ctaatacgactcactatagggc3'(SEQIDNO.88)的混合物)以及3'IgGl恒定区的特定引物(5'tatgcaaggcttacaaccaca(SEQIDNO.89)或5'gccagtggatagacagatgggggtgtcg(SEQIDNO.90))扩增重链可变区。4吏用5'寡核苷酸引物混合物UniversalPrimerMixA和3'Kappa恒定区特定引物(5,ctcattcctgttgaagctcttgacaat3,(SEQIDNO.91)或5'cgactgaggcacctccagatgtt3'(SEQIDNO.92))扩增Kappa链的可变区。通过琼脂糖凝胶电泳分离单独PCR产物，并使用QiaquickGelPurification试剂盒(Qiagen)，根据制造商提供的说明书进行纯化。随后使用基于拓朴异构酶的克隆试剂盒TOPOTACloning试剂盒(具有pCR2.l-T0P0⑧载体)(Invitrogen，Carlsbad,CA)，根据制造商提供的说明书将PCR产物克隆到pCR2.1T0P0质粒中，并使用标准的转化技术，将所得质粒转化到DH5细菌中。由AgencourtBioscience公司使用标准的双脱氧DNA测序方法，使用T7(5'TAATACGACTCACTATAGGG30(SEQIDNO.93)、M13正向引物(5'GTAAAACGACGGCCAGT30(SEQIDNO.94)和Ml3反向引物(5'CAGGAAACAGCTATGACC30(SEQIDNO.95)对由转化的细菌克隆中分离的质粒DNA进行测序，从而鉴定可变区序列的顺序。利用VectorNTI软件(Invitrogen，Carlsbad,CA)和IMGT/V-Quest网络服务器(http:〃imgt.cines.fr/textes/vquest)对所得序歹'J进行分析，从而鉴定和验证可变区的序列。c.编码1A3、1D3、1F3和2B8的Kappa以及IgGl链的免疫球蛋白重链和轻链恒定区序列的核苷酸序列的测定使用正向引物5'ttcc(划线部分为起始密码子)(SEQIDNO.96)和反向引物5'(划线部分为终止密码子)(SEQIDNO.97),从上述制备的cDNA中PCR扩增1A3、1D3和1F3的IgGl链的全长的cDNA。使用正向引物5'ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctgccacc^gggatggagctatatcatcctcttt(划线部分为起始密码子)(SEQIDNO.98)和反向引物5'ggggaccactttgtacaagaaagctgggt^￡^tttaccaggagagtgggagag3,(戈1线部分为终止密码子)(SEQIDNO.99)，从上述制备的cDNA中扩增2B8的IgGl链的全长cDNA。使用正向引物5'ata3'(划线部分为起始密码子)(SEQIDNO.IOO)和反向引物5'ggggaccactttgtacaagaaagctgggt^^acactCEittcctgttggLagctc37(划线部分为终止密码子)(SEQIDNO.101)扩增2B8的Kappa链的全长的cDNA。通过GatewayBP重组反应(Invitrogen，Carlsbad,CA)，将PCR片段亚克隆到pD0NR221(Invitrogen，Carlsbad,CA)中，并的质粒进行测序，从而鉴定恒定区的序列，并进一步验证可变区的序列。d.序列分析利用IMGT/V-QUEST网络服务器软件(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)鉴定可变区(正常文本)。根据确认位于测定的可变区的上游的阅读框中的起始密码子(ATG)来预测信号肽序列。鉴定信号肽序列并在其下标记下划线。每个可变区的最后一个核苷酸为由可变区/恒定区连接体所产生的下一个密码子的第一个碱基。该核苷酸包含在可变区内，这是因为其为外显子的一部分。以下所列的恒定区的氨基酸序列包含该连接体密码子的翻译产物。为了产生完整的重链或kappa链抗体序列，以下标注的可变区序列与其各自的恒定区序列结合(信号序列带有下划线)。(1)1A3重链可变区(SEQIDNO.1)1atgaacfflggg;ctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgaa61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtccctg纖ctctcc121tgtgcagcctctgaattcactttcagtaactattacatgtcttgggttcgccagactcca181gagaagaggctgcagtgggtcgcatacattagtcctggtggtggtagctcctactatcca241gccagtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctg301caaatgagcagtctgaagtctg鄉acacagccatgtattactgtgcaag織aggggat361ggttactacggggactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc421tcag(2)1A3Kappa轻链可变区(SEQIDNO.3)1atga她tgcccactcaggtcctggggttgctgctectetgpctt織gatgccagatgt61gacatccagatgactcagtctccagcctccctatctgtttctgtgggagaaactgtcacc121atcacatgtcgagcaagtgagaatatttatagtaatttagcatggtatcagcagaaacag181ggaaaatctoctcagctcctggtctatgctgcaacaaacttagcagatggtgtgccatca241aggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttccctcaagatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggacttattactgtcaacatttttggggtactccgtacacgttcggaggg361gggaccaagctggaaataaaac(3)2B8重链可变区(SEQIDNO.11)1atgggatggagctatatcatcctctttttggtapcaacagctacagatgtccactcccag61gtocaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctgggacttcagtgaagctgtcc121tgcaaggcttctggctacaccttcaccacctactggatgcactgggtgaatcagaggcct181ggacaaggccttgagtggattggagagattaatoctaccaacggtcatactaactacaat241gagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatg301caactcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagaaactatgtt361ggtagcatctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcag(4)2B8Kappa轻链可变区(SEQIDNO.13)1atggaatcacagactotggtcttcatatccatactgctctggttatatggtgctgatggg61aacattgtaatgacccaatctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcacc121ttgagctgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtatcaacagaaacca181gcgcagtctcctaaactgctgatatacggggcatccaaccggaacactggggtccccgat241cgcttcacaggcagtggatctgcaacagatttcactctgaccatcagcagt魄cgggct301gaagaccttgcagattatcactgtgggcagagttacaactatccgtacacgttcggaggg361gggaccaggctggaaataaaac(5)2F8重链可变区(SEQIDNO.21)1'atggaatggagctgggtctttctcttcctoctgtcagtaactgcaggtgtccactgccag61gtccagctgaagciagtctggagctgagctggtgaggcctgggacttcagtgaagatgtcc21tgcaaggcttctggctacaccttcactacctactatataeactgggtgaatcagaggcct181ggacagggccttgagtggattggaaagattggtcctggaagtggtagtacttactacaat241gagatgttoaaagacaaggccacattgactgtagacacatcctccagcacagcctacatg301cagctcagcagcctgacatctgacgactctgcggtctatttctgtgcaagaaggggactg361ggacgtggctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcag(6)2F8Kappa轻链可变区(SEQIDNO.23)1latggagacagacacaatccte:ctatgggtgctgctgctctgggttccaggctccactggt61gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc121atctoctgcaaggccagccaaagtgttgattatgatggtaatagttatatcaactggtac181caacagaaaccaggacagccacccaaagtcctcatctatgttgcatccaatctagaatct241gggatcccagccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttoaccctcaacatccat301cctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcaaagtattgaggatcctccc361acgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaac(7)3B6重链可变区(SEQIDNO.31)1atggaatggce廿^atctttctcttcctoctetcaetaactgaaggtgtQg^g￡cag61gttcagctgcagcagtctggggctgaactggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcc121tgcaaggcttctggctatgtattcagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcct181ggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatagtaactacaat241ggaaacttcaagggtaaagccacactgactgcagaeaaatcctccagtacagcctacatg301cagctcagcagcctaacatctgaggaetctgcggtctatttctgtgcatcccagctcggg361ctacgtgagaactactttgactactggggct;aaggcaccactctcacagtctectcag(8)3B6Kappa轻链可变区(2个可能的ATG起始密码子(大写字母表示))(SEQIDNO.33)1ATGgacATjGaggacccctgctcagtttcttggaatcttgttp;ctctggtttccaggtatc613aatgtgacatcaagatgacccagtctccatcttccatgtatgcatctctaggagagaga121gtcacaatcacttgcaaggcgagtcaggacattaaaagctatttaagctggttccagcag181aaaccagggaaatctcctaagaccctgatctatcgtgtaaacagattggtagatggggtc241ccatcaaggttcagtggcagtggatctgggcaagattcttctctcaccatcaccagcctg301gagaatgaagatatgggaatttattattgtctacagtatgatgagtttccgttcacgttc361ggaggggggaccaagctggaaataaagc(9)3D11重链可变区(SEQIDNO.41)1atggctgtcccggtgctgttcctctgcctggttgcatttccaagctgtgtcctgtcccag61gtacagctgaaggagtcaggacctggcctggtggc'gccctcacagagcctgtceatcact121tgcactgtctctgggttttcaWaaccagctatagtttacactgggttcgccagcctcca181ggaaagggtotggaatggctgggagtaatatgggctggtggaaacacaaattataattcg241tctctcatgtccagactgaccatcaggaaagacaactccaagagccaagttttcttaaaa301atgaacagtctgcaaactgatgacacagccatgtactactgtgccagagagaggtttgct3'61tactggggccaagggactctggtcactgtctctgcag(10)3D11Kappa轻链可变区(SEQIDNO.43)1atggattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcapgcctcagtcaaaatatcc61卿卿caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatatccaggggagaag121gtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgcactggtaccagcagaag181tcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccct241gctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactccctcacaatcagtagtatggag301gctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccactcacgttcggt361gctgggaccaagctggagctgaaac(11)1D3重链可变区(SEQIDNO.51)1atgaacfflgggctcagattgattttccttgtacttettttaaaaggtgtgaagtgtgaa61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcc121tgtgcagcctctggattcactttcagtgactattacatgtcttgggttogccagactcca181gagaagaggctggagtgggtcgcatacattagtagtggtggtggtagcacctactatcca241gacagtgtgaagggtcgattcaccatctcccgagacaatgccaagaacaccctgtacctg301c認tgagcagtctgaagtetgaggacacagccatatattactgtgtgagacaaggggat361ggttattacggggactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcatcgtctcc421tcag(12)1D3Kappa轻链可变区(SEQIDNO.53)1atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgctgctgctgtggcttacagatgtcagatgl;61gacatccagatgactcagtctccagcctecctatctgtatctgtgggagaaactgtcacc121atcacatgtcgaacaagtgagaatatttacagtaatttagcgtggtatcagcagaaacag18]ggaaaatctcctcagctcctaatctatgctgcaacaaacttagcagatggtgtgccatca241aggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttccctcaggatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggaggtattactgtcaacatttttgggggactccgtacacgttcggaggg361gggaccaaactggaaataaaac(13)1F3重链可变区(SEQIDNO.61)1atgaactttgggctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgag61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagtctggagggtccctgaaactctcc121tgtgcggcctctggattcactttcagtaactattt.catgtcttgggttcgccagactcca181gagaagaggctggagtgggtcgcatatattagtagtggtggtggtagcacctactatcca241gacagtgtgaagggtcgattcaccatctctagagacaatgccaagaacaccctgtacctg301caaatgagcagtctgaagtctgaggacaeagccatgtattactgtgtaagacaaggggat36]ggttactaeggggactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc421tcag(14)1F3Kappa轻链可变区(SEQIDNO.63)1atgagtgtgcccactcaggtcctegggttgctgctgctgtggcttacagatgccagatgt61gacatccagatgactcagtctccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcaec121atcacatgtcgagcaagtgagaatatttacagtaatttagcatggtatcagcagaaacag181ggaaaatctcctcagctcctggtctatgatgcaacacacttaccagatggtgtgccatca241aggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttccctcaagatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggagttattaictgtcaacatttttggggtactccgtacacgtttggaggg361gggaccagactggaaattaaac(15)3A12重链可变区(SEQIDNO.71)1atgaactttgggctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgaa61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaaatctcc121tgtgcagcctctggatttactttcagtaactatttcatgtcttgggttcgccagactcca181gagaagaggctggagtgggtcgcatacattagtagtggtggtggtagcacctactatcca241gacagtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctg30〗caaatgaacagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgtaagacaaggagat361ggttactatggggactatgct辨gactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc、42tcag(16)3A12Kappa轻链可变区(SEQIDNO.73):iatgagtgtgcccactcaggtcctg,ttgctgctgctgtggctt鄉gatgccagatgt61gacatccagatgactcagtcgccagcctccctatetgtatctgtgggagaaactgtcacc121atcacatgtcgagcaagtgagaatatttacattaatttagcatggtatcagcagaaacag181ggaaaatctcctcagctcctggtccatgctgeaacaaagttagcagatggtgtgccatea241aggttcagtggcagtggatcaggcacacagtattccctcaagatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggagttattactgtcaacat加ggggtactccgtacacgttcggaggg361gggaccaaactagaaataaaac(17)参照小鼠IgGl重链恒定区(J00453)(SEQIDNO.81)1ccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaact61ccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacct12〗ggaactctggatccctgtocagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctggagtctgacc181tctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagccctcggcccagcgagaccgtca241cctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccaggg301attgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatc:ttcc361ccccaaagcccaaggatgtg加accattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtgg421tagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggagg481tgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtca541gtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtca601acagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatotccaaaaccaaaggcagaccga661aggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtca721gtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtgga781atgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatgaacacgaatggctctt841acttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttca901cctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccact961ctcctggtaaatga(18)1A3、1D3、1F3和2B8的测定的小鼠IgGl重链恒定区(衍生自AJ系小鼠)(SEQIDNO.82)1ccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatotgctgcccaaactaact61ccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacct121ggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagc"tgtcctgcagtctgacc81tctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtca241cctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccaggg301attgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatottcc361ccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtgg421tagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggagg481tgcacacagctcagacgcaaccccggg鄉agcagttcaacagcactttccgctcagtca541gtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtca6013cagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccga661aggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtca721gtctgacctgcatgataacagacttettccctgaagacattactgtggagtggcagtgga781atgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctctt841acttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttca901cctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccact961ctcctggtaaatga(19)参照小鼠Kappa轻链恒定区(V00807)以及1D3、1F3和2B8的测定的小鼠Kappa轻链恒定区(衍生自AJ系小鼠)(SEQIDNO.83)1gggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctg61gaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagt121ggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggaca181gcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaac24〗gacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaaga301gcttcaacaggaatgagtgttag(20)与1D3、1F3和2B8的情况相比含有1个改变的核苷酸(用下划线表示)的，1A3的测定的小鼠Kappa轻链恒定区(SEQIDNO.84)1gggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctg61gaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagt121'ggaagattgatggeagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggaca181gcaaagacageacctacagcatgagcagcaccctea|gttgaceaaggaegagtatgaac241gacataacagctatacctgtgaggccactc,acaagacatcaacttcacccattgtcaaga301gcttcaacaggaatgagtgttag限定实施例1所制备的抗体的免疫球蛋白重链可变区的每个氨基酸序列都列于图2中。每个序列都与其他序列比对，并且在方框中确定了限定信号肽、CDRi、CDR2和CDR3的序列。图3显示了每个抗体的、单独的CDl、CDR2和CDR3的比对。限定了实施例1所制备的每个抗体的免疫球蛋白轻链可变区的每个氨基酸序列都列于图4中。每个序列都与其他序列比对，并且在方框中确定了限定信号肽、CDl、CDR2和CDR3的序列。图5现实了用于每个抗体的、单独的CDRi、CDl和CDRs的排列。为了方便，表1提供了本实施例中所讨论的抗体序列与序列表中列出的那些序列之间的对应关系的索引表。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>此外，为了方便，以下序列代表了本实施例所述的每个抗体的实际的或者预计的全长重链序列和轻链序列(即，包含可变区序列和恒定区序列二者)。注意，小鼠抗体2F8、3A12、3B6和3D11的恒定区没有测序，但是假定它们包含与1D3、1F3和2B8抗体(其经过测序)相同的恒定区序列，这是因为它们都衍生自AJ系小鼠。但是，应该理解，本文所述的可变区序列可以与本领域技术人员已知的多个其他恒定区序列中的每一个序列连接，从而产生有活性的全长免疫球蛋白重链和轻链。(1)编码全长1A3重链庠列(1A3重链可变区和IgGl恒定区)的核遞序列(下划线的为信号戽列)(SEOIDNO.122)1611211812413013614s:x541601"工72178184196110211141120113211381atgaactttgggctcagatt:gattttcctt:gtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgaag仁gcagctgggagaagaggcg仁cacctgcaagggattgtggtcaaca_gtggtcagtctgatggaatgggctcttacttcgttcacctgcttggagtctggtgcagtgggtgtctg站gtctgaccctgggctggatccctgttgtsagccttcccatcatcagctttccccctgcatgatctgtgttacacgcaJ:acattatctgtctatatgcctggtcctcagtgactttgcatatgtgc3accccgggcaccaggacaacagacttctgagggcctgagtcctggtgtggggtc站grg仁ccagttcatggctcaatgcctcccaaggttccctgaaga_a_csLCtca_gcgagggtccctgtggtagctccc站ga^ac:acctgga_tctgcgc3cctggcctggscaagaagctggtttgtgc貼ggagtttctcca^aacccatcatggagaaactctccct3ctatccacctgtacctgtgcccaaactagtga_cagtgtgtcttcatccacgtgtgtttttccgctcsgagcctctcc^i^LJ^X^长1A3重链序列(1A3,链可变区^j^jg^j^Jjg^lAi'J(没有信号序列)(SEOIDNO.123)1evglvesggg181sdlytlsssv241ifppkpkdvl301svselpimhg421tftcsvlheglvqpggsiJcls:rdna"kntlytvpsstwpsetitltpkvtcdwlngr)cefkcffpeditvewtnsmvtlgclrvnsaafpapshspgkvkgyfpepvtsstJcvdkkivevgfswfvddiektis红kgJai仁qpimdtdpeta:lqwvaydgyygdyamdp:rdcgckpcirpkapqvytigsyfvysklnispgggssyyywgggtsvtvctvpevssvf_01_^竭全长1A3轻链序列(1A3Kappa可变区和恒定区)的核^^liiXM^iMiLiigi(SEQIDNO.124)1atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgctgctgctgtgrgcttacagatgccagatg七61gacatcca_ga12:latcacatgtc181ggaaaatctc241aggttcagtg301gaagattttg361g"ggaccaagc481ccc貼agaca541aacagttgga601ttgaccaagg661tcsacttcscgcagtggatctgg貼at貼actgatcaggatccsgcctccgtggaagattgagcttcaacttttccctcatcagtcgtgtgatggcagtgagctatacctctgtgggagacatggtatcatagcsgatggctgtatccatgcttcttg貼gcatgagcaggttcggra的gcttcccaccatggcgtcctg(4)限定了全长1A3轻链序列(1A3Kappa可变区和恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEOIDNO.125)1diqmtqspaslsvsvgetvtitcraseniysnlawygqkcjgkspgllvyaatnladgvps61rfsgsgsgtgfslkirjslqsedfgtyycqhfwgtpytfgggtkleiloradaaptvsifpp121ssegltsggaswcflxmfypkdimrkwkidgsergngvlnswtdc3dskdstysmsstlm181ltlccieyerhnsytceathktstspivksfnrnec(5)编码全长2B8重链序列(2B8重链可变区和IgGl恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEOIDNO.126)16工1211812413013S14214815416016617217819ca102110811工41120113211381atgggatggagctatatcatcctctttttggt:agcaacagctacagatgt:ccactcccaggtcc貼ctgcgg匕agrcatctgttgcccacccccaaggatgagcaaggatgcccatcatgcgetttccctggtgttacatgageagectggttgagtggstgcctgaca_tc匕tgactact:g"ctgtctatccccagcggtgtcagtgactgtatcccgaggtcccccatcg"3cagacttctttcaatgtgcaagggectgeaggct:gaax:tgtggagagatttgaggactctgggecaaggegggctatttcgcacaccttccccctccagctactctgactccagttcagcggag"cagttcgctcaatggctcccaaggaggtgaa^gcctgaatcctaccaggatctgctgccagctgtccacctggcccaeittactgtggaeggtcataecctccagcacactgtgcaagtgcagtctgagcgagaccgtcgtgtgttgtaatgcagggtagga仁aaag仁agtggcagtggaagctgtccaaactatg仁仁ctccatggtgcctctacactcacctgcaac的attgtggtcaacagtgeacagtctgaccgaatgggcegttacttcgtcc&cctgctctctctcctggt(6)限定了全长2B8重链序列(2B8重链可变区和IgGl恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEOIDNO.127)1qyglqqpgaeLvkpgtsvOcl61nekfkskatltvdkssstay121ttppsvyplapgsaagtnsm181tlsssvtvpsstwpsetvtc241kpkdvltitltpkvtcvwdmqlssltsedvtlgclvkgyiskddpevgftywmhwvng:rsavyycarnyvdkkivprdcswfvddvevhvgsifdywgqsgslssgvhtgckpcictvpinptnghtnyfpavlqscUyevssvfifpp301lpimhgdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktJcgrpkapqvytipppkeqmakdkvsl361tcmitdffped化vewqvmgqpaexiykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftc421svlheglluihhtekslshspgk(7)编码全长2B8轻链序列(2B8Kappa轻链可变区和恒定区)的核酸序列(下划线的为信号岸列)(SEOIDNO.128)1atggaatcacagactctggtcttcatatccatactgctctggt:tatatggtgctgatggg61asca^ttigtaa121ttgagctgca181gcgcagtctc241cgcttcacag301gaagaccttg361gggrsccsggc481ccc犯agaca541aacsgttg"ga601ttgaccaagg661tca&cttcactg3ccc站t;cctaaactgctgcagtggatccagattatcactga_tcaggag站tgtggt七gatatacgrggctgtgggcagacggrgrctgatg仁gg貼gatttdttatgtatgcatccaacc仁tcactctgagctgcax:caatcagtcgtgtgatggcagtgagcacctacaagctatacct3ggaatgagtcctggtatca3tccgtaiC3cctgtatccsitgcttcttg5Lagcatgagcetggagggtcaccggtccccgattgtgcgggctgttcggaggg质序列(没有信号序列)(SE0IDNO.129)1nivmtqspksmsrasvgervtlsckasenwsyvswyq咖agspklliygasnmtgvpd61rftgsgsatdftltissvxaedladyhcgqsynypytfgggtrleikradaaptvsifpp121ssegltsggaswcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstlt181ltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(9)编码全长2F8重链序列(2F8重链可变区和IgGl恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEOIDNO.130)161121tgc3aggctt，n1上O丄241301361ggacgtggct421481541ggaxccctgt601"1gttgcccacc721781841901gctcaga_cgc，Sl1021gctttccc匕gr1081U41tgca仁gataa1201ccagcggaga1261tacagcaagc1321g七gtta^catgH38:igctgggtc匕ttctcttcctcctgteagtaactgcgigrgtgtccactgccaggcc仁gacatcgcctggtcaac^gtgactgtcggccagcagtgctcaccatcccccatcgaccattccacctggaaagat七cacatfcgactgggccaaggcactggcccctgggctatttcgc3caccttccccctccagcc&ccaaggtgtsctctgactccagttcagcgctcaatggcgaaaa^cc￡itcgtgaggcctgggtcctggetagcgrgtctattaccactctcaggatctgctggtatcatctgtggtt仁gtagcctccagcactctgtgca这gcagtctcctctgcsgtctgacgtgtgttgtactacaagaacactcagccctcaatgtgcagaagagcaacaggg"cctgcacaaccaccatatcatggacacagatggctctgggaggcaggaaatactttactgagaagagcctctcccaagcctacatgcctcta_cactcscctgcaacggattgtggtc抑cagtgcattacttcgtccacctgctctctctcctggt61(10)限定了全长2F8重链序列(2F8重链可变区和IgGl恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEOIDNO.131)1qyql!kgsgae61netnfkdkatl121ttppsvypla181tlsssvtvps241kpkdvltitl301lpimhqdwln361仁cmitdffpe421svlheglhnhtvdtssstays仁wpsetvtc仁p3ortcwvdgkefkcrviisditvewqwngmglssltscidaafpapiekttyyihwvng:rsavyfcaa:rgisktkgrp)capim(3tdgsyfpgqglewigklgrgfdywgqsgslssgp/htgckpcictvptaqtqp:reegpgvytippp)cvysklnvgksigpgsg曰tyygttitvssakfpavlqsdlyevssvfifppfnstf;rsvsenweagntftc(11)编码全长2F8轻链序列(2F8Kappa可变区和恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SE0IDNO.132)atggagacagacacaa匕cctgctatgggtgc仁gctgctctgggttccaggctccactggt61121181241301.3G1421481541661gacattgtgcatctcctgcagggatcccagcctgtgg^grgatcttcccsc站tggcgtcctgacccastcca_g*geicagcccgttgaccaatccagcttctacccaaagtctggcagtgggtgcaacctatgctggagctggac仁gatcagggacgagt:at3cccsttgtc:tctgggacagtactgtC6igca貼cgggctgtctggaggtgctctagggcaatagt仁ata仁cctcagtcgtttgatggcagacagctataccaactggtscggatcctcccaactgtatccgtgcttcttgtgaacg3C站gtgttag白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO,133)1divltqspaslavslgqratisckasgsvdydgnsyinwygqkpgqppkvliyvasnlesSIgiparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqqsi已dpptfgagtklelkxadaaptvs121ifppssegltsggaswcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysms181stltltkc5eyerhnsytceathktstspivIcsfnrnec'(13)编码全长3B6重链序列(3B6重链可变区和IgGl恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEOIDNO,134)1atggaatggccttgtstctttctcttcctcctgrtcagtaactgaaggtgtccact:cccag61^tcagctgcagcagtctggggctgaactggtgaggcctgggtcctcagtjaagatttcc121tgcaaggcttctggrctatgtat仁cagtagctactggatgaactgggtgaagcagaggcct181ggacagggtcttgagtggattggacagatttatcctggragatggtgatagtaactacaat241ggaaacttca301cagctc:agc:a361ctacgtgaga481atggtga_ccc541aactctggatGO1tacactctga721tgtggttgta781ccaaa_gccca841gacatcagca361g站cttccca1021agtgca^ctt1081gctccacagg1141ctgacctgca_1261ttcgtctaca1321tgctctgtgt1381cctggt3a3tccccatctgtccctgtcca^gcagctcagtcccacccggcaggatgatcctccctgcccccacactgact:ctactggggcctatccac:tgggtc貼gggcgactgtcccccagca^cacccaccattactcgaggtccagccgggagg的cttcttccctgcccctggattatttccctgtccsgcscctctgactcctattca_gc:tggtcagttcaacaaatggc汰a的accatctccacagcccatcactgrctgrcccactg"tcctgc汪catctgtcttttg"tagatgagcactttccgctgtggagtgccsgctcgggctcctcagcceigtgacctgggtctgacctcgaccgtcaccgcccagggatcatcttcccctgttgtggtatgrtggaggtgctcagtcagttactttcscc(14)限定了全长3B6重链序列(3B6重链可变区和IgGl恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.135)61tignfkgkatl121akttppsvyp301selpimhcjdw361sltcmitdff421tcsvlheglh1vrpgssvOciped±仁vewqwsnrvtlgclv"kngqpaenytaxsavyfcasq;lgyfpepvtvtktisktIcgrpglrenyfdywdcgckpcictvhtaqtqp;reiat.fpavlgsci序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.136)161121181241301361421481541601"1JVTGgacATGagqacccc仁^rc:仁cagttt:ct:匕grgraa仁ct:仁q"匕仁gc仁ctg^tt:tccaggrtatcgtcacaatcaccatc貼grgttcaagatgaccttgca&ggcViagracatcaacttcacccatccagtctccagagtcaggactggatctggga^catctggatgtcraagtggcaagattcttgctga>t:gctgggtgcctcagatgcatctcttcgtgtgcttgttcca^C3ggttcacgttccttg貼c貼c(16)限定了全长3B6轻链序列(3B6Kappa可变区和恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.137)丄dikmtq印犯myaslgervtitckasqdiksylsv/fqqkpgk，kt)i，vin:"d^ps61rfsgsgsgqdssltitslen—iyyclqydefpftfgggtkl"""ptvs，121ss4l2sggaswcflnnfypkdiiwkv/kidgserqngvlnswtdqdskcistysmsstl匕181ltkdeyerhnsytceathktstspivksfnmec(17)编码全长3D11重链序列(3D11重链可变区和IgGl恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDN0.138)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>(21)编码全长1D3重链序列(1D3重链可变区和IgGl恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.142)1atffaactttgggctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgaa61121181241301421481541601"1721781841301961102110811201126113211381gtgcagctggtgtgcagcctgaga^agaggcgacc:tctacagtcacctgcaagggat七gtgttcccccca^gtgg仁agacagaggtgcacattcacctgctcax:tctcctgtggagtctgggtctgaagtctgaccctggga_cgttgccca_gttgta^gccagccca^ggaca_gctcsgraccagctttccccacaggtgtacctgca仁gatagccagcggactgtgttacacgc3tacattcaccstctcc3tctgtc仁atc匕cagtgactcc:cggcca_gcgcaccaggactgcccccatccacc3ttcca_agtegtggtgcc&ctggccc^gggct'attgtgcacaccfcgtcccctccagagg3gc3gtcctcccaaggttccctgaagaacactcagccaga3gagcagagggtccctcttgggttcggtggtagcacctggatctgc七ccctgagcctcccsgctgtgcacctggccaagtatcatcctcctaaggtgctggtttgtagrcagatggcctactatccacctgtacctgacaaggggatcatcgtctccaattgtgccccacgtgtgttagatgatgtgtittecgetca>caaatgeaggcraaaggcagaggagtggcagcacagatggc(22)限定了全长1D3重链序列(1D3重链可变区和IgGl恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.143)1evqlvesgrgglvqpggslklscaasgfsdyymswvjrgtpekrlewvayissgggstyy61pdsvkgrftisrdnakntlylgmsslksedtaiyyevrqgdgyygdyamdywgqgtsviv121ssakttppsvyplapgsaagtnsmvtlgrclvOcgyfpepvtvtvmsgslssgvhtfpavlg181sdlylilsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdegekpeictvpevssvf241ifppkpkdvltitltpkvtcvwdisk:ddpevqfswfvddvevhtagtgpreegfnstfr301svselpimhgdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdIcvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenyknt:qpirnd匕dgsyfvysklnvqksnweagn421tftcsvlheg"lhiahhtekslshspgk(23)编码全长1D3轻链序列(1D3Kappa可变区和恒定区)的核酸序列i1211812413013G1421481601S61(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.144)atgagtgtgcccac仁caggftcctffqrggrttgctgctgctgtggcttacagratgtcagatgrtgacatcc对aatcacstgtcctcagctccttcaatgtcaa仁ccagcctccgaatatttacaatctatgetaegggctgattggaggtgccacgacataacgagcttcaacctatctgtstgcaacaaactttttccctca_ttttgrggggatcagtcgtgtgatggcagtgagctatacctcgtggtatcat:agcagatggctgtatccatgcttcttgaaaactgtcacctgtgcc3tcacrctgcsgtctgttcggagggcaacttctsccaccctcscg(24)限定了全长1D3轻链序列(1D3Kappa可变区和恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.145)1d丄qmt:qspaslsvsvgetvtitcrtserdysnlawyggkggkspqlliyaatnladgvps61rfsgsgsgtgfslrinslgsedfgryycqhfwgtpytfgggtkleikradaaptvsifpp121sseqltsggaswcflimfypkdin咏wkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstlt181ltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(25)编码全长1F3重链序列(1F3重链可变区和IgGl恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.146)1stq^actttgg~gctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgag61gtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgcagtctggagggtccctgaaactctcc121tgtgcggcctctggattcactttcagtaactatttcatgtcttgggttcgccagactcca181gragaagagrgctggagtgggtcgcatatattag仁agtggr匕ggtgpgtagca^cctactstcca241ga_cagtgtgaagggtcgattcaccatctctagagacasttgccaagaacaccctgtacctg301caaatgagcagtctgaagtctga的acacagcca仁gtattactgtgtaagacaaggggat361ggttactacggggactatgctatggactactggg:gtcaaggaacctcag仁caccgtctcc421tcagccaaaacgacacccccatctgtctatccax;tggc:ccctggatctgctgcccaaact481aactccatggtgscrcctgggatgcctg"gi:caagggrctatttccctgagccagtgacsgtg541acctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtct601gracctc仁acactctgagcagctcagtgactgtcccc仁ccagcacctggcccagcgagacc661gtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgccc721agggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagftcccagaagtatcatct:gtcttcatc781ttccccccaaagcccaagga仁gtgrc仁caccafctact:ctgactcctaaggtcacgtgtgrtt8,41gtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtciagttcagctggt仁tgtagatgatgtg901gaggtgcacacagc仁cagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcact仁tccgctca961gtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagg1021gtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaacrcatctcca貼accaaaggcaga工081ccgaag"gctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaa1141gtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcag1201tggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggc1261tcttacttcgtctsLcagcaagctc站tgtgcagaagagcaact的gaggcaggaaatact1321t仁cacctgctctg仁gttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcc1381csctctcctggtaaatga(26)限定了全长1F3重链序列(1F3重链可变区和IgGl恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.147)1evglvesggg1vqsggsl3clscaasgftfsnyfmswvrgtSIpdsvOcgrftisrdna)oitlylgmsslksedtamyycvrqg121ss3kttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvt1B1sdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkiv241ifppkpkdvltitltpkvtcvwdiskddpevgfswfvdd301svselpimhcjdwlng^cefkcrvnsaafp3piektiskt3cg3SIkvsltcrnitdffpeditvewqwnggpaenykntqpimdtd421tftcsvlheglhnhhteks丄shspgk序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.148)pek3rlewvayvtwnsgslssprdcgckpcirpkapqfvytigsyfvys3clnissgggstyyywgqgtsvtvgvhtfpavlqctvpsvssvfreegfnstfrppp)cegmakdatgagtgtgcccaetcaqfgtcctggggttgctgc;tgctgtggcttacagatgccagatgt61gacatccaga121atcacatgtc181ggaa^atctc241aggttcsgtg301gaagattttg361gggax:c:agac421tccagtgagc481cccaaagacs541aac在gttgga661tcaacttcactgactcagtcgagcaagtgac仁cagctcctgcagtggatctggaaattaactgatcaggaacgagfcatgatccagx;ctccggtctatgstctgtcaacattggsggtgccgagcttcaaccta匕ctgtatttttgggg七agatggcsgtgagc3cctacaaggaatg这gtctgtgggagacatggtatcactccgtacacctgtaitccatgtgaggccacgttagaactgtcaccgcagaaac&gcctgcagtcttggcgtcctgcaccctcacgtcacaagaca白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.149)1diqmtqspaslsvs"vgetvt61:rfsgsgsgtqfsl)ciiislqs121sseqltsggaswcflnnfy181ltkdeyerhnsytceatWctitciraseniysnlawyqqkq;gkspqllvydathlpdgvpsedfgsyycqhfwgtpytfgggtarleikradaaptvsifpppJcdinvlcwkidgserqngvlnswtdgdsJccistysmsstltstspiv)csf:n;rnec(29)编码全长3A12重链序列(3A12重链可变区和IgGl恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.150)161121181241301361421481541SOI72178184190110211081114113211381atgaactttgggrctcagattgattttccttgtccttgttttaaaaggtgtgaagtgtgaatgtgcagcctagggattgtgttCCCCCC33tggaatgggcttcacctgctcactctcctgtggagtctggtggagtgggtgtctgaagtcrgrgrg^ctatgccga^caccccctgax:cctgggctggatccctacgttgcccsicagctcagacctgtgttacacgcatacatttatggucta_catgcctggtcgtccagcggtttgcat沃tgttga仁cccg"agtgcccccstctgag的cctgagtagtggtggccatg仁attgtgcacacctgtcccctccaga^ggagcagttggctcaatgcctccca_a_gggtggtagcacactgtgtaagrtccctgagccgcacctggccctcct33ggtgctggtttgtcca>ga_ctccacctgrtacctgcaccgtctcctgcccaaax:tagtgacagtgcctgcragtcttgtcttcst:ccacgtgtgrtttttccgctcacaaatgc&gggagcctctcc(30)限定了全长3A12重链序列(3A12重链可变区和IgGl恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.151)1evqlvesggg61pdsv3cgr"fti121ssakttppsv181sdlytlsssv241ifppkpkdvl361kvjsltcmitd421tftcsvlhegyplapgrsaaqtvpsstwpselqmnslksedtnsmvtlgcltvtc:nvahpEirvnsaafpapqwnggpaeny曰hspgknyfmswvxgtvkgyfpepvtsstkvdlOcivevgfswfvddkntgpimdtcidgyygdyamdvtwnsgslssrpkapqyytigsyfvysklnissgggstyyywgqgtsvtvctvpevssvfreeqfnstfrvg3c白nweagn(31)编码全长3A12轻链序列(3A12Kappa可变区和恒定区)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.152)1atgagtgrtgrcccactcacrcrt:cctggrgrgtt:gc仁gctgctgrtgrgcttacaqratgccagatgt61gacatccagatgactcagtcgccagcctccctatctgtatctgtgggagaaactgtcax;c:atcacatgtcgagcraagtgagsatatttacattaatttagcatggtatcagcagaaacag181ggaaaatctcctcagctcctggtcc3tgctgcaacaaagttagcagatggtgtgcca仁ca241aggttcagtggcagtggatcaggcacacagtattccctcaagatcaacagcctgcagtct301gaagattttgggaLgttattactgtcaacatttttggggtactccgtacacgttcggaggg3SIgggaccaaactagaaataaaacgggctgatgctgcaccaactgtstccatcttcccacca42itccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtegtgtgcttcttgaacaacttctac481cccaaagacatcaatgtcaagrtgg汪agrattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtc:ctg541aacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacg601ttgaccasggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagaca661tcaacttcacccattgtc:aagagcttcaacaggaatgagtgttag(32)限定了全长3A12轻链序列(3A12Kappa可变区和恒定区)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.153)1digmtq;spaslsvsvgetvtitcraseniyinlawyggk:ggkspgllvhaatkladgvps61rfsgsgsgtgyslkinslqsedfgsyycghfwgtpytfgggtkleikradaaptvsifpp121sseqltsggaswcflrmfypjcdirrvkwkicJgserqngvlnswtdgdskd曰tysmsstlt181l匕5ccieyerhnsytcea仁hJctstspivksfiarnec为了方便，表2提供了本实施例中所讨论的抗体的全长序列与序列表中列出的那些序列之间的对应关系的索引表。表2SEQIDNO.蛋白质或核酸1221A3重链可变区+IgGl恒定区-核酸1231A3重链可变区+IgGl恒定区-蛋白质1241A3轻链可变区+恒定区-核酸125U3轻链可变区+恒定区-蛋白质1262B8重链可变区+IgGl恒定区-核酸1272B8重链可变区+IgGl恒定区-蛋白质1282B8轻链可变区+恒定区-核酸1292B8轻链可变区+恒定区-蛋白质1302F8重链可变区+IgGl恒定区-核酸1312F8重链可变区+IgGl恒定区-蛋白质1322F8轻链可变区+恒定区-核酸1332F8轻链可变区+恒定区-蛋白质1343B6重链可变区+IgGl恒定区-核酸<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>实施例3—多种重组hHGF蛋白质的制备本实施例描述了用于表征实施例l和实施例14中制备的抗体的多种重组蛋白质的克隆和表达。具体而言，本实施例描述了以下蛋白质的克隆和表达，所述的蛋白质为重组hHGF蛋白质、含有在555位置处甘氨酸被谷氨酸取代的重组hHGF蛋白质(G555E)、含有在561位置处半胱氨酸被精氨酸取代的重组hHGF蛋白质(C561R)、含有置于小鼠HGF序列中的人V495-L585HGF序列的重组小鼠-人-小鼠(mhm)嵌合体HGF蛋白质、含有置于小鼠HGF序列中的人I499-R566HGF序列的重组mhm嵌合体HGF蛋白质、以及含有置于小鼠HGF序列中的人W507-L585HGF序列的重组mhm嵌合体HGF蛋白质。利用标准的分子技术产生以下的表达构建体，并通过DNA测序验证所得的cDNA序列。a.hHGF-Fc在PCR的第一轮中，产生2个重叠的PCR片段，其中在hHGF和hlgFc之间引入了NotI位点并编码了6xHis标签。在第二轮中，重叠的PCR片段作为才莫板以扩增hHGF-his-IgFc。用Nhel和BaraHI消化所得的片段，再克隆到pcDM5/FRT(Invitrogen，#35-3014)中。然后，从Invitrogen克隆序号IOH29794(人HGFcDM)中扩增hHGF。发现，所得的序列对应于NCBI中储存的收录号为NM-000601.4的序列。(1)5'hHGFNhel引物ACTGGCTAGCATGTGGGTGACCAAACTCCT卿IDNO.102)(2)hHGFNotlHis标签引物GTGATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCATGACTGTGGTACCTTATATG(SEQIDNO.103)(3)HisIgFc引物ACTGGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC(SEQIDNO.104)(4)IgFcBamHI引物ACTGGGATCCTCACTATTTACCCGGGGACAG(SEQIDNO.105)b.hHGF-FcG555E和hHGF-FcC561R使用QuikChangeIIXL定点突变试剂盒(Stratagene)，根据制造商提供的说明书，通过定点突变产生hHGF-Fc突变体G纟55E和hHGF-Fc突变体C561R。(1)hHGF-Fc(G555E)正义引物CATGATGTCCACGAAAGAGGAGATGAG(SEQIDNO.106)(2)hHGF-Fc(G555E)反义引物CTCATCTCCTCTTTCGTGGACATCATG(SEQIDNO.107)(3)hHGF-Fc(C561R)正义引物GGAAGAGGAGATGAGAAACGCAAACAGGTTCTCAATG(SEQIDNO.108)(4)hHGF-Fc(C561R)反义引物CATTGAGAACCTGTTTGCGTTTCTCATCTCCTCTTCC(SEQIDNO.109)c.小鼠-人-小鼠嵌合体Fc小鼠-人-小鼠嵌合体IgFc构建体包含mHGFoc链-hHGF、人HGF的P链氨基酸Val495-Leu585、以及其后为6xHis标签和IgG-Fc的mHGFC末端p链。从Invitrogen克隆序号IOH29794(人HGFcDNA)扩增编码氨基酸V495-L585的人HGFcDNA。该序列对应于NCBI中储存的收录号为NM—000601.4的序列。使用来自InvUrogen的SuperScriptOneStepRT-PCR试剂盒(#10928-034)，根据制造商提供的说明书，从小鼠肝的总RNA(Clontech,#636603)中，通过RT-PCR扩增小鼠HGF序列。所得的mHGFcDNA序列对应于NCBI中储存的收录号为D10213.1的序列。使用重叠的PCR引物产生3个片段(分别被称为片段1、2和3)，并在PCR扩增的连续的轮次中退火。将终产物用Nhel和Notl酶切，并克隆到pcDNA5/FRTIgGFc中。(1)用于mHGFoc链5，Nhel的片段l的引物5'ATCGGCTAGCATGATGTGGGGGACCAAAC(SEQIDNO.110)GAATCCCATTTACAACCCGCAGTTGTTTTGTTTTGG(SEQID肌111)(2)用于hHGF&链aaV495-L585的片段2的引物5'CCAAAACAAAACAACTGCGGGTTGTAAATGGGATTC(SEQIDNO.112)CAGGATTGCAGGTCGAGCAAGCTTCATTAAAACCAGATCT(SEQIDNO.113)(3)用于mHGFP链C末端3，Notl的片段3的引物5'AGATCTGGTTTTAATGAAGCTTGCTCGACCTGCAATCCTG(SEQIDNO.114)3'GTAATTTTGACATACAAGTTGTGCGGCCGCCATCACCATCACCATCAC卿IDNO.115)d.hHGF和mhm嵌合体的构建通过定点突变产生不含有Fc-标签的、编码hHGF和mhm嵌合体(V495-L585)的载体，即pcDM5/FRThHGF和pcDNA5/FRT-mhm嵌合体(V495-L585)。使用QuikChangeIIXL定点突变试剂盒(Stratagene),根据制造商提供的说明书将终止密码子引入6xHis-标签的3，端。突变引物包括引物1和引物2，其中引物l为CATCACCATCACCATCACTAAGCGGGTCTGGTGCCACG(SEQIDNO.116)，引物2为CGTGGCACCAGACCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATG(SEQIDNO.117)。此外，使用QuikChangeIIXL定点突变试剂盒(Stratagene),根据制造商提供的说明书，通过定点突变由pcDNA5/FRT-mhm(V495-L585)构建体产生2个另外的mhm嵌合体。其中1个mhm构建体含有位于小鼠序列之间的hHGF的1499-R556区域。另一个mhm构建体含有位于小鼠序列之间的hHGF的W507-L585区域。对于mhm嵌合体(I499-R556)，利用合适的寡核苷酸序列，在模板pcDNA5/FRT-mhm嵌合体(V495-L585)构建体中依次制造以下点突变D558E、C561R、V564I、V567I和M583L。对于mhm嵌合体(W507-L585),利用合适的寡核苷酸序列，在模板pcDM5/FRT-mhm嵌合体(V495-L585)构建体中在一个步骤中引入以下点突变Q502R、NS(HT和1505V。所得的hHGF-Fc蛋白质的核苷酸序列如SEQIDNO.118所示，包含信号序列(核苷酸l-93)和原结构域(prodomain)(核苷酸94-162)。hHGF-Fc蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.119所示。所得的编码mhm(V495-L585)-Fc嵌合体蛋白质的核苷酸序列如SEQIDNO.120所示，包含信号序列(核苷酸l-96)和原结构域(核苷酸97-165)。mhra(V495-L585)-Fc嵌合体蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.121所示。所得的编码mhm(V495-L585)构建体的核苷酸序列和限定mhm(V495-L585)构建体的蛋白质序列分别如SEQIDNO.211和212所示。如SEQIDNO.211所示的核酸序列包含信号序列(核苷酸l-96)和原结构域(核苷酸97-165)，而如SEQIDNO.212所示的蛋白质序列包含活性蛋白质序列(不含有信号序列或原结构域)。所得的编码mhm(1499-R556)构建体的核苷酸序列和限定mhm(1499-R556)构建体的蛋白质序列分别如SEQIDNO.213和214所示。如SEQIDNO.213所示的核酸序列包含信号序列(核苷酸1-96)和原结构域(核苷酸97-165)，而如SEQIDNO.214所示的蛋白质序列包含活性蛋白质序列(不含有信号序列或原结构域)。所得的编码mhm(W507-L585)的核苷酸序列和限定mhm(W507-L585)的蛋白质序列分别如SEQIDNO.215和216所示。如SEQID冊.215所示的核酸序列包含信号序列(核苷酸1-96)和原结构域(核苷酸97-165)，而如SEQIDNO.216所示的蛋白质序列包含活性蛋白质序列(不含有信号序列或原结构域)。e.蛋白质的表达(1)细胞培养在37。C、50/"02以及100jag/mLZeocin(Invitrogen，CatalogNo.R250-Ol)条件下，在F12K培养基(ATCC，CatalogNo.30-2004)、10%FCS(Invitrogen，CatalogNo.10438026)、1%青霉素(10000units/mL)/链霉素(10，000jug/mL)(Invitrogen，CatalogNo.15140—122)中培养CHOFlpln细胞(Invitrogen，CatalogNo.R758-07)。(2)稳定的CH0Flpln细胞系的产生使用Lipofectamine2000(Invitrogen，CatalogNo.11668-027),根据制造商提供的说明书，用比例为9:1的pOG44:pcDNA5/FRT表达质粒DM转染CHOFlpln宿主细胞。使用空的pcDNA5/FRT载体/pOG44和单独的p0G44质粒(Invitrogen，CatalogNo.35-3018)转染细胞，作为对照。转染后24小时，分开细胞，并在48小时后，向该细胞中加入0.5rag/mL潮霉素B(Sigma，CatalogNo.H0654-SPEC)。在F12K、10%FCS、1%青霉素/链霉素、0.5rag/mL潮霉素B中，选择多克隆的稳定的细胞。(3)在稳定的CHOFlpln细胞系中蛋白质的表达将大约2xl(r个细胞接种于15cm的平板中，并在37'C、5%C02下，在比例为1:1的F12K(ATCC,CatalogNo.30-2004)/DMEM高糖(Invitrogen，CatalogNo.11995065)、以及5%极低IgGFCS(Invitrogen，#16250-78)中培养5-6天。收集上清液，并通过ELISA和表面等离子体共振分析所得的蛋白质。实施例4一抗hHGF单克隆抗体的结合特性实施例1制备的单克隆抗体以及实施例3中制备的一些重组HGF蛋白质可通过它们结合hHGF的能力来表征，使用BIAcoreT100装置，通过表面等离子体共振来分析所述的抗体以及一些在实施例3中所讨论的融合蛋白质，从而评估它们结合HGF的能力。使用胺偶联(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，根据制造商提供的说明书，通过标准的偶联方法将每种抗体固定于羧甲基化的葡聚糖CM5的传感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25。C下，使用PBS(GIBC0，CatalogNo.14040-133)作为运4亍緩冲剂来进行分析，所述的PBS含有0.05%表面活性剂P20(BIAcore，CatalogNo.R-1000-54)、2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)和10mg/mLCM-葡聚糖的钠盐(Fluka，CatalogNo.86524)。将含有不同HGF融合蛋白质的上清液或者来自用空载体转染的细胞的上清液以30uL/min的流速注射在每种抗体上，时间持续3分钟。在注射完毕后30秒时，在基线上，以共振单位(RU)测定所得的结合。将结合与稀释于运行緩冲剂中的人HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)比较。通过比较与对照表面的结合，监测到不存在特异性的结合，其中所述的对照表面上包含使用相同的胺偶联方法固定的小鼠IgG(Rockland,CatalogNo.010—0102)。所得的结果总结于表3中。74表3<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表3中的结果表明，每种抗体都与rHGF和純化的人HGF结合。此外，所有的抗体都与含有点突变G555E和C561R的hHGF结合。总体而言，除了1F3和2F8之外的所有抗体都不与小鼠HGF结合，表明抗体1A3、1D3、2B8、3A12、3B6和3D11特异性地结合人HGF。抗体1D3、1F3和2B8结合小鼠-人-小鼠嵌合体，而其他抗体则不结合该嵌合体。这些结果表明抗体1D3和2B8至少部分地结合人HGF的残基4"-585。抗体U3、3A12、3B6和3D11似乎结合人hHGF的除了残基495-585之外的部分。目前尚不确定为什么2F8不结合mhm嵌合体，而其似乎结合hHGF和mHGF。实施例5—抗hHGF的单克隆抗体结合还原的和非还原的HGF的能力在本实施例中，对实施例1制备的抗hHGF的单克隆抗体结合还原的和非还原的HGF的能力进行分析。通过免疫印迹法评估抗HGF的血清与重组hHGF的反应性。在4-12%Bis-Tris1.0mmX2D孑L凝胶(wel1gel)(Invitrogen,Carlsbad,CA)上，对在含有或不含有NuPAGE样品还原緩沖剂(Invitrogen的NuPAGEMOPSSDS运行緩冲剂(Invitrogen)中的8|ug重组hHGF进行分级。然后，使用标准的方法将分级的蛋白质转移至硝化纤维膜上。将该硝化纤维膜用溶于含有0.1%Tween-20(TBST)的Tris緩沖盐溶液中的5%脱脂奶粉溶液封闭，然后封片到MiniProteanIIMulti-Screen仪器(BioRad)中以便进一步封闭。用纯化的抗体在Multi-Screen仪器上探针检查所得的膜。将纯化的抗体在封闭緩冲剂中稀释成5jjg/mL。然后，将硝化纤维膜从所述仪器中取出，并与辣根过氧化物酶标记的抗小鼠的IgG抗体温育。所得的结果总结于表4中，其中数字反应了结合的程度，-代表最少结合(几乎不结合或不结合)而3+代表最多结合。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>表4中的数据表明，所有的抗体都与非还原的rhHGF结合。与此形成对比的是，单克隆抗体U3、1D3、1F3、2F8和3B6结合还原的rhHGF，但抗体2B8、3A12和3D11不结合还原的rhHGF。实施例6—结合亲和力通过表面等离子体共振测定实施例l制备的每种抗体与hHGF的结合亲和力及相互作用的动力学。使用胺偶联(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，才艮据制造商提供的说明书，通过标准的偶联方法将兔抗小鼠免疫球蛋白(BIAcore，CatalogNo.BR-1005-14)固定于羧曱基化的葡聚糖CM5的传感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25°C下，使用PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作为运行緩冲剂来进行分析，所述的PBS含有0.05%表面活性剂P20(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-54)、2rng/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)和10mg/mLCM-葡聚糖的钠盐(Fluka，CatalogNo.86524)。将抗体捕获在流速为10^L/min的单个流动的细胞上。用于每种抗体的注射时间是可变的，从而使每个循环中捕获大约20RU的抗体。以60liL/min的速度，在2分钟内向参照表面(没有被捕获的抗体)和活性表面(有待测试的抗体)上依次注射緩冲剂或稀释于运行緩沖剂中的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)。根据浓度，对解离相监测15或90分钟。然后，再开始另一个循环之前，使用10mM的甘氨酸-HC1，pH1.7(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-54H吏所述的表面再生，其中所述的甘氨酸-HCl是在3分钟内以60jiL/min的流速注入的。所测试的HGF的浓度为0.46nM至7.5nM。利用BIAevalutation软件的动力学函数及推荐的差级，确定动力学参数。每种抗体的动力学参数(L(结合速率常数)，kd(解离速率常数)和K。(平衡解离常数))总结于表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表5中的数据表明，所述抗体结合hHGF的K。为约100pM或更低、约50pM或更低、或者20pM或更低。实施例7—抗hHGF的抗体的中和活性在本实施例中，用抗体(a)抑制hHGF与c-Met结合的能力和(b)抑制4MBr-5细胞中HGF刺激的BrdU引入的能力来表征实施例1制备的抗体。a.HGF-Met结合抑制分析(中和作用分析)4吏用ELISA测试抗体抑制hHGF与c-Met结合的能力。具体而言，在4。C下，用碳酸盐包被緩冲剂(15mMNa2C03和34mMNaHC03，pH9.0)中的100jaL6.25|ig/mLHGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)包^皮Wallac96孔DELFIA分析平板(Wallac公司，CatalogNo.AAAND-0001)16小时。然后，在室温下将该分析平板用PBS中的200jaL5%的非脱脂奶粉封闭1小时。通过将升高浓度的处于研究中的抗体(O.033_667nM，3倍系列稀释)加入到含5%非脱脂奶粉的PBS中的2nMc-Met(R&DSystems,CatalogNo.358-MT/CF)中，在分开的板中制备该抗体。将每个孔中的IOOjuL的样品转移至分析平板中，并在4。C下温育过夜。然后，将该分析平板用PBS-0.1%Tween20洗涤3次，并在室温下，与100|aL/孔的2jug/mL生物素才示i己6々抗人c-Met的抗体(R&DSystems,CatalogNo.BAF358)S显育，其中所述的抗人c-Met的抗体在含5%非脱脂奶粉的PBS中中制备。然后，将所得平板用PBS-0.1°/。Tween20洗涤3次，并在室温下，与在DELFIA分析緩沖液(Wallac，CatalogNo.4002-0010)中以1:1000稀释的Eu标记的链霉亲和素(Wallac,CatalogNo.1244-360)温育1小时。将所得平板用DELFIA洗涤液(Wallac，CatalogNo.4010-0010)洗涤3次，并在室温下，在搅拌条件下与100juL/孔的DELFIA增强溶液(Wallac#4001-OOIO)温育15分钟。使用铕示踪法，在Victor^仪器(PerkinElmer)上读取所述平板。计算IQ的值，并总结于表6中。78表6<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>这些结果表明，除了3B6以外的所有抗体(即，1D3、1A3、2B8、3A12、1F3、3D11和2F8)有效地中和HGF与c-Met的结合。b.中和4MBr-5细胞中HGF刺激产生的BrdU的引入将1GuL12.5nM的hHGF分配到96孔组织培养微孔板(CostarCatalogNo.3903)的每个孔中。将10pL浓度为6667、2222、740、247、82、27、9.1、3.0、1.0和0.33nM的系列稀释的抗体加入每个孔中。然后在室温下，将HGF-抗体混合物温育30分钟。将培养在F-12K(ATCC530-2004)、15%FBS(Gibco10438-026)、30ng/mLEGF(SigmaE9644)以及P/。青霉素/链霉素(PS，GibcoCatalogNo.15140-122)中的猴支气管上皮细胞4MBr-5(ATCC，CCL208)用胰蛋白酶(GibcoCatalogNo.25200-056)解离，并以75,000细胞/mL重悬于分析培养基(F-12K、2.5%FBS、1%PS)中，然后将80pL细胞悬浮液分配到HGF-抗体混合物中。将所得的细胞在37°C、5°/。0)2下温育。48小时后，加入10jnL100jaM的BrdU(RocheCatalogNo.1669915)。72小时后，除去培养基，用电吹风干燥所述平板，并用BrdUELISA(RocheCatalogNo.1669915)根据制造商提供的说明书进行处理。使用SynergyHT平读取器(Bio-Tek)对荧光信号进行定量。所得数据与GraphPadPrism(GraphPadSoftware)中斜率可变的反曲剂量应答(sigmoidaldoseresponse)曲线相拟合，所述曲线的等式为y-底值+(顶值-底值)/(l+l(r(log(EC50-xh曲线斜率))。在相同的样品中，每个试验都重复至少3次，并且平均EQ值示于表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>表7中的结果表明，所有的抗体(1A3、1D3、1F3、2B8、2F8、3A12、3B6和3D11)都抑制HGFi秀导的4MBr-5细力包增殖。实施例8—抗hHGF抗体的抗扩散活性本实施例描述了实施例1制备的抗体抑制HGF诱导的扩散活性的能力的特征。HGF诱导了MDCK细胞(ATCC，Manassas,VA，CatalogNo.CCL-34)簇的"扩散"(运动性)。将MDCK细胞以每孔4乂103个细胞的密度接种于96孑LCostar组织培养平板(CorningIncorporated,Corning,NY3CatalogNo.3595)中，其中每个孔装有80mL的包含10%胎牛血清(InvitrogenCatalogNo.10438026)和1%青霉素-链霉素(InvitrogenCatalogNo.15140122)的MEM(ATCCManassas,VA，CatalogNo.30-2003)。将待研究的每种抗体在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的MEM中稀释成6，667nM。然后，将每种不同的抗体稀释液、以及含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素但不含有抗体的MEM分别与等体积的含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的MEM、以及IOOng/mlHGF(R&DSystemsCatalogNo.294-HGN-025)混合。在25'C下，将抗体/HGF稀释液温育30分钟。将20jaL的每种抗体/HGF稀释液分别加入到各个孔中，使得最终的抗体浓度为666.7nM,而最终的HGF浓度为10ng/ml。然后，在37。C、5%002下，将MDCK细胞温育24小时。温育24小时后，将MDCK细胞小心地用每孔100jul的冰冷的PBS(InvitrogenCatalogNo.14190144)洗涤1次，并用每孔100mL的冰冷的甲醇固定，同时在25'C下摇动10分钟。然后将平板用蒸馏水小心地洗涤1次。将每个孔中加入100pL的结晶紫溶液，其由0.5%的结晶紫(Sigma，St.Louis,M0，CatalogNo.C3886)和50%的溶于蒸馏水中的乙醇构成，并将细胞在25。C下摇动温育20分钟。将使用结晶紫溶液染色后，将所得的细胞用蒸馏水小心地洗涤3次。然后，向每个孔中加入PBS以防止样品干燥。^吏用LeicaDMIRB显微镜(LeicaMicrosystemsGmbH,Wetzler，Germany)、DC500照相机(LeicaMicrosystemsGmbH,Wetzler，Germany)和MagnaFire2.1C软件(Optronics,Goleta，CA)对细胞成^象，并评定样品的扩散水平。所得的结果总结于表8中。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>-不抑制+++极强，接近完全抑制++强烈抑制+可检测程度的抑制表8所示的结果表明，抗体2B8比其他抗体更能抑制HGF诱导的扩散。抗体1D3和3B6显示出中等水平的抑制；抗体1A3显示出低于中等水平的抑制；抗体1F3和2F8显示出低水平的抑制；而抗体3A12和3D11几乎不产生抑制或检测不到抑制。实施例9一对HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制本实施例描述了实施例1制备的抗体抑制PC-3细胞中HGF刺激的c-Met磷酸化的能力的特征。HGF诱导了PC-3细胞(ATCCNo.CRL-1435)中Met的磷酸化。将PC-3细胞以每孔4.5xl(T个细胞的密度接种于96孑LCostar组织培养平板(CorningCatalogNo.3595)的每个孔中，其中每个孔装有IOOjaL的包含10。/。胎牛血清(InvitrogenCatalogNo.10438026)和1°/。青霉素-链霉素(InvitrogenCatalogNo.15140122)的F-12K(ATCC，Manassas，VA，CatalogNo.30-2004)。在37°C、5%C02下经过24小时之后，除去培养基，并用不含血清但含有1%青霉素_链霉素的F-12K漂洗细胞1次。然后将细胞在100)iL的含有l。/。青霉素-链霉素的无血清F-12K中温育24小时。在含有1%青霉素-链霉素的无血清F-12K中制备待研究的每种抗体的以下10种不同的稀释液6667nM、2222nM、741nM、247nM、82.3nM、27.4nM、9.1nM、3.0nM、1.0nM和0.3nM。将每种抗体稀释液、以及不含抗体的含有1%青霉素-链霉素的无血清F-12K分别与等体积的含有1%青霉素-链霉素的无血清F-12K和500ng/mLHGF(R&DSystemsCatalogNo.294-HGN-025)混合。在25。C下，将这些抗体/HGF的稀释液温育30分钟。由此得到最终浓度为1.25nM的HGF。然后，将PC-3细胞用含有1%青霉素-链霉素的无血清F-12K漂洗1次。接着向细胞中加入70jaL含有1%青霉素-链霉素的无血清F—12K，然后再加入10jjL含有10mMNa3VO4(SigmaCatalogNo.S6508)的含有1%青霉素-链霉素的无血清F-12K。然后，将细胞在37°C、5%C02下温育60分钟。温育后，将20iuL的每种抗体/HGF分别加入各个孔中，得到HGF的最终浓度为50ng/mL，每种抗体的最终浓度如下666.7nM、222.2nM、74.1nM、24.7nM、8.23nM、2.74nM、0.91nM、0.30nM、0.lOnM和O.03nM。然后，将细胞在37'C、5%0)2下温育IO分钟，其后除去培养基/抗体/HGF的混合物，并将平板放在水上。接着，用每孔IOOiaL的含有1mMNa3V04的冰冷的PBS(InvitrogenCatalogNo.14190144)漂洗细胞1次。然后，将细胞在4。C下，在每孔100juL水冷的裂解緩沖剂中温育30分钟，所述的裂解緩冲剂由1%OmniPurTritonX-IOO(MERCKKGaA，Darmstadt,Germany,CatalogNo.9410)、50mMTris-HClpH8.0、100mMNaCl、0.3mMNa具、lx蛋白酶抑制剂混合物(SigmaCatalogNo.P8340)以及lx石舞酸酶抑制剂混合物2(SigmaCatalogNo.5726)构成。将生物素标记的抗人HGF-R(c-met)的抗体(R&DSystemsCatalogNo.BAF358)在包含1%胎牛血清(SigmaCatalogNo.A2153)的DELFIA分析緩冲液(PerkinElmer，Turku,Finland,CatalogNo.4002-0010)中稀释至浓度为2jug/mL，并将50的这种稀释液加入到黄色链霉亲和素孩t孔平板(PerkinElmerCatalogNo.AAAND-0005)的每个孔中。然后，在25。C下将所述平板与抗体摇动温育30分钟。温育后，用DELFIA洗涤液(PerkinElmerCatalogNo.4010-0010)洗涤所述平板，并将80jaL每种不同的PC-3细胞裂解物分别加入经洗涤的链霉亲和素微孔平板的各个孔中。将含有PC-3细胞裂解物的链霉亲和素微孔平板在2S。C下摇动温育60分钟，然后用DELFIA洗涤液洗涤。将100nL稀释有600ng/mLDELFIAEu-NlP-Tyr-100抗体(PerkinElmerCatalogNo.AD0159)的含有1。/。胎牛血清的DELFIA分析緩沖液中加入之前与PC-3细胞裂解物温育的经洗涤的链霉亲和素微孔平板中。将该平板在"。C下摇动温育60分钟。将所述平板用DELFIA洗涤液洗涤最后1次。然后，将200jaL的DELFIA增强溶液(PerkinElmerCatalogNo.4001-0010)加入到经83洗涤的链霉亲和素微孔平板的各个孔中，并将该板在25'C下在黑暗中摇动温育5分钟。然后，使用铕示踪法，在Victor3V仪器(PerkinElmer)上测定信号。使用Prism4forWindows(GraphPadSoftware，Inc.,SanDiego，CA)和反曲剂量应答等式计算ECs。的值。以nM计的作为ECs。而总结出的结果列于表9中。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表9中的数据表明，所有的8个抗体都是PC-3细胞中HGF诱导的c-Met磷酸化的有效抑制剂。实施例10—U87MG异种移植物模型中的肺瘤抑制在U87MG异种移植物模型中测试本发明的小鼠单克隆抗体抑制肿瘤生长的能力。在37。C下在含有5%C02和95%空气的气氛中培养条件下扩增U87MG细胞(ATCC)，其中使用的培养基包括舍有10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100pg/mL链霉素的Dulbecco'sModifiedEagle培养基(DMEM)。通过使用胰蛋白酶-EDTA分离培养皿壁上的细胞对细胞进行次级培养和维持。通过胰蛋白酶消化作用来收集接近汇合的细胞，然后将50%Matrigel(BDBiosciences;catalogno.356237)中的5x106个细胞皮下注射到7周龄雌性ICRSCID小鼠(TaconicLabs)的肩胛骨之间的背部上侧的区域中。使用卡尺测量胂瘤的长直径(L)和短直径(W)(mm)。如下计算肺瘤的体积(vol.):体积(mm3)=LxW2/2。当肿瘤生长到大约200mm3时，将带有肿瘤的小鼠随机分成5组，每组10只小鼠。其中的一组小鼠接受PBS。其他4组中的每组小鼠接受抗体1A3、1D3、1F3或2B8中的一种抗体。所有抗体的剂量均为1mg/kg体重，每周2次，并通过腹膜内注射5个剂量。每星期记录2次肿瘤的体积和小鼠的体重。利用学生t检验分析肿瘤生长的抑制。结果总结于图6和表10中。表10抑制百分率2B8对比PBS93%p=0.0011A3对比PBS73%p=0.00751D3对比PBS5"/。p=0.0751F3对比PBS6Mp=0.027在2B8治疗组中，取得了部分衰退(参见图6)。在1A3治疗组和1F3治疗组中观察到统计学显著的生长抑制(参见表10)。1D3的肿瘤生长抑制为51%，其p值为0.075。没有观察到明显的体重损失。实施例11—U118异种移植物模型中紳瘤的抑制在U118异种移植物模型中测试抗体U3、1D3、1F3和2B8抑制肿瘤生长的能力。按照实施例IO(上述实施例)中针对U87MG细胞所述增值细胞(ATCC)。如上文实施例10所述建立皮下肿瘤模型，不同之处在于所用的小鼠为7周龄的雌性NCr棵鼠(Taconic)，并且当肿瘤生长至大约80mm3时开始治疗。如同在U87MG模型中那样，所有抗体的剂量均为lmg/kg体重，每周2次，并通过腹膜内注射4个剂量。每星期记录2次肿瘤的体积和小鼠的体重。利用学生t检验分析肿瘤生长的抑制。结果总结于图7和表11中。85<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>2B8CDR残基用于替换在小鼠2B8CDR和人种系CDR之间不同的相应人种系可变区残基时，保留人种系可变区的框架残基。然后，将与2B8小鼠J区最相似的人J区加入到"超级人源化，，的可变区的羧基端。接着，将信号序列加入到"超级人源化"的可变区的氨基端，并将这些氨基酸序列转化为核酸序列。利用基因合成PCR方法(Young等人，(2004)NUCL.ACIDSRES.32:e59)构建完整的可变区核酸序列，并使用标准的分子生物学技术将其克隆到含有人恒定IgGl(Glm(17，1)同种异型)或Kappa(Km(3)同种异型(等位基因2))区(可变区的下游)的哺乳动物表达载体(基于pcDNA3.2DEST(Invltrogen))中。使所有的4条重链IgGl抗体(嵌合体2B8和3条人源化的重链(Hu2B8Hvl-f.1、Hu2B8Hv5-a.1和Hu2B8Hv5-51.1))与所有的3条kappa链抗体(嵌合体2B8和2条人源化的轻链(Hu2B8Kvl-39.l和Hu2B8Kv3-15.1))的可能的组合表达，从而产生12种不同的抗体蛋白质。然后，按照以下所述测定嵌合体、嵌合/人源化的抗体、以及人源化的抗体与人HGF的结合，并将结果总结于图8中。表12A中列出了免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的可变区的每一种可能组合。表12A<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>表12B中列出了免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的每一种可能组合。表12B<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>含有全长免疫球蛋白重链和轻链(含有人源化的可变区)的两种可能的抗体构建设计如下sh2B8-9(Glm(17，1))=hu2B8Hv5-51.1(+IgGl恒定区(Glm(17，1)同种异型)(SEQIDNO.171)+hu2B8Kv1-39.1(+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因2)))(SEQIDNO.177);sh2B8-12(Glm(17，1))=hu2B8Hv5-51.1(+IgGl恒定区(Glm(17，1)同种异型))(SEQIDNO.m)+hu2B8Kv3-15.1(+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因2)))(SEQIDNO.181)。编码每一种人源化抗体的核酸序列以及限定每一种人源化抗体的蛋白质序列总结如下。在该部分中，每个可变区的最后一个核苷酸为由可变区/恒定区连接体产生的下一个密码子的第一个碱基。该核苷酸包含在可变区内，这是因为其是外显子的一部分。以下列出的恒定区的氨基酸序列包含了该连接体密码子的翻译产物。(1)编码全长嵌合体2B8重链(小鼠可变区和人IgGl恒定区)(同种异型Glm(17，l))的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQID亂154)1121181241301421481541SOI"17217B1841901961102110811141120112S113211381atqgqatggagctatatcatGc仁c仁ttttggtagcaacagctacaqatgrtccactcccaggtccaactgctgcaaggcttggtagcatctgccctgggcttccctc3gc3aacgtgraatcttcctct仁cctgcgrtggtggcg仁g仁gg仁catgc^ggtctgggcagccccgacggctcctaacgtcttctctctccc仁gtctggctscacgcctgacatcttgactactgcggtc仁仁cccgcctggtca_a_ccagcggcgtgcgtggtgacaca沃gcccagtggacgtgagtgcataatgcgcg仁cctcacgagaaccacsL汪tgggc&gcccatgctccgtcttcaccacctgaggactctgggccaaggcggactacttccgrtgccctccaccgtgcccaccacgaagaccgtcctgcaccctcccagccggtgtacscccagcaagctcgtgaagcctgtactggatgccccgaaccggccggcrtgtccagca_gcttggctcatgatctcctgagg"tcaccc3tcgagactgcccccat的cttctatcaccgtggacagctctgcacaggacttcagtax:tgtgceiagccgtctcctctgacggtgtctacagtcctcasgttgagcccccggaccccagttcaactg貼accatctccgcctcccgtagagcagrgtggaagctg仁ccagcctscatgagcctccsccgtgg貼ctcactacatctgctgaggtcacagtacgtggacggagteicsaggctga_ccaa_gcgccgtggaggctggactccgcagcagggg(2)限定了全长嵌合体2B8重链(嵌合体2B8IgGl(Glm(17，1)同种异型)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.155)1qvqlgqpgaelvkpgtsvklsckasgytfttywmhwvngrpgqglewigeinptnghtny61nekfkskatitvdkssstaymglssltsedsavyycarnyvgsifdywgrq[gttltvssas121tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfp邻vtvswnsgaltsgvhtfpavlqssgl181yslsswtvpssslgtqtyicmmhkpsntkvdkkv印kscdkthtcppcpapellggps241vflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvsliedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynst301yrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsi:del仁361kraqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwgq(3)编码全长嵌合体2B8轻链(小鼠可变区和人恒定区)(嵌合体2B8Kappa(Km(3)))的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQI跳156)1atggaatcacagactctqgrtcttcatatccatactgctctggttatatcr^rtgc仁gatggrg61aacattgtaatgacccaatctcccaaatccatgtccatgtcagtaggagagagggtcacc121ttgagctgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatg仁atcctggtatcaac51gaa3cca181gcgcagtctcctaaacrtgrctga仁atacggggcatcrcaaccgg^acactggggtccccgat241cgcttcacaggcagtggatctgcaacagatttcactctgaccatcagcagtgtgcgggct301gaagaccttgcagattatcactgtgggcagagttacaactatccgtacacgttcgga^grg361gggaccaggctggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca421tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctat481cccagagaggccsaag仁ac:agtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag541gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcax:ctacagcctcagcagcgccctgacg601ctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggc661ctgagctcgcccgtc3c:3aagagcttc犯csggggsgagtgttga(4)限定了全长嵌合体2B8轻链(嵌合体2B8Kappa(Km(3)))的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.157)1nivmtqspJcsmsmsvgervt:lsckasenwsyvswyq;gkp3gspklliyga加rntgvpd61rftgsgsatdftltissvraedladyhcggsynypytfgggtrleikrtv*aapsvfifpp121sdecjlksgtaswcllnnfypreaXvqwlcvdnalqsgnsqesvtegdskdstyslsstlt181lskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(5)编码人源化Hu2B8Hvl-f.1重链可变区的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.158)1ategactgcacctggaggatcctcctcttggtggca&cagctacaggcaeccacgccgag:61gtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggctacagtgaaaatctcc121tgcaaggtttetggatacacettcaccacctactggatgcaetgggtgeaacaggcccct181ggaaaagggcttgagtggatgggagagattaatcetacc;aaeggtcatactaactacaat241gagaagttccagggeagagtcaccataaccgcggacacgtctacagacacagcctacatg301gagctgagcagcetgagatetgaggacacggccgtgtattactgtgcaaeaaactatgtt361ggtagcatctttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcag(6)限定了人源化Hu2B8Hvl-f.1重链可变区的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.159)1evqWqsgaevkkpgatvkisckvsgytfttywmhwvqqapgkglewmgei叩tnghtny61nekfqgrvtitadtstdtaymessrsedtavyycatnyvgsifdywgqgtlvtvss(7)编码人IgGl重链恒定区(Glm(17，1)同种异型)的核酸序列(SEQIDNO.160)1cctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg61gcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt121ggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcag181gactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacct241acatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagccca301aatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggac361cgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaeccctg421aggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggt481ac魄gacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca541gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagg601agt.acaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca661aagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagc721tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcg781ccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgc841tggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggc901agcaggggaacg城ctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc961agaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(8)限定了人IgGl重链恒定区(Glm(17，l)同种异型)的蛋白质M(SEQIDNO.161)。第一个氨基酸得自可变区的最后一个核苷酸与IgGl重链序列的开始2个核苷酸的翻译产物。1astkgpsvfylapsskstsggtaalgcivkdyfpepvtvswnsgaitsgvhtfpavlqss61glysisswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellgg121psvflfypkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfowyvdgvevhnaktkpreeqyn181styrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrde241ltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw301qqgnvfscsvmhealhnhytqkslsspgk(9)编码全长重链人源化Hu2B8Hylf.l可变区和人Ml(Glm(17，1)同种异型)重链恒定区的核酸序列(下划线的为信号序蕴(SEQIDNO.162)161121241301361421481541601"1721781841901%1102110811141120113211381atggactgcacctggagrgatcctcctcttggtgrgcagcaqctacagg"cacccacgccgaggtccagctggggtsgcatctgccctgggctggcgcccrtga:aacgtgaatcgac貼a^cfccttcctcttcctgcgtggtgggggcagccccgacggctcc仁ctctccctgttacagtctggttgacta_ctgcggtcttcccgcctggtc的ccagcggcgtacscatgccccccca^a^ccgcgtcctcacgcctgacc:tgatgggcagcccatgctccgtctccgggtaaggctgsiggtgcttcaccacccctggcacccggactacttcgc汰caccttccgtgccctcccgtcctgcacgcggacacgtgcc9t;gtattcccguaccggccggctgtccagcagcttggctcatgatctcctgaggtcaccgcgggaggcsggax:匕ggcctgcccccatggcttctatccteicagacacactgfcgcaacccgtctcctctgacggtg"tcgcacceagactcctggggggtgaatggcaascaggcccctagcctacatgagcctccaccgggcscagcggtgg貼ctc沃gctgaccaagcgccgtggaggctggactcc_(10)限定了全长重链人源化Hu2B8Hvlf.1可变区和人IgGl會_链恒定区(Glm(17,1)同种异型)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEOIDNO.163)1evglvgsgae61nekfqgrvti121Ucgpsvfpl^241vflfppkpkd301yrwsvltvl361toqvsltclv*421gxrvfscsvmhvkkpgatvkipsskstsgg仁hqdwlxigkeyealhiihytgkscJorsgytftmelsslrsedkclcvsnkalpfpepv仁vswixdpevkfnwyvpgkglewmgevgsifdywgqsgaltsgvhtcdkthtcppcdgvevhnaktsdgsfflysk;inptnghtnygtlvtvssaspapellggpskpreeqynst(11)编码人源化Hu2B8Hv5a.i重链可变区的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEOIDNO.164)1atgKggtcaaccgccatcctcgccctcctcctggctgttctecaag&agtctgtgccgaa61gtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaggatctcc121tgtaagggttctggatacagctttaccacctactggatgcactgggtgcgccagatgccc181gggaaaggcctggagtggatgggggagattaatcctaccaacggteatactaactacaat241ccgtccttecaaggccacgtcaccatctcagctgacaagtccatcagcactgcctacctg301cagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagaaactatgtt361ggtagcatctttgactactggggecaaggaaccctggtcaccgtctcctcag(12)限定了人源化Hu2B8Hv5a.l重链可变区的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.165)1evqlvqsgaevkkpgeslrisckgsgysfttywjmhwvrqmpgkglewmgeinptnghtny61npsfqghvtisadksistaylqwsslkasdtamyycarnyvgsifdywgqgtlvtvss(13)编码全长人源化Hu2B8Hv5a.1重链可变区和人IgGl(Glm(17,1)同种异型)重链恒定区的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.166)atgggg仁caaccgcca仁cgtcgccc:仁c:c:tcctggctgttctccaaggagtctgtgccgaa611211812413014214815416015617217818419019611021108111411201126113211381ccgtccttcccagtgga^gcagccctgggctggcgccct:gattcctcttcctgcaa^ggtctaaccaggtcatgggagagcagacggctcctaacgtcttctctctccctgttgcagtctggtggagtggatgcctgaaggccggtcttcccccagcggcg七gcgtggrtgactggscgtgaggcgtcctcacgcctgacctgatgggcagcctcttcctct3catgctccgtctccgggt站agcagaggtgcctggcacccggactacttccgrtgccctccaccgtgcccacctcccagccggtgtacacccagcaagctcaaaaagcccgtactggatgcgctga^ca^gtaccctggtcacctgaggtcacaggactggcggcttctatcaccgtggacaacggtcatacccatcagcacactgtgcgagccgtctcctcgcacctctggtgacggtgtctcctggggggcccggfgatgaccagcgacatcgcctcccgttgcct3cctgragcctccaccgggcscagcgaggactctaccaaatcttgtaccgtcagtcgtacgtggaccgccgtggaggctgg3ctcc(14)限定了全长人源化Hu2B8Hv5a.1重链可变区和人IgGl(Glm(17，1)同种异型)重链恒定区的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.167)1evqlvqsgaenpsfqghvti181yslsswtvp241vflfppkpkd301y;rwsv工t:vlvkKpges工:cisadksistayssslgtqtyiIi<jdLwlrig}ceylqwsslkasdaalgclvkdycnvrlhkpsnt361knqy曰ltclvkgfypsdiavewesngqp已n421gnvfscsvmhealhnhytq3cslslspgktywmhwvrqmpg!kglewmgeinptngh仁nytamyycarnyvgsifdywgqgtlvtvssasfpepvtvswnsgailtsgvlitfpavlgssglkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsdpevkfnwyvdgvevhnaJctkp:reeqynstap丄ekt丄sk3kgqpi:epqvytlppsrdeltnyktitppvldsdgsfflyskltvdksrwgg(15)编码人源化Hu2B8Hv5-51,1重链可变区的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEOIDNO,168)161gtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcc121tgtaagggttctggatacagctttaccacctactggatgcactgggtgcgccagatgccc181gggaaaggcctggagtggatgggggagattaatcctaccaacggtcatactaactacaat241ccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagctgacaagtccatcagcactgcctacctg301cagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagaaactatgtt361ggtagcatctttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcag(16)限定了人源化Hu2B8Hv5-51.1重链可变区序列的蛋白盾岸列(没有信号序列)(SEOIDNO.169)1evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysfttywmhwvrqmpgkglewmgei叩tnghtny61npsfqgqvtisadksistayqwsslkasdtamyycarnyvgsifdywgqgtlvtvss(17)编码全长人源化Hu2B8Hv5-51.1重链可变区和人IgGl(Glm(17，1)同种异型)重链恒定区的核酸序列(下划线的为信号序Mi卿IDNO.170)1atgrqggtcaaccgcca匕cctcgcc:ctcctcctggctgttctccaagqagtctgtgccgaa61121181241301361421481541601"17217818413013611021108111411201ccgtccttccggtsgcatctgccctgggctggcgccctgacgtg匕ggtcatgcaaggtctgggcagcccctgggagagcagaicggctccttgcagtctggtggagtggatgcctgaaggcttgactactggcgtggtgactgcat站tgctcttcctcta■ctttaccacccaccatctcagcscaccttccgtgccctccaccgtgcccaggtgta_C￡iccaaaaagcccgtactggatgcgctg3c的gtgccatgtattaccctggtca_tcctcc3agaccggctgtccagcagcttggctcatgatctcctgaggtcaccgcgggagg"ggcttctatcaccgtggacaactgggtgcgactgtgcgagccgtctcctcgcacctcitggtgacggtgtctcctggggggcccggaccccccagcgacatc:gcctcccgtagagcaggtgtgcctacctgagcctccsccgggcacagcgaggactcta_cgtacgtggaccagc这cgtaccgccgtggaggctggac仁ccgcagcagggg1321aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggCtc:tgcac;aaccactacacgcagaagaqc1331ctctccctgtctccgggtasatga(18)限定了全长人源化Hu2B8Hv5-51,1重链可变区和人IgGl(Glm(17，l)同种异型)重链恒定区的蛋白盾序列(没有信号序列)(SEQIDNO.171)1evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysfttyvrmhwvrqmpgkglevmgei叩tnghtny61npsfqgqytisadksistaylqwsslkasdtamyycamyvgsifdywgggtlvtvssas121仁kgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssgrl181yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggps241vflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqjoist301yrwsvltvlhgdwlngkeykckvsnkalpapieJctiskakgqprepqvytlppsrdelt361knqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwgg421g:ivfscsvnihealhnhytqkslslspgk(19)编码人源化Hu2B8Kvl-39.1Kappa链可变区的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.172)。两个可能的起始ATG以大些字母示出。1ATGgacATGagggtccccgctcagptcctp;g印ctcctgetactct路ctccgag弥cg.61agat魄acatecagatgacccagtotccatcctccctgtctgcatctgtaggagacaga121gtcaccatt;acttgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtatcagcag181aaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatggggcatccaaccggaacactggggtc241ceatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctg301caacctgaagattttgcaacttactactgtgggcagagttacaactatocgtacacgttt361ggccaggggaccaagctggagateaaac(20)限定了人源化Hu2B8Kvl-39.1Kappa链可变区的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.173)1diqmtqspsslsasvgdrvtitckasenvvsyvswyqqkpgkapklliygasnmtgvps61rfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycgqsynypytfgqgttcleik(21)编码人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因2)的核酸序列(SEQIDNO.174)1gaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcag'ttgaaatctg61gaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagt121ggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggaca181gcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga241aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaaga301gcttcaacaggggagagtg"ttga(22)限定了人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因2)的蛋白质序列(SEQIDNO.175)。第一个氨基酸得自可变区最后一个核苷酸和Kappa轻链序列的开始两个核苷酸的翻译产物。irtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcitartfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqd61skdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(23)编码全长人源化Hu2B8Kvl-39.1轻链可变区和人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因2)的核酸序列(下划线的为信号序蕴鹏IDNO.176)1atgrgacatgagggtccccgctcagctcctggggctcctgctactctggctccgagrgtgrcc:61agatgEgacatccagatgacccagftctccafccctccctgtctgcatc仁gtaggagracaga12工gtcaccatcact仁gcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctggtatcagcag181aaaccagggaaatgcccctaagctcctgatctatggggca/tccaaccggaacactggggtc241ccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagELtttcactctcaccatcagcagtctg301caacctgaagsttttgcaact仁actactgtgggcagagttacaactatccgtacacgttt361ggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc421ccgccatctgra匕gagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac481ttctatcccagagaggrccaaag匕acagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaac541tcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccSOIctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaag仁ctacgcctgcgeiagtcaccceLtcagg^cctgagc仁cgrcccgt:cacaaagagcttcaacaggggsgagtgttga(24)限定了全长人源化Hu2B8KvI-39.1轻链可变区和人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因1)的蛋白质序列(SEQIDNO.177)1diqmtqspsslsasvgdrvtitckasenwsyvswyqqkpgkapklliygasnrntgvps61rfsgsgsgtdf仁ltisslqpedfatyycgqsynypytfgggtkleikrtvaapsvfifpp121sdeglksgrtaswcllnnfypreakvgwkvdnalgsgnsgesvteqdskdstyslsstlt1811s]cadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(25)编码人源化Hu2B8Kv3-15.1轻链可变区的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.178)1.atgga雄ccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactggg61gaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccacc121ctctcctgcaaggccagtgagaatgtgglttcttatgtatcctggtaccagcagaaacct181ggccaggctcccaggctcctcatctatggggcatccaaccggaacactggtatcccagcc241aggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctoaccatcagcagcetgcagtct301gaagattttgcagtttattactgtgggcagagttacaactatccgtacacgtttggccag361gggaccaagctggagatcaaac(26)限定了人源化Hu2B8Kv3-15.1轻链可变区的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.179)1eivmtqspatlsvspgeratlsckasenwsyvswyqqkpgqaprUiygasnrntgipa61rfegsgsgteftltisslqsedfavyycgqsynypytfgqgtkleik(27)编码全长人源化Hu2B8Kv3-15.1轻链可变区和人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因2)的核酸(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.180)latggaagccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaetgga61gaasi仁agtgafcgacgcsgtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccacc121ctctcctgcaaggccagtgagaatgtggtttcttatgtatcctgrgtaccagrcagaaacct181ggccaggctcccaggctcctcatctatggggcaitccaaccggaacactggtatcccagcc241aggttcagtggcagtg的tctgrggacagagrttcactctcaccatcagcagcctgcagtct301gaagattttgcagtttattactgtgggcagagttacaactatccgtacacgtttggccag361gggaccaagctgg3g3tc站acgaactgtggctgcacceitctgtcttcatcttcccgcca421fcctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctat481cccagugaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactccesg541gag的tgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagrcagcaccctgacg601ctg的cSaagcagactacgagaaacax:aEi&gtctacgcctgcg站gtcacccatcagggc661ctgagctcgcccgtc3c3a3gagcttcaacaggggagagtg"ttga(28)限定了人源化Hu2B8Kv3-15.1轻链可变区和人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因2)的蛋白质序列(没有信号序蕴(SEQIDNO.181)1eivmtqspatlsvspgeratlsckasenwsyvswyqgkpggaprlliygasnmtgiparfs柳sgteftltisslqsedfavyycggsynypytfgqgtkleikrtvaapsvfifpp121sdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsqesvteqdskdstyslsstlt181lskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec为了方便，表13提供了本部分中讨论的抗体的全长序列与序列表中列出的那些序列之间的对应关系的索引表。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>B.人源化方法2用于减小小鼠2B8抗体免疫原性的第二种人源化方法是基于Studnicka等人(1994)PROTEINENG.7:805-814中所述的方法。鉴定出与小鼠2B8的重链可变区和kappa链可变区的同一性最高(在氨基酸的水平上)的重链和kappa链人种系可变区。根据残基变化影响结合或免疫原性的可能的风险，将在小鼠与人之间不同的残基转换成人的序列。在重链可变区(产生LR2B8HC)和kappa可变区(产生LR2B8LC),将低风险的残基(即，在其变化时可能不影响抗原的结合而且还会减小潜在的免疫原性的残基)变为人的氨基酸。此外，在重链可变区(产生LRMR2B8HC)和kappa可变区(产生LRMR2B8LC)中，将低风险和中等风险的残基(即，在其变化时稍有可能影响抗原的结合但是还会减小潜在的免疫原性的残基)变为人的氨基酸。将人IgGl重链恒定区(Glm(3)同种异型(等位基因l))加入到两个经改造的人重链可变区的羧基末端，并将人Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因l))加入到两个经改造的人轻链可变区的羧基末端，由此产生四个经改造的人抗体链。首先，通过基因合成的方法合成可变区核酸序列，然后将该序列加入到人恒定区序列中。将这些经改造的人抗体克隆到哺乳动物蛋白质表达载体中，而后以四种可能的重链加轻链的组合表达蛋白质。如下所述，使用常规的技术测定嵌合体、嵌合体/人源化抗体、或人源化抗体与人HGF的结合。编码每一种人源化抗体的核酸序列和限定每一种人源化抗体的蛋白质序列总结如下。在该部分中，每个可变区的最后一个核苷酸是由可变区/恒定区连接体所产生的下一个密码子的第一个碱基。该核苷酸包含在可变区中，这是因为其为外显子的一部分。以下所列的恒定区的氨基酸序列包含该连接体密码子的翻译产物。(1)编码人源化LR2B8HC重链可变区的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.182)1atgggctggtcatatattattctctttcttgttgctaccgctaccgatetgcactctcaa61gtccaactcgtacaaccaggcgctgaagtcgtaaaacccggaacatctgttaaactctca121tgcaaagwtcaggatacactttcacaacttactggatgcattgggtcaatcaagccccc181ggacaaggcctcgaatggat敏cgaaattaacccaactaacggacatactaattataat241gaaaaatttaagggcaaagctacactcaccgtcgataaatcaacctctacagcttatatg301gaactttcatccctgagatcagaagatacagcegt"actattgcgccagaaactacgta361ggatcaatattcgattactggggtcaaggcactotccteacagtcagctcag(2)限定了人源化LR2B8HC重链可变区的蛋白质序列(没有信号序蕴卿IDNO.183)1qvqlvqpgaewkpgtsvklsckasgytfttywmhwvnqapgqglewigeinptnghtny61nekfkgkatltvdkststaymelsslrsedtavyycarnyvgsifdywgqgtlltvss(3)编码人IgGl重链恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因l)的核酸序列(SEOIDNO.184)1ccagcaeaaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg61gcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt121824303642485460667278849096ggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagc3acaccsaggtggscaagagagttgagcccacgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca3ggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtg魄gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctocaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggteagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggggaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggaeaagagcaggtggcageaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga(4)限定了人IgGl重链恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因l或2)的蛋白质序列(SEQIDNO.185)。第一个氨基酸得自可变区最后一个核苷酸和IgGl重链序列的开始两个核苷酸的翻译产物。1astkgpsvf^)lapsskstsggtaalgclvkdy:Q3epvtvsvmsgaltsgvh饰avlqss61glysisswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellgg121psvflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvshedpevkfirwyvdgvevhnaktkpreeqyn181styrvvsvUvlhqdwlngkeykckvsnkalp汰piektiskakgqprepqvytlppsree24mtknqvsltelvkgfypsdiavewesngqpeimykttppvldsdgsfflyskltvdksrw301qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(5)编码全长重链人源化LR2B8HC重链可变区和人IgGl重链恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因l)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.si12118124130136nS41501721781841301102110811141120113211381186)tc仁c仁t仁c:仁t:qttqctacegctaccgatqtgca^ctctcsaggcgccctgattcctc匕t:cctgcgtggtggggcgtggaggcgtgtggtcatgggagagcactctccctgtcaggatacacccctgagstctcgattactggcctggtcaagcgtggtgacacacatgtcctggacgtgagrgcctg丑cctgtcttcc:tct:ac3tgctccgtcgctgaagtcgggtcaaggcggtgtacacctactggatgcgccgtctactccggctgtccagcagcttggccgcgggaggctgccccc:3tca^cctctacattgcgccagcagtcagctcgcacctctggtacsgtcctc:gcacccagactcctggggggagcagtacaatcaagcccccgggcacagcggtggaactcaaggactctacgtac:gtggaccagcacgtaccgccgtggag(6)限定了全长重链人源化LR2B8HC重链可变区和人IgGl重链恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因l)的蛋白质序列(没有信号序蕴卿IDNO.187)1qvqlvqpgae121tkgpsvfpla181yslss"V"V"tvp421gnvfscs"VTnhpsskstsggtscJcasgytftt:cwvdvshekckvsnkalptavyyca:mydpevkfnwyvnyJcttppvldpggglewigesgaltjsgvhtcdkthtcppcsdgsfflyskfpavlqssgltlpp33reemt11vd3csrwgg(7)编码人源化LRMR2B8HC重链可变区的核酸序列(下划线的为刊号序列)(SEQIDNO.188)1atgggttggtcatatattatactctttctcgtagccaccgccaccgacgtacactctcag61gttcaactcgtacaacecggcgccgaagtcaagaaaccaggaacatcagtcaaactctca121tgtaaagcaagcggatacacctttactacttattggatgcattgggtaagacaagccccc181ggacaaggactcgaatggataggcgaaataaatcccactaatggacatacaaattataat241caaaaatttcaaggacgcgctacactcaccgtcgataaatcaacctcaaccgcatacatg301gaactcagctccctccgatccgaagacactgccgtttattattgtgccagaaactatgta361ggatctattttegattactggggacaaggaacacttctcaccgtaagctoag(8)限定了人源化LRMR2B8HC重链可变区的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.189)1qvqlvqpgaevkkpgtsvklsckasgytfttywmhwvrqapgqglewigeinptnghtny61nqkfqgrattvdkststaymelsslrsedtavyycarnyvgsifdywgqgtlltvss(9)编码全长重链人源化LRMR2B8HC重链可变区和人IgGl重链恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因l)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.190)1atgggttggtcatatattat:actctttctcgtagccaccgccraccgacgt:acactctca^g61gttcaactcg121tgtaaag"cas181ggacaaggac241caaa_aatttc301gaactcagct361ggrstctattt421aa_gggcccat481gccctgggct541ggcgccctga601tccctcagca721g己ca^aactc781ttcctcttcc841tgcgtggtggMlggcgtggagg961cgtgtggtca1021tgcaaggtct1081gggcsgcccc1141aaccaggtca1201tgggagagcs1261gacggctcct1321a^cgtcttct1381ctctccc仁gtta_C￡tacccggccctccgatccggtcttcccgcctggtc3accagcggcgtgcgtggtgacacacatgtcctgcataatgcgcg匕cctcacccaa_ca_a_a_gcgcctgacctgtcttcctGtatacactcacccctggcacccgcacaccttcaccgtgcccacaaggacacccgtcctgcaccctccca^gccggtgtax:accgccgtttsttcccgaaccggccggctgtccgcacctgaacccgcggg&ggcaggactggcctgcccccatgrgcttctatcgaacatcagtatggacatacattgtgccagccgta^gctcgcacctctggt:ga>cggtgtcgcacccagacgagttgagcctcctggggggcccggaccccagttcaactgt:ga^SLtggcaacccgggaggscgcctcccgta^gagcaggtgcgcatacatggggcacagcggtgsraactcacaa^tcttgtaccgtcagtccagcacgtacggagtacaagcgccgtggaggctggactccgcagcagggg(10)限定了全长重链人源化LRMR2B8HC重链可变区和人IgGl重链恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因l)的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.191)1qvq!vqpgaevkkpgtsvklsckasgytft61nqkfggratltvdkststaymelsslrsed121tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdy181yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsnt241vflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshe301yrwsvltvlhgdwlngkeykckvsnkalp361knqvsltclvkgfypsdiavewesngqpen421gnvfscsvtrihealtohytqkslslspgktywmhwvrqapgqglewigeinptnghtnytavyycarnyvgsifdywgqgtlltvssasfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlgssglkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsdpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstapiektiskakgqprepqvytlppsreemtnykttppvlds&gsfflyskItvdksrwgq号序列)(SEQIDNO.192)1atg&aaa亿tcagacccttp;tattcatctotattcttctttg;g;ttgtatg:gagcagacgge61gacattgtgatgacccaatcccccgatagtatggccatgagtgtaggagaaagagteacc121cttaattgcaaagcctccgaaaatgtcgttteatatgtgtettggtatcaacaaaaaecc8]ggccaatcacccaaaettctcatatacggcgcttcaaacagaaacacaggcgttcccgac241agatttagtggatccggatoagctacagatttcacccttaccatcagttcagttcaagca30gaagacgttgcagactatcattgcggacaatcttataactacccttacacattcggacaa(12)限定了人源化LR2B8LC轻链可变区的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.193)1divmtqspdsmamsvgervtlnckasenwsyvswyqqkpgqspklliygasnrntgvpd61rfsgsgsatdftltissvqaedvadyhcgqsynypytfgqgtkleik(13)编码人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因1)的核酸序列(SEQIDNO.194)1gtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctg61gaaptgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagt121ggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggaca181gcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga241aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaaga301gcttcaacaggggagagtgttag(14)限定了人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因1)的蛋白质序列(SEQIDNO.195)。第一个氨基酸得自可变区最后一个核苷酸和Kappa轻链序列的开始两个核苷酸的翻译产物。1rtvaapsvfi;^jpsdeqlksgtaswcllnrrfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqd61skdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfhrgec(15)编码全长人源化LR2B8LC轻链可变区和人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因l)的核酸序列(SEQIDNO.196)1atggaaagtcagacccttgtat匕catctctattcttctttgffttgtatggagcagacggc61geicattgtgatgacccaatcccccgatsgtatggccatgagtgtaggagsaagagtcaxrc121cttaattgcaaagcctccgaaaatgtcgtttcat逸tgtgtcttggtatca3caaaa3ccc181ggccaatcacccaaacttctcstatacggcgcttcaaacaga站cacaggcgttcccgac241agatttagrtgga仁ccggatcagctacagatttcacccttaccatcagttcagttcaagca301gaagaegttgcagactatcattgcggacaatcttataactaccc"acacattcgg3caa361ggaaccaaactcgaaattsaacgtacggtgg"Ctgcaccatctgtcttcatcttcccgccs421tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcrctgctgaataacttct&t481cc:c3gagag5rcc36iagtacagtggaaggtggataa^cgccctccaatcgggtaactcccag"541gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacg601ctgagcaaagcagactacgagaaacaca貼gtctacgcctgcgaagtcacccatcagggc,ctgagctcgcccgtcacasagagcttcasc的gggagagtgttag(16)编码人源化LR2B8LC轻链可变区和人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因l)的蛋白质序列(SEQIDNO.197)1divmtcjspdsmamsvgervtlnckasenwsyvswyg妙pggspiciliygasrurxi仁gvpdSirfsgsgsat:dftltissvqaedvadyhcggsynypytfgqgtkleikrtvaapsvfifpp121sd已cjlJcsgtaswcllrmfyprealcv^qwkvdnalqsgnscje曰vteqdskdstyslss匕lt18;ilskadyekhkvyacevthqglsspvt]csfnrgec信号序列)(SEQIDNO.198)1atggaatcccaaacccttgttttcatctctatccttctctggctttatggcgccgacgga61gacatcgtaatgacacaatcccctgactctcttgctatgagcttgggcgaacgagtaaca121cttaactgcaaagcatccgaaaatgtcgtatcttacgtatcctggtatcagcaaaaacct18〗ggtcaaagtcctaaacttcttatatatggtgcaagtaatcgtgaaagtggcgtcecagae24agatttagcggttcaggttcagcaaetgaetttacacttacaatttctagcgttcaggcc301gaagacgttgcagactatcattgtggacaatcttataactatccttatactttcggacaa361ggcactaaacttgaaattaaac(18)限定了人源化LRMR2B8LC轻链可变区的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.199)1divmtqspdslamslgervtlnckasenwsyvswyqqkpgqspklHygasnresgvpd61rfsgsgsatdftltissvqaedvadyhcgqsynypytfgqgtkleik(19)编码全长人源化LRMR2B8LC轻链可变区和人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因1)的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.200)gcttgggcgagtga站gtggc站tttctagc仁gtcttcatgcctgctgaatcc站tcggggcctcagcaggcgaagrtcacgttag3cgagt貼cacgtccc叫accgttcaggcccttcccgccataax;ttctatcaccc仁gacg1atggaatcccaaacccttgttttcatctctatccttctctggctttatggcgccgacgga61gacatcgtaatgacacaatcccctgactc仁cttgctatgagcttgggcgaacgagtaaca121cttaactgcaaagcatccgaaaatgtcgtatcttacgtat181ggtcaaagtcctaaacttcttatatatggtgca叫taatc241agatttagcggttcaggttcagcaactgactttacactta301gaagacgttgcagactatcattgtggacaatc仁tataact361ggcactaaacttgaaattaaacgtacggtgg*ctgcaccat421tctgatgagcagttguaettctggaactgcctctgttgtgt481cccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccc541gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctaca501etgagrcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcct561ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt(20)限定了全长人源化LRMR2B8LC轻链可变区和人Kappa链恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因l)的蛋白质序列(SEQIDNO.201)1divmtgspdslamslgervtlnckaseriwsyvswygqJcpggspklliyga犯resgvpd61rfsgsgsatdftltissvcjaedvadyhcggsynypytfgqgtkleikrtvaapsvfifpp121sdecjlksgtaswcllnnfyprealcvqwkvdnalqsgnsqesvtecjdskdstyslsstl匕181lskadyekhkvyacevthq;glsspvtksfnrgec为了方便，表14提供了本部分中讨论的抗体的全长序列与序列表中列出的那些序列之间的对应关系的索引表。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>白质198LRMR2B8LC轻链可变区-核酸199LRMR2B8LC轻链可变区-蛋白质200LRMR2B8LC+Kappa恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因1)-核酸201L應2B8LC+Kappa恒定区(Km(3)同种异型)(等位基因1)—蛋白质化方法2制备的人源化2B8抗体的重链CDR序列(Kabat定义)。表15抗体CDR1CDR2CDR3全长重链可变区小鼠2B8重链TY丽H(SEQIDNO:15)EINPTNGHTNYNEKFKS(SEQIDNO:16)NYVGSI丽(SEQIDNO:17)SEQIDNO:12Hu2B8Hvlf.1TYWMH(SEQIDNO:15)EINPT歸TNY匿FQG(SEQIDNO:202)NYVGSIFDY(SEQID歐17)SE()IDNO:159Hu2B8Hv5a.1TYWMH(SEQIDNO:15)EINPTNGHT謂PSFQG(SEQIDNO:203)NYVGSI丽(SEQIDNO:17)SEQIDNO:165Hu2B8Hv5-5L1T濯H(SEQIDNO:15)EINPT歸T歸PSFQG(SEQIDNO:203)譜GSIFDY(SEQIDNO:17)SEQIDNO:169LR2B8HCTYWMH(SEQIDNO:15)EINPT歸TNYNEKFKG(SEQIDNO:204)NYVGSI丽(SEQIDNO:17)SEQIDNO:183函R2B8HCTYWMH(SEQIDNO:15)EINPT腦TNY,FQG(SEQIDNO:205)NYVGSIFDY(SEQIDNO:17)SEQIDNO:189化方法2制备的人源化2B8抗体的轻链CDR序列(Kabat定义)。106表16<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>C.人源化2B8抗体的结合亲和力使用BIAcoreTIOO装置通过表面等离子体共振来评估抗体结合亲和力以及相互作用的动力学。使用胺偶联(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，才艮据制造商的建议，通过标准的偶联方法将小鼠抗人免疫球蛋白(JacksonImmunoResearchLabs，209-005-098)固定于羧甲基化的葡聚糖CM4的传感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1005-34)上。在25。C下，使用PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作为运行緩沖剂进行分析，所述PBS含有0.05%表面活性剂P20(BIAcore，CatalogNo.BR—1000-54)、2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)以及IOmg/mLCM—葡聚糖的钠盐(Fluka，CatalogNo.86524)。抗体^皮捕获在流速为10ML/min的单个流动的细胞上。用于每种抗体的注射时间是可变的，从而使每个循环中捕获大约20RU的抗体。以60liL/min的速度向参照表面(没有被捕获的抗体)和活性表面(捕获了待测试的抗体)上依次注射緩沖剂或稀释于运行緩冲剂中的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)，时间为2分钟。才艮据浓度，对解离相监测15或90分钟。然后在开始另一个循环之前，使用10mMpH2.0的甘氨酸-HCl(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-55)使所述的表面再生，其中所述甘氨酸-HC1在3分钟内以60jaL/min的流速注入。所测试的HGF的浓度为1.88、3.75和7.5nM。利用BIAevalutation软件的动力学函数及推荐的差级，确定动力学参数。每种抗体的动力学参数(ka(结合速率常数)，kd(解离速率常数)和K。(平衡解离常数))总结于图8中。图8总结的结果表明，超级人源化重链(Hu2B8Hv5a.1、Hu2B8Hv5-51.1或Hu2B8Hvl-f.1)和轻链(Hu2B8Kv卜39.1或Hu2B8Kv3-15.1)的某些组合保持了与嵌合体2B8(小鼠可变区与人恒定区)和2B8相同的与HGF的结合亲和力(Kd)(表5)。D.互斥结合分析使用BIAcoreT100装置通过表面等离子体共振技术来评估与HGF的互斥结合。4吏用胺偶联(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50),才艮据制造商的建议，通过标准的偶联方法将小鼠抗人免疫球蛋白(JacksonImmunoResearchLabs,209-005-098)固定于羧曱基化的葡聚糖CM5的传感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25。C下，使用PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作为运行緩冲剂来进行分析，所述PBS含有0.05%表面活性剂P20(BIAcore，#BR-1000—54)、2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)以及10mg/mLCM-葡聚糖的钠盐(Fluka，CatalogNo.86524)。人源化的抗体净皮捕获在流速为30jaL/min的单个流动的细胞上。用于每种抗体的注射时间是可变的，从而使每个循环中捕获大约150RU的抗体。以30juL/min的速度向捕获的人源化的抗体上注射稀释于运行緩冲剂中的最终浓度为7.5Mg/mL的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)，时间持续90秒。监测HGF的结合，随后以30jaL/min的速率注入小鼠2B8抗体或多克隆山羊抗HGF的抗体(R&DSystems,AF294)，时间持续3分钟。然后在开始另一个循环之前，^f吏用10mMpH2.0的甘氨酸-HCl(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-55)使所述的表面再生，其中所述甘氨酸-HCl是在3分钟内以60pL/min的流速注入。所得结果总结于图9中。图9中总结的结果表明，人源化的2B8抗体和嵌合体2B8抗体二者都抑制了小鼠2B8与HGF的结合。这些结果证明，人源化的抗体仍如同原始的2B8抗体结合相同的HGF表位。实施例13—人源化的2B8变体的制备a.HUMANENGINEEREpTM抗体的人轻链(分别为LR2B8LC和LRMR2B8LC)和重链(分别为LR2B8HC和LRMR2B8HC)同步克隆到XOMA的瞬时抗体表达载体中，该载体含有人Kappa和Gamma-l恒定区结构才莫块(module)。通过瞬时转染到HEK293E细胞中产生4种经改造的人2B8变体。所产生的4种抗体如下HE2B8-1=LR2B8HC(+IgGl恒定区(Glm(3)同种异型(等位基因l))(SEQIDNO.187)+LR2B8LC(+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因l)))(SEQIDNO.197)HE2B8-2=LR2B8HC(+IgGl恒定区(Glm(3)同种异型(等位基因l))(SEQIDNO.187)+LRMR2B8LC(+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因l)))(SEQIDNO.201)HE2B8-3=LRMR2B8HC(+IgGl恒定区(Glm(3)同种异型(等位基因l))(SEQIDNO.191)+LR2B8LC(+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因l)))(SEQIDNO.197)HE2B8-4=LRMR2B8HC(+IgGl恒定区(Glm(3)同种异型(等位基因l))(SEQIDNO.191)+LRMR2B8LC(+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因l)))(SEQIDNO.201)将轻链和重链共转染到XOMA的悬浮适应HEK293E细胞中，所述细胞培养在2升的摇瓶的IS293培养基(IrvineScientific,Irvine,CA)中。在摇瓶中24小时后，对200mL的转染细胞离心，然后重悬于40mL的新鲜培养基中并转移至Integra烧瓶(WilsonWolfManufacturing公司，MN)中，用于生产。温育7天后，将细胞悬浮液从Integra瓶中取出，离心，并保留培养物上清液。在蛋白质A离心柱(Pro-Chem)上纯化培养物上清液中的抗体，然后用PBS透析，再进行浓缩和除菌过滤。b.SUPERHUMANIZEDTM抗体利用Hindlll和EcoRI限制性位点，将全长Hu2B8一Hv5-51.1+人IgGl恒定区(Glm(3)同种异型)cDNA克隆到pEE6.4(LonzaBiologies,Berkshire,UK)中。利用Hindlll和EcoRI限制性位点，将全长Hu2B8—Kvl-39.1可变区+人Kappa恒定区cDNA、以及全长Hu2B8-Kv3-15.1可变区+人Kappa恒定区cDM分别克隆到pEE14.4(LonzaBiologies)中。通过Notl/SalI消化，移取hCMV-MIE启动子+全长Hu2B8—Hv5-51.1+人IgGl恒定区结构域(Glm(3)同种异型)cDNA+SV40polyA片段(在pEE6.4中)，并通过Notl/Sail位点，插入到任一个Kappa链pEE14.4载体中，由此产生2个不同的表达载体，每一贯都同时表达重链和轻链，从而产生以下抗体sh2B8-9(Glm(3))=hu2B8Hv5-51.1(+IgGl恒定区(GLm(3)同种异型)(等位基因2))(SEQIDNO.210)+hu2B8Kv1-39.1(+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因2)))卿IDNO:177)sh2B8-12(Glm(3))-hu2B8Hv5-51.1(+IgGl恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因2))(SEQIDNO.210)+hu2B8Kv3-15.1(+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因2")卿IDNo.181)以下列出编码人IgGl重链恒定区Glm(3)同种异型(等位基因2)以及每种全长重链序列的核酸序列、以及限定了人IgGl重链恒定区Glm(3)同种异型(等位基因2)以及每种全长重链序列的蛋白质序列。轻链序列与实施例12中所述的相同。(1)编码人IgGl重链恒定区(Glm(3)同种异型)(等位基因2)的核酸序列(SEQID亂207)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage111</formula>(2)限定了人IgGl重链恒定区(Gltn(3)同种异型)(等位基因l或2)的蛋白质序列(SEQIDNO.208)。第一个氨基酸得自可变区最后一个核苷酸和IgGl重链序列的开始两个核苷酸的翻译产物。1astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvh饰aviqss61glyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrv邻kscdkthtcppcpapellgg121psvf!Q)pkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfhwyvdgvevhnaktkpreeqyn181styrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsree241mtknqvsltclvkg:fypsdiavewesngqpennykttppvIdsdgsfflyskltvdksrw301qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(3)编码含有人源化的Hu2B8Hv5-51.1重链可变区和人IgGl重链恒定区Glm(3)同种异型(等位基因2)的全长链的核酸序列(下划线的为信号序列)(SEQIDNO.209)1atggggtcaaccgccatcc:tcgccctcct:ccfcggcrtgtfcctccaaggagtctgfcgqcsraa61gtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagpcccggggagtctctgaagatctcc121tgtaagggttctggatacagctttaccacctactggatgcactgggtgcgccagatgccc181gggaaaggcctggagtggatggrgggagrattaatcctaccaac的tcatactaactacaat241ccgtccttccetaggcrcaggtcaccettctcagctga_caagtccatcagcactgcctacctg301cagtggagcagcctgaaggcctcggracaccgccatgtattactgtgcgagaaactatgtt361ggtagcatctttgactacrtggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccscc421aagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcsu:ctctgggggcacagcg481gccctgggctgcctgsrtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgt將aactca54工grgcgccctgaccsgcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctac601tccctcagcagcgtgrgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgc661aacgtgaatcacaagfccceigcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgt721gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctga^ctcctggggggaccgtcagtc781ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca841tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac901ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac961cgrtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcacca的actggctgaa/tggcaaggagtacaag1021tgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaagaccatctccaaagccaaa1081ggg"cagc:c:crcgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatccc的gaggagatgaccaag1141aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag1201tgggagagrcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc1261gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg1321aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc1381ctctccctgtctccgggtaaatga(4)限定了含有人源化的Hu2B8Hv5-51.1重链可变区和人IgGl重链恒定区Glm(3)同种异型(等位基因2)的全长重链的蛋白质序列(没有信号序列)(SEQIDNO.210)1evqlvgsgaevkkpgeslkisckgsgysfttywmhwxa:qmpgkglewmgeinptnghtny61npsfggqvtisadJcsistaylgwsslkasdtamyycamyvgsifdywgggtlvtvssas12:1tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepv匕vswnsgaltsgvhtfpavlgssgl181yslsswtvpssslg仁qtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscd3cthtcppcpapellggps241vflfppkpkdtlmisrtpevtcvwcivshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynst301yrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemt361knqvsltclv3cg"fypsd丄avewesngqperinykttppvldsdgsfflyskItvdksrwgg421grivfscsvmhealhnhy仁g)cslslspgk将每个双表达载体都转染到293T细胞中，并使用含有10%胎牛血清的DMEM进行瞬时表达。转染48小时后，将细胞用含有4mML-谷氨酰胺的无血清培养基ISGRO(IrvineScientific,SantaAna，CA)洗涤，并用该培养基代替原来的培养基。每天收集上清液，并用新的培养基代替收集的上清液，如此持续10天。将培养物上清液离心，过滤(0.45jam)并浓缩10-100倍。在ProSepvA树脂(Mi11ipore)上纯化抗体，并用PBS透析，再进行浓缩和除菌过滤。实施例14一人源化2B8变体的结合特性实施例13中制备的人源化的抗体以及实施例3中制备的重组HGF112蛋白质通过它们结合hHGF的能力来表征。使用BIAcoreTl00装置通过表面等离子体共振来分析抗体以评估其结合hHGF和实施例3中讨论的融合蛋白质的能力。使用胺偶联(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，根据制造商提供的说明书通过标准的偶联方法将每种抗体固定于羧甲基化的葡聚糖CM5的传感器芯片(BIAcore,CatalogNo.BR-1006-68)上。在25。C下，使用PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)作为运行緩沖剂来进行分析，所述PBS含有0.05%表面活性剂P20(BIAcore，CatalogNo.R—1000-54)、2rag/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)和10mg/mLCM-葡聚糖的钠盐(Fluka，CatalogNo.86524)。将含有不同HGF融合蛋白质的上清液或得自经空载体转染的细胞的上清液以30jLiL/min的流速注射到每种抗体上，时间持续3分钟。在注射完毕后30秒时，在基线上，以共振单位(RU)测定所得的结合。将结合与稀释于运行緩沖剂中的人HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)相比较。通过将结合与对照表面相比较，监测到不存在特异性的结合。结果总结于表17中。表17抗体r跳F,rmHGF(歸MHM嵌合体MHM嵌合体MHM嵌合体Systems)Systems)(495-585)(507-585)(499-556)2B8结合不结合结合结合结合HE2B8-1结合不结合结合结合结合HE2B8-2钍会z口口不结合结合结合结合HE2B8-3结合不结合结合结合结合HE2B8-4结合不结合结合结合结合sh2B8-9结合不结合结合结合结合(Glm(3))sh2B8-12结合不结合结合结合结合(Glm(3))表17中的结果表明，每种基于人源化的2B8的抗体以及所有的3中小鼠_人-小鼠嵌合体都结合rhHGF。实施例15—人源化2B8变体的结合亲和力113使用表面等离子体共振测定表15中列出的抗体的结合亲和力以及相互作用的动力学。4吏用胺偶联(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50),根据制造商提供的说明书通过标准的偶联方法将小鼠抗人免疫球蛋白(JacksonLabs,CatalogNo.209-005)固定于羧曱基化的葡聚糖CM4的传感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)上。在25。C下，使用含有0.05%表面活性剂P20(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-54)和2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)的PBS(GIBCO，CatalogNo.14040-133)进行分析。抗体被捕获在流速为10yL/min的单个流动的细胞上。用于每种抗体的注射时间是可变的，从而使每个循环中捕获大约20RU的抗体。以60yL/min的速度向参照表面(没有被捕获的抗体)和活性表面(捕获了待测试的抗体)上依次注射緩沖剂或稀释于运行緩沖剂中的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)，时间持续2分钟。才艮据浓度，对解离相监测15或90分钟。然后在开始另一个循环之前，使用10mMpH2.2的甘氨酸-HC1(BIAcore,CatalogNo.BR-1003-54)使所述的表面再生，其中所述的甘氨酸-HCl是在3分钟内以60juL/min的流速注入的。所测试的HGF的浓度为0.46nM至7.5nM。利用BIAevalutationTM软件的动力学函数及推荐的差级，确定动力学参数。每种抗体的动力学参数(ka(结合速率常数)，kd(解离速率常数)以及Kd(平衡解离常数))总结于表l8中。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>这些数据表明，人源化的抗体具有快的结合速率(u、极慢的解离速率(kd)和极高的亲和力(KD)。具体而言，所述抗体的亲和力为2.0-12pM。实施例16—比较25匸下和37'C下的结合亲和力使用表面等离子体共振，在不同的条件下测定抗体HE2B8-4、sh2B8-9、sh2B8-12以及小鼠2B8的结合亲和力以及相互作用的动力学。使用胺偶联(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-50)，才艮据制造商提供的说明书通过标准的偶联方法将小鼠抗人免疫球蛋白(JacksonLabs，CatalogNo.209-005)或兔抗小鼠免疫球蛋白(BIAcore,CatalogNo.BR-1005-14)固定于羧甲基化的葡聚糖CM4的传感器芯片(BIAcore,CatalogNo.BR-1006-68)上。在25°C下测定抗体sh2b8-9和sh2B8-12时，4吏用CM5传感器芯片(BIAcore，CatalogNo.BR-1006-68)。在25。C和37°C下，使用含有0.05%表面活性剂P20(BIAcore，CatalogNo.BR-1000-54)和2mg/mLBSA(EMD，CatalogNo.2930)的PBS(GIBC0，CatalogNo.14040-133)作为运行緩冲剂来进行分析。抗体被捕获在流速为10ML/min的单个流动的细胞上。用于每种抗体的注射时间是可变的，从而使每个循环中捕获大约20RU的抗体。以60juL/min的速度向参照表面(没有被捕获的抗体)和活性表面(捕获了待测试的抗体)上依次注射緩冲剂或稀释于运行緩沖剂中的HGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)，时间持续2分钟。根据浓度，对解离相监测15或90分钟。然后在开始另一个循环之前，^f吏用10mMpH2.2的甘氨酸-HC1(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-54)使小鼠抗人免疫球蛋白传感器芯片的表面再生，其中所述的甘氨酸-HC1是在3分钟内以60jaL/min的流速注入的。在开始另一个循环之前，1"吏用10mMpH1.7的甘氨酸-HC1(BIAcore，CatalogNo.BR-1003-54)使兔抗小鼠免疫球蛋白传感器芯片的表面再生，其中所述的甘氨酸-HCl是在3分钟内以60inL/min的流速注入的。所测试的HGF的浓度为0.46nM至7.5nM。利用BIAevaluation软件的动力学函数及推荐的差级，确定动力学参数。每种抗体的动力学参数(ka(结合速率常数)，kd(解离速率常数)以及Kd(平衡解离常数))总结于表19中。表19抗体温度rc)Ul/Ms)Ul/s)KD(pM)2B8251.6xl062.lxl(T513.52B8372.8xl061.3xl0—54.5HE2B8-4252.Oxl061.2xl(T55.6HE2B8-4373.lx1061.Oxl(T53.3sh2B8-9(Glm(17,l))252,0x1061.7xl(T58.1sh2B8-9(Glm(3))372.5xl061.4xl(r55.8sh2B8-12(Glm(17,l))251.9xl062.3xl(T512.0sh2B8-12(Glm(3))372.4xl061.lx10—54.8如所预计的那样，结合速率常数随着温度的升高而升高。另人惊奇地是，解离常数没有随着温度的相应升高而明显改变。因此，总体的平衡解离常数(U比生理温度(37'C)下的平衡解离常数小大约1.4至3倍(亲和力更高)。实施例17—人源化的2B8变体的中和活性表征实施例14制备的抗体的(a)抑制hHGF与c-Met结合的能力以及(b)抑制4MBr-5细胞中由引入的BrdU所刺激产生的HGF的能力。按照以下所述进行HGF-Met的结合抑制分析(中和分析)。通过ELISA检测抗体抑制hHGF与c-Met结合的能力。具体而言，在4X:下，将Wallac96孑LDELFIA分析平板(Wallac/〉司，CatalogNo.AAAND-OOOl)用100jaL碳酸盐包被緩沖剂(15mMNa2C03和34mM116Na跳，pH9.0)中的6.25jug/mLHGF(R&DSystems,CatalogNo.294-HGN-025)包被16小时。然后，在室温下将该分析平板用200jnLPBS中的5°/。非脱脂奶粉封闭1小时。在单独的分析平板中，通过将浓度升高的处于研究中的抗体(O.033-250nM，2倍系列稀释)加入到2nM生物素标记的c-Met中来制备该抗体，其中所述的c-Met溶于含有5%由非脱脂奶粉的PBS中。根据制造商提供的说明书，以10:1的生物素c-Met的比例(Pierce,CatalogNo.21335)对c-Met(翻Systems,CatalogNo.358-MT/CF)进行生物素标记。将每孔中的100iaL样品转移至分析平板中，并在室温下温育2小时。然后，将所得分析平板用PBS-0.1。/。Tween20洗涤3次，并在室温下，与Eu标记的链霉亲和素(Wallac，CatalogNo.1244-360)温育1小时，其中Eu标记的链霉亲和素以1:1000的比例稀释于DELFIA分析緩沖液(Wallac，CatalogNo.4002-0010)中。将所得板用DELFIA洗涤液(Wallac，CatalogNo.4010-OOIO)洗涤3次，并在室温下与100juL/孔的DELFIA增强溶液(Wallac#4001-0010)搅拌温育15分钟。使用铕示踪法，在Victor3V仪器(PerkinElmer)上读取所述平板。使用Prism计算IC5。的值。所得的ICs。值示于表20中。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表20的结果表明，所测试的人源化的抗体有效地中和HGF与c-Met的结合。此外，在实施例7(b)所述的细胞增殖分析中，对表17中的抗体也进行了测试。结果总结于表21中。表21抗体IC5。(nM)SD2B80.860.35阻B8-10.470.15HE2B8-20.660.13HE2B8-30.550.28HE2B8-40.580.26sh2B8-9(Glm(3))0.520.11sh2B8-12(Glm(3))0.810.22表212的结果表明，所有测试的人源化的抗体都抑制HGF诱导的4MBr-5细力包的增殖。实施例18—人源化2B8变体的抗扩散活性在实施例8所述的抗扩散分析中，对表17中的抗体进行测试。结果总结于表22中。表22对HGF诱导的MDCK细胞扩散的抑制抗体试验1试验22B8++++HE2B8-1++++HE2B8-2++++HE2B8-3++++HE2B8-4++++sh2B8-9(Glm(3))++++sh2B8-12(Glm(3))++++-不抑制+++极强，接近完全抑制++强烈抑制+可检测程度的抑制表22中的结果表明，所有测试的人源化抗体对HGF诱导的扩散的118抑制程度都与小鼠单克隆抗体2B8的抑制程度相同。实施例19—对HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制在实施例9所述的c-Met磷酸化分析中，对表17中的抗体进4亍测试。结果总结于表23中。表23抗体2次试验的平均值标准误差2B80.910.02HE2B8-10.800.04HE2B8-20.880.15HE2B8-30.790.05HE2B8-40.750.14sh2B8-9(Glm(3))0.930.03sh2B8-12(Glm(3))0.810.07表23的结果表明，所有测试的人源化的抗体都是PC-3细胞中HGF诱导的c-Met磷酸化的有效抑制剂。实施例20—U87MG异种移植物模型中的肿瘤抑制在U87MG异种移植物模型中，测试本发明的人源化单克隆抗体抑制肿瘤生长的能力。在37。C下在含有5%0)2和95%空气的气氛的培养中扩增U87MG细胞(ATCC)，其中包括含有10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和100jag/mL链霉素的Dulbecco'sModifiedEagle培养基(DMEM)的培养基。对细胞进行次级培养，并通过使用胰蛋白酶-EDTA移取培养皿壁上的细胞进行维持。通过胰蛋白酶消化来收集接近汇合的细胞，随后将50%Matrigel(BDBiosciences;catalogno.356237)中的5xl06个细胞皮下注射到7周龄雌性ICRSCID小鼠(TaconicLabs)的肩胛骨之间的背部上侧的区域中。使用卡尺测量肿瘤的长直径(U和短直径(W)(mm)。如下计算肿瘤的体积(vol.):体积(mm3)=LxW2/2。当肿瘤生长到大约200119mm3时，将带有肿瘤的小鼠随机分成5组，每组10只小鼠。一组小鼠接受PBS，一组小鼠接受人IgG对照。其他4组中的每组小鼠接受人源化的抗体(HE2B8-1、HE2B8-2、HE2B8-3和HE2B8-4)中的一种。所有抗体的剂量均为0.25mg/kg体重，每周2次，并通过腹膜内注射5个剂量。每星期记录2次肿瘤的体积和小鼠的体重。利用学生t检验分析胂瘤生长的抑制。所测试的人源化的抗体在体内是有活性的。HE2B8-1的肿瘤生长抑制为57%，其p值为0.02;HE2B8-2的肿瘤生长抑制为61%，其p值为0.02;HE2B8-3的肿瘤生长抑制为85°/。，其p值为0.0004;而HE2B8-4的肿瘤生长抑制为74%,其p佳为0.001。没有观察到明显的体重损失。在肋侧皮下接种U87MG肺瘤的雌性NCR棵鼠(TaconicLabs)中，如上所述进行随后的研究。每组小鼠(每组10只)都以0.5rag/kg的量接受以下治疗中的一种PBS载体对照、huIgG对照、HE2B8-4或sh2B8-9。在最少5个星期内，每周2次腹膜内给予治疗。每个治疗组都表现为相似的肿瘤衰退，其中sh2B8-9的肿瘤生长抑制为113%，HE2B8-4的胂瘤生长抑制为115%,而最短的肿瘤生长延迟为30天。所述两种治疗的耐受性均良好，并且明显的体重没有损失。通过引用并入本文为所有目的，本文所提及的每份专利文献和科学文章的全部公开内容均以引用方式并入本文。等价物本发明可以表现为其他具体形式，而不脱离本发明的精神或基本特征。因此，上述实施方案在任何情况下都被认为是示意性的，而不是限定本文所述的发明。因此，本发明的范围由所附的权利要求书而不是上述说明来表明，并且在与权利要求等价的意义和范围内的所有改变都被认为包含在本发明的范围内。权利要求1.一种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含(a)包含结构CDRL1-CDRL2-CDRL3的免疫球蛋白轻链可变区，其中(i)CDRL1包含氨基酸序列X1X2SerX4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15，其中氨基酸X1为Arg、Lys或Ser，X2为Ala或Thr，X4isGlu、Gln或Ser，X5为Asn、Asp或Ser，X6为Ile或Val，X7为Asp、Lys、Ser、Val或Tyr，X8为肽键或Tyr，X9为肽键或Asp，X10为肽键或Gly，X11为肽键或Asn，X12为肽键、Ile或Ser，X13为Asn或Tyr，X14为Ile、Leu、Met或Val，X15为Ala、Asn、His或Ser，(ii)CDRL2包含氨基酸序列X16X17X18X19X20X21X22，其中氨基酸X16为Ala、Asp、Arg、Gly或Val，X17为Ala、Thr或Val，X18为Asn、Ser或Thr，X19为Arg、Asn、Lys或His，X20为Leu或Arg，X21为Ala、Asn、Glu、Val或Pro，X22为Asp、Ser或Thr，以及(iii)CDRL3包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X28ProX30Thr，其中氨基酸X23为Leu、Gly或Gln，X24为His或Gln，X25为Phe、Ser、Trp或Tyr，X26为Asp、Ile、Ser、Trp或Tyr，X27为Gly、Glu、Asn或Ser，X28为Asp、Asn、Phe、Thr或Tyr，X30为Leu、Phe、Pro或Tyr；以及(b)包含3个互补性决定区的免疫球蛋白重链可变区，其中所述的免疫球蛋白轻链和所述的免疫球蛋白重链的互补性决定区限定了结合人HGF的结合位点。2.—种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含(a)包含结构CDRH1-CDRH2-CDR^的免疫球蛋白重链可变区，其中(i)CDIU包含氨基酸序列XJyrX^Xs,其中氨基酸Xi为Asp、Asn、Ser或Thr，乂3为Phe、Ser、Trp或Tyr，X4为Ile、Leu或Met,Xs为Asn、His或Ser,(ii)CDRH2包含氨基酸序列XJleXsXAJuGlyXuXnX15TyrX17X18X19X2。X21X22，其中氨基酸X6为Lys、Gln、Glu、Val或Tyr,Xs为Asn、Gly、Ser、Trp或Tyr,X,为Ala、Pro或Ser，乂10为Gly或Thr，Xn为肽键、Asp、Asn、Gly或Ser，义13为Asp、Asn、His、或Ser，X"为Ser或Thr,Xs为Asn或Tyr,X17为Asn或Pro,Xu为Ala、Asp、Gly、Glu、Pro或Ser,乂19为Asn、Lys、Met或Ser，X;。为Leu、Phe或Val，Xn为Lys、Met或Gln，X"为Asp、Gly或Ser,(iii)CDRH3包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X28X29X3。X31X32X33X34Tyr，其中氨基酸X23为Arg、Asn、Gln或Glu，X"为Gly、Leu、Arg或Tyr，X25为肽键、Asp或Gly，XM为肽键或Gly,Xu为肽键或Tyr，X^为肽键、Leu或Tyr,X"为肽键、Gly、Leu、Arg或Val，X3。为肽键、Asp、Gly或Glu,X"为肽键、Asn、Arg、Ser或Tyr,X"为肽键、Ala、Gly、lie或Tyr，X33为Met或Phe,X^为Ala或Asp;以及(b)包含3个互补性决定区的免疫球蛋白轻链可变区，其中所述的免疫球蛋白轻链和所述的免疫球蛋白重链的互补性决定区限定了结合人HGF的结合位点。3.权利要求2所述的分离的抗体，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含结构CDRL1-CDRLfCDRL3,其中(i)CDRu包含氨基酸序列XJJerX^X^XJJwXuXuXJJ",其中氨基酸X!为Arg、Lys或Ser，X2为Ala或Thr,X4isGlu、Gln或Ser，义5为Asn、Asp或Ser，Xe为lie或Val，X为Asp、Lys、Ser、Val或Tyr，Xs为肽键或Tyr,Xs为肽键或Asp,X^为肽键或Gly，Xu为肽键或Asn，Xu为肽键、lie或Ser,Xn为Asn或Tyr,X14为Ile、Uu、Met或Val，乂15为Ala、Asn、His或Ser，m)CDRL2包含氨基酸序列XJnXwXnX2。Xj22，其中氨基酸Xw为Ala、Asp、Arg、Gly或Val，Xn为Ala、Thr或Val，乂18为Asn、Ser或Thr，Xw为Arg、Asn、Lys或His，X2。为Leu或Arg，乂21为Ala、Asn、Glu、Val或Pro，X22为Asp、Ser或Thr,以及(iii)CDRu包含氨基酸序列X23X2J25X26X27X28ProX3。Thr，其中氨基酸X"为Leu、Gly或Gln，XM为His或Gln，X"为Phe、Ser、Trp或Tyr，)(26为Asp、Ile、Ser、Trp或Tyr，X"为Gly、Glu、Asn或Ser，乂28为Asp、Asn、Phe、Thr或Tyr,X"Uu、Phe、Pro或Tyr。4.权利要求l、2或3所述的结合蛋白质，其中所述互补性决定区被插在框架区之间。5.权利要求4所述的结合蛋白质，其中所述CDR序列被插在人或人源化的框架区之间。6.—种分离的核酸，其包含编码权利要求1所述的免疫球蛋白轻链可变区的核苷酸序列。7.—种表达载体，其包含权利要求6所述的核苷酸序列。8.—种宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体。9.一种制备结合蛋白质的方法，该方法包括(a)在一定条件下培养权利要求8所述的宿主细胞，使得该宿主细胞表达所述免疫球蛋白轻链可变区；以及(b)收集所述免疫球蛋白轻链可变区。10.权利要求9所述的方法，其中在步骤(b)后，将所述免疫球蛋白轻链可变区与所述免疫球蛋白重链可变区共价连接，使得所述轻链与重链可变区一起结合人HGF。11.一种分离的核酸，其包含编码权利要求2所述的免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列。12.—种表达载体，其包含权利要求11所述的核苷酸序列。13.—种宿主细胞，其包含权利要求12所述的表达载体。14.一种制备结合蛋白质的方法，该方法包括(a)在一定条件下培养权利要求13所述的宿主细胞，使得该宿主细胞表达所述免疫球蛋白重链可变区；以及(b)收集所述免疫球蛋白重链可变区。15.权利要求14所述的方法，其中在步骤(b)后，将所述免疫球蛋白重链可变区与所述免疫球蛋白轻链可变区共价连接，使得所述轻链与重链可变区一起限定了结合人HGF的结合位点。16.—种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含(a)包含结构CDRu-CDl^-CDRu的免疫球蛋白轻链可变区；其中(i)CDRu包含选自SEQIDNO.8(1A3)、SEQIDNO.18(2B8)、SEQIDNO.28(2F8)、SEQIDNO.38(3B6)、SEQIDNO.48(3D11)、SEQIDNO.58(1D3)、SEQIDNO.68(1F3)和SEQIDNO.78(3A12)的序列，(ii)CDRu包含选自SEQIDNO.9(1A3)、SEQIDNO.19(2B8)、SEQIDNO.29(2F8)、SEQIDNO.39(3B6)、SEQIDNO.49(3D11)、SEQIDNO.59(1D3)、SEQIDNO.69(1F3)和SEQIDNO.79(3A12)的序列，(iii)CDRu包含选自SEQIDNO.10(1A3)、SEQIDNO.20(2B8)、SEQIDNO.30(2F8)、SEQIDNO.40(3B6)、SEQIDNO.50(3D11)、SEQIDNO.60(1D3)、SEQIDNO.70(1F3)和SEQIDNO.80(3A12)的序列；以及(b)免疫球蛋白重链可变区，其中所述免疫球蛋白轻链可变区和所述免疫球蛋白重链可变区一起限定了用于结合人HGF的单个结合位点。17.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.8(lA3)的CDRu,(ii)包含序列SEQIDNO.9(1A3)的CDRu，以及(iii)包含序列SEQIDNO.10(1A3)的CDRU。18.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.18(2B8)的CDR^，(ii)包含序列SEQIDNO.19(2B8)的CDRu，以及(iii)包含序列SEQIDNO.20(2B8)的CDRL3。19.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.28(2F8)的CDR山(ii)包含序列SEQIDNO.29(2F8)的CDRu,以及(iii)包含序列SEQIDNO.30(2F8)的CDRU。20.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.38(3B6)的CDR山(ii)包含序列SEQIDNO.39(3B6)的CDRu，以及(Ui)包含序列SEQIDNO.40(3B6)的CDRU。21.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.48(3D11)的CDR"，(ii)包含序列SEQIDNO.49(3D11)的CDRL2,以及(iii)包含序列SEQIDNO.50(3D11)的CDRL3。22.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.58(1D3)的CDR山(ii)包含序列SEQIDNO.59(1D3)的CDRl"以及(iii)包含序列SEQIDNO.60(1D3)的CDRL3。23.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.68(lF3)的CDRu，(ii)包含序列SEQIDNO.69(1F3)的CDRl2，以及(iii)包含序列SEQIDNO.70(1F3)的CDRU。24.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.78(3A12)的CDRL1，(ii)包含序列SEQIDNO.79(3A12)的CDRu，以及(iii)包含序列SEQIDNO.80(3A12)的CDRL3。25.权利要求16所述的结合蛋白质，其中CDRu、CDRu和CDRu被插在人或人源化的免疫球蛋白框架区之间。26.权利要求16所述的结合蛋白质，其中所述结合蛋白质为抗体或其抗原结合片段。27.权利要求26所述的结合蛋白质，其中所述抗体为单克隆抗体。28.—种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含(a)包含结构CDR『CDRpu-CDRH3的免疫球蛋白重链可变区；其中(i)CDRm包含选自SEQIDNO.5(1A3)、SEQIDNO.15(2B8)、SEQIDNO.25(2F8)、SEQIDNO.35(3B6)、SEQIDNO.45(3D11)、SEQIDNO.55(1D3)、SEQIDNO.65(1F3)和SEQIDNO.75(3A12)的序列，(U)CDRh2包含逸自SEQIDNO.6(1A3)、SEQIDNO.16(2B8)、SEQIDNO.26(2F8)、SEQIDNO.36(3B6)、SEQIDNO.46(3D11)、SEQIDNO.56(1D3)、SEQIDNO.66(1F3)、SEQIDNO.76(3A12)、SEQIDNO.202(Hu2B8Hvlf.l)和SEQIDNO.203(Hu2B8Hv5a.1和Hu2B8Hv5-51.l)的序列,(iii)CDRH3包含选自SEQIDNO.7(1A3)、SEQIDNO.17(2B8)、SEQIDNO.27(2F8)、SEQIDNO.37(3B6)、SEQIDNO.47(3D11)、SEQIDNO.57(1D3)、SEQIDNO.67(1F3)和SEQIDNO.77(3A12)的序列，以及(b)免疫球蛋白轻链可变区，其中所述免疫球蛋白重链可变区和所述免疫球蛋白轻链可变区一起限定了用于结合人HGF的单个结合位点。29.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(U包含序列SEQIDNO.5(1A3)的CDIW,(ii)包含序列SEQIDNO.6(1A3)的CDRh2，以及(iii)包含序列SEQIDNO.7(1A3)的CDRH3。30.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.15(2B8)的CDRh"(n)包含序列SEQIDNO.16(2B8)、SEQIDNO.202(Hu2B8Hvlf.1)或SEQIDNO.203(Hu2B8Hv5a.1和Hu2B8Hv5-51.1)的CDRH2,以及(iii)包含序列SEQIDNO.17(2B8)的CDRH3。31.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(U包含序列SEQIDNO.25(2F8)的CDRh，(ii)包含序列SEQIDNO.26(2F8)的CDRm，以及(iii)包含序列SEQIDNO.27(2F8)的CDRH3。32.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.35(3B6)的CDRm,(ii)包含序列SEQIDNO.36(3B6)的CDRh2,以及(iii)包含序列SEQIDNO.37(3B6)的CDRH3。33.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(U包含序列SEQIDNO.45(3D11)的CDRH1,(ii)包含序列SEQIDNO.46(3D11)的CDRH2，以及(iii)包含序列SEQIDNO.47(3D11)的CDRH3。34.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.55(1D3)的CDRh"(ii)包含序列SEQIDNO.56(1D3)的CDRh2，以及(iii)包含序列SEQIDNO.57(1D3)的CDRH3。35.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.65(1F3)的CDRh"(ii)包含序列SEQIDNO.66(1F3)的CDR们，以及(iii)包含序列SEQIDNO.67(1F3)的CDRH3。36.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(i)包含序列SEQIDNO.75(3A12)的CDRH1，(ii)包含序列SEQIDNO.76(3A12)的CDRH2，以及(iii)包含序列SEQIDNO.77(3A12)的CDRH3。37.权利要求28所述的结合蛋白质，其中CDRH1、CDRm和CDRh3被插在人或人源化的免疫球蛋白框架区之间。38.权利要求28所述的结合蛋白质，其中所述结合蛋白质为抗体或其抗原结合片段。39.权利要求38所述的结合框架，其中所述抗体为单克隆抗体。40.—种分离的核酸，其包含编码权利要求16所述的免疫球蛋白轻链可变区的核苷酸序列。41.一种表达载体，其包含权利要求40所述的核酸序列。42.—种宿主细胞，其包含权利要求41所述的表达载体。43.—种制备结合蛋白质的方法，该方法包括(i)在一定条件下培养权利要求42所述的宿主细胞，使得该宿主细胞表达所述免疫球蛋白轻链可变区；以及(ii)收集所述免疫球蛋白轻链可变区。44.权利要求43所述的方法，其中在步骤(b)后，将所述免疫球蛋白轻链可变区与所述免疫球蛋白重链可变区共价连接，使得所述轻链与重链可变区一起结合人HGF。45.—种分离的核酸，其包含编码权利要求28所述的免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列。46.—种表达栽体，其包含权利要求45所述的核酸。47.—种宿主细胞，其包含权利要求46所述的表达载体。48.—种制备结合蛋白质的方法，该方法包括(i)在一定条件下培养权利要求47所述的宿主细胞，使得该宿主细胞表达所述免疫球蛋白重链可变区；以及(ii)收集所述免疫球蛋白重链可变区。49.权利要求48所述的方法，其中在步骤(b)后，将所述免疫球蛋白重链可变区与所述免疫球蛋白轻链可变区共价连接，使得所述轻链与重链可变区一起限定了能够结合人HGF的结合位点。50.—种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，其选自SEQIDNO.4(1A3)的残基21-127、SEQIDNO.14(2B8)的残基21-127、SEQIDNO.24(2F8)的残基20-131、SEQIDNO.34(3B6)的残基23-129、SEQIDNO.44(3D11)的残基23-128、SEQIDNO.54(1D3)的残基21-127、SEQIDNO.64(1F3)的残基21-127、SEQIDNO.74(3A12)的残基2卜127、SEQIDNO.173(Hu2B8Kv卜39.1Kappa链可变区)以及SEQIDNO.179(Hu2B8Kv3-15.1Kappa链可变区)；以及免疫球蛋白重链可变区，其选自SEQIDNO.2(1A3)的残基20-141、SEQIDNO.12(2B8)的残基20-137、SEQIDNO.22(2F8)的残基20-137、SEQIDNO.32(3B6)的残基20-139、SEQIDNO.42(3D11)的残基20-132、SEQIDNO.52(1D3)的残基20—141、SEQIDNO.62(1F3)的残基20-141、SEQIDNO.72(3A12)的残基20-141、SEQIDNO.159(Hu2B8Hvlf.1重链可变区)、SEQIDNO.165(Hu2B8Hv5a.1重链可变区)以及SEQIDNO.169(Hu2B8Hv5-51.1重链可变区)。51.权利要求50所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.4(1A3)的残基21-127的氨基酸序列，而所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.2(1A3)的残基20-141的氨基酸序列。52.权利要求50所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.14(2B8)的残基21-127的氨基酸序列，而所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.12(2B8)的残基20-137的氨基酸序列。53.权利要求50所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.24(2F8)的残基20-131的氨基酸序列，而所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.22(2F8)的残基20-137的氨基酸序列。54.权利要求50所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.34(3B6)的残基23-129的氨基酸序列，而所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.32(3B6)的残基20-139的氨基酸序列。55.权利要求50所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.44(3D11)的残基23-128的氨基酸序列，而所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.42(3D11)的残基20-132的氨基酸序列。56.权利要求50所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.54(1D3)的残基21-127的氨基酸序列，而所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.52(1D3)的残基20-141的氨基酸序列。57.权利要求50所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.64(1F3)的残基21-127的氨基酸序列，而所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.62(1F3)的残基20-141的氨基酸序列。58.权利要求50所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含SEQIDNO.74(3A12)的残基21-127的氨基酸序列，而所述免疫球蛋白重链可变区包含SEQIDNO.72(3A12)的残基20-141的氨基酸序列。59.—种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，其选自SEQIDNO.173(Hu2B8Kvl-39.1轻链可变区)和SEQIDNO.179(Hu2B8Kv3-15.1轻链可变区)；以及免疫球蛋白重链可变区，其选自SEQIDNO.159(Hu2B8Hvlf.1重链可变区)，SEQIDNO.165(Hu2B8Hv5a.1重链可变区)以及SEQIDNO.169(Hu2B8Hv5-51.1重链可变区)。60.—种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区，其选自SEQIDNO.177(Hu2B8Kvl-39.l+kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因2))和SEQIDNO.181(Hu2B8Kv3-15.1+Kappa恒定区(Km(3)同种异型(等位基因2));以及免疫球蛋白重链可变区，其选自SEQIDNO.163(Hu2B8Hvlf.1+IgGl恒定区(Glm(17，1)同种异型))、SEQIDNO.167(Hu2B8Hv5a.1+IgGl恒定区(Glm(17，1)同种异型))、SEQIDNO.171(Hu2B8Hv5-51.1+IgGl恒定区(Glm(17，1)同种异型))和SEQIDNO.210(Hu2B8Hv5-51.1+IgGl恒定区Glm(3)同种异型(等位基因2))。61.权利要求50、59或60所述的结合蛋白质，其中所述结合蛋白质为抗体或其抗原结合片段。62.权利要求61所述的结合蛋白质，其中所述抗体为单克隆抗体。63.—种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含(i)包含3个互补性决定区的免疫球蛋白轻链可变区；以及(n)包含3个互补性决定区的免疫球蛋白重链可变区，其中所述免疫球蛋白轻链和所述免疫球蛋白重链的互补性决定区一起限定了结合还原的人HGF的结合位点。64.权利要求63所述的结合蛋白质，其中所述结合蛋白质为抗体或其抗原结合片段。65.权利要求64所述的结合蛋白质，其中所述抗体为单克隆抗体。66.权利要求63所述的结合蛋白质，其中所述互补性决定区被插在框架区之间。'67.权利要求63所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链为IgGl。68.权利要求63所述的结合蛋白质，其中所述结合蛋白质与包含在561位置处的半胱氨酸被精氨酸取代或者在5"位置处的甘氨酸被谷氨酸取代的人HGF结合。69.权利要求63所述的结合蛋白质，其中所述结合蛋白质结合人HGF的oc链。70.权利要求63所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含至少1个互补性决定区(CDR),该互补性决定区选自CDRU、CDRL2和CDRL3，其中CDRu包含氨基酸序列X^SerXAUXsUXuX;^"其中氨基酸Xi为Arg或Lys，X2为Ala或Thr，X4isGlu或Gln，Xs为Asn、Ser或Asp，X6为Ile或Val，X7为Tyr、Asp或Lys,Xs为肽键或Tyr，X9为狀键或Asp，Xm为肽键或Gly，Xn为肽键或Asn，X^为肽键或Ser，Xu为Asn或Tyr,Xn为Ile或Leu,Xu为Ala、Asn或Ser,其中CDRu包含氨基酸序列X16X17X18X19LeuX21X22,其中氨基酸X16为Ala、Asp、Val或Arg，X17为Ala或Val，X18为Asn、Ser或Thr，X19为Arg、Asn或His,X^为Ala、Glu、Val或Pro,X22为Asp或Ser，以及其中CDRu包含氨基酸序列X23X24X25X26X27X2SProX3Jhr，其中氨基酸X23为Leu或Gin,X24为His或Gln，X"为Phe、Ser或Tyr,X"为Asp、lie或Trp，Xn为Gly或Glu,X2S为Asp、Phe或Thr，X^为Phe、Pro或Tyr。71.权利要求63或70所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含至少1个CDR，该CDR选自CDRu、CDRl2和CDRl"其中CDIU包含氨基酸序列XJyrX3X4X5，其中氨基酸X!为Asp、Asn、Ser或Thr，乂3为Phe、Trp或Tyr,X卩为lie或Met，Xs为Asn、His或Ser，其中CDRH2包含氨基酸序列X6IleX8X9GlyXGlyX13X14X15TyrX17X18X19X2。LysX22，其中氨基酸l为Lys、Gin或Tyr，l为Gly、Ser或Tyr，X9为Pro或Ser,Xu为Asp、Gly或Ser，Xu为Asp或Ser，X"为Ser或Thr,X"为Asn或Tyr，X17为Asn或Pro,Xu为Ala、Asp、Gly或Glu，Xw为Asn、Met或Ser，X2。为Phe或Val，X22为Asp或Gly，以及其中CDRH3包含氨基酸序列X23X2J25X26X27X28X29X3。X31X32X33AspTyr，其中氨基酸X23为Arg或Gln，Xw为Gly或Leu，Xu为Asp、Gly或肽键，X26为Gly或肽键，X"为肽键或Tyr,X28为Leu、肽键或Tyr,X"为Gly、Arg或Uu,X3。为Asp、Gly或Glu,Xn为Tyr、Arg或Asn，X"为Ala、Gly或Tyr,X^为Met或Phe。72.权利要求70所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链包含(i)CDRLI,其包含选自SEQIDNO.8(1A3)、SEQIDNO.28(2F8)、SEQIDNO.38(3B6)、SEQIDNO.58(1D3)和SEQIDNO.68(1F3)的序列，(ii)CDRL2,其包含选自SEQIDNO.9(1A3)、SEQIDNO.29(2F8)、SEQIDNO.39(3B6)、SEQIDNO.59(1D3)和SEQIDNO.69(1F3)的序列，以及(iii)CDRL3，其包含选自SEQIDNO.10(1A3)、SEQIDNO.30(2F8)、SEQIDNO.40(3B6)、SEQIDNO.60(1D3)和SEQIDNO.70(1F3)的序列。73.权利要求72所述的结合蛋白质，其中所述CDR序列插在人或人源化的框架区之间。74.权利要求72所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白轻链包含选自SEQIDNO.4(1A3)的残基21-127、SEQIDNO.24(2F8)的残基20-131、SEQIDNO.34(3B6)的残基23-129、SEQIDNO.54(1D3)的残基21-127以及SEQIDNO.64(1F3)的残基21-127的氨基酸序列。75.权利要求71所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含(i)CDRH1，其包含选自SEQIDNO.5(1A3)、SEQIDNO.25(2F8)、SEQIDNO.35(3B6)、SEQID亂55(1D3)和SEQIDNO.65(1F3)的序列，(ii)CDRH2，其包含选自SEQIDNO.6(1A3)、SEQIDNO.26(2F8)、SEQIDNO.36(3B6)、SEQIDNO.56(1D3)和SEQIDNO.66(1F3)的序列，以及mi)CDRH3，其包含选自SEQIDNO.7(1A3)、SEQIDNO.27(2F8)、SEQIDNO.37(3B6)、SEQIDNO.57(1D3)和SEQIDNO.67(1F3)的序列。76.权利要求75所述的结合蛋白质，其中所述CDR序列插在人或人源化的框架区之间。77.权利要求75所述的结合蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链可变区包含选自SEQIDNO.2(1A3)的残基20-141、SEQIDNO.22.(2F8)的残基20-137、SEQIDNO.32(3B6)的残基20-139、SEQIDNO.52(1D3)的残基20-141以及SEQIDNO.62(1F3)的残基20-141的氨基酸序列。78.—种分离的核酸，其包含编码权利要求63、70、72或74所述的免疫球蛋白轻链可变区的核苷酸序列。79.—种表达载体，其包含权利要求78所述的核酸序列。80.—种宿主细胞，其包含权利要求79所述的表达载体。81.—种分离的核酸，其包含编码权利要求63、71、75或77所述的免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列。82.—种表达载体，其包含权利要求81所述的核酸序列。83.—种宿主细胞，其包含权利要求82所述的表达载体。84.—种结合人肝细胞生长因子(HGF)的分离的结合蛋白质，该结合蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，其中所述分离的结合蛋白质与至少1种参照抗体竟争性地结合HGF，所述参照抗体选自(i)具有SEQIDNO.24(2F8)的残基20-131的免疫球蛋白轻链可变区和SEQIDNO.22(2F8)的残基20-137的免疫球蛋白重链可变区的抗体，(ii)具有SEQIDNO.34(3B6)的残基23-129的免疫球蛋白轻链可变区和SEQIDNO.32(3B6)的残基20-139的免疫球蛋白重链可变区的抗体，以及(iii)具有SEQIDNO.44(3D11)的残基23-128的免疫球蛋白轻链可变区和SEQIDNO.42(3D11)的残基20-132的免疫球蛋白重链可变区的抗体。85.权利要求84所述的结合蛋白质，其中所述结合蛋白质结合与参照抗体之一相同的HGF的表位。86.—种分离的结合蛋白质，其与人肝细胞生长因子(HGF)结合的L为4.OxlO一5s—i或更低。87.权利要求86所述的结合蛋白质，其中L为3.0xl(T5s^或更低。88.权利要求87所述的结合蛋白质，其中h为2.0x10—5s—!或更低。89.—种分离的结合蛋白质，其与人肝细胞生长因子(HGF)特异性结合的L为20pM或更低。90.权利要求89所述的结合蛋白质，其中K。为10pM或更低。91.权利要求90所述的结合蛋白质，其中K。为5pM或更低。92.—种分离的结合人肝细胞生长因子(HGF)的结合蛋白质，其中所述抗体在37。C下结合人HGF的K。比该抗体在"。C下结合人HGF的KD更低。93.权利要求92所述的结合蛋白质，其中所述结合蛋白质在37°C下的K。小于5pM。94.一种抑制或减少肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括将所述细胞暴露于有效量的权利要求1、2、3、16、28、50、59、60、63、70、71、72、74、75、77、84、86或89所述的结合蛋白质中，从而抑制或减少所述肿瘤细胞的增殖。95.—种抑制或减少肿瘤细胞增殖的方法，该方法包括将所述细胞暴露于有效量的结合蛋白质中，从而抑制或减少所述肿瘤细胞的增殖，其中所述结合蛋白质特异性地结合人HGF、但基本不减小人HGF与c-Met结合的能力。96.权利要求95所述的方法，其中所述结合蛋白质包括权利要求22、23、24、34、35、36、56、57、58、84、86或89所述的结合蛋白质。97.权利要求94或95所述的方法，其中所述肿瘤细胞为人肿瘤细胞。98.—种抑制或减少哺乳动物中肿瘤生长的方法，该方法包括将所述哺乳动物暴露于有效量的权利要求1、2、3、16、28、50、59、60、63、84、86、89或92所述的结合蛋白质中，从而抑制或减少肿瘤的增殖。99.一种治疗哺乳动物中肿瘤的方法，该方法包括施用有效量的权利要求1、2、3、16、28、50、59、60、63、84、86、89或92所述的结合蛋白质。100.权利要求98或99所述的方法，其中所述哺乳动物为人。全文摘要本发明申请提供一种结合肝细胞生长因子(HGF)(特别是人HGF)并中和其活性的结合蛋白质家族。所述结合蛋白质可以用作诊断剂和/或治疗剂。就其治疗活性而言，所述结合蛋白质可用于治疗某些HGF应答的紊乱，例如某些HGF应答的肿瘤。文档编号C07K16/18GK101460521SQ200780020154公开日2009年6月17日申请日期2007年6月1日优先权日2006年6月2日发明者B·伊特麦德-吉尔伯森,C·克尼赫,J·久里斯,L·布劳尔特,M·韩,S·K·赖特,W·M·小温斯特,杰林申请人:Aveo制药公司