多特异性结构域交换共有可变轻链抗体的制作方法
【专利说明】多特异性结构域交换共有可变捏链抗体
[0001] 本发明设及基于共有可变轻链结构域(VL)和两个不同可变重链结构域(V出和V也） 的修饰多特异性抗体、其制备和用途。
【背景技术】
[0002] 本领域已知诸如能够结合两种或多种抗原的双特异性或多特异性抗体的改造蛋 白质。运类多特异性结合蛋白质可W用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生。
[0003] 最近发展了多种重组多特异性抗体型式，例如通过例如IgG抗体型式(format)和 单链结构域的融合产生的四价双特异性抗体（参见例如Coloma，M . J .等，Nature Biotech.15(1997)159-163;WO 2001/077342;和Morrison，S丄.，化ture Biotech.25 (2007)1233-1234)。
[0004] 在一种方法中，用四源杂交瘤(qua化oma)技术(参见Milstein，C.和化ello，A.C.， Nature 305(1983)537-540)产生了与天然抗体非常相似的双特异性抗体，该四源杂交瘤技 术基于表达具有希望得到的双特异性抗体特异性的鼠单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞 系的体细胞融合。由于两种不同抗体重链和轻链在所得到的杂种杂交瘤(或四源杂交瘤)细 胞系内的随机配对，产生至多十种不同的抗体种类，其中只有一种是希望得到的功能性双 特异性抗体。由于错配副产物的存在和显著降低的生产产率，需要用于复杂纯化流程的手 段（参见例如Morrison,S丄.，化ture Biotech. 25(2007) 1233-12:34)。一般而言，错配副产 物的相同问题在使用重组表达技术时仍然存在。
[000引在WO 98/50431中，在多特异性抗体中使用共同轻链W阻止轻链和重链的错配，但 是，WO 98/50431的方法使用通过所谓的"巧入白"技术(Ridgway，J.B. ,Protein Eng.9 (1996)617-621;和WO 96/027011)异二聚化的不同重链。在WO 98/50431中，观察到高产率 的具有异二聚化（"巧-白"）重链的抗体。但是，也观察到了一些同二聚体形成（"白-白"或 "巧-巧"）。通过用隧菌体展示法重塑两个CH3结构域的相互作用表面，并在两个CH3结构域 之间引入二硫键来稳定异二聚体，可W进一步提高异二聚化重链的百分比(Merchant A.M 等，化Uire Biotech 16(1998)677-681 ;Atwell，S.等，J.Mol.Biol.270( 1997)26-35)。例如 EP 1870459A1中描述了使用巧入白技术的原理的新方法。运种策略的一个重要限制是，两 种亲本抗体的轻链必须100%-致，W防止错配和形成无活性分子。与从头产生的抗体相配 的共同轻链的开发仍具有挑战。因此，此技术不适合用于从抗第一和第二抗原的两种不同 抗体起始，容易地开发抗两种抗原的重组、双特异性抗体，因为必须优化运些抗体的重链 和/或相同的轻链。
[0006] WO 2012/023053设及使用共同重链的双特异性抗体。鉴于普遍存在的产生共同链 的困难，W及尤其因为双特异性抗体的结合特性必须仅通过抗第一和第二抗原的两种不同 轻链来赋予而没有重链的任何贡献，此方法甚至更受限而不是广泛适用。鉴于认为在大部 分抗体中重链高变区尤其是例如重链的互补决定区3(CDR3-H)对抗体与其祀抗原的结合特 性很重要运一事实，运是明显的限制。
[0007] WO 2009/080252设及二价、双特异性抗体，其中在两个抗体臂的仅一个中，交换了 重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，W通过产生由不同结构域建立的轻链来防止 轻链错配。
[000引发明概述
[0009] 本发明设及基于共同可变轻链结构域(VL)和两个不同可变重链结构域(本文中分 别称为第一结合特异性的可变重链结构域的V出和第二结合特异性的可变重链结构域的 VH2)的修饰多特异性抗体、其制备及其用途。
[0010] 本发明提供多特异性抗体，其中该抗体包含：
[0011] a)两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至UC册、CH2 和CHl，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)，其中该轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变 结构域；
[0012] b)-条、在一个实施方案中确切地为一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端 方向包含K同种型的恒定轻链结构域(CL)(本文称为乂U")和源自特异性结合第一抗原的 抗体的可变重链结构域(VHi);和
[0013] C)-条、在一个实施方案中确切地为一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端 方向包含A同种型的恒定轻链结构域(本文称为乂 LA")和源自特异性结合第二抗原的抗体 的可变重链结构域(VH2)。
[0014] 在本发明的抗体内，该可变结构域VHl和化形成特异性结合第一抗原的第一抗原 结合部位，该可变结构域VH2和VL形成结合第二抗原的第二抗原结合部位。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体是二价、双特异性抗体。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体属于IgG同种型。在本发明的一个实 施方案中，该多特异性抗体属于IgGi或IgG4亚类。在本发明的一个实施方案中，该多特异性 抗体属于IgGi亚类。
[0017] 本发明的一个方面是编码本发明的多特异性抗体的核酸。本发明的另一方面是包 含该核酸的表达载体，其中该表达载体能够在原核或真核宿主细胞中表达该核酸。本发明 的另一方面是包含该表达载体的原核或真核宿主细胞。
[0018] 本发明的一个方面是用于制备本发明的多特异性抗体的方法，其包括步骤：
[0019] a)用包含编码本发明的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
[0020] b)在允许合成该多特异性抗体分子的条件下培养该宿主细胞;和
[0021] C)从该培养物回收该多特异性抗体分子。
[0022] 本发明的一个方面是包含本发明的多特异性抗体和至少一种可药用赋形剂的药 物组合物。
[0023] 本发明的一个方面是用作药物的多特异性抗体。
[0024] 本发明的一个方面是用于治疗癌症的本发明的多特异性抗体。
[0025] 本发明的一个方面是本发明的多特异性抗体在制备药物中的用途。
[0026] 本发明的一个实施方案是本发明的多特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中 的用途。
[0027] 本发明的一个方面是用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于对该患者施用 治疗有效量的本发明的多特异性抗体。
[0028] 本发明的一个方面是用于产生基于特异性结合第一抗原的第一抗体和特异性结 合第二抗原的第二抗体的多特异性抗体的方法，其中该第一抗体和该第二抗体包含共同轻 链，该方法包括步骤：
[0029] a)通过用源自该第一抗体的重链的重链可变结构域（V出）取代轻链可变结构域 (VL)和可选地用K同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自该第 一抗体的轻链，W获得按C端至N端方向包含K同种型的恒定轻链结构域(CU)和重链可变结 构域(VHi)的轻链;和
[0030] b)通过用源自该第二抗体的重链的重链可变结构域(V出）取代轻链可变结构域 (VL)和可选地用A同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自该第 二抗体的轻链，W获得按C端至N端方向包含A同种型的恒定轻链结构域(CU)和重链可变结 构域(VH2)的轻链；
[0031] 及步骤C)和d)中的一个或两个：
[0032] C)通过用源自该第一抗体的轻链的轻链可变结构域（VL)取代重链可变结构域 (VHi),来修饰源自该第一抗体的重链，W获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至1 (C册、C肥和CHl，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)的重链；
[0033] d)通过用源自该第二抗体的轻链的轻链可变结构域（VL)取代重链可变结构域 (V出），来修饰源自该第二抗体的重链，W获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至1 (C册、C肥和CHl，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)的重链。
[0034] 在一个实施方案中，该方法进一步包括步骤：
[0035] -用包含编码本发明的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞；
[0036] -在允许合成该多特异性抗体分子的条件下培养该宿主细胞;和
[0037] -从该培养物回收该多特异性抗体分子。
[0038] 本发明的一个方面是通过该方法获得的多特异性抗体。
[0039] 本发明的多特异性抗体可W容易地从具有分别与共同轻链配对的不同重链可变 结构域(分别特异性结合第一和第二抗原）的两种抗体衍生。对于本发明的多特异性抗体， 没有必要例如通过巧入白技术或类似的异二聚化方法改造重链来确保异二聚体的结合。本 发明的抗体具有IgG样结构，并显示非常好的抗原结合特性。此外，就抗原结合而言，该抗体 显示高变异性，因为在本发明的抗体内，抗原结合主要由它的可变重链结构域赋予。运提供 了由抗原结合部位结合的广谱的可能表位，因为抗体内所有抗原结合区（CDR)的最高变异 性设及重链可变结构域的CDR3。因此，重链的CDR3通常主要负责特异性抗原或表位结合。总 的来说，运意味着在大多数抗体中，就抗体的抗原结合特性而言，重链可变结构域的CDR3内 的氨基酸修饰比所有其他CDR中的氨基酸修饰更不可耐受得多。
[0040] 此外，本发明的抗体可W良好的产率产生，且由于不同的恒定轻链结构域(K和入） 而可W通过K和A特异性纯化步骤容易地从其副产物如不想要的同二聚体分开。
[0041 ] 附图简述
[0042] 图1对一种抗原特异的全长IgG样抗体的示意图，该抗体具有分别按典型顺序包含 可变和恒定结构域的两对重链化C)和轻链化C)。
[0043] 图2A本发明的双特异性抗体的示意图，该双特异性抗体基于包含共同轻链的两种 抗体，特异性结合两种不同抗原(抗原1和抗原2)。通过重链和轻链可变结构域之间的结构 域交换，该双特异性抗体的重链包含该共同轻链的化结构域。该抗体包含两条不同轻链，其 中一条轻链包含该特异性结合抗原2的可变重链结构域和A同种型的恒定轻链结构域;且其 中另一条轻链包含该特异性结合抗原1的可变重链结构域和K同种型的恒定轻链结构域。显 示重链和两条不同轻链的可变和恒定结构域。
[0044]图2B本发明的特异性结合FAP和DR5的双特异性抗体的示意图。在该抗体内，使来 自抗-FAP(3C6)抗体的可变重链结构域(V此）与A同种型的恒定轻链结构域偶联，W形成第 一修饰轻链;使来自抗DR5 (2A11)抗体的可变重链结构域(V出)与K同种型的恒定轻链结构 域偶联，W形成第二修饰轻链。显示祀向部分和各轻链结构域。类似地产生了双特异性抗 体，但未分开显示，其中使来自抗-FAP(3C6)抗体的VH与化A结构域偶联，并使来自抗-DR5 (8E11)抗体的VH或来自抗-DR5 (21C11)抗体的VH与CLk结构域偶联。
[004引图3通过还原和非还原条件下的CE-SDS分析来分析本发明的特异性结合FAP和DR5 的双特异性抗体的纯度和分子量。电泳图谱显示为W下双特异性抗体的SDS-化ge: A)〈 FAP (3〔6)[化人]-〇35(8611)[化10]〉（还原），8)作4口（3〔6)[化人]-〇1?5(8611)[化10]〉（非还原），(：） 作八口（3〔6)[化人]-〇1?5(21(：11)[化10]〉（还原），〇)作4?(3〔6)[化人]-〇1?5(21(：11)[化10]〉（非还 原)。
[0046] 图4用抗-FAP和抗-DR5双特异性抗体〈FAP(3C6) [CU]-DR5(8E11) [CLk]作为实例， 通过LC-MS确认均质制备物。144697. IDa处的主峰对应于具有两个氧化位点的希望得到的 抗体分子的正确分子量。在LC-MS中未检测到包含两条K或两条A轻链的抗体分子。
[0047] 图5显示用于通过表面等离振子共振，检测特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体 与两种不同抗原的同时结合的测定设置的示意图。将人或食蟹猴DR5偶联至链霉抗生物素 蛋白忍片并用于固定双特异性抗体，而用非结合FAP来评估与FAP的抗原结合。
[0048] 图6表征本发明特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体的同时结合的检测的示例性 传感图。表面等离振子共振测量结果确认，本发明的双特异性抗体能够同时结合两种抗原 (通过分析〈FAP (3C6) [ CU ]-DR5 (2A11) [ CLk ]〉双特异性抗体(样本识别号 GA803_G25_H14D_ 001)获得的传感图的示例性图像）。
[0049] 图7来自细胞表面结合研究的结果。通过随后的FACS分析，在使用表达DR5的MDA-MB 231肿瘤细胞系的细胞结合研究中，评估了本发明特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体 与其抗原DR5的结合。所显示的是使用〈FAP(3C6) [CU]-DR5 (2A11)[化K]〉双特异性抗体(样 本识别号GA803_G25_H14D_001)的结合研究的结果。构建体W依赖浓度的方式结合MDA-MB 231细胞。
[0050] 图8来自细胞表面结合研究的结果。通过随后的FACS分析，在使用表达FAP的成纤 维细胞系GM05389的细胞结合研究中，评估了本发明特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体 与其抗原FAP的结合。所显示的是使用〈FAP(3C6)[CU]-DR5(2A11)[化K]〉双特异性抗体(样 本识别号GA803_G25_H14D_001)的结合研究的结果。构建体W依赖浓度的方式结合GM05389 细胞。
[0051 ] 图9在缺乏或存在表达FAP的成纤维细胞（细胞系GM05389)的情况下，用MDA-MB 231细胞评估了本发明S种双特异性抗体在表达DR5的MDA-MB 231肿瘤细胞中介导的调亡， 该双特异性抗体特异性结合DR5和FAP，且包含源自抗-DR5抗体克隆2A11、8E11和21C11 (分 别为样本识别号 GA803_G25_H14D_001、GA803_G27_H14D_001、GA803_G28_H14D_00)中任一 个的不同DR5结合部位的。所有构建体都能够在FAP的存在下，在MDA-MB 231细胞中介导调 亡。
[0052] 发明详述
[0053] 1.定义
[0054] 除非文中清楚地另有说明，术语"一"、"一个"和"该"一般包括复数指代物。
[0055] 用于本文目的的"受体人构架"是包含源自下文定义的人免疫球蛋白构架或人共 有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列的构架。"源 自"人免疫球蛋白构架或人共有构架的受体人构架可W包含其相同氨基酸序列，或者它可 W包含氨基酸序列交换。在一些实施方案中，氨基酸交换的数目为10个或更少、9个或更少、 8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一 些实施方案中，化受体人构架在其氨基酸序列上与化人免疫球蛋白构架氨基酸序列或人共 有构架氨基酸序列100 %同一。
[0056] 本文所用的术语"抗体"指由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体(参见 图1)。
[0057] 全长抗体的重链是按N端至C端方向包含抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链 结构域1(邸1)、抗体重链恒定结构域2(邸2)和抗体重链恒定结构域3(邸3)(本文也称为 "VH-CH1-CH2-CH3")及在I巧亚类抗体的情况下可选地包含抗体重链恒定结构域4 (CH4)的 多肤。在一个实施方案中，运种抗体包含较链区（位于CHl和C肥结构域之间）。
[0058] 全长抗体的轻链是按N端至C端方向包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒 定结构域(CL)(本文也缩写为"VkCL")的多肤。抗体轻链恒定结构域(CL)可W属于K或入同 种型。
[0059] 抗体的轻链和重链通过轻链的化结构域和重链的CHl结构域之间及全长抗体的两 条重链的较链区之间形成的多肤间二硫键连接在一起。
[0060] 典型全长抗体的实例是天然抗体，如IgG(IgGi、IgG2、IgG3和IgG4亚类）、IgM、IgA、 I曲和I巧。
[0061] 本发明的抗体可W来自单个物种，例如人，或者它们可W是嵌合或人源化抗体。
[0062] 野生型全长抗体包含两个抗原结合部位，其中每一个由一对VH和化结构域形成， 其中两个抗原结合部位都特异性结合相同的（例如第一)抗原（参加图1)。本发明的全长抗 体包含两个抗原结合部位，其中每一个由一对VH和VL结构域形成，其中结合部位之一（即由 共同轻链的VL结构域和源自第一抗体的重链的VH结构域[V出]运一对形成结合部位)特异 性结合至少一种(例如第一)抗原;其中结合部位中的另一个（即由共同轻链的VL结构域和 源自第二抗体的重链的VH结构域[VH2]运一对形成结合部位)特异性结合至少一种其他(例 如第二)抗原(参见图2)。
[0063] 抗体的"种类"指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在5个主要的抗 体种类：IgA、I曲、I巧、IgG和IgM,运些种类中的几种可W进一步划分为亚类（同种型），例如 1邑61、1邑62、1邑63、1邑64、1邑4谢1邑42。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称 为口、5、e、丫和]1。
[0064] 本文所用的术语"结合部位"或"抗原结合部位"指本文所述多特异性抗体的一个 或多个区域，配体(例如它的抗原或抗原片段)实际上与该区域结合，且该区域源自抗体分 子或其片段。本发明的抗体的抗原结合部位包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变 结构域(VL)。
[0065] 特异性结合希望的抗原的抗原结合部位（即VH/VL结构域对)可W源自：a)特异性 结合该抗原的已知抗体;或b)通过尤其是使用该抗原蛋白质或核酸或其片段的从头免疫法 或通过隧菌体展示获得的新抗体或抗体片段。对于本文所述的结合第一和第二抗原的多特 异性抗体，结合该第一和第二抗原的抗原结合部位包含对两个抗原结合部位而言相同的第 一共同轻链可变结构域(VL)和第二共同轻链可变结构域(VL)二者。
[0066] 本发明的多特异性抗体的抗原结合部位包含W不同程度促成结合部位对抗原的 亲和力的六个互补决定区（CDR)。存在S个重链可变结构域CDR(CD畑1、CDRH2和CD畑3)和S 个轻链可变结构域CDR(C抓11、〔0化巧日00化3)。通过与已根据序列间变异性定义运些区域 的氨基酸序列编译数据库比较，来确定CDR和构架区(FR)的程度。
[0067] 抗体特异性指抗体或多特异性抗体的结合部位对抗原的特定表位的选择性识别。 例如天然抗体是单特异性的。双特异性抗体是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。在抗 体具有一种W上特异性时，所识别的表位可W与单种抗原或与一种W上抗原相关。
[0068] 本文所用的术语"共同轻链"指运样的轻链，其能够与结合第一抗原的抗体的第一 重链配对，