形成特异性结合该第一抗原的结合部位，也能够与结合第二抗原的抗体的第二 重链配对，形成特异性结合该第二抗原的结合部位。共同轻链是按N端至C端方向包含抗体 轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CLK本文也缩写为"VkCL")的多肤。在本发 明的多特异性抗体内，共同轻链可变结构域化与源自特异性结合第一抗原的抗体的重链可 变结构域(V出)配对，形成特异性结合第一抗原的抗原结合部位。此外，共同轻链可变结构 域VL与源自特异性结合第二抗原的抗体的重链可变结构域(V此)配对，形成特异性结合第 二抗原的抗原结合部位。因此，本文所述的包含运种共同轻链可变结构域的多特异性抗体 含有两个相同的共同轻链可变结构域(VL)，其与V出和V出配对，形成结合第一抗原的抗原结 合部位[m/VL]和结合第二抗原的抗原结合部位[VH2/VL]。包含在多特异性抗体内的两个 共同轻链可变结构域(VL)显示至少95%、在一个实施方案中至少99%、在另一个实施方案 中100 %氨基酸序列同一性。
[0069] 共同轻链和产生运类包含其共同轻链可变结构域(VL)的共同轻链的方法描述于 例如 WO 98/50431 中或 W02010/084197 中、或 US 2013/045492、W02011097603 和 W02012148873中（其中使用了共同轻链小鼠）。本文所列的实施例1中也详细描述了共同轻 链及其可变结构域的产生。在多特异性抗体内使用一种共同轻链可变结构域避免了形成异 二聚体，其中源自第一抗体的轻链和源自第二抗体的重链的配对产生无功能或换言之不能 结合一种或多种祀抗原的抗原结合结构域。
[0070] 本文所用的"修饰轻链"指轻链，其中通过重组手段用对应的重链结构域交换了至 少一个它的结构域(可变或恒定结构域）。具体而言，在本发明的多特异性抗体内，在修饰轻 链内，用源自对应的重链的重链可变结构域VH替换轻链可变结构域化。因此，本发明的抗体 的修饰轻链从N端至C端方向包含结构域VH-化。
[0071] 本文所用的"修饰重链"指重链，其中通过重组手段用对应的轻链结构域交换了至 少一个它的结构域(可变结构域VH或恒定结构域CH1)。具体而言，在本发明的多特异性抗体 内，在修饰重链内，用源自对应的轻链的轻链可变结构域化替换重链可变结构域VH。因此， 本发明的抗体的修饰重链按N端至C端方向包含至少结构域化-CHl。
[0072] 本发明的多特异性抗体包含两条修饰重链，它们都含有至少一个共同轻链的轻链 可变结构域化和恒定重链结构域1(化-CHl)。在一个实施方案中，修饰重链按N端至C端方向 包含结构域化-CH1-CH2-CH3,通常包含位于CHl和CH2结构域之间的较链区。在一个实施方 案中，多特异性抗体的修饰重链显示至少95%、在一个实施方案中至少99%、在另一个实施 方案中100 %氨基酸序列同一性。
[0073] 但是，由宿主细胞产生的抗体可W从重链的C端翻译后切割一个或多个、尤其是一 个或两个氨基酸。因此，宿主细胞通过表达编码全长重链的具体核酸分子而产生的抗体可 W包含全长重链，或者它可W包含全长重链的切割变体(本文也称为切割的变体重链）。在 重链的最后两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸化447,按照Kabat抓指数的编号）时， 情况可W是运样。抗体群体可W包含具有全长重链的抗体和具有切割的变体重链的抗体。 抗体群体可W由具有全长重链的抗体和具有切割的变体重链的抗体的混合物组成;其中至 少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的抗体具有切割的变体重链。
[0074] 本文所用的术语"单特异性"抗体指具有一个或多个结合部位的抗体，其中每个结 合部位结合同一抗原的同一表位。
[0075] 本文所用的术语"价"指抗体分子中存在指定数目的结合部位。例如天然抗体或本 发明的全长抗体具有两个结合部位，且是二价的。因此，术语"二价"、"四价"和"六价"分别 指抗体分子中存在两个结合部位、四个结合部位和六个结合部位。本发明的多特异性抗体 优选二价、双特异性抗体。
[0076] 在优选实施方案中，本发明的多特异性抗体是全长抗体，即包含免疫球蛋白恒定 区。本发明的全长抗体包含一个或多个免疫球蛋白种类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白 种类包括1肖6、1肖1、1肖4、1曲和1巧同种型及其亚型(在1肖6和1肖4的情况下）。在优选实施方案 中，本发明的全长抗体具有IgG同种型抗体的恒定结构域结构。
[OOW]本文所用的术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"指具有单种氨基酸组成的 抗体或抗体分子的制备物。
[0078] 术语"嵌合抗体"指运样的抗体，其包含来自一个来源或物种的可变区（即结合区） 和源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，通常通过重组DNA技术制备。优选包含鼠可 变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明所涵盖的其他优选的"嵌合抗体"形式是其中已从原抗 体的恒定区修饰或改变恒定区，来产生本发明的特性(尤其是就Clq结合和/或Fc受体(FcR) 结合而言）的那些。运类嵌合抗体也称为"种类转换抗体"。嵌合抗体是所表达的包含编码免 疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的产物。 用于产生嵌合抗体的方法设及常规重组DNA，基因转移技术为本领域公知。参见例如 Morrison,S.，L.等，Proc.化tl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855;US 5,202,238和US 5， 204,244。
[0079] 术语"人源化抗体"指运样的抗体，其中与亲本免疫球蛋白的构架或互补决定区 (CDR)相比，已将构架或"互补决定区"（CDR)修饰为包含具有不同特异性的免疫球蛋白的 CDR。在优选实施方案中，将鼠 CDR移植入人抗体的构架区来制备"人源化抗体"。参见例如 Riechmann，L.等，Nature 332( 1988)323-327 ;和化uberger'M. S.等，Nature 314( 1985) 268-270。尤其优选的CDR对应于代表识别上文针对嵌合抗体指出的抗原的序列的那些。本 发明所涵盖的"人源化抗体"的其他形式是其中已从原抗体的恒定区附加地修饰或改变恒 定区来产生本发明的特性(尤其是就Clq结合和/或Fe受体(FcR)结合而言）的那些形式。
[0080] 本文所用的术语"人抗体"旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和 恒定区的抗体。人抗体为现有技术中公知（van Dijk，M.A.和van de Winkel，J.G.， Curr.Opin.Chem. Biol. 5(2001)368-374)。人抗体也可W在转基因动物(例如小鼠）中产生， 该转基因动物能够在免疫时，在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下，产生全库或一系列的 人抗体。运类种系突变体小鼠中，人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致在抗原攻击时 产生人抗体（参见例如化 kobovits，A.等，Proc.化 tl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555; Jakobovits，A.等，化1:ure 362(1993)255-258;Brueggemann，M.等，Year Immunol. 7(1993) 33-40)。人抗体也可W在隧菌体展示文库中产生（Hoogenboom，H.R.和Winter，G.， J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)nCole等 和Boerner等的技术也可W用于制备人单克隆抗体（Cole, S.，P.，C.，等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss(1985)77-96;和Boerner，P.等， J. Immuno1.147 (1991)86-95)。如已就本发明的嵌合和人源化抗体提到，本文所用的术语 "人抗体"还包括运类抗体，其已例如通过"种类转换"（即改变或突变化部分）（例如从IgGi 至IgG4和/或IgGi/IgG4的突变)在恒定区中修饰，W产生本发明的特性，尤其是就Clq结合 和/或化受体(FcR)结合而言。
[0081] 本文所用的术语"重组人抗体"旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的 所有人抗体，如从诸如NSO或CHO细胞的宿主细胞或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例 如小鼠）分离的抗体，或用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。运类重组人抗体具 有重排形式的可变区和恒定区。本发明的重组人抗体已经历了体内体细胞高变。因此，重组 抗体的VH和化区的氨基酸序列是运样的序列，其虽然源自人种系VH和化序列并与人种系VH 和VL序列相关，但可W并非在体内天然存在于人抗体种系库内。
[0082] 本文所用的"可变结构域"（重链的可变结构域(VH)或轻链的可变结构域(VU)指 轻链和重链对的每一个，其直接设及抗体与抗原的结合。在本发明的多特异性抗体内，共同 轻链的两个相同的可变结构域(VL)与第一重链可变结构域(V出）和第二重链可变结构域 (VH2)形成两个不同的抗原结合部位。
[0083] 人轻链和人重链的可变结构域具有相同的一般结构。每个可变结构域包含4个序 列高度保守的构架(FR)区，构架区通过立个"高变区"（或互补决定区，CDR)连接。构架区采 用e-折叠构象，CDR可W形成连接0-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持其S维 结构，并与来自另一条链的CDR-起形成抗原结合部位。抗体重链和轻链CDR3区在抗体的结 合特异性/亲和力中发挥极其重要的作用。
[0084]本文提到的个体(individual r或"对象（sub ject)"是哺乳动物。哺乳动物包括但 不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马）、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴）、兔 和晒齿类(例如小鼠和大鼠）。在某些实施方案中，该个体或对象是人。
[0085] "分离的"抗体是已从其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，将抗体 纯化至通过例如电泳（例如SDS-PAGE、等电聚焦（IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换 或反相HPLC)手段测定的纯度大于95%或99%。用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如 Flatman，S.等，J. Qiromatogr. B 848 (2007) 79-87。
[0086] "分离的"核酸指已从其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在 通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或不同于其天然 染色体位置的染色体位置上。
[0087] 在本文中使用时，术语"高变区"或"抗体的抗原结合部分"指抗体的负责抗原结合 的氨基酸残基。高变区包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基。"构架"或"FR"区是除 本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端至C端 包含结构域。31、〔01?1^1?2、〔01?2少1?3、〔01?3和。1?4。每条链上的〔01?由运类构架氨基酸分开。 尤其是，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域。按照Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5片反，Public Health Service,National Institutes of Health ,Bethesda，MD( 1991)的标准定义确定 CDR 和 FR 区。
[0088] 本文所用的术语"结合"或"特异性结合"指抗体在使用纯化的野生型抗原的体外 测定中、优选等离振子共振测定(載iAc汾r蚁篡\GE-Hea 1 thcare化Psa 1 a，瑞典）中与抗原表 位的结合。通过术语ka(抗体从抗体/抗原复合物结合的速率常数）、kD(解离常数)和KdAd/ ka)来定义结合的亲和力。"结合"或"特异性结合"意指l(T8mo Vl或更小、在一个实施方案中 为ICT8M至lO^mol/l、在一个实施方案中为ICT9M至lO^mol/l的结合亲和力化D)。因此，在本 发明的一个实施方案中，本文所述的多特异性抗体WicrVoVi或更小、在另一个实施方案 中为ICT 8M至l(ri3mol/l、在另一个实施方案中为ICT9M至I(TiV)Vl的结合亲和力(Kd)特异性 结合它对其特异的各抗原。
[0089] 术语"表位"包括能够与抗体特异性结合的任意多肤决定簇。在某些实施方案中， 表位决定簇包括诸如氨基酸、糖侧链、憐酷基或横酷基的分子的具有化学活性的表面分组 (SUdace grouping),且在某些实施方案中可W具有特异的S维结构特征，或特异的电荷 特征。表位是抗体结合的抗原区域。
[0090] 本申请内所用的术语"恒定区"指除可变区外，抗体的结构域的总和。恒定区不直 接设及与抗原的结合，但它显示多种效应子功能。取决于其重链的恒定区的氨基酸序列，将 抗体划分为W下种类:IgA、I曲、I巧、IgG和IgM,运些种类中的几个可W进一步划分为亚类， 如IgGi、IgGs、IgGs和IgG4，IgAi和IgAs。对应于不同种类的抗体，重链恒定区分别称为a、S、e、 丫和y。可见于五个抗体种类中的轻链恒定区(CL)称为K和入。
[0091] 本中请中所用的术语"源自人来源的恒定区"指gGi、IgG2、IgG3或IgG4亚类的人抗 体的恒定重链区和/或恒定轻链K或A区。运类恒定区为现有技术中公知，并例如由Kabat, E.A.，（参见例如 Johnson, G.和 Wu, T.T. ,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218;Kabat， E.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72( 1975)2785-2788)描述。
[0092] "效应子功能"指可归因于抗体的化区的那些生物活性，其随抗体同种型而变。抗 体效应子功能的实例包括:Clq结合和依赖补体的细胞毒性(CDC) ;Fc受体结合;依赖抗体的 细胞毒性(ADCC);吞隧作用;细胞表面受体(例如B细胞受体)下调;及B细胞活化。
[0093]物质（agnet)，例如药物组合物的"有效量"指对在剂量下和必要的时间内达到希 望得到的治疗或预防结果有效的量。
[0094]本文用术语"Fe区"来定义免疫球蛋白重链的包含至少一部分恒定区的C端区域。 该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从切S226或从 Pro230延伸至重链的簇基端。但是，Fc区的C端赖氨酸化ys447)可W存在或不存在。除非文 中另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5片反，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH 化blication 91-3242中所述的抓编号 系统，也称为抓指数。
[009引2.本发明的实施方案详述
[0096] 本发明设及多特异性抗体，其包含：
[0097] a)两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至UC册、CH2 和CHl，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)，其中该轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变 结构域；
[0098] b)-条、在一个实施方案中确切地为一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端 方向包含K同种型的恒定轻链结构域(CL)(本文称为乂U")和源自特异性结合第一抗原的 抗体的可变重链结构域(VHi);和
[0099] C)-条、在一个实施方案中确切地为一条修饰轻链，其中该修饰轻链按C端至N端 方向包含A同种型的恒定轻链结构域(本文称为乂 LA")和源自特异性结合第二抗原的抗体 的可变重链结构域(VH2)。
[0100] 本发明还设及多特异性抗体，其中该抗体包含：
[0101] a)两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3至UC册、CH2 和CHl，按此顺序)和轻链可变结构域(VL)，其中该轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变 结构域；
[0102] b)-条、在一个实施方案中确切地为一条修饰的第一轻链，其中该修饰的第一轻 链按C端至N端方向包含K同种型的恒定轻链结构域(CL)(本文称为乂U")和源自特异性结 合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VHi);和
[0103] C)-条、在一个实施方案中确切地为一条修饰的第二轻链，其中该修饰的第二轻 链包含按C端至N端方向含有A同种型的恒定轻链结构域(本文称为乂 LA")和源自特异性结 合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH2)的多肤。
[0104] 本发明还设及多特异性抗体，其包含：
[0105] a)两条修饰重链，其包含由结构域C册-CH2-CH1-化组成的多肤，其中化是共同轻 链的可变结构域；
[0106] b)-条修饰轻链，其包含由结构域化K-VHi组成的多肤，其中VHi是来自结合第一抗 原的抗体的可变重链结构域;和
[0107] C)-条修饰轻链，其包含由结构域化A-V出组成的多肤，其中V出是来自结合第二抗 原的抗体的可变重链结构域。
[0108] 在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体包含：
[0109] a)两条修饰重链，其包含由CH3-CH2-CH1-化组成的多肤，其中化是共同轻链的可 变结构域；
[0110] b)-条修饰轻链，其包含由化K-VHi组成的多肤，其中VHi是来自结合第一抗原的抗 体的可变重链结构域；
[0111] C)-条修饰轻链，其包含由CU-V出组成的多肤，其中V出是来自结合第二抗原的抗 体的可变重链结构域；
[0112] 其中该可变结构域V出和化形成特异性结合第一抗原的第一抗原结合部位，其中 该可变结构域V出和VL形成特异性结合第二抗原的第二抗原结合部位。
[0113] 在本发明的多特异性抗体内，抗体识别第一抗原的一半与抗体识别第二抗原的一 半具有共同的轻链可变结构域，且该共同的轻链可变结构域与各VH结构域掉换，产生CH3-CH2-CH1-化型结构。运确保了正确的抗体链结合。确保了正确的重链配对，因为只有一类重 链存在于多特异性抗体内。此外，由于存在一个共同的轻链可变结构域而达到正确的轻链 结合。此外，与VHi结构域连接的化K和与V出结构域连接的化A的存在允许通过应用Wk和入特 异的柱去除不想要的同二聚体的后续纯化步骤，来纯化希望得到的双特异性抗体。在本发 明的多特异性抗体内，该第一结合部位的可变结构域化和该第二结合部位的可变结构域化 显示至少95%、在一个实施方案中为至少99%、在另一实施方案中为100%氨基酸序列同一 性。在一个实施方案中，该第一结合部位的可变结构域VL和该第二结合部位的可变结构域 化在其氨基酸序列上100%同一。
[0114] 在另一方面，本发明设及多特异性抗体，其包含：
[0115] a)特异性结合第一抗原的抗体的第一修饰重链和第一修饰共同轻链;和
[0116] b)特异性结合第二抗原的抗体的第二修饰重链和第二修饰共同轻链；
[0117] 其中来自a)的重链和第一共同轻链的可变结构域VH和化相互替换，其中来自