[0301] 生物素化并固定在链霉抗生物素蛋白小球上之后，对重组FAB和DR5蛋白质进行隧 菌体淘选。选择后通过化ISA确认结合，通过经典双脱氧测序对阳性克隆进行测序，然后转 化为IgG或化ossMab型式。
[0302] 实施例2
[0303] 双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的产生
[0304] 为了在不使用任何异二聚化方法(例如巧入白技术）的情况下产生可同时结合两 种不同抗原的双特异性抗体，应用了共同轻链与所谓的CrossMab技术的组合:使共同轻链 (化C)的可变区与标准人IgGi抗体的CHl结构域融合形成两种特异性所共有的化/VH交叉分 子(与化融合）。为了产生交叉对应物(VH-化），使对抗原A特异的可变重链结构域(分离自共 同轻链文库)与恒定人K轻链融合，而对抗原B特异的可变重链结构域(也分离自共同轻链文 库）与恒定人1轻链融合。运使得能够通过应用WKappaSe Iect和LambdahbSe Iect柱（GE Healthcare)去除不希望得到的同二聚体抗体的后续纯化步骤，来纯化希望得到的双特异 性抗体。
[030引对于概念验证，为了观察运些分子是否可W活性形式产生，将抗人死亡受体 (TRAIL-R2)和人成纤维细胞活化蛋白（FAP)的抗体W1+1价组合为双特异性抗体。
[0306] 在第一个构建体中，将DR5结合剂2A11与FAP结合剂3C6组合。在显示此分子可W结 合两种抗原且在调亡诱导测定中具有活性之后，按上文所述产生了另外两种DR5-FAP双特 异性构建体：此处使FAP结合剂3C6与分离自共同轻链文库的不同DR5结合剂（即8E11和 21C11)融合。本发明的运些特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体也进一步称为"双特异性 修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体"。
[0307] 用Sambrook, J.等，Molecular cloning：A laboratory manual ；Cold Spring 化rbor Laboratoiy Press ,Cold Spring 化rbor ,New York, 1989中所述的标准重组DNA技 术产生了所有抗体表达载体。按照厂家的建议使用分子生物学试剂。基因或基因片段通过 聚合酶链反应(PCR)扩增或在Geneart AG(Regensburg，德国）通过自动化基因合成从合成 的寡核巧酸产生。通过DNA测序（Synergene Gm地，瑞±)确认PCR扩增或亚克隆的DNA片段。 将质粒DNA转化入适宜的大肠杆菌宿主菌株并在其中扩增，用于用标准Maxiprep试剂盒 (Qiagen)制备转染级质粒DNA。为了产生双特异性分子，使用标准的基于聚乙締亚胺(PEI) 的方法，用编码各基因的质粒转染肥K293邸NA细胞。所使用的S种质粒的质粒比为1:1:1。 转染细胞培养7天，然后收集上清进行纯化。
[03川因此，产生了 ^下；种本发明的特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体：
[0312] 表4:双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体
[0314]图2A中显示双特异性修饰共同轻链-K-A抗体的结构示意图。显示两条相同的修饰 重链和两条不同的修饰轻链的可变和恒定结构域。图2B中W抗体GA803_G25_H14D_001 (基 于抗-DR5 2A11和抗-FAP 3C6)为例，显示双特异性K-A抗体的示意图。显示祀向部分和各轻 链结构域。W类似的结构域结构产生了 3C6与8E11和21C11的组合。
[0引引实施例3
[0316] 双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的表达和纯化
[0317] 通过用聚乙締亚胺，用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的皿K293-邸NA细胞来 产生该分子。用1:1: 2比例的相应表达载体（"载体修饰VHi-K轻链(DR5-CU)":"载体修饰 V也-A轻链(FAP-CUr :"载体具有共同轻链化的修饰重链(化C-Fc cross-MabT )转染细 胞。
[0318] 在CD CHO培养基中悬浮无血清培养肥K293-邸NA细胞。对于500ml摇瓶中的产生， 转染前24小时接种4亿个皿K293-EBNA细胞。对于转染，210X g离屯、细胞5分钟，用预热的 20ml CD C册培养基替换上清。在20ml CD C册培养基中混合表达载体至20化g DNA的最终 量。加入54化1阳I后，满旋溶液15秒，随后室溫解育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混 合，转移至500ml摇瓶，在5%C02空气的培养箱中37°C解育3小时。解育时间之后，加入160ml F17培养基，并培养细胞24个小时。转染一天后，加入ImM丙戊酸(valporic acid)和7%化ed 1。培养7天后，通过210X g离屯、15分钟来收集上清进行纯化，溶液进行无菌过滤(0.22WI1滤 器），加入0.0 l %w/v终浓度的叠氮化钢，并保存在4°C。
[0319] 通过使用K轻链和A轻链亲和层析的两个连续的亲和层析步骤、随后的大小排阻层 析步骤来从细胞培养物上清纯化分泌性蛋白质。
[0320] 对于第一个亲和层析步骤，将上清上样在装填在Tricorn 5/50柱（CV= ImL,GE 胎althcare)中并用5ml 50mM TRISUOOmM甘氨酸、150mM 化CUpH 8.0平衡的Capture Select Ka卵a亲和基质(BAC)上。通过用至少15个柱体积的50mM TRIS、IOOmM甘氨酸、150mM 化Cl、pH 8.0洗涂来去除未结合的蛋白质。W25个柱体积内达到50mM TRIS、IOOmM甘氨酸、 150mM NaCl、pH 2.0的分级抑梯度洗脱祀蛋白。
[0321] 通过1:1稀释入50mM TRIS、IOOmM甘氨酸、150mM化CUpH 8.0来中和来自第一纯 化步骤的洗脱物。
[0322] 在装填在Tricorn 5/50柱（CV= lmL，GE Healthcare)中并用5ml 50mM TRIS、 IOOmM甘氨酸、150mM NaCl、pH 8.0平衡的Cap1:ure Select Lambda亲和基质（BAC)上进行第 二亲和层析步骤。上样后，用至少15个柱体积的50mMTRIS、100mM甘氨酸、150mM化Cl、pH 8.0洗涂柱。通过在分级pH梯度中降低pH至pH 2.0来从柱洗脱祀蛋白。混合来自Capture Select Lambda亲和柱的级分，并用离屯、浓缩管(Amicon MWCO:30.OOODa)浓缩。由此更换缓 冲液为抑6.0的20mM组氨酸、140mM氯化钢溶液。
[0323] 随后将浓缩的蛋白质溶液上样在用抑6.0的20mM组氨酸、140mM氯化钢溶液平衡 的Superdex 200 10/300化柱（GE Healthcare)上。
[0324] 实施例4
[0325] 双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的表征
[0326] 使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm光密度(OD)来测定纯 化的蛋白质样品的蛋白质浓度。
[0327] 通过存在和缺乏还原剂情况下的CE-SDS分析来分析分子的纯度和分子量。按照厂 家的说明书使用化Iiper Lab化ip GXII系统（Caliper Iifescience)。用化g样品进行分 析。电泳图谱显示为双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的SDS-化ge:A)3C6/8Ell还 原），B)3C6/8E11 (非还原)C)3C6/21C11 (还原），D)3C6/21C11(非还原）（结果显示在图3中）。 [032引用TSKgel G3000 SW化分析型大小排阻柱（Tosoh)在25°C下在25mM K2册04、 125mM化Cl、200mMレ精氨酸单盐酸盐、0.02%(w/v)化N3、pH6.7运行缓冲液中分析抗体 样品的聚集体含量。
[0329] 通过两个连续的亲和层析步骤可W均质地纯化由共同重链与kW及A轻链组成的 分子。表5中列出了制备物的最终单体含量。
[0330] 表5:双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的产率和最终单体含量
[0332] 双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的LC-MS分析
[0333] 双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的去糖基化
[0334] 为了确认通过两个连续的亲和层析步骤获得的双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的均质制备物，通过LC-MS分析分析了最终的蛋白质溶液。为了去除由糖类引入的 异质性，用PNGaseF处理双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体。因此，通过向浓度0.5mg/ ml的20]ig蛋白质加入化1 2M Tris来将蛋白质溶液的抑调节至抑7.0。加入0.祉g IdeS，并 在25 °C解育68小时。
[0335] 去糖基化的双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的LC-MS分析(在线检测）
[0336] 在偶联TOF 6441 质谱仪（Agilent)的Agilent 册LC 1200上进行LC-MS法。在 Macherey化gel聚苯乙締柱RP1000-8(祉m颗粒大小，4.6x 250mm;目录号719510)上进行层 析分离。洗脱液A是含5 %乙腊和0.05 % (v/v)甲酸的水，洗脱液B是95 %乙腊、5 %水和 0.05%甲酸。流速为Iml/分钟，在40°C进行分离，用前述处理获得了化g(15iU)抗体样品。
[0337] 表6: LC-MS洗脱条件 [033引
[0339] 在前4分钟期间，洗脱物导入废液，W防止质谱仪受盐污染。W12升/分钟的干燥气 流、350°C的溫度和60psi的喷雾器压力运行ESI源。W阳离子模式用350V碎裂电压 (fragmentor ￥〇11日肖日）和700至3200111八质量范围获取15谱。通过仪器软件获取15数据4至 17分钟。
[0340] 结果
[0341 ] 图4中W双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体3C6/8E11为例，通过LC-MS显示 均质制备物。144697.1化处的主峰对应于具有2个氧化位点的蛋白质的正确分子量。LC-MS 中未检测到携带两条K或两条A轻链的分子(图4)。
[0342] 实施例5
[0343] 表面等离振子共振分析双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体与两种不同抗原 的同时结合
[0344] 所有表面等离振子共振(SPR)实验都W皿S-EP作为运行缓冲液(0.OlM肥阳S pH 7.4、0.15M 化Cl、3mM 邸TA、0.005 %表面活性剂P20，Biacore，Freibu巧/德国），在25°C 下 在狡.iaeore锻TiOO上进行。
[034引通过在链霉抗生物素蛋白忍片(Biacore，Freiburg/德国）上直接偶联约120个响 应单位(RU)的生物素化人和食蟹猴DR5,来进行双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体 (GA803_G25_H14D_001)与肿瘤抗原FAP和人死亡受体5 (DR5)的同时结合。图5中显示示意 图。按150nM捕获双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体(GA803_G25_H14D_001)90秒。随 后使浓度SOOnM的人FAPW3化1/分钟的流速通过90秒。现慢解离60秒。通过注射IOmM甘氨 酸、pH 1.5 30秒来再生表面。
[0346] 通过减去在参考流动池上获得的响应来校正体积折射率差异(bulk refractive index difference)，在参考流动池中，重组人FAP流过未捕获双特异性修饰共同轻链DR5/ FAP-K-A抗体的表面。
[0347] 结果
[0348] 表面等离振子共振测量结果确认，双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体 (GA803_G25_H14D_001)能够同时结合两种抗原（显示在图6中）。
[0349] 实施例6
[0350] 双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的细胞表面结合
[0351] 通过FACS测量了人双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体与表达DR5的MDA-MB 231肿瘤细胞系的细胞及与表达FAP的成纤维细胞系GM05389的细胞的结合。作为对照，使用 了包含相同结合剂的另一四价双特异性DR5/FAP抗体构建体。简言之，用40iU所示浓度的构 建体在4°C解育96孔圆底板中的0.2Mio细胞/孔30分钟。通过用含0.1 %BSA的PBS洗涂细胞 来去除未结合的构建体。用Dyli曲t649缀合的Affini化re F(ab'）2片段山羊抗-人IgG Fcg 片段特异性二抗(Jackson ImmunoResearch#109-496-098;工作液 1:50在PBS、0.1 %BSA中） 检测结合的构建体。4°C解育30分钟后，通过洗涂去除未结合的抗体，并用1%PFA固定细胞。 用抓FACS CantoIKSoftware BD DIVA)分析细胞。结果显示在图7和8中。在DR5阳性MDA-MB 231细胞上测试了双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体GA803_G25_H14D_001的结 合。构建体W浓度依赖方式结合MDA-MB 231细胞(图7)。
[0352] 在FAP阳性GM05389成纤维细胞上测试了双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体 GA803_G25_H14D_001的结合。构建体W浓度依赖方式结合GM05389细胞(图8)。
[0巧3] 实施例7 [0巧4] 调亡测定
[03巧]用Cell Death Detection ELISAplus(Roche Applied Science#11774425001)在 共培养测定中测量了人双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的调亡诱导。简言之，在96 孔平底细胞培养板中接种10000个表达FAP的GM05389细胞，并在培养箱中解育过夜。第二 天，按所示浓度加入稀释的构建体并解育10分钟，W允许抗体结合。然后向平板加入10000 个调亡敏感的MDA-MB 231肿瘤细胞。作为阴性对照，在缺乏GM05389的情况下测试调亡诱 导。解育24小时后，按厂家的说明书中所述进行Cell Death Detection化ISA。结果显示在 图9中。在缺乏或存在表达FAP的成纤维细胞(GM05389)的情况下在MDA-MB 231上测试了S 种双特异性修饰共同轻链DR5/FAP-K-A抗体的调亡诱导。所有构建体都能够在FAP的存在下 诱导特异性调亡。
【主权项】
1. 多特异性抗体，其包含： a) 两条修饰重链，其中各重链按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1(CH3、CH2和 CH1)，及轻链可变结构域(VL)，其中轻链可变结构域(VL)是共同轻链的可变结构域； b) -条修饰轻链，其中修饰轻链按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域(CL)， 和源自特异性结合第一抗原的抗体的可变重链结构域(VHO;和 c) 一条修饰轻链，其中修饰轻链按C端至N端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域，和源 自特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域(VH 2); 其中可变结构域VHjPVL形成特异性结合第一抗原的第一抗原结合部位，且其中可变结 构域VH2和VL形成结合第二抗原的第二抗原结合部位。2. 权利要求1的多特异性抗体，其中抗体是二价、双特异性抗体。3. 权利要求1至2中任一项的多特异性抗体，其中抗体属于I gG种类。4. 前述权利要求中任一项的多特异性抗体，其中抗体属于I gGi或I gG4亚类。5. 核酸，其编码前述权利要求中任一项的多特异性抗体。6. 包含权利要求5的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。7. 原核或真核宿主细胞，其包含权利要求6的表达载体。8. 用于制备权利要求1至4中任一项的多特异性抗体的方法，其包括步骤： a) 用包含编码权利要求1至4中任一项的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿 主细胞； b) 在允许合成所述多特异性抗体分子的条件下培养所述宿主细胞;和 c) 从所述培养物回收所述多特异性抗体分子。9. 药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项的多特异性抗体和至少一种可药用赋形 剂。10. 权利要求1至4中任一项的多特异性抗体，其用作药物。11. 权利要求1至4中任一项的多特异性抗体的用途，用于制备药物。12. 用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于对所述患者施用治疗有效量的权利 要求1至4中任一项的多特异性抗体。13. 用于产生基于特异性结合第一抗原的第一抗体和特异性结合第二抗原的第二抗体 的多特异性抗体的方法，其中第一抗体和第二抗体包含共同轻链，该方法包括步骤： a) 通过用源自所述第一抗体的重链的重链可变结构域(Vm)取代轻链可变结构域(VL) 和可选地用κ同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自所述第一 抗体的轻链，以获得按C端至N端方向包含κ同种型的恒定轻链结构域和重链可变结构域 (VHO的轻链； b) 通过用源自所述第二抗体的重链的重链可变结构域(VH2)取代轻链可变结构域(VL) 和可选地用λ同种型的恒定轻链结构域取代原来的恒定轻链结构域，来修饰源自所述第二 抗体的轻链，以获得按C端至Ν端方向包含λ同种型的恒定轻链结构域和重链可变结构域 (VH 2)的轻链； C)通过用源自所述第一抗体的轻链的轻链可变结构域(VL)取代重链可变结构域(vm)， 来修饰源自所述第一抗体的重链，以获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1 (CH3、CH2和CH1)及轻链可变结构域(VL)的重链;和/或 通过用源自所述第二抗体的轻链的轻链可变结构域(VL)取代重链可变结构域(VH2)，来 修饰源自所述第二抗体的重链，以获得按C端至N端方向包含重链恒定结构域3、2和1 (CH3、 CH2和CH1)及轻链可变结构域(VL)的重链。14. 权利要求13的方法，其进一步包括步骤： a) 用包含编码所获得的多特异性抗体的核酸分子的表达载体转化宿主细胞； b) 在允许合成所述多特异性抗体分子的条件下培养所述宿主细胞;和 c) 从所述培养物回收所述多特异性抗体分子。15. 多特异性抗体，其通过权利要求13或14的方法获得。
【专利摘要】本发明涉及基于具有共同轻链的抗体的多特异性抗体。该多特异性抗体包含通过结构域交换而含有共同轻链可变结构域VL的修饰重链；和通过结构域交换而含有第一抗体(VH1)和第二抗体(VH2)的可变重链结构域的两条修饰轻链，其中一条轻链属于κ同种型，一条轻链属于λ同种型。本发明还涉及该抗体的制备方法及其用途。
【IPC分类】C07K16/28, C07K16/40
【公开号】CN105612182
【申请号】CN201480055535
【发明人】P·布鲁恩克尔, C·耶格尔, C·克莱因, E·默斯纳, W·舍费尔
【申请人】豪夫迈·罗氏有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2014年10月8日
【公告号】CA2922912A1, WO2015052230A1