b)的 重链和第二共同轻链的可变结构域VH和化相互替换;其中a)的第一共同轻链包含K恒定轻 链结构域化K;其中b)的第二共同轻链包含A恒定轻链结构域CU;其中来自a)的第一共同轻 链的化结构域和b)的第二共同轻链的化结构域二者相同；其中a)的第一重链和b)的第二重 链的恒定区二者相同。
[0118] 在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体是二价的。在本发明的一个实施方 案中，该多特异性抗体是双特异性抗体。在本发明的一个实施方案中，该多特异性抗体是二 价、双特异性抗体。
[0119] 在本发明的多特异性抗体的一个实施方案中，全长抗体的重链按N端至C端方向包 含VH结构域、CHl结构域、较链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，全长抗体的 重链按N端至C端方向由VH结构域、CHl结构域、较链区、CH2结构域和C册结构域组成。在一个 实施方案中，全长抗体的重链是按N端至C端方向由VH、CH1、C肥和C册组成的多肤。
[0120] 在本发明的一个实施方案中，该修饰重链包含在其氨基酸序列上100%同一的化-CHl结构域。
[0121] 在本发明的一个实施方案中，未改变（即通过氨基酸取代)多特异性抗体的重链恒 定结构域CH3, W支持异二聚化。具体而言，未例如通过巧入白技术不对称地改变重链恒定 结构域CH3,其中改变一个CH3结构域来产生"巧"，改变另一个CH3结构域来产生"白"，使得 通过将"巧"氨基酸放置在"白"内，来支持不同重链的异二聚化。相反，本发明的多特异性抗 体的具体优势是无需支持异二聚化，由于修饰重链中的结构域交换，修饰重链可W结合多 特异性抗体的两条轻链，且当然可W与另一相同的重链配对。
[0122] 本文提到多肤之间"同一的"和"同一性"（例如重链之间的"同一性"或共同轻链可 变结构域化之间的"同一性"）时意指多肤的氨基酸序列的100%同一性。但是，多肤可W在 附着于多肤链的聚糖结构上不同。
[0123] 本发明的一个方面是用于产生多特异性抗体的方法，其包括步骤：
[0124] a)通过相互交换来自重链和共同轻链的可变结构域V出和化，来修饰特异性结合 第一抗原的抗体的第一重链和第一共同轻链;和
[0125] b)修饰第一共同轻链W包含K恒定轻链结构域化K ;
[0126] C)通过相互交换来自重链和共同轻链的可变结构域V此和化，来修饰特异性结合 第二抗原的抗体的第二重链和第二共同轻链;和
[0127] d)修饰第二共同轻链W包含A恒定轻链结构域CU;
[0128] 其中来自第一共同轻链和b)的第二共同轻链的可变轻链结构域化二者相同；其中 第一和第二重链的恒定区二者相同。
[0129] 抗体变体
[0130] 在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可W希望改善 抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可W通过在编码抗体的核巧酸序列中引入适当 的修饰或通过肤合成来制备抗体的氨基酸序列变体。运类修饰包括例如从抗体的氨基酸序 列缺失残基和/或在抗体的氨基酸序列内插入残基和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。 可W进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望 得到的特征，例如抗原结合。
[0131] a)取代、插入和缺失变体
[0132] 在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。进行取代诱变 的目的位点包括CDR和FR。在一个实施方案中，在重链的CDR和/或FR中进行取代诱变。表1中 "示例性取代"的表头下提供示例性改变，如下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。表1中 "优选的取代"的表头下显示保守取代。可W在目的抗体中引入氨基酸取代，并针对希望得 到的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
[0133] 表1:
[0135] 氨基酸可W按照共同的侧链性质分组：
[0136] (1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、化 l、Leu、Ile;
[0137] (2)中性亲水性：Cys'SerJ 虹、Asn、Gln;
[013 引（3)酸性:43口、6111;
[0139] (4)碱性:His、Lys、Arg;
[0140] (5)影响链取向的残基:Gly、Pro;
[0141] (6)芳香族:T;rp、Ty;r、Phe。
[0142] 保守取代将需要将运些种类之一的成员换为另一种类的成员。
[0143] -类取代变体设及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体）的一个或多个高变 区残基。通常，所得到的选择用于进一步研究的一种或多种变体将相对于亲本抗体具有某 些生物学特性(例如提高的亲和力、降低的免疫原性）的修饰(例如改善)和/或将具有基本 上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可W例如 用基于隧菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，突变一个 或多个CDR残基，将变体抗体展示在隧菌体上，并针对具体的生物学活性(例如结合亲和力） 进行筛选。
[0144] 可W在CD帥进行改变(例如取代），例如W改善抗体亲和力。可W在CDIT'热点'（即 由在体细胞成熟过程中W高频率发生突变的密码子编码的残基）（参见例如Chow^ury, P.S. ,Methods Mol.Biol.207(2008) 179-196)和/或SDR(a-CDR)中进行运类改变，针对结合 亲和力测试所得到的变体VH或化。通过构建二级文库并从二级文库重新选择的亲和力成熟 已描述于例如化Ogenboom,H.R.等in Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。 在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核巧酸定点诱 变）中的任一种来在选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后筛选 该文库来鉴定具有希望的亲和力的任意抗体变体。引入多样性的另一种方法设及CDR定点 途径，其中随机化几个CDR残基(例如每次4-6个残基）。可W例如用丙氨酸扫描诱变或模拟 来明确地鉴定出设及抗原结合的CDR残基。尤其是通常祀向CDR-册和CDR-L3。
[0145] 如Cunnin曲am,B.C.和Wells,J.A. ,Science 244(1989)1081-1085所述，用于鉴定 可W祀向进行诱变的抗体的残基或区域的方法称为"丙氨酸扫描诱变"。在此方法中，鉴定 残基或祀残基组(例如带电荷的残基，如3巧、339、]113、173和肖111)，并用中性或带负电荷的 氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，W确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可 W在证明对最初的取代的功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。备选地或此外，用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。运类接触残基和邻近残基可W作 为取代的候选残基祀向或消除。可W筛选变体来确定它们是否包含希望得到的特性。
[0146] 氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肤的范围内 的氨基端和/或簇基端融合，W及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包 括具有N端甲硫氨酷残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如， 对于ADEPT)的融合，或与增加抗体的血清半衰期的多肤的融合。
[0147] b)糖基化变体
[0148] 在某些实施方案中，改变本文提供的抗体来提高或降低该抗体糖基化的程度。通 过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，可W方便地实现对抗体进行 糖基化位点的加入或缺失。
[0149] 在抗体包含化区时，可W改变附着于Fc区的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体 通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于化区的CH2结构域的Asn297(参见例 如Wright，A.和Morrison,S丄.，TIBTECH 15(1997)26-32)。寡糖可W包括多种糖类，例如甘 露糖、N-乙酷葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，W及在双触角寡糖结构的"茎"中附着于 GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可W进行本发明的抗体中的寡糖的修饰来产生具有 某些改善的特性的抗体变体。
[0150] 在一个实施方案中，提供具有(直接或间接)附着于化区的缺乏岩藻糖的糖类结构 的抗体变体。例如，运种抗体中的岩藻糖的量可W是1%至80 %、1%至65 %、5 %至65 %或 20 %至40 %。相对于通过例如WO 2008/077546中所述的MALDI TOF质谱法测量的附着于Asn 297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构）的总和，通过计算Asn297处的糖链内岩 藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297指定位在Fc区中的约297位(Fe区残基的Eu指数编 号）的天冬酷胺残基;但是，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可W定位在297位上游或下 游约± 3氨基酸，即在294位和300位之间。运类岩藻糖基化变体可W具有改善的ADCC功能。 参见例如US 2003/0157108;US 2004/0093621。设及"去岩藻糖基化"或"岩藻糖缺乏"的抗 体变体的出版物的实例包括:US 2003/0157108;W0 2000/61739;W0 2001/29246;US 2003/ 0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；W0 2003/085119；W0 2003/084570；WO 2005/035586；W0 2005/035778;W02005/053742;W02002/031140;Okazaki,A.等，J.Mol.Biol.336(2004) 1239-1249; Yamane-Ohn址 i，N.等，Biotech. Bioeng. 87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖 基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lecl3 CHO细胞(Ripka，J.等， Arch.Biochem.Bio地ys.249( 1986)533-545;US 2003/0157108;及WO 2004/056312，尤其是 在实施例11中）和敲除细胞系，如a-1,6-岩藻糖基转移酶基因即T8敲除的CHO细胞(参见例 如Yamane Ohnuki，N.等，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622;Kanda，Y.等， Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688;和WO 2003/085107)。
[0151] 还提供具有二等分寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被 GlcNAc二等分。运类抗体变体可W具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。运类抗体 变体的实例描述于例如WO 2003/011878、美国专利号6,602,684和US 2005/0123546中。还 提供在附着于化区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。运类抗体变体可W具有 改善的CDC功能。运类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、W0 1998/58964和WO 1999/ 22764 中。
[0152] C)化区变体
[0153] 在某些实施方案中，可W向本文提供的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修 饰，从而产生化区变体。Fc区变体可W包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例 如取代）的人化区序列（例如人IgGi、IgG2、IgG3或IgG4Fc区）。在一个实施方案中，该一个或 多个氨基酸位置处的氨基酸修饰在本发明的抗体的两条重链中都相同。
[0154]在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，运 使得它成为其中抗体的体内半衰期重要但某些效应子功能（如补体和ADCC)不必要或有害 的应用所希望的候选者。可W进行体外和/或体内细胞毒性测定来确认CDC和/或ADCC活性 的降低/减损。例如，可W进行化受体(FcR)结合测定来确保抗体缺乏化丫 R结合（因此可能 缺乏ADCC活性），但保留Fc化结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达化(RIII，而单核 细胞表达Fc 丫 RI、Fc 丫 RII和Fc 丫 RIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch，J.V.和 Kinet，J. P.，Annu. Rev. Immunol. 9(1991 )457-492 的第464 页上的表 3 中。评估目的分子的 ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如化113化加1， I. 等，Proc.化t'l Acad. Sci. USA 83( 1986)7059-7063和 Hellstrom, I.等，Proc.化t'l Acad. Sci. USA 82(1985) 1499-1502);美国专利号 5，821,337(参见化 Uggemann，M.等， J. Exp.Med. 166(1987) 1351-1361)中。备选地，可W利用非放射性测定方法(参见例如用于 流式细胞术的ACTI?非放射性细胞毒性测定(Cel technology，Inc. Moun1:ain View ,CA);和 切1：〇1'(^9接&'.非放射性细胞毒性测定。1'01]1日旨日，]\&1(113〇]1，￥1))。用于运类测定的效应细胞包 括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或此外，可W在体内，例如在诸如公 开于Clynes，R.等，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 95(1998)652-656中的动物模型的动物模型 中评估目的分子的ADCC活性。还可W进行Clq结合测定来确认抗体不能结合Clq,并因此缺 乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的Clq和C3c结合化ISA。为了评 估补体活化，可W进行CDC测定（参见例如Gazzano-Santoro，H.等，J. Tmmuno !.Methods 202 (1996)163-171;Cragg，M.S.等，Blood 101(2003)1045-1052;及Cragg，M.S.和 M.J.Glennie ,Blood 103(2004)2738-2743)。还可W用本领域已知的方法进行化化结合和 体内清除/半衰期测定(参见例如化tkova，S.B.等，Int. Immunol. 18(2006)1759-1769)。
[01巧]具有减少的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和 329中的一个或多个取代的那些(美国专利号6,737,056，按照1(曰6曰*的抓指数的编号）。运类 Fc变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个处具有取代的化突变体， 包括具有残基265和297至丙氨酸的取代的所谓"DANA"Fc突变体(美国专利号7,332,581，按 照Kabat的抓指数的编号）。
[0156] 如本文所使用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置按照Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5片反，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中所述的Kabat编号系统编号。具体 而言，对于可变结构域及对于K和A同种型的轻链恒定结构域化，使用Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5片反，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda，MD( 1991)的Kabat编号系统（参见647-660页），且本文称 为"按照Kabat的编号"，对于恒定重链结构域(邸1、较合部、CH2和CH3)，使用Kabat抓指数 编号系统(参见661-723页），且本文称为"按照Kabat的抓指数的编号"。
[0157] 在一个实施方案中，该多特异性抗体属于IgG同种型。在一个实施方案中，该多特 异性抗体属于IgGi或IgG4同种型。
[0158] 在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgGi亚类的含有突变L234A和L235A(按 照 Kabat 的抓指数的编号；Kabat, E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5片反，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda, MD( 1991 )，NIH Publication 91-3242.)的恒定重链区。
[0159] 在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgGi亚类的含有突变L2%A、L235A和 P329G(按照Kabat的抓指数的编号）的恒定重链区。
[0160] 在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgG4亚类的恒定重链区。
[0161] 在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgG4亚类的含有突变S228P和L235E(按 照Kabat的抓指数的编号）的恒定重链区。
[0162] 在一个实施方案中，该多特异性抗体包含IgG4亚类的含有突变S228P、L23祀和 P329G(按照Kabat的抓指数的编号）的恒定重链区。
[0163] 描述了某些具有改善或减少的与FcR的结合的抗体变体(参见例如美国专利号6， 737,056;W0 2004/056312;及Siields，R丄.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
[0164] 在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如 Fc区的298、333和/或334位(按照Kabat的抓指数的编号）的取代）的Fc区。
[0165] 在一些实施方案中，例如，如美国专利号6，194,551、胖0 99/51642和1(1113〇邑16， E.E.等，J. Immunol. 164(2000)4178-4184中所述，在化区中进行改变，该改变导致改变（即 改善或减少)的Clq结合和/或依赖补体的细胞毒性(ADCC)。
[0166] 具有增加的半衰期和改善的与新生儿化受体(Fe化）（其负责将母体IgG转移至胎 儿（加 yer'R.L.等，J. Immunol. 117 (1976)587-593 和Kim, J.K.等，J. Immunol. 24(1994) 2429-2434))的结合的抗体描述于US 2005/0014934中。那些抗体包含其中具有一个或多个 取代的Fc区，该取代改善Fc区与FcRn的结合。运类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、 272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434 中的一个或多个处具有取代的那些，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371，826)