利用肝细胞生长因子的两种以上的异构体的肌萎缩性侧索硬化症预防或治疗用组合物的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本专利申请针对2 013年10月2 2日向韩国专利厅提出的韩国特许申请第K R10 -2013-0126216号及2014年10月22日向韩国专利厅提出的韩国特许申请第KR10-2014-0143377号主张优先权，上述专利申请的公开事项插入于本说明书中作为参考。
[0002] 本发明设及肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用组合物，包含肝细胞生长因子的 两种W上的异构体或对上述异构体进行编码的聚核巧酸作为有效成分。
【背景技术】
[0003] 肌萎缩性侧索硬化症(Amyotro地ic Lateral Sclerosis:ALS)作为发生于运动神 经元的疾病，最初，1869年由法国医生Jean-Martin化artcot报告指出。之后，1939年作为 美国有名的棒球选手的Lou Gehrig患运种疾病，并公知于一般人，从此还被称为葛雷克氏 症（Lou Ge hrig's disease)。
[0004] 肌萎缩性侧索硬化症的预后将临床特征、电诊断测试及与症状相关的健康状态的 排除作为基础。在与肌萎缩性侧索硬化症相关的几种基因有关临床实验中可使用的分子基 因检查在遗传类型诊断及遗传咨询中起到重要的作用。
[0005] 肌萎缩性侧索硬化症可通过常染色体显性、常染色体隐性或X-相关方法遗传。遗 传咨询及危险评价取决于特定基因诊断的准确的诊断。
[0006] 众所周知，延迟肌萎缩性侧索硬化症病的发展的药剂有利鲁挫（Riluzole)。众所 周知，利鲁挫抑制认为破坏运动神经细胞的原因之一的过量的谷氨酸，从而可延迟肌萎缩 性侧索硬化症的发展速度。但是，利鲁挫的临床效果无法改善肌萎缩性侧索硬化症的症状， 在增加肌萎缩性侧索硬化症患者不做器管切开术而生存的期间（tracheostomy-free survival)方面结果不明确。如上所述，据报告，有助于肌萎缩性侧索硬化症患者的利鲁挫 的真正的临床效果非常有限且模糊(Stewad et al，2001)。虽然如此，当前，除了如上所述 的临床有用性模糊的利鲁挫之外，无对肌萎缩性侧索硬化症的有效的预防或治疗剂，因而 当前需要开发对肌萎缩性侧索硬化症可呈现预防或治疗效果的药物。
[0007] 另一方面，众所周知，W往有作为用于治疗基因的基因载体的多种表达载体。在本 发明的一实施例中使用的pCK载体详细记载于PCT/KR99/000855中。并且，在PCT/KR03/ 000548中记载有包含在本发明中所使用的pCK-肝细胞生长因子X7重组载体的缺血性疾病 或肝病治疗或预防用组合物。PCT/KR99/000855及PCT/KR03/000548的全部内容合并于本说 明书作为参照。
[000引本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及 专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属技术领 域的水平及本发明的内容。
【发明内容】
[0009] 要解决的问题
[0010] 本发明人为了开发可预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物而锐意研究努力。其 结果，查明了可利用包含两种W上的肝细胞生长因子化epato巧te Growth FactonHGF)的 异构体或对上述异构体进行编码的聚核巧酸作为有效成分的组合物治疗肌萎缩性侧索硬 化症，从而完成了本发明。
[0011] 因此，本发明的目的在于，提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学组合物。
[0012] 本发明的再一目的在于，提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗方法。
[0013] 通过W下的发明的详细说明、发明要求保护范围及附图，更加明确本发明的其他 目的及优点。
[0014] 解决问题的手段
[0015] 根据本发明的一实施方式，本发明提供肌萎缩性侧索硬化症的预防或治疗用药学 组合物，包含肝细胞生长因子的两种W上的异构体或对上述异构体进行编码的聚核巧酸作 为有效成分。
[0016] 本发明人为了开发可预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症的药物而锐意研究努力。最 终，查明如下：利用包含两种W上的肝细胞生长因子的异构体或对上述异构体进行编码的 聚核巧酸作为有效成分的组合物可治疗肌萎缩性侧索硬化症。
[0017] 本发明的治疗战略大致可分为蛋白质治疗及基因治疗两种。根据本发明的蛋白质 治疗剂战略，利用肝细胞生长因子的两种W上的异构体蛋白质。另一方面，根据本发明的基 因治疗剂战略，利用对肝细胞生长因子的两种W上的异构体进行编码的一种W上的核巧酸 序列。两种W上的肝细胞生长因子异构体-编码核巧酸序列提供为一种聚核巧酸，或提供为 单独的聚核巧酸。优选地，肝细胞生长因子的两种W上的肝细胞生长因子异构体-编码核巧 酸序列提供为一种聚核巧酸。
[001引 W下，对本发明进行详细记载。
[0019] 在本说明书中所使用的术语"肝细胞生长因子异构体(isoform)"是指包含全部对 立基因变体(variants)的、具有与在动物中自然生成的（naturally occurring)肝细胞生 长因子氨基酸序列至少相同80%的氨基酸序列的肝细胞生长因子聚肤。例如，肝细胞生长 因子异构体具有全部包括肝细胞生长因子的正常型(normal form)或野生型(wild type) 及肝细胞生长因子的多种变异体(例如，剪接变异体及缺损变异体)的意义。
[0020] 在本发明的一实施例中，本发明的肝细胞生长因子的两种W上的异构体包含全长 型肝细胞生长因子（化11 length HGF;flHGF)和缺损的变异型肝细胞生长因子（deleted variant HGF;地GF)。在利用均包含全长型肝细胞生长因子和缺损的变异型肝细胞生长因 子的组合物的情况下，可更有效地预防或治疗肌萎缩性侧索硬化症。
[0021] 在本说明书中使用的术语"全长型肝细胞生长因子"是指动物，优选地，指哺乳动 物，更优选地，人类肝细胞生长因子的氨基酸序列1-序列728。
[0022] 在本说明书中使用的术语"缺损的变异型肝细胞生长因子"是指在动物中，优选 地，在哺乳动物中通过肝细胞生长因子基因的选择性剪接生成的肝细胞生长因子蛋白质的 缺损的变体，更优选地，从全长型肝细胞生长因子序列a链的第一个=环域中由5个氨基酸 (F、L、P、S及S)缺损的723个氨基酸组成的人类肝细胞生长因子。
[0023] 在本发明的一具体例中，本发明的全长型肝细胞生长因子包含序列表中序列1的 氨基酸序列，本发明的缺损的变异型肝细胞生长因子包含序列表中序列2的氨基酸序列。
[0024] 在本发明的一实施例中，本发明的肝细胞生长因子的多个异构体借助单独的核巧 酸序列进行编码，或借助单一的聚核巧酸进行编码。本发明的药学组合物在肝细胞生长因 子的互不相同的种类的多个异构体借助单独的聚核巧酸进行编码的情况下，包含两种W上 的聚核巧酸，在肝细胞生长因子的互不相同的种类的多个异构体借助单一的聚核巧酸进行 编码的情况下，包含含有上述单一的聚核巧酸的一种W上的聚核巧酸。本发明的聚核巧酸 能够W可操作的方式与用于调节多个肝细胞生长因子异构体的表达的一种W上的调节序 列(例如，启动子或增强子)相连接。
[0025] 在肝细胞生长因子的两种W上的异构体借助单独的聚核巧酸进行编码的情况下， 能够W两种方式构建表达组件。根据第一种方式，将表达调节序列与针对各个异构体的编 码序列（CDS,coding sequence)相连接来构建表达组件。根据第二种方式，W "表达调节序 列-第1异构体编码序列-内部核糖体进入位点（IRES,internal ribosomal enhy Site)-第2异构体编码序列-转录终止序列"的方式利用内部核糖体进入位点或2A肤构建表达组 件。内部核糖体进入位点使基因的翻译在内部核糖体进入位点序列中开始，从而使两种W 上的感兴趣的基因在相同的结构物中表达。
[0026] 在肝细胞生长因子的两种W上的异构体借助单一的聚核巧酸进行编码的情况下， 对上述两种W上的异构体均进行编码的聚核巧酸W可操作的方式与单一的表达调节序列 相连接。
[0027] 在本发明中，肝细胞生长因子的异构体可借助两种W上的互不相同的种类的异构 体，例如，一同表达全长型肝细胞生长因子及缺损的变异型肝细胞生长因子的杂交 化ybrid)肝细胞生长因子基因进行编码。
[00%]根据本发明的优选实例，上述杂交肝细胞生长因子基因包含:互补脱氧核糖核酸， 相当于人类肝细胞生长因子的外显子1至外显子18; W及人类肝细胞生长因子基因的内含 子4或其片段，插入于上述互补脱氧核糖核酸的外显子4与外显子5之间。
[0029] 根据本发明的更优选实例，上述杂交肝细胞生长因子基因包含选自由序列表中序 列3至序列10组成的组中的核巧酸序列。
[0030] 包含上述内含子4的杂交肝细胞生长因子基因的长度为7113bp，包含序列表中序 列3的核巧酸序列。选择性地，上述杂交肝细胞生长因子基因在肝细胞生长因子的互补脱氧 核糖核酸的外显子4与外显子5之间可包含内含子4的片段。
[0031] 根据本发明的优选实例，追加插入于上述外显子4与外显子5之间的序列为人类肝 细胞生长因子基因的内含子4、序列表中序列3的从第392至第2247的核巧酸、序列表中序列 3的从第392至第727的核巧酸、序列表中序列3的从第2229至第5471的核巧酸、序列表中序 列3的从第5117至第5471的核巧酸、序列表中序列3的从第3167至第5471的核巧酸、序列表 中序列3的从第4167至第5471的核巧酸或其组合。
[0032] 更优选地，在本发明中利用的追加插入于治疗学核巧酸序列的外显子4与外显子5 之间的序列为（i)序列表中序列3的从第392至第2247的核巧酸和序列表中序列3的从第 2229至第5471的核巧酸、（ii)序列表中序列3的从第392至第2247的核巧酸和序列表中序列 3的从第5117至第5471的核巧酸、（iii)序列表中序列3的从第392至第2247的核巧酸和序列 表中序列3的从第3167至第5471的核巧酸、（iv)序列表中序列3的从第392至第2247的核巧 酸和序列表中序列3的从第4167至第5471的核巧酸、（V)序列表中序列3的从第392至第727 的核巧酸和序列表中序列3的从第2229至第5471的核巧酸、（Vi)序列表中序列3的从第392 至第727的核巧酸和序列表中序列3的从第5117至第5471的核巧酸、（Vii)序列表中序列3的 从第392至第727的核巧酸和序列表中序列3的从第3167至第5471的核巧酸或(Viii)序列表 中序列3的从第392至第727的核巧酸和序列表中序列3的从第4167至第5471的核巧酸。
[0033] 根据追加插入于上述外显子4与外显子5之间的序列，整理本发明的治疗学核巧酸 序列如下：（i)(外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第392至第2247的核巧酸-序列表 中序列3的从第2229至第5471的核巧酸）-(外显子5至外显子18); (ii)(外显子1至外显子 4)-(序列表中序列3的从第392至第2247的核巧酸-序列表中序列3的从第5117至第5471的 核巧酸)-(外显子5至外显子18); QiiK外显子1至外显子4)-(序列表中序列3的从第39