肝素结合表皮生长因子样生长因子抗原结合蛋白的制作方法

专利名称：肝素结合表皮生长因子样生长因子抗原结合蛋白的制作方法
肝素结合表皮生长因子样生长因子抗原结合蛋白背景人表皮生长因子受体(HER)家族包括称为HERl (或erbBl)、HER2(或erbB2)、 HER3 (或erbB3)和HER4 (或erbB4)的4种不同的受体酷氨酸激酶。HERl通常也称为表皮 生长因子受体(EGFR)。除了 HER3以外，这些受体都具有磷酸受体(phospho-acc印tor)靶 特异性内在蛋白酪氨酸激酶活性。HER家族的成员在大多数表皮细胞以及在许多不同的肿 瘤细胞类型中表达。例如，HER家族的受体在上皮来源以及间充质来源的肿瘤细胞中表达。 此外，HER受体酪氨酸激酶参与细胞增殖和血管生成，这与疾病例如癌症相关。例如，EGFR 频繁在乳腺癌、肝癌、肾癌、白血病、支气管癌、胰腺癌和胃肠癌例如结肠癌、直肠癌或胃癌 中过表达或被异常激活。高水平的EGF受体还与不良预后和对治疗的应答相关(Wright等 人，1992,Br. J. Cancer 65 :118_121)。因此，中断来往于这些激酶之间的信号转导可具有抗 增殖作用，从而对许多癌症和肿瘤细胞类型具有治疗作用。受体酪氨酸激酶的酶促活性可通过过表达和/或通过配体介导的二聚化来刺激 (Heldin, 1995, Cell 80 :213_223)。受体同二聚体和异二聚体的激活导致受体上的酪氨酸 残基的磷酸化，这反过来磷酸化其他分子(包括细胞内蛋白质)的酪氨酸残基。(Ullrich 等人，1990，Cell 61:203-212)。之后细胞内信号转导途径例如牵涉丝裂原活化蛋白激酶 (MAP 激酶)(Dhillon 等人，2007，Oncogene 26 =3279-3290)和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3 激 酶)的信号转导途径被激活。已显示此类途径的激活增加细胞增殖和抑制细胞凋亡，还已 显示小分子抑制剂或单克隆抗体对由HER家族成员介导的信号转导的抑制抑制了细胞增 殖和促进了细胞凋亡(Prenzel 等人，2001，Endocr. Relat. Cancer 8 :11_31)。肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)是22kDa的0_糖基化蛋白质 (Higahiyama 等人，1992，J Biol Chem 267:6205-6212)。HB-EGF 以其成熟形式结合并 且激活 EGF 受体和 HER4(Elenius 等人，1997，EMBO 16:1268-1278)。HB-EGF 是 G 蛋白 偶联受体(GPCR)诱导的细胞增殖(通过称为三重膜传递信号转导(triple-membrane passingsignaling, TMPS)的过程)的至关重要的介体(Prenzel 等人，1999，Nature 402 884-888，综述于 Fischer 等人 2003，Biochem. Soc. Trans. 31 1203-1208 中)。已显 示HB-EGF促进细胞增殖以及血管生成(Zushi等人，1997，Int J Cancer 73:917-923; Abramovitcn 等人，1998，FEBS letters 425:441-447)。还显示 HB-EGF 在许多癌症中起着 至关重要的作用，即，其与卵巢肿瘤的侵袭性行为相关。(Tanaka等人，2005，Clin. Cancer Re s. 11 =4783-4792) 0此外，HB-EGF是卵巢癌细胞系异种移植物肿瘤形成所必需的。 HB-EGF (野生型或分泌形式)的过表达加速了 SK0V3和RMG-I细胞中的肿瘤形成。然而，使 用siRNA对内源HB-EGF的抑制消除或延迟了 SK0V3和RMG-I细胞的肿瘤形成。Miyamoto， 2004，Cancer Res. 64 :5720。如由上述证据所表明的，HB-EGF表达或活性的抑制可抑制肿 瘤形成。类似地，HB-EGF在一些癌症包括人膀胱癌中是不良预后的标志物(Thogersen等 人，2001，Cancer Res. 61 =6227-6233) 0体外研究表明经工程改造表达HB-EGF (野生型，可 溶性的或不可切割的)的人EJ膀胱细胞展示生长的增加、不依赖锚定的生长和VEGF的产
15生以及增强的迁移。当将此类表达HB-EGF的EJ膀胱细胞移植入裸小鼠时，在肿瘤中观察 到增加的肿瘤形成、血管的大小和密度。(Ongusaha，2004Cancer Res. 64 =5283-5290) 概述本文中提供了结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白。此类抗原结合蛋白中的一些 包含A) —个或多个由下列组成的轻链互补决定区(CDRL) :(i)选自SEQ ID NO :189_217的 CDRLl ； (ii)选自 SEQ IDNO :218_233 的 CDRL2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :234_274 的 CDRL 3 ； 或(iv)包含一个或多个不超过4个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii) 的CDRL。备选地，HB-EGF抗原结合蛋白可包含B) —个或多个由下列组成的重链互补决定区 (CDRH)⑴选自 SEQ ID NO :275_299 的 CDRHl ； (ii)选自 SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ； (iii)选自SEQ ID NO :332_372的⑶RH 3 ；或(iv)包含一个或多个不超过4个氨基酸的氨 基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRH。在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白可包含1、2或更多个上述轻链⑶RL和 1、2或更多个上述重链⑶RH。在一个方面中，分离的抗原结合蛋白包含⑶RH1、⑶RH2、⑶RH 3、⑶RL1、⑶RL2和⑶RL 3。在另一个方面，A)的分离的抗原结合蛋白(同上)选自来自 SEQ IDNO 189-217 的 CDRLl ；来自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；来自 SEQ IDNO :234_274 的CDRL 3 ；和包含一个或多个不超过2个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的上述(i)、 (ii)或(ii)的CDRL。此外B)的所述重链CDRH(同上)选自来自SEQ ID NO =275-299的 CDRHl ；来自 SEQ IDNO :300_331 的 CDRH2 ；来自 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 和包含一个或 多个不超过2个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的上述的CDRH。此外，分离的抗原结合蛋 白可包含一个或多个A)的轻链⑶RL (同上)；和一个或多个B)的重链⑶RH(同上)。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含选自下列的⑶RL:来自SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl ；来自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；来自 SEQ ID NO :234_274 的 CDRL3。 抗原结合蛋白还可包含选自下列的⑶RH 来自SEQ ID NO 275-299的⑶RHl ；来自SEQ ID NO 300-331的CDRH2 ；来自SEQ ID NO :332_372的CDRH 3。备选地，分离的抗原结合蛋白 可包含一个或多个A)中所列的轻链⑶RL (同上)，和一个或多个B)的重链⑶RH(同上)。 特别地，分离的抗原结合蛋白可包含SEQ ID NO 189-217的CDRLl、SEQ ID NO 218-233 的 CDRL2 和 SEQID NO 234-274 的 CDRL3 和 / 或 SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl、SEQ IDNO 300-331 的 CDRH2 和 SEQ ID NO 332-372 的 CDRH3。在一个方面中，分离的抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO :94_141的氨基酸序列 具有至少80%、90%或100%的序列同一性的轻链可变区(\)。在另一个方面，分离的抗原 结合蛋白包含与选自SEQ IDNO 142-186的氨基酸序列具有至少80 %、90 %或100 %的序列 同一性的重链可变区(Vh)。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白特异性识别至少HB-EGF的包含IHGE 的表位和/或EGF样结构域。此外，本文中还提供了与如上所述的结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白竞争结 合的分离的抗原结合蛋白。本文中还提供了分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白结合HB-EGF并且包含 A) 一个或多个选自下列的轻链CDR (CDRL) (i)与SEQID NO 189-217具有至少80%或至 少90%的序列同一性的CDRLl ； (ii)与SEQ ID NO :218_233具有至少80%或至少90%的
16序列同一性的CDRL2 ；和(iii)与SEQ ID NO :234_274具有至少80%或至少90%的序列同 一性的⑶RL 3。备选地，结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白包含B) —个或多个选自下列 的重链CDR(CDRH) :(i)与SEQ ID NO :275_299具有至少80%或至少90%的序列同一性的 CDRHl ； (ii)与SEQ ID NO 300-331具有至少80%或至少90%的序列同一性的CDRH2 ；和 (iii)与SEQ ID NO :332_372具有至少80%或至少90%的序列同一性的CDRH 3。分离的 抗原结合蛋白还可包含C) 一个或多个A)的轻链⑶RL和一个或多个B)的重链⑶RH。
在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白结合HB-EGF并且包含A)选自下列的 轻链互补决定区(CDRL)⑴选自SEQ ID NO =234-274的CDRL3 ;(ii)在氨基酸序列上与 ⑴的CDRL3相异于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRL3 ；和(iii)选自 下列的⑶RL3氨基酸序列X1QX2X3X4X5PX6X7(SEQ ID NO: 1046)，其中
X1是I或M，
X2是々、6或S，
&是1或T，
X4是H或Q，
X5 是 F、L 或 W，
X6 是 C、1、!1、1^或1\
X7是S或T ；
QQX1X2X3X4X5IT(SEQ ID NO: 1047)，其中
X1是I或S，
X2是F或Y，
X3 是 F、I、S 或 Y，
X4 是 A、S 或 T，
X5是P或S ；
X1X2X3X4X5X6X7X8T(SEQ ID NO: 1048)，其中
X1是！^或Q，
X2是K、N或Q，
X3是々、H、S或Y，
X4 是 H、N 或 Y，
X6 是 A、F、I、Τ、V 或 Y，
X7是P或无氨基酸，
X8 是 F、L 或 P ；
QX1X2DX3LPX4X5(SEQ ID NO: 1049)，其中
X1是!1或Q，
X2是C或Y，
X3 是 D、I、N、S 或 Y，
父4是？、I或L，
父5是々、3或T ；
17
QQX1X2X3X4PX5X6X7(SEQ ID NO: 1050)，其中X1 是 H 或 Y，X2 是 G 或 N，X3 是 N 或 S，X4 是 S 或 W，X5是P或无氨基酸，X6 是 R 或 W，X7 是 S 或 T ；或X1QYX2X3X4X5X6X 7F(SEQ ID NO: 1051)，其中X1 是 H 或 Q，X2 是 F 或 Y，X3 是 G、I 或 S，X4 是 F、I 或 T，乂5是] 、？、3或1\X6 是 F、L、R 或 W,X7 是 S 或 T。分离的抗原结合蛋白还包含B)选自下列的重链互补决定区(⑶RH) :(i)选自SEQ ID NO 332-372的⑶RH3 ； (ii)在氨基酸序列上与(i)的⑶RH3相异于不超过2个氨基酸 的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH3 ；和iii)选自下列的CDRH3氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11DX12 (SEQID NO 1065)，其中X1是E 或 S，X2是0、G或无氨基酸，X3是D、N或无氨基酸，X4是G或无氨基酸，X5是G或无氨基酸，X6是W、Y或无氨基酸，X7 是 I、N 或 Y，X8 是 A 或 Y，X9 是 G、V 或 Y，父10是八、？或GX11 是 F、L 或 M，X12 是 V 或 Y ；QX1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13X14DX15(SEQ ID N0:1066)，其中X1是G或无氨基酸、X2 是 K、L 或 Y，X3 是 A、G 或 S，X4 是 S、V 或 Y，X5 是 A 或 G，X6是G或无氨基酸，
X7是T或无氨基酸，X8是S或无氨基酸，X9是Y或无氨基酸，X10 是 W 或 Y，X11 是 G、S 或 Y，X12 是 F 或 Y，X13是G或无氨基酸，X14是M或无氨基酸，X15 是 V 或 Y ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO: 1067)，其中
X1是D、G、L、S或无氨基酸，X2是6、H、W、Y或无氨基酸，X3是A、F、W、Y或无氨基酸，X4是D、G、Q、T或无氨基酸，X5是G、I、Q、S或无氨基酸，X6是A、D、N、Q、S或无氨基酸，X7是6、Y或无氨基酸，X8是0、Y或无氨基酸，X9是Y或无氨基酸，X1。是 A、E、N 或 Y，X11 是 G、P、Τ、V 或 Y，父12是？或I，父13是0或 Q，X14 是 C、H、V或 Y;X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18(SEQ ID NO: 1068)，其中X1是E、D或无氨基酸，X2是6、R或无氨基酸，X3是I、V、Y或无氨基酸，X4 是 A、G、L 或 N，父5是々、6、￥或 W，X6 是 A、N、R 或 T，X7是6、N、P或无氨基酸，X8是6、T或无氨基酸，X9是A或无氨基酸，Xltl是D、E或无氨基酸，X11是S、Y或无氨基酸，X12是6、Y或无氨基酸，X13是N、Y或无氨基酸，X14是Y或无氨基酸，
X15是0、Y或无氨基酸，X16是々、G或无氨基酸，X17 ^ F ^ M,父18是1、乂或Y;X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23 (SEQ ID NO ；1069)，其中X1 是八、0、6、3 或 T，父2是43、6、1^、11 、￥或无氨基酸，父3是4、6、1^、11 、1\￥或无氨基酸，父4是0、6、1 、5、￥、￥或无氨基酸，X5是六、6、I、S、V、Y或无氨基酸，X6是F、G、L、R、V或无氨基酸，&是1^、1\￥或无氨基酸，X8是Y或无氨基酸，X9是Y或无氨基酸，Xltl是D或无氨基酸，X11是S或无氨基酸，X12是S或无氨基酸，X13是G或无氨基酸，乂14是0、1^、11、5、￥ 或无氨基酸，X15 是 H、I、P、V、W 或无氨基酸，乂16是？、6、1^、1 、5、￥ 或无氨基酸，X17 是0、F、V、W、Y 或无氨基酸，X18 是 C、F、L、P、S 或 Y，X19 是0、F、G 或 Y，父2。是八、(、6、卩、1 、￥或￥，X21 是？、1^、11、3 或无氨基酸，X22是々、D或无氨基酸，&3是I、L、V、Y或无氨基酸；X1YSSGffX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO: 1070)，其中父是]^或 V，X2是S或无氨基酸，X3是F或无氨基酸，X4是V或无氨基酸，父5是？或1X6是V或Y;或RX1X2X3PFX4Y(SEQ ID N0:1071)，其中X1 是G、H、L、N 或 R，X2是E、T 或 W，父3是1^、111或￥，
X4 是 D 或 E。在另一个方面，分离的抗原结合蛋白还可包含A)选自下列的⑶RL:(i)选自SEQ ID NO 189-217的⑶RLl ； (ii)在氨基酸序列上与(i)的⑶RHl相异于不超过2个氨基酸 的氨基酸添加、缺失或置换的CDRLl ；或(iii)选自下列的CDRLl氨基酸序列x1ssqslx2x3sdgx4tylx5(seq id n0:1035)，其中父是仄或R，X^L 或 V，父3是!1或 Y，父4是1(或n，父5是13或Y;RASQX11SX2YLN(SEQ ID N0:1036)，其中父1是尺、3或1\父2是1 或S;RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID NO: 1037)，其中父1是0、6、3或1\父2是八、1 或S，X3 是 H、I、N、R、S 或 T，X4 是 D、W 或 Y，父5是八、6或n;QASQDIX1X2X3LN(SEQ ID N0:1038)，其中父1是3或1\x^d 或n，&是3 或Y;RASQX1VX2X3X4X5LA(SEQ ID N0:1039)，其中父1是3或1\X2 是 I 或 S，X3 是 R 或 S，X4是S、N或无氨基酸，X5是Y或无氨基酸；或kssqx1x2lx3x4snnknylx5(seq id no: 1040)，其中X1是N 或 S，父2是1或乂，X3 是 D 或 Y，X4 是 N、R 或 S，XjA或V;(iv)选自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ； (ν)在氨基酸序列上与(iv)的 CDRL2 相 异于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRL2 ；或(vi)选自下列的CDRL2氨 基酸序列X1X2SNX3X4S(SEQ ID N0:1041)，其中
X1是E 或K、X2 ^ I ^ V,父3是1 或W，X4 是D 或F;X1X2SX3LQS(SEQ ID N0:1042)，其中父1是八或T，X2 是 A、E 或 V，X3 是 S 或 T ；X1ASX2LQS(SEQ ID N0:1043)，其中X1 是 A 或 V，X2 是 S 或 T ；DASX1LET(SEQ ID NO: 1044)，其中X1 是 I 或 N ；GASSRAT(SEQ ID NO 223)；或WASX1RES(SEQ ID NO: 1045)，其中父丨是八或T。分离的抗原结合蛋白还可包含B)选自下列的CDRH (i)选自SEQID NO =275-299 的CDRHl;(ii)在氨基酸序列上与(i)的CDRHl相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、 缺失或置换的⑶RHl ； (iii)选自下列的⑶RHl氨基酸序列GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 1052)，其中
父工是？或L，
X2 是E、G 或 S，
X3 是 H、L 或 Y，
父4是6、3或Y，
X5是I或M，
X6是H或S ；
GYX1FTSYffIG(SEQ ID NO: 1053)，其中
X1是R或S ；
GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID N0:1054)，其中
X1是1 或S，
X2是H或Y，
X3是D或G ；
GFX1FSX2YX3MX4(SEQ ID N0:1055)，其中
父工是？或T，
X2是々、1 或S，
&是々或S，
X4是N或S ；
GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8(SEQ ID NO: 1056)，其中
父工是0或G，
父2是卩、1或乂，X3是R、S或无氨基酸，X4是6、Y或无氨基酸，&是0、6、3或无氨基酸，x6 是 a、s 或 y，x7 是 a 或 y，x8 是 n 或 s ；gfslsnarmgvs (seq id no 279)；或gfslxjggvgvg(seq id no: 1057)，其中x1 是 s 或 n ；(iv)选自 SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ； (ν)在氨基酸序列上与(iv)的 CDRH2 相 异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH2 ；或(vi)选自下列的CDRH2氨 基酸序列x1x2x3x4x5x6gx7tx8x9xltlqkx11x12 (seq id no: 1058)，其中X1 是 S 或 W，父2是？或I，X3 是 D、N 或 S，x4 是 a 或 p，x5是e、n 或 s，X6 是 D、N 或 S，X7 是 E、G 或 N，x8 是 i 或 n，x9 是 c、h 或 y，x1。是 a 或 t，x11 是 f 或 l，X12 是 D 或 G ；Iiypx1Dsdx2Ryspsfqg(seq id no:io59)，其中X1 是 D 或 G，x2 是 a、i 或 t ；X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G(SEQ ID NO: 1060)，其中x1 是 f 或 v，x2 是 s 或 w，父3是0、3或 y，x4 是 i、n 或 t，X5 是 K 或 Q，X6 是 N、R 或 Y，x7 是 a、t 或 v，X8 是 K 或 R ；x1isx2sx3x4x5xeyyadsvkg(seq id n0:1061)，其中
X1 是 A、H 或 Y，父2是6、1 或S，父3是6或 S，X4 是 G、R 或 S，X5 是 S、T 或 Y，X6 是 I 或 T ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13SX14KS(SEQ ID NO: 1062)，其中X1是E、R 或 Y，X2 是 I 或 T，X3 是 H、N 或 Y，X4 是 C、H、S、T 或 Y，X5 是 S 或 R，X6 是 G 或 S，X7 是 G、K、S 或 T，X8 是 T 或 W，X9 是 N 或 Y，Xltl是N或无氨基酸，X11是D或无氨基酸，X12 是 A 或 N，X13 是 P 或 V,X14 是 L 或 V ；X1Ifsndeksystslks(seq id no:io63)，其中父工是！!或Li;或LIYffNX1X2KRYSPSLX3S(SEQ ID N0:1064)，其中X1 是 D 或 V，父2是0或E、X3 是 K 或 R。在另一个实施方案中，上述分离的抗原结合蛋白包含第一氨基酸序列和第二氨基 酸序列，这两个序列彼此共价连接。第一氨基酸序列还包含SEQ ID NO: 234-274的⑶RL 3、 SEQ ID NO 218-233 的 CDRL2 和 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl，以及第二氨基酸序列包含 所述 SEQ IDNO 332-372 的 CDRH3，SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 和 SEQ ID NO :275_299 的 CDRHl。在一个方面，分离的抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人 抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。抗体片段可以是Fab片段、 Fab'片段、F(ab' )2片段、Fv片段、双价抗体(diabody)或单链抗体分子。在一个实施方 案中，本发明的分离的抗原结合蛋白是人抗体。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白 是单克隆抗体。本文中描述的分离的抗原结合蛋白，可以是下列类型的任一种IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4类型。在一个实施方案中，抗原结合蛋白是I gG2或I gG4类型。此外，可将抗原结合蛋白偶联至标记基团。此类标记基团可以是例如放射性同位素、放射性核素、荧光基团、 酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽基团。在另一个实施方案中，将分离的抗原结合蛋白偶联至效应子基团例如放射性同位 素、放射性核素、毒素、治疗性基团或化学治疗基团。化学治疗基团可以是例如卡奇霉素、 auristatin-PE、格尔德霉素、美登纳新或其衍生物。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白与本文中所述和请求保护的抗原结合 蛋白竞争对人HB-EGF的结合。该竞争性抗原结合蛋白可以是例如单克隆抗体、多克隆抗 体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。抗体片段可以 是例如Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。在一个 实施方案中，分离的结合蛋白是人抗体。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白是单克 隆抗体。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4类型。在 一个实施方案中，抗原结合蛋白是IgG2或IgG4类型。在另一个实施方案中，可将本文中描 述的抗原结合蛋白偶联至标记基团。标记基团的实例是放射性同位素、放射性核素、荧光基 团、酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽基团。在另一个实施方案中，将分 离的抗原结合蛋白偶联至效应子基团例如，放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗性基团 或化学治疗基团。治疗性基团或化学治疗基团的实例包括例如卡奇霉素、auristatin-PE, 格尔德霉素、美登纳新或其衍生物。在一个方面中，提供了至少部分地减少HB-EGF介导的信号转导的分离的抗原结
合蛋白ο本文中还提供了编码之前所描述的分离的抗原结合蛋白的核酸分子，其中核酸分 子与控制序列有效连接。在一个方面中，提供了包含上述核酸分子的载体。在另一个方面， 提供了包含上述核酸分子和/或载体的宿主细胞。在一个实施方案中，提供了用于制备抗原结合蛋白的方法，其包括从分泌所述抗 原结合蛋白的宿主细胞制备所述抗原结合蛋白的步骤。在另一个实施方案中，提供了包含至少一种上述的本发明的抗原结合蛋白以及可 药用的载体、稀释剂和/或佐剂的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物可包含另外 的活性剂例如抗肿瘤剂。抗肿瘤剂可以是例如抗肿瘤抗体。抗肿瘤抗体的实例可以是例如 抗受体酪氨酸激酶或EGFR的抗体。在一个方面中，药物组合物用于过度增殖性疾病的诊断、预防或治疗。在另外的方 面，过度增殖性疾病与HB-EGF表达相关。在另一个方面，过度增殖性疾病与被扰乱的(例 如病理性增强的)生长因子受体激活相关或与其相伴，其中所述病理性增强的生长因子受 体激活与G蛋白和/或G蛋白偶联受体的活性的病理性增加相关或由其引起。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种抗原结合蛋白和可药用的载体、稀 释剂和/或佐剂，所述药物组合物用于诊断、预防或治疗癌症例如乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、 前列腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺 癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑素瘤、其他表达或过表达HB-EGF的癌症以及肿瘤转移的形成。在另一个实施方案中，本文中所描述的抗原结合蛋白用于制造药物组合物，所述 药物组合物用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病。在另外的实施方案中，过度增殖性疾病 与HB-EGF表达相关。
—个实施方案描述了用于诊断与HB-EGF的表达相关的病况的方法，该方法包括 将样品与本文中所描述的分离的抗原结合蛋白接触，和确定HB-EGF在所述样品中的存在 的步骤。在另外的实施方案中，病况是与HB-EGF表达相关的过度增殖性疾病。另一个方面描述了用于预防或治疗患者中与HB-EGF的表达相关的病况的方法， 其包括对有此需要的患者施用有效量的本文中所描述的抗原结合蛋白。在另外的方面，病 况是与HB-EGF表达相关的过度增殖性疾病。在另外的方面，患者是哺乳动物患者。在一个实施方案中，提供了包含如上所述的抗原结合蛋白、核酸分子或载体的试 剂盒。在另外的实施方案中，试剂盒包含至少一种另外的活性剂，其中另外的活性剂是抗肿 瘤剂。本发明的这些和其他方面将在本文中进行更详细地描述。本发明的每一个方面可 包括本发明的不同实施方案。因此预期包括一个元素或元素的组合的本发明的每一个实施 方案可包括在本发明的每一个方面中。本发明的其他特征、目的和有利方面在随后的发明 详述中是显然的。附图概述

图1A-1P描述了抗原结合蛋白的不同轻链可变区。⑶R1、⑶R2和⑶R3区标示于 框中。图2A-20描述了抗原结合蛋白的不同重链可变区。⑶R1、⑶R2和⑶R 3区标示于 框中。图3A-3K描述了抗原结合蛋白的不同轻链的氨基酸序列。图4A-40描述了抗原结合蛋白的不同重链的氨基酸序列。图5A描述了抗原结合蛋白的示例性轻链恒定区的氨基酸序列。图5B描述了抗原结合蛋白的示例性重链恒定区的氨基酸序列。图6A-6F描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同CDR区的氨基酸序列。图7A-7E描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同CDR区的氨基酸序列。图8A-8H描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同FR区的氨基酸序列。图9A-9F描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同FR区的氨基酸序列。图IOA和IOB描述了抗原结合蛋白的轻链可变序列的氨基酸序列的比对。⑶R1、 CDR2和CDR3区示于框中。图IlA和IlB描述了抗原结合蛋白的重链可变序列的氨基酸序列的比对。⑶R1、 CDR2和CDR3区示于框中。图12A描述了显示抗原结合蛋白的轻链可变区的亲缘关系(relatedness)的进化 树。图12B描述了显示抗原结合蛋白的轻链CDRL3区的亲缘关系的进化树。图12C描述了显示抗原结合蛋白的重链可变区的亲缘关系的进化树。图13A-13V描述了抗原结合蛋白的不同轻链可变区的核苷酸序列。图14A-14C描述了抗原结合蛋白的不同重链可变区的核苷酸序列。图15A-15M描述了抗原结合蛋白的不同轻链的核苷酸序列。图16A-16L描述了抗原结合蛋白的不同重链的核苷酸序列。图17A描述了抗原结合蛋白的轻链恒定区的核苷酸序列。
图17B描述了抗原结合蛋白的重链恒定区的核苷酸序列。图18A-18F描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同⑶R区的核苷酸序列。图19A-19G描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同⑶R区的核苷酸序列。图20A-20K描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同FR区的核苷酸序列。图21A-21K描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同FR区的核苷酸序列。图22A图解说明本文中提供的不同抗HB-EGF IgG2抗体制剂抑制HB-EGF诱导的 表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸磷酸化所达到的程度。提供了抗体U2-1至U2-68的制 剂的结果。如所说明的，单克隆抗体制剂U2-18、U2-24、U2-19和U2-42强烈地抑制EGFR的 酪氨酸磷酸化。图22B图解说明本文中提供的不同抗HB-EGF IgG4抗体制剂抑制HB-EGF诱导的 表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸磷酸化所达到的程度。提供了抗体U2-2至U2-66的制 剂的结果。如所说明的，单克隆抗体制剂U2-39、U2-34、U2-45和U2-6强烈地抑制EGFR的
酪氨酸磷酸化。图23举例说明抗体抑制C0S-7细胞中溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA) 诱导的EGFR的酪氨酸磷酸化。LPA是激活TMPS途径，从而导致HB-EGF的释放(进而导致 EGFR的酪氨酸磷酸化)的GPCR配体。用指定的抗体预处理且用LPA刺激C0S-7细胞，然后 制备细胞裂解物，且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离裂解物蛋白质。在制备印迹后，使用抗磷 酸酪氨酸抗体检测磷酸化的EGFR。作为对照，如下图中所示，使用WB抗EGFR抗体检测总 EGFR0如所说明的，抗HB-EGF抗体制剂U2-24、U2-19和U2-42强烈抑制LPA诱导的EGFR 磷酸化。图24图解说明本文中提供的不同抗体对HB-EGF-诱导的EGF受体的酪氨酸磷酸 化的剂量依赖性抑制。在刺激SCC9鳞癌细胞之前将不同浓度的候选U2-39、U2-42和U2-45 抗体制剂与HB-EGF —起预温育，然后检测EGFR的酪氨酸磷酸化的量。如所显示的，抗体 U2-42和U2-39获得多达111%的抑制。对于抗体测定的IC50值分别为0. 167nM(U2_39)、 lnM(U2-42)和 2nM(U2_45)。图25图解说明抗HB-EGF抗体制剂对MDA-MB231细胞中经由TMPS的凝血酶诱导的 EGFR磷酸化的剂量依赖性抑制。在凝血酶存在的情况下将MDA-MB231细胞与候选U2-42、 U2-39和U2-45抗体制剂一起温育，然后使用实施例6中描述的方法检测EGFR的酪氨酸磷 酸化的量。如所显示的，抗体U2-42和U2-39获得100%的抑制。图26举例说明抗HB-EGF抗体制剂对PPC-1细胞中经由TMPS的LPA诱导的EGFR 的酪氨酸磷酸化的剂量依赖性抑制。将PPC-I细胞与候选U2-42、U2-39和U2-45抗体制剂 一起温育，然后使用实施例4中描述的方法检测LPA刺激后EGFR的酪氨酸磷酸化的量。如 所显示的，抗体U2-42、U2-39和U2-45获得100%的抑制。图27举例说明抗HB-EGF抗体制剂对鞘氨醇磷酸诱导的MDA-MB231乳腺癌细 胞的迁移的抑制达到100%。使用胶原I-包被的transwell(BD FalcomSym孔)就细胞 迁移的抑制检测候选抗HB-EGF抗体制剂U2-42、U2-39和U2-45。如所显示的，抗HB-EGF抗 体制剂U2-42抑制鞘氨醇-1-磷酸诱导的MDA-MB231细胞迁移大约70%，而U2-39和U2-45 抗HB-EGF抗体制剂抑制MDA-MB231细胞迁移大约100%。因此，本文中提供的抗HB-EGF抗 体强烈抑制MDA-MB231细胞迁移。
图28图解说明HB-EGF诱导的MCF-7乳腺癌细胞的迁移被3种抗HB-EGF抗体制 剂(U2-42、U2-39和U2-45单克隆抗体制剂)抑制。图29举例说明抗HB-EGF抗体制剂对HB-EGF诱导的HER4的酪氨酸磷酸化的剂量 依赖性抑制。在刺激和检测HER4的酪氨酸磷酸化之前将U2-42. 1或U2-39. 1抗HB-EGF抗 体制剂与HB-EGF —起温育。如所显示的，观察到对HER4的酪氨酸磷酸化的100%的抑制。 注意，示于χ轴的抗体的量对数减少。图30A显示单克隆抗体制剂与来自食蟹猴(cynomolgus monkey)的HB-EGF交叉 反应，如使用用表达食蟹猴HB-EGF的DNA载体转染的HEK-293细胞通过流式细胞术(FACS) 所估量的。如所显示的，对于用空载体对照转染的HEK-293对照细胞观察到极低的X-平均 值(1-2)。相反地，当用编码食蟹猴HB-EGF的表达盒转染HEK-293细胞时，观察到250或更 高的X-平均值。图30B显示单克隆抗体U2-45制剂与来自小鼠的HB-EGF交叉反应，如使用用表达 小鼠HB-EGF的DNA载体转染的HEK-293细胞通过流式细胞术(FACS)所估量的。当用编码 小鼠HB-EGF的表达盒转染HEK-293细胞时，观察到33. 7的X-平均值。图30C显示HB-EGF抗体与双调蛋白(amphiregulin)的交叉反应性的程度。图31显示HB-EGF在人血管内皮细胞(HUVEC)上表达，如通过FACS分析所检测的。图32A-32B显示HB-EGF刺激HUVEC细胞增殖，而抗HB-EGF抗体制剂抑制基础增殖 大约8%至14%。HB-EGF刺激HUVEC细胞增殖大约38% (图32A)。然而，在加入抗HB-EGF 抗体制剂U2-42、U2-39或U2-45后，基础细胞增殖被抑制大约8%至14% (图32B)。图 33A-33L 举例说明抗 HB-EGF 抗体加速 HUVEC 管退化(tuberegression)。HUVEC 管形成是内皮细胞血管生成的模式系统。图33A-33C提供了在不使用抗HB-EGF抗体的情况 下进行的对照测定。如所显示的，HUVEC细胞连接形成许多环形结构或“管”。图33D-33F举 例说明加入抗HB-EGF U2-39抗体制剂对管形成的作用。图33G-33I举例说明加入抗HB-EGF U2-42抗体制剂对管形成的作用。图33J-33L举例说明加入抗HB-EGF U2-45抗体制剂对管 形成的作用。如所显示的，当存在U2-42、U2-39和U2-45抗HB-EGF抗体制剂时，可看到较 少的HUVEC管，并且网络减少。图33M图解说明在加入本文中提供的抗HB-EGF抗体制剂后HUVEC管形成的定量 评估，其支持HB-EGF抗体抑制血管生成的用途。针对U2-42、U2-39或U2-45抗HB-EGF抗 体制剂，将每显微镜视野的管或封闭的细胞结构的数目作图。如所显示的，当抗HB-EGF抗 体不存在时可看到大约10个HUVEC管，而当加入U2-39抗HB-EGF抗体制剂时，每显微镜视 野只观察到大约4个HUVEC管。在U2-42抗HB-EGF抗体制剂存在的情况下，只观察到大约 1个HUVEC管。当U2-45抗HB-EGF抗体制剂存在时，只观察到6个HUVEC管。图34A举例说明抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF刺激的0VCAR-8卵巢癌细胞的集落形 成。如所显示的，HB-EGF刺激0VCAR-8细胞形成比在HB-EGF不存在的情况下培养的对照 0VCAR-8细胞显著更大的平均集落大小。然而，当在HB-EGF存在的情况下将0VCAR-8细胞 与抗HB-EGFU2-39抗体一起培养时，平均集落大小减小至在无HB-EGF处理的情况下对于对 照细胞观察到的基础大小。图34B举例说明抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF刺激的BM1604前列腺癌细胞在软琼 脂中的集落形成。如所显示的，HB-EGF刺激BM1604细胞形成比在HB-EGF不存在的情况下培养的对照BM1604细胞更大数目的集落/孔。然而，当在HB-EGF存在的情况下将BM1604 细胞与抗HB-EGF U2-39抗体一起培养时，平均集落大小减小至与在无HB-EGF处理的情况 下对于对照细胞所观察到的大小相似的大小。抗HB-EGFU2-45和U2-42抗体部分地抑制集 落形成，然而在该测定中，U2-39抗HB-EGF抗体完全抑制集落形成。图34C举例说明抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF刺激的NCI-H226肺癌细胞的集落形 成。如所显示的，HB-EGF刺激NCI-H226细胞形成比在HB-EGF不存在的情况下培养的对照 NCI-H226细胞显著更大的平均集落大小。然而，当在HB-EGF存在的情况下将NCI-H226细 胞与抗HB-EGF U2-39抗体一起培养时，平均集落大小减小至在无HB-EGF处理的情况下对 于对照细胞所观察到的基础大小。图34D举例说明抗HB-EGF抗体抑制Sk0V-3HB-EGF克隆71细胞(来源于用HB-EGF 表达载体转染以引起HB-EGF的组成型过表达的SkOV-3卵巢癌细胞)的基础集落形成。 如所显示的，对照Sk0V-3HB-EGF克隆71细胞形成大量的集落。然而，当将Sk0V_3HB_EGF cl. 71细胞与抗HB-EGF U2-42或U2-39抗体一起培养时，集落的数目急剧减少。图34E举例说明抗HB-EGF抗体抑制Sk0V-3HB-EGF克隆74细胞(来源于用HB-EGF 表达载体转染以引起HB-EGF的组成型过表达的SkOV-3卵巢癌细胞)的基础集落形成。如 所显示的，对照Sk0V-3HB-EGF克隆74细胞形成大量的集落。然而，当将Sk0V_3HB_EGF克 隆74细胞与抗HB-EGF U2-39抗体一起培养时，集落的数目急剧减少。图34F举例说明抗HB-EGF抗体抑制培养在软琼脂中的BxPC3胰腺腺癌细胞的基 础集落形成。如所显示的，对照BxPC3细胞形成大量的集落。然而，当在HB-EGF存在的情 况下将BxPC 3细胞与抗HB-EGF U2-42或U2-39抗体一起培养时，集落的数目急剧减少。图35举例说明抗HB-EGF抗体抑制培养在软琼脂中的过表达HB-EGF的 EF0-27HB-EGF克隆58卵巢癌细胞的基础集落形成。如所显示的，对照细胞形成大量集落。 然而，当将EF0-27HB-EGF cl. 58细胞与抗HB-EGF U2_42、U2_39或U2-45抗体一起培养时， 集落的数目急剧减少。此外，抗HB-EGF抗体与抗EGFR抗体爱必妥(Erbitux)的联合治疗 完全抑制集落形成。图36显示抗HB-EGF抗体抑制HB-EGF诱导的体内管生成。抗体U2-42、U2-39和 U2-45可以以剂量依赖性的方式阻断小鼠基质胶塞测定(matrigel plug assay)中的血管 个生(Angiogenicnetwork formation)。图37举例说明抗体U2-42和U 2-39在小鼠异种移植物模型中对已建立的BxPC3 肿瘤的生长的抑制。图38A-38C举例说明抗体U2-42、U2-39和U2-45在小鼠异种移植物模型中对已 建立的EF0-27 HB-EGF克隆58肿瘤的生长的抑制(图38A)。如图38B中所示，显示抗体 U2-42和U2-39对异种移植物肿瘤生长的抑制的功效是剂量依赖性的。此外，与抗EGFR抗 体爱必妥的联合治疗导致肿瘤生长的完全消失，从而显示抗HB-EGF抗体作为联合疗法的 试剂的有效协同活性(图38C)。图39A-39B举例说明人抗HB-EGF抗体用于通过免疫组织化学(图39A)和通过 ELISA(图39B)检测人组织中的HB-EGF的用途。图40A举例说明显示HB-EGF诱导的CLS354上皮鳞癌细胞(口)的迁移的抑制的 ^lJJtIlJ^ (scratch assay)。
图40B举例说明显示HB-EGF诱导的Detroit 562上皮癌细胞(咽)的迁移的抑
(transmigration assay)。图41举例说明显示VEGF刺激的内皮细胞出芽(sprouting)的抑制的基于球状体 的(spheroid-based)细胞血管生成测定。图42举例说明显示体内肿瘤的CD31染色的抑制的人肿瘤异种移植物样品的免疫 组织化学(IHC)分析。图43举例说明显示U2-39与顺钼和阿瓦斯丁的联合治疗的体内卵巢肿瘤异种移 植物模型。发明详述本文中使用的章节标题仅用于组织目的而不被解释为限定所述的主题内容。除非在本文中另外定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语将具有本领域技 术人员通常理解的意义。此外，除非根据上下文需要，否则单数术语包括复数并且复数术语 包括单数。通常，本文中描述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传 学和蛋白质与核酸化学及杂交使用的命名法以及细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、 微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学及杂交的技术是本领域内熟知和常用的。除非另 外指出，否则本申请的方法和技术通常按照本领域内熟知的和在整个本说明书中引用和 论述的各种一般和更专业的参考文献中描述的常规方法来进行。参见，例如，Sambrook 等 人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 第 3 版·，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)禾口 Ausubel 等人，Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates(1992),以及 Harlow 禾口 Lane Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)，其通过引用合并入本文。如本领域中通常实现的或如本文中所描述 的，按照厂商说明书进行酶促反应和纯化技术。本文中描述的结合分析化学、合成有机化学 和医学与药物化学使用的术语以及分析化学、合成有机化学和医学与药物化学的实验室方 法和技术是本领域内熟知和常用的。可使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、 配制和递送以及患者的处理。应当理解本发明不限于本文中描述的特定方法、方案和试剂等，因为其可发生变 化。本文中使用的术语只用于描述特定实施方案的目的，并且无意限定只由权利要求界定 的公开的范围。与在操作实施例中不同，或除非另外指出，否则本文中使用的表示成分或反应条 件的数量的所有数值在所有情况下应当理解为由术语“大约”进行修饰。术语“大约”，当与 百分比结合使用时，可以表示士 1%。A. 一般概述本文中提供了结合HB-EGF，特别是人HB-EGF(hHB-EGF)蛋白的抗原结合蛋白。提 供的抗原结合蛋白是如本文所述的一个或多个互补决定区(CDR)被包埋和/或连接入其中 的多肽。在一些抗原结合蛋白中，⑶R被包埋入“构架”区中，所述构架区确定⑶R的方位以 使获得正确的CDR的抗原结合性质。通常，提供的抗原结合蛋白可干扰、阻断、减少或调节 HB-EGF与其相关受体(包括EGF-R和HER4)之间的相互作用。
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本文中描述的某些抗原结合蛋白是抗体或来源于抗体。在某些实施方案中，抗 原结合蛋白的多肽结构基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微小抗体 (minibody)、结构域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化 抗体、人抗体、抗体融合物(在本文中有时称为“抗体缀合物”)和分别地其片段。在下文中 进一步描述各种结构。已显示本文中提供的抗原结合蛋白结合HB-EGF特别地人HB-EGF的几个表位。如 实施例中所显示的，HB-EGF结合其相关受体的能力减小或被抑制。因此，本文中提供的抗 原结合蛋白能够抑制HB-EGF的活性。特别地，结合此类表位的抗原结合蛋白可具有一个或 多个下列活性抑制，特别地，EGF-R和HER4的自磷酸化、EGF-R和HER4信号转导途径的诱 导、EGF-R和HER4诱导的细胞生长以及在HB-EGF结合后由EGF-R和HER4诱导的其他生理 效应。本文中公开的抗原结合蛋白具有多种用途。一些抗原结合蛋白例如可用于HB-EGF 特别地hHB-EGF的特异性结合测定、亲和纯化和可用于筛选测定以鉴定这样的受体。此外， 公开的抗原结合蛋白还可用于疾病例如增殖性病症的诊断和/或治疗。此类疾病包括但不 限于各种类型的癌症。B.肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)HB-EGF由各种肿瘤细胞产生，并且用作自分泌肿瘤生长因子。Davis-Fleischer ^A, 1998, Front Biosci. 3 288-299 ；Iwamoto&Mekada, 2000, Cytokine Growth Factor Rev. 11 :335-344。HB-EGF对于可增加HB-EGF的生物学活性的肝素具有强亲和力。HB-EGF 产生为跨膜蛋白，其被金属蛋白酶蛋白水解切割，产生生长因子的成熟可溶形式。HB-EGF最早以可溶、分泌的形式在培养的人巨噬细胞的上清液中得到鉴定。在人 细胞上，前体proHB-EGF用作白喉毒素受体。不同细胞类型，包括上皮细胞、角质形成细胞、 单核细胞、系膜细胞(mesangialcell)、淋巴样细胞和骨骼肌细胞产生HB-EGF。其为上皮细 胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和各种人癌细胞的有效丝裂原和趋化因子。HB-EGF的跨膜形式由许多细胞类型合成为208个氨基酸的跨膜前体 (tm-HB-EGF)，其含有EGF结构域、发夹结合结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。细胞外 结构域可通过金属蛋白酶的作用作为12至22-kDa的HB-EGF的可溶性形式(sol-HB-EGF) 释放，这受不同的G蛋白偶联受体(GPCR)或肿瘤促进剂例如十四酰佛波乙酸酯(TPA)的调 控。通常，显著量的跨膜HB-EGF前体在细胞表面上保持未切割状态。tm-HB-EGF和sol-HB-EGF都具有生物学活性。sol-和tm-HB-EGF的生物学功能 都由EGF受体(EGFR;HER1)和ErbB4(HER4)介导。这些受体的这些类型的激活据信作为配 体诱导的受体同二聚化或异二聚化的结果而发生。活化后，EGF受体显示增加细胞生长、增 加细胞运动性、抑制细胞凋亡和增加细胞转化。在刺激G蛋白偶联受体(GPCR)后，可反式激活EGFR依赖性信号转导途径。通过 与GPCR相互作用产生的异三聚体G蛋白的配体激活导致诱导跨膜金属蛋白酶的细胞外活 性的细胞内信号。激活GPCR途径的配体包括LPA(溶血磷脂酸)、凝血酶、卡巴胆碱、铃蟾 肽(bombesin)和内皮素。此类激活导致跨膜生长因子前体的细胞外加工和成熟因子的释 放，所述成熟因子直接或通过蛋白聚糖基质与EGFR的胞外结构域相互作用，并且通过酪 氨酸磷酸化激活它。参见，Prenzel等人，1999，Nature 402 :884_888。因此，HB-EGF是GPCR借以激活膜结合金属蛋白酶的三重膜传递信号(TMPS)机制的成分，所述金属蛋白酶 切割proHB-EGF，从而释放可溶性生长因子，该可溶性生长因子随后激活EGF受体。EGFR 的反式激活与不同疾病状态例如心肌肥厚(综述于ShahBH，Catt KJ. Trends Pharmacol Sci. 2003May ；24 (5) :239_244 中)、血管重塑(综述于 Eguchi 等人，2003，Biochem Soc Trans. 2003Dec ；31 (Pt 6) 1198-202 中)和癌症(综述于 Fischer 等人，2003 中，同上)相 关。HB-EGF蛋白的序列和编码此类蛋白的核酸的序列对于本领域技术人员来说是 可获得的。例如，这样的HB-EGF序列可见于由NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI)提供的数据库(参见，http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)。HB-EGF 序列 的一个实例是NCBI登录号NM 001945和NP_001936(gi =4503413)下的氨基酸序列。下文 中提供该序列以方便参考(SEQ ID N0 1072)MKLLPSVVLKLFLAAVLSALVTGESLERLRRGLAAGTSNPDPPTVSTDQLLPLGGGRDRKVRDLQEAD LDLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCH GLSLPVEN RLYTYDHTTILAVVAVVLSSVCLLVIVGLLMFRYHRRG GYDVENEEKVKLGMTNSH。注意，上文中所示的HB-EGF序列(SEQ ID NO :1072)具有19个氨基酸的信号肽 (MKLLPSVVLK LFLAAVLSA, SEQ ID NO 1073)。可溶性细胞外结构域由上述HB-EGF序列的氨基酸1_149组成。HB-EGF可溶性细 胞外结构域的该序列在下文中提供为SEQ ID N0 1074MKLLPSVVLKLFLAAVLSALVTGESLERLRRGLAAGTSNPDPPTVSTDQLLPLGGGRDRKVRDLQEADL DLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRD PCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHG LSLP。在切割后，产生由氨基酸63-149 (87个氨基酸)组成的成熟HB-EGF。成熟HB-EGF 的该序列在下文中提供为SEQ ID NO 1075 DLQEADLDLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPS CICHPGYHGERCHGLSLF。HB-EGF与表皮生长因子受体(EGFR)相互作用并且激活其。EGFR是由细胞外配体 结合结构域、跨膜区和具有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域组成的170kDa跨膜糖蛋白。生 长因子与EGFR的结合导致配体-受体复合物的内化，受体和其他蛋白质底物的自磷酸化， 从而最终导致DNA合成和细胞分裂。外部配体结合结构域不仅受HB-EGF刺激，而且还受 EGF, TGF α和双调蛋白(AR)刺激。EGFR的过表达通常伴随EGF样生长因子的共表达，这表明控制生长的自分泌途径 在肿瘤的进展中可能起主要作用。现在普遍认为这是肿瘤借以逃脱正常生理控制的机制。C. HB-EGF受体抗原结合蛋白提供了许多用于调控HB-EGF的活性的选择性结合试剂。此类试剂包括，例 如，包含抗原结合结构域的抗原结合蛋白(例如，单链抗体、结构域抗体、免疫粘附素 (inmmunoadhesion)和具有抗原结合区的多肽)并且特异性结合HB-EGF多肽，特别地人 HB-EGF。一些试剂例如可用于抑制HB-EGF与其受体的结合，从而可用于抑制、干扰或调节 与HB-EGF介导的信号转导相关的一个或多个活性。—般地，提供的抗原结合蛋白通常包含1个或多个本文中描述的⑶R(例如，1，2，3，4，5或6个)。在一些情况下，抗原结合蛋白包含(a)多肽结构和(b) —个或多个插入和 /或连接至多肽结构的⑶R。多肽结构可采用许多不同的形式。例如，其可以是，或包含天 然发生的抗体的构架或其片段或变体，或可以是完全天然合成的。不同多肽结构的实例在 下文中进一步描述。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构是抗体或来源于抗体，包括但不限 于单克隆抗体、双特异性抗体、微小抗体、结构域抗体、合成的抗体(在本文中有时称为“抗 体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)和其各自的部 分或片段。在一些情况下，抗原结合蛋白是抗体的免疫学片段(例如，Fab、Fab'、F(ab' )2 或scFv)。在本文中进一步描述和定义各种结构。本文中提供的某些抗原结合蛋白特异性结合人HB-EGF。在特定的实施方案中，抗 原结合蛋白特异性结合具有SEQ ID NO: 1072的氨基酸序列的人HB-EGF蛋白。在其中抗原结合蛋白用于治疗应用的实施方案中，抗原结合蛋白可抑制、干扰或 调节HB-EGF的一个或多个生物学活性。在该情况下，当过量的抗体使与其受体结合的人 HB-EGF的量减少(或反之亦然)至少大约20%、40%、60%、80%、85%或更多(例如通过 在体外竞争结合测定中测量结合)时，抗原结合蛋白特异性结合和/或显著抑制人HB-EGF 与其受体的结合。HB-EGF具有许多不同的生物学效应，其可在许多不同的测定中在不同的 细胞类型中进行测量；本文中提供了此类测定的实例。1.天然发生的抗体结构提供的一些抗原结合蛋白具有通常与天然发生的抗体相关的结构。这些抗体的 结构单位通常包含一个或多个各自由两个相同的多肽链偶联体组成的四聚体，虽然一些哺 乳动物物种也产生只具有单个重链的抗体。在经典的抗体中，各个对或偶联体包含一个全 长“轻”链(在某些实施方案中，大约25kDa)和一个全长“重”链(在某些实施方案中，大 约50-70kDa)。各个单独的免疫球蛋白链由几个“免疫球蛋白结构域”组成，其各自由大约 90至110个氨基酸组成并且表达特征折叠模式。这些结构域是组成抗体多肽的基本单位。 各链的氨基末端部分通常包括负责抗原识别的可变结构域。羧基末端部分在进化上比链的 另一个末端更保守并且称为“恒定区”或“C区”。人轻链通常分类为K和λ轻链，并且这 些链的每一个包含一个可变结构域和一个恒定结构域。重链通常分类为μ、δ、Υ、α或 ε链，这些链分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几种亚型，包 括但不限于IgGU IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgMl和IgM2。IgA亚型包括IgAl和 IgA2。在人中，IgA和IgD同种型包含4条重链和4条轻链；IgG和IgE同种型包含2条重 链和2条轻链；IgM同种型包含5条重链和5条轻链。重链C区通常包含一个或多个可负 责效应子功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。例如IgG重链包含称 *CH1、CH2*CH3的3个C区结构域。提供的抗体可具有任何这些同种型和亚型。在某些 实施方案中，HB-EGF抗体是IgGl、IgG2或IgG4亚型的抗体。在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“ J”区连 接，重链还包含大约10或更多个氨基酸的“D”区。参见，例如，Fundamental Immunology, 第2版，Ch. 7 (Paul，W.，ed.) 1989，New York Raven Press (以其全文通过引用合并入本文， 用于所有目的)。各轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合部位。示例性HB-EGF单克隆抗体的κ轻链恒定结构域的一个实例具有氨基酸序列
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RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 187)。示例性HB-EGF单克隆抗体的IgG2重链恒定结构域的一个实例具有氨基酸序列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPI EKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 188)。免疫球蛋白链的可变区通常展示相同的总体结构，包含通过3个高变区(更通 常地称为“互补决定区”或CDR)连接的相对保守的构架区(FR)。来自各个上述重链/轻 链对的两条链的CDR通常通过构架区联配(align)，从而形成特异性结合靶蛋白(例如， HB-EGF)上的特定表位的结构。从N末端至C末端，天然发生的轻链和重链可变区都通常遵 从此类元件的下列顺序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已设计编号系统用于给占 据每一个此类结构域中的位点的氨基酸赋予编号。在Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(1987 禾口 1991，NIH Bethesda, MD)或 Chothia&Lesk，1987，J. Mol. Biol. 196 901-917 ；Chothia 等人，1989，Nature 342 :878_883 中定义了该编号系统。本文中提供的各种轻链和重链可变区分别描述于图1A-1P和图2A-20。可分别将 这些可变区中的每一个连接至上述重链和轻链恒定区以形成完整的抗体重链和轻链。此 外，可将每一个如此产生的重链和轻链序列组合以形成完整的抗体结构。提供的一些抗体的全长轻链和重链的特定实例和它们相应的氨基酸序列分别概 述于图3A-3K和图4A-40中。再次地，可将图3A-3K中所列的每一个示例性轻链(UL-1, Ul_2，Ul_3等)与图 4A-40中显示的任一示例性重链组合以形成抗体。此类组合的实例包括Uf 1与 -1至 -58 的任一个组合;Ul-2与Uh-I至Uh-58的任一个组合；或队-3与Uh-I至UH_58的任一个组合 等。在一些情况下，抗体包括分别来自图3A-3K和图4A-40的至少一条轻链和一条重链。在 其他情况下，抗体包含两条相同的轻链和两条相同的重链。例如，抗体或免疫功能片段可包 含两条Ul-I轻链和两条Uh-I重链，或两Ul-2轻链和两条Uh-2重链，或两条UL_3轻链和两 条Uh-3重链以及分别如图3A-3K和图4A-40中所列的成对轻链与成对重链的其他相似组
口 O提供的其他抗体是通过组合分别在图3A-3K和图4A-40中显示的重链和轻链形成 的抗体的变体，其包括各自与这些链的氨基酸序列具有至少70 %，75 %，80 %，85 %，90 %， 95%,97%或99%的同一性的轻链和/或重链。在一些情况下，此类抗体包含至少一条轻链 和一条重链，然而在其他情况下，变体形式包含两条相同的轻链和两条相同的重链。2.抗体的可变结构域还提供了包含抗体轻链可变区和/或抗体重链可变区以及此类轻链和重链可变 区的免疫功能性片段、衍生物、突变蛋白和变体的抗原结合蛋白，所述轻链可变区选自 U-VlI、U-VL2、U-VL3、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U_VL7、U-VL8、U-VL9、U-Vl 10、U-VlI 1、U-Vl 12、U-VlI 3、 U-Vl14、U-VlI5, U-Vl16、U-VlI7, U_VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、U_VL23、U_VL24、 U-Vl25、U-Vl26、U-Vl27、U_Vl28、U_Vl29、U_Vl30、U_Vl31、U_Vl32、U_Vl33、U_Vl34、U_Vl35、U-VL36、U-VL37、U-VL38、U_VL39、U_VL40、U_VL41、U_VL42、U_VL43、U_VL44、U_VL45、U_VL46、 U-Vl47、U-Vl48、U-Vl49、U_Vl50、U_Vl51、U_Vl52、U_Vl54、U_Vl55、U_Vl56、U_Vl57、U_Vl58、 U-Vl59 ,U-Vl60 ,U-Vl6 1,U-VL62,U-VL64 和 U_VL65，所述重链可变区选自U-VH1、U-VH2、U_VH3、 U-VH4、U-VH5、U-VH6、U-VH7、U_VH8、U_VH9、U-VHIO, U-VHI 1、U-VHI2, U-VHI3, U_VH14、U-VHI5, U-VH16、U-VHI7, U-VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、U_VH24、U_VH25、U_VH26、 U-Vh27、U-Vh28、U-Vh29、U_Vh30、U_Vh31、U_Vh32、U_Vh33、U_Vh34、U_Vh35、U_Vh36、U_Vh37、 U-Vh38、U-Vh39、U-Vh40、U_Vh41、U_Vh42、U_Vh43、U_Vh44、U_Vh45、U-VH46、U_VH47、U_VH48、 U-VH49、U-VH50、U-VH51、U-VH52、U_VH53、U_VH54、U_VH55、U-VH 56、U_VH57 和 U_VH58，分别如 图1A-1P和图2A-20中所示。不同轻链和重链可变区的序列比对分别提供于图IOA和IOB以及图IlA和IlB中。该类型的抗原结合蛋白通常可以用式“VHx/\y”来标示，其中“X”相应于重链可变 区的数目，“y”相应于轻链可变区的数目(通常，χ和y各自为1或2)。可将图1A-1P中所列的每一个轻链可变区与图2A-20中所列的任一个重链可变区 组合以形成抗原结合蛋白。此类组合的实例包括U-VlI与U-VHI、U-VH2、U_VH3、U_VH4、U_VH5、 U-VH6、U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VHIO, U-VHI 1、U_VH12、U-VHI3, U_VH14、U_VH15、U_VH16、U-VHI7, U-Vh18、U-Vh19、U-Vh20、U_Vh21、U_Vh22、U_Vh23、U_Vh24、U_Vh25、U_Vh26、U_Vh27、U_Vh28、 U-Vh29、U-Vh30、U-Vh31、U_Vh32、U_Vh33、U_Vh34、U_Vh35、U_Vh36、U_Vh37、U_Vh38、U_Vh39、 U-VH40、U-VH41、U-VH42、U_VH43、U_VH44、U_VH45、U_VH46、U_VH47、U_VH48、U_VH49、U_VH50、 U-Vh51、U-Vh52、U-Vh53、U-Vh54、U-Vh55、U-Vh56、U-Vh57 或 U-Vh58 中的任一个组合或 U_Vl2 与 U-VHI、U-VH2、U-VH3、U_VH4、U_VH5、U_VH6、U_VH7、U_VH8、U_VH9、U-VH 10、U-VHI 1、U-VH 12、U-VHI 3、 U-VH14、U-VHI5, U-VH16、U-VHI7、U_VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、U_VH24、 U-Vh25、U-Vh26、U-Vh27、U_Vh28、U_Vh29、U_Vh30、U_Vh31、U_Vh32、U_Vh33、U_Vh34、U_Vh35、 U-VH36、U-VH37、U-VH38、U_VH39、U_VH40、U_VH41、U_VH42、U_VH43、U_VH44、U_VH45、U_VH46、 U-Vh47、U-Vh48、U-Vh49、U_Vh50、U_Vh51、U_Vh52、U_Vh53、U_Vh54、U_Vh55、U_Vh56、U_Vh57 或 U-Vh58中的任一个组合等。在一些情况下，抗原结合蛋白包括分别来自图1A-1P和图2A-20中所列的那些的 至少一个重链可变区和/或一个轻链可变区。在一些情况下，抗原结合蛋白包含分别来自 图1A-1P和图2A-20中所列的那些的至少两个不同的重链可变区和/或轻链可变区。这样 的抗原结合蛋白的实例包含(a) —个U-VJ和(b)U-VJ、U-VJ、U-VJ、U-Vj、U-八6、U-VJ、 U-Vl8,U-Vl9,U-VlIO,U-Vl1UU-Vl12,U-Vl13,U-Vl14,U-Vl15,U-Vl16,U-Vl17,U-Vl18,U-Vl19, U-VL20、U-VL21、U-VL22、U_VL23、U_VL24、U_VL25、U_VL26、U_VL27、U_VL28、U_VL29、U_VL30、 U-VL31、U-VL32、U-VL33、U_VL34、U_VL35、U_VL36、U_VL37、U_VL38、U_VL39、U_VL40、U_VL41、 U-VL42、U-VL43、U-VL44、U_VL45、U_VL46、U_VL47、U_VL48、U_VL49、U_VL50、U_VL51、U_VL52、 U-Vl54、U-Vl55、U-Vl56、U-Vl57、U-Vl58、U-Vl59、U-Vl60、U-Vl61、U-Vl62、U-Vl64 和 U_VL65 中 的一个。再次地，这样的抗原结合蛋白的另一个实例包含(a) —个U-VJ和(b)U-\l、U-\3、 U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U_VL8、U_VL9、U-VlIO, U-VLI 1、U-VlI2, U-VlI3, U_VL14、U-VLI5, U-VL16、U-VLI7, U-VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、U_VL23、U_VL24、U_VL25、U_VL26、 U-VL27、U-VL28、U-VL29、U_VL30、U_VL31、U_VL32、U_VL33、U_VL34、U_VL35、U_VL36、U_VL37、 U-Vl38、U-Vl39、U-Vl40、U_Vl41、U_Vl42、U_Vl43、U_Vl44、U_Vl45、U_Vl46、U_Vl47、U_Vl48、U-Vl49、U-Vl50、U-Vl51、U_Vl52、U_Vl54、U_Vl55、U_Vl56、U_Vl57、U_Vl58、U_Vl59、U_Vl60、 U-\61、U-\62、U-\64和U-&65中的一个。再次地，这样的抗原结合蛋白的另一个实例包含 (a) 一个 U-Vl3 和(b)U-VLl、U-VL2、U-VL4、U-VL5、U-VL6、U-VL7、U-VL8、U-VL9、U-VL10、U-VLll、 U-VLI2, U-VlI3, U_VL14、U-VlI5, U_VL16、U-VlI7, U_VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、 U-VL23、U-VL24、U-VL25、U_VL26、U_VL27、U_VL28、U_VL29、U_VL30、U_VL31、U_VL32、U_VL33、 U-VL34、U-VL35、U-VL36、U_VL37、U_VL38、U_VL39、U_VL40、U_VL41、U-V42、U_VL43、U_VL44、 U-VL45、U-VL46、U-VL47、U_VL48、U_VL49、U_VL50、U_VL51、U_VL52、U_VL54、U_VL55、U_VL56、 U-VL57, U-VL58, U-VL59, U_VL60、U_VL61、U_VL62、U-VL64 和 U_VL65 中的一个等。再次地，这样的抗原结合蛋白的另一个实例包含(a) —个U-VhI和(b)U_VH2、 U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U_VH7、U_VH8、U_VH9、U-VHIO, U-VHI 1、U-VHI2, U-VHI3, U_VH14、 U-VhI5, U-Vh16、U-VhI7, U_VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、U_VH24、U_VH25、 U-VH26、U-VH27、U-VH28、U_VH29、U_VH30、U_VH31、U_VH32、U_VH33、U_VH34、U_VH35、U_VH36、 U-VH37、U-VH38、U-VH39、U_VH40、U_VH41、U_VH42、U_VH43、U_VH44、U_VH45、U_VH46、U_VH47、 U-VH48、U-VH49、U-VH50、U-VH51、U_VH52、U_VH53、U_VH54、U_VH55、U_VH56、U_VH57 和 U_VH58 中 的一个。另一个实例包含(a) —个 U-Vh2 和(b)U-VHl、U-Vh3、U_Vh4、U_Vh5、U_Vh6、U_Vh7、 U-Vh8、U-Vh9、U-Vh10、U-Vh11、U-Vh12、U-Vh13、U-Vh14、U-Vh15、U-Vh16、U-Vh17、U-Vh18、U-Vh19、 U-VH20、U-VH21、U-VH22、U_VH23、U_VH24、U_VH25、U_VH26、U_VH27、U_VH28、U_VH29、U_VH30、 U-VH31、U-VH32、U-VH33、U_VH34、U_VH35、U_VH36、U_VH37、U_VH38、U_VH39、U_VH40、U_VH41、 U-Vh42、U-Vh43、U-Vh44、U_Vh45、U_Vh46、U_Vh47、U_Vh48、U_Vh49、U_Vh50、U_Vh51、U_Vh52、 U-Vh53、U-Vh54、U-Vh55、U-Vh56、U-Vh57 和 U-Vh58 中的一个。再次地，另一个实例包含(a) — 个 U-Vh3 和(b) U-VhI、U-Vh2、U-Vh4、U-Vh5、U-Vh6、U-Vh7、U-Vh8、U-Vh9、U-Vh10、U-Vh1 1、U-Vh12、 U-VHI3, U-VH14、U-VHI5, U_VH16、U-VHI7, U_VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、 U-VH24、U-VH25、U-VH26、U_VH27、U_VH28、U_VH29、U_VH30、U_VH31、U_VH32、U_VH33、U_VH34、 U-Vh35、U-Vh36、U-Vh37、U_Vh38、U_Vh39、U_Vh40、U_Vh41、U_Vh42、U_Vh43、U_Vh44、U_Vh45、 U-VH46、U-VH47、U-VH48、U_VH49、U_VH50、U_VH51、U_VH52、U_VH53、U_VH54、U_VH55、U_VH56、 U-VH57和U-VH58中的一个等。可将重链可变区的不同组合与轻链可变区的任何不同组合相组合。在其他情况下，抗原结合蛋白包含两个相同的轻链可变区和/或两个相同的重链 可变区。例如，抗原结合蛋白可以是抗体或免疫功能片段，其包括成对轻链可变区和成对重 链可变区(分别如图1A-1P和图2A-20中所列)的组合中的两个轻链可变区和两个重链可 变区。提供的一些抗原结合蛋白包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自 U-VLI、U-VL2、U-VL3、U_VL4、U_VL5、U_VL6、U_VL7、U_VL8、U_VL9、U-VL 10、U-VLI 1、U-VL 12、U-VLI 3、 U-VL14、U-VLI5, U-VL16、U-VLI7, U_VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、U_VL23、U_VL24、 U-V L25、U-VL26、U-VL27、U_VL28、U_VL29、U_VL30、U_VL31、U_VL32、U_VL33、U_VL34、U_VL35、 U-Vl36、U-Vl37、U-Vl38、U_Vl39、U_Vl40、U_Vl41、U_Vl42、U_Vl43、U_Vl44、U_Vl45、U_Vl46、 U-VL47、U-VL48、U-VL49、U_VL50、U_VL51、U_VL52、U_VL54、U_VL55、U_VL56、U_VL57、U_VL58、 U-Vl59, U-八60、U-VL6U U-八62、U-八64或U-八65的轻链可变结构域的序列相异只在于1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基的氨基酸序列，其中每一个这样的序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、插入或置换。一些抗原结合蛋白中的轻链可变区包 含与 U-VLI、U-VL2、U-VL3、U_VL4、U_VL5、U_VL6、U_VL7、U_VL8、U_VL9、U-VLIO, U-VLI 1、U_VL12、 U-VLI3, U-VL14、U-VLI5, U_VL16、U-VLI7, U_VL18、U_VL19、U_VL20、U_VL21、U_VL22、U_VL23、 U-VL24、U-VL25、U-VL26、U_VL27、U_VL28、U_VL29、U_VL30、U_VL31、U_VL32、U_VL33、U_VL34、 U-Vl35、U-Vl36、U-Vl37、U_Vl38、U_Vl39、U_Vl40、U_Vl41、U_Vl42、U_Vl43、U_Vl44、U_Vl45、 U-Vl46、U-Vl47、U-Vl48、U_Vl49、U_Vl50、U_Vl51、U_Vl52、U_Vl54、U_Vl55、U_Vl56、U_Vl57、 U-VL58, U-八59、U-VL60, U-八61、U-八62、U-VL64或U_\65的轻链可变区的氨基酸序列具有 至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性的氨基酸序列。某些抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自U-VHI、U_VH2、 U-VH3、U-VH4、U-VH5、U-VH6、U_VH7、U_VH8、U_VH9、U-VHIO, U-VHI 1、U-VHI2, U-VHI3, U_VH14、 U-VhI5, U-Vh1 6、U-VhI7, U_VH18、U_VH19、U_VH20、U_VH21、U_VH22、U_VH23、U_VH24、U_VH25、 U-VH26、U-VH27、U-VH28、U_VH29、U_VH30、U_VH31、U_VH32、U_VH33、U_VH34、U_VH35、U_VH36、 U-Vh37、U-Vh38、U-Vh39、U_Vh40、U_Vh41、U_Vh42、U_Vh43、U_Vh44、U_Vh45、U_Vh46、U_Vh47、 U-Vh48、U-Vh49、U-Vh50、U_Vh51、U_Vh52、U_Vh53、U_Vh54、U_Vh55、U_Vh56、U_Vh57 或 U_VH58 的重链可变结构域的序列相异只在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基 酸残基的氨基酸序列，其中每一个这样的序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、插入或 置换。一些抗原结合蛋白的重链可变区包含与U-VH1、U-Vh2、U-Vh3、U-Vh4、U_Vh5、U_Vh6、 U-VH7、U-VH8、U-VH9、U-VHIO、U-VHI 1、U_VH12、U_VH13、U_VH14、U_VH15、U_VH16、U_VH17、U_VH18、 U-Vh19、U-Vh20、U-Vh21、U_Vh22、U_Vh23、U_Vh24、U_Vh25、U_Vh26、U_Vh27、U_Vh28、U_Vh29、 U-VH30、U-VH31、U-VH32、U_VH33、U_VH34、U_VH35、U_VH36、U_VH37、U_VH38、U_VH39、U_VH40、 U-Vh41、U-Vh42、U-Vh43、U_Vh44、U_Vh45、U_Vh46、U_Vh47、U_Vh48、U_Vh49、U_Vh50、U_Vh51、 U-VH52、U-VH53、U-VH54、U_VH55、U_VH56、U_VH57 或 U_VH58 的重链可变区的氨基酸序列具有 至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性的氨基酸序列。其他抗原结合蛋白例如抗体或免疫功能片段包括如刚才所描述的变异轻链和变 异重链的变异形式。3. CDR本文中公开的抗原结合蛋白是其中移植、插入和/或连接了一个或多个CDR的多 肽。抗原结合蛋白可具有1、2、3、4、5或6个⑶R。因此抗原结合蛋白可具有例如一个轻链 CDRl (“CDRL1，，)和 / 或一个轻链 CDR2 (“CDRL2，，)和 / 或一个轻链 CDR3 (“CDRL3，，)和 / 或一 个重链 CDRl (“CDRH1”)和 / 或一个重链 CDR2 (“CDRH2”)和 / 或一个重链 CDR3 (“CDRH3”)。 一些抗原结合蛋白包含⑶RL3和⑶RH3。图6A-6F和图7A-7E中鉴定了特定的⑶R。可使用由 Kabat 等人在 Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,第 5 片反，US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991中描述的系统鉴定给定的抗体的互补决定区(CDR)和构架区(FR)(图8A-8H和图 9A-9F中分别给出了轻链和重链FR氨基酸序列的实例)。本文中公开的某些抗体包含一个 或多个与图6A-6F(⑶RL)和图7A-7E (⑶RH)中所示的一个或多个⑶R的氨基酸序列同一或 与其具有充分序列同一性的氨基酸序列。已描述了天然发生的抗体中的⑶R的结构和性质，同上。简而言之，在一般的抗体 中，CDR被包埋在重链和轻链可变区的构架区中，在其中它们构成了负责抗原结合和识别的区域。可变区在构架区(被Kabat等人，1991 (同上)称为构架区1_4，FR1、FR2、FR3和FR4 ； 也参见Chothia和Lesk，1987，同上)内包含至少3个重链或轻链CDR，参见，同上(Kabat 等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,Public Health Service N. I. H.，Bethesda, MD ；也参见 Chothia 和 Lesk, 1987，J. Mol. Biol. 196 :901_917 ；Chothia 等人，1989, Nature 342 :877_883)。然而，本文中提供的CDR不仅可用于界定常规抗体结构 的抗原结合结构域，而且还可包埋在许多其他多肽结构中，如本文中所描述的。
在一个方面中，提供的CDR是(a)选自下列的CDRL :(i)选自SEQ IDNO 189-217的 CDRLl ； (ii)选自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :234_274 的 CDRL3 ； 和(iv)包含一个或多个不超过5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、 (ii)禾口 (iii)的 CDRL ； (B)选自下列的 CDRH ⑴选自 SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ； (ii) 选自 SEQ ID NO 300-331 的 CDRH2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ；禾口 (iv)包含 一个或多个不超过5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii) 的 CDRLH。在另一个方面，提供了与图6A-6F和图7A-7E中所列的⑶R序列具有至少80%、 85 %、90 %或95 %的序列同一性的⑶R的变异形式。在另一个方面，本文中公开的⑶R包含来源于相关单克隆抗体的组的共有序列。 如本文中所描述的，“共有序列”是指具有在许多序列之间共同的保守氨基酸和在给定的 氨基酸序列中变化的可变氨基酸的氨基酸序列。提供的CDR共有序列包括相应于CDRL1、 CDRL2、CDRL3、CDRHl、CDRH2 和 CDRH3 中的每一个的 CDR。使用标准系统发生分析法(phylogenic analysis approach)确定相应于抗 HB-EGF抗体的U-Vl和U-Vh的CDR的共有序列。在该方法中，首先将相应于U-Vl或U-Vh的 完整可变结构域的氨基酸序列转换成FASTA格式以方便处理比较比对和推断系统发生。基 于该比较，分别将各轻链和重链可变区分成系统发生相关的组，即，将轻链可变区分成6个 组，A、B、C、D、E和F(参见，图12A和12B)，将重链可变区分成7个组，A、B、C、D、E、F和G(参 见，图12C)。然后，在这些组的每一个组中，将CDRLl、CDRL2、CDRL3、CDRHl、CDRH2、CDRH3区 域的每一个的比较用于确定共有集合(consensus collection)。A组轻链⑶R包括下列共有集合a.通式为 X1Ssqslx2X3SDGX4TYlX5 (seq id no 1035)的 cdrl1，其中X1 是 K 或 R，x2 是 l 或 v，X3 是 H 或 Y，X4 是 K 或 N，X5 是 N、S 或 Y。b.通式为 X1X2SNX3X4S(SEQ ID NO 1041)的 CDRL2，其中X1是E 或K，X2 是 I 或 V，X3 是 R 或 W，X4 是 D 或 F。c.通式为 X1QX2X3X4X5PX6X7 (SEQ ID NO 1046)的 CDRL3，其中
X1 是 I 或 M，X2 是 A、G 或 S，X3 是 I 或 T，X4 是 H 或 Q，X5 是 F、L 或 W，X6 是 C、I、H、L 或 T，X7 是 S 或 T。B组轻链⑶R包括下列共有集合a 通式为 RASQX11SX2YLN(SEQ ID NO 1036)的 CDRLl，其中X1 是 R、S 或 T，父2是1 或S。b.通式为 X1X2SX3LQS (SEQ ID NO: 1042)的 CDRL2，其中父！是六或T，X2 是 A、E 或 V，X3 是 S 或 T。c.通式为 QQX1X2X3X4X5IT (SEQ ID NO 1047)的 CDRL3，其中X1 是 I 或 S，X2 是 F 或 Y，X3 是 F、I、S 或 Y，X4 是 A、S 或 T。X5 是 P 或 S.C组轻链⑶R包括下列共有集合a.通式为 RAsQX1IX2X3X4LX5 (seq ID NO 1037)的 CDRL1，其中父1是0、6、3或1\父2是六、1 或S，X3 是 H、I、N、R、S 或 T，X4 是 D、W 或 Y，X5 是 A、G 或 N。b.通式为 X1AsX2LQsGEQ ID NO 1043)的CDRL2，其中X1 是 A 或 V，父2是3或丁。c.通式为 X1X2X3X4X5X6X7X8T (SEQ ID NO: 1048)的 CDRL3，其中X1 是 L 或 Q，X2 是 K、N 或 Q，X3 是 A、H、S 或 Y，X4 是 H、N 或 Y，乂5是13或1\X6 是 A，F，I，T，V 或 Y，X7是P或无氨基酸，
X8 是 F、L 或 P。
D组轻链⑶R包括下列共有集合a.通式为 QasqdiX1X2X3LMseq id no :io38)的 cdrli，其中X1 是 S 或 T，X2 是 D 或 N，X3 是 S 或 Y。b.通式为 DasxiLEI^sEQ ID no 1044)的 CDRL2，其中X1 是 I 或 N。c.通式为 QX1X2DX3LPX4X5 (SEQ ID NO: 1049)的 CDRL3，其中X1 是 H 或 Q，X2 是 C 或 Y，X3 是 D、I、N、S 或 Y，X4 是 F、I 或 L，乂5是六、3或11。E组轻链⑶R包括下列共有集合a.通式为 RasqX1VX2X3X4X5UUseq ID no :1039)的 CDRL1，其中父1是3或1\X2 是 I 或 S，X3 是 R 或 S，X4是S、N或无氨基酸，X5是Y或无氨基酸。b.通式为 GASSRAT (SEQ ID NO 223)的 CDRL2c.通式为 QQX1X2X3X4PX5X6XTiSEQ ID NO 1050)的 CDRL3，其中X1 是 H 或 Y，X2 是 G 或 N，X3是N 或 S，X4 是 S 或 W，x5是p或无氨基酸，X6 是 R 或 W，父7是3或丁。F组轻链⑶R包括下列共有集合a.通式为 KssqxiX2Lx3X4SnnKnYLX5 (SEQ ID NO :1040)的 CDRL1，其中X1是N 或 S，父2是1或乂，X3 是 D 或 Y，X4 是 N、R 或 S，父5是六或v。b.通式为 WASX1RES (SEQ ID NO 1045)的 CDRL2，其中父是八或T。
c.通式为 X1QYX2X3X4X5X6X7F(SEQ ID NO 1051)的 CDRL3，其中X1 是 H 或 Q，X2 是 F 或 Y，父3是6、1或 S，X4 是 F、I 或 T，父5是] 、卩、3或1\X6 是 F、L、R 或 W，父7是3或丁。A组重链⑶R括下列共有集合a.通式为 GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO 1052)的 CDRH1，其中X1 是 F 或 L，X2是E、G 或 S，X3 是 H、L 或 Y，X4 是 G、S 或 Y，
X5 是 I 或 M，X6 是 H 或 S。b.通式为 X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9XltlQKX11X12 (SEQ ID NO: 1058)的 CDRH2，其中X1 是 S 或 W，父2是？或I，X3 是 D、N 或 S，X4 是 A、P，X5 是 Ε、N 或 S，X6 是 D、N 或 S，X7是E、G 或 N，X8 是 I 或 N，X9 是 C、H 或 Y，父10是八或1\X11 是 F 或 L，X12 是 D 或 G。c.通式为 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11DX12 (SEQ ID NO: 1065)的 CDRH3，其中X1是E 或 S，X2是0、G或无氨基酸，X3是0、N或无氨基酸，X4是G或无氨基酸，X5是G或无氨基酸，X6是W、Y或无氨基酸，X7 是 I、N 或 Y，父8是六或Y，X9 是 G、V 或 Y，
X10 是 A、F 或 G，X11 是 F、L 或 M，X12 是 V 或 Y。
集合a.通式为 GyxiFTSyWIG(SEQ ID NO 1053)的 CDRH1，其中父丨是！ 或s。b.通式为 IIYPX1DSDX2RYSPSFQG(SEQ ID NO 1059)的 CDRH2，其中x1 是 d 或 g，父2是八、1或丁。c.通式为 QX1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13X14DX15(SEQ ID NO 1066)的 CDRH3，其中x1是g或无氨基酸，x2 是 k、l 或 y，x3 是 a、g 或 s，X4 是 S、V 或 Y，x5 是 a 或 g，x6是g或无氨基酸，x7是t或无氨基酸，x8是s或无氨基酸，X9是Y或无氨基酸，x1。是 w 或 y，X11 是 G、S 或 Y，X12 是 F 或 y，x13是g或无氨基酸，x14是m或无氨基酸，x15 是 v 或 y。c组重链⑶r包括下列共有集合a.通式为 GFTFX1SX2X3MiKSEQ ID NO 1054)的 CDRH1，其中x1 是 r 或 s，父2是!1或 y，x3 是 d 或 g。b.通式为 X1Ix2X3DgSX4X5X6YX7DSVX8G (SEQ ID NO: 1060)的 CDRH2，其中X1 是 F 或 v，x2 是 s 或 w，X3 是 D、S 或 Y，x4是i、n或t，x5 是 k 或 q，x6 是 N、r 或 y，X7 是 A、T 或 V，父8是1(或R。
c.通式为 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14 (SEQ ID NO 1067)的 CDRH3，其中父丨是〕^^或无氨基酸，X2是6、H、W、Y或无氨基酸，X3是八、F、W、Y或无氨基酸， X4是D、G、Q、T或无氨基酸，X5是G、I、Q、S或无氨基酸，X6是A、D、N、Q、S或无氨基酸，X7是6、Y或无氨基酸，X8是0、Y或无氨基酸，X9是Y或无氨基酸，X1。是 A、E、N 或 Y，X11 是 G、P、Τ、V 或 Y，父12是？或I，父13是0或 Q，X14 是 C、H、V 或 Y。D组重链⑶R包括下列共有集合a.通式为 Gfx1Fsx2Yx3MxJseq id no :io55)的 cdrhi，其中父丨是卩或T，X2 是 A、R 或 S，X3 是 A 或 S，X4 是 N 或 S。b.通式为 X1Isx2Sx3X4X5X6YyADSVKG(SEQ ID NO 1061)的 CDRH2，其中X1 是 A、H 或 Y，父2是6、1 或S，X3 是 G 或 S，父4是6、1 或S，X5 是 S、T 或 Y，X6 是 I 或 T。c.通式为 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17DX18 (SEQ ID NO: 1068)的 CDRH3， 其中X1是E、D或无氨基酸，X2是6、R或无氨基酸，X3是I、V、Y或无氨基酸，X4 是 A、G、L 或 N，X5 是 A、G、V 或 W，X6 是 A、N、R 或 T，X7是6、N、P或无氨基酸，父8是6、1\无氨基酸，X9是A或无氨基酸，
Xltl是D、E或无氨基酸，X11是S、Y或无氨基酸，X12是6、Y或无氨基酸，X13是N、Y或无氨基酸， X14是Y或无氨基酸，X15是0、Y或无氨基酸，X16是六、G或无氨基酸，X17 是 F 或 M，X18 是 I、V 或 Y。E组重链⑶R包括下列共有集合a.通式为 GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8 (SEQ ID NO: 1056)的 CDRHl，其中父！是0或G，X2 是 F、I 或 V，X3是R、S或无氨基酸，X4是6、Y或无氨基酸，&是0、6、3或无氨基酸，X6 是 A、S 或 Y，X7 是 A 或 Y，X8是N 或 S。b.通式为 X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13SX14KS (SEQ ID NO 1062)的 CDRH2，其中X1是E、R 或 Y，父2是1或T，X3 是 H、N 或 Y，X4 是 C、H、S、T 或 Y，X5 是 S 或 R，X6 是 G 或 S，X7 是 G、K、S 或 T，X8 是 T 或 W，X9 是 N 或 Y，Xltl是N或无氨基酸，X11是D或无氨基酸，X12 是 A 或 N，X13 是 P 或 V,X14 是 L 或 V。c.通式为 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23 (SEQ ID NO: 1069) 的CDRH3，其中X1 是八、0、6、3 或 T，父2是八』、6、1^、11 、￥或无氨基酸，父3是八、6、1^、11 、1\￥或无氨基酸，
父4是0、6、1 、5、￥、￥或无氨基酸，X5是八、6、I、S、V、Y或无氨基酸，X6是F、G、L、R、V或无氨基酸，X7是L、T、Y或无氨基酸，
X8是Y或无氨基酸，X9是Y或无氨基酸，X10是D或无氨基酸，X11是S或无氨基酸，X12是S或无氨基酸，X13是G或无氨基酸，父14是0、1^、皿、5、￥或无氨基酸，X15 是 H、I、P、V、W 或无氨基酸，父16是？、6、1^、1 、5、￥或无氨基酸，X17 是0、F、V、W、Y 或无氨基酸，X18 是 C、F、L、P、S 或 Y，X19 是0、F、G 或 Y，父2。是八、(、6、卩、1 、￥或￥，X21是？、1^、1、3或无氨基酸，X22是A、D或无氨基酸，X23是I、L、V、Y或无氨基酸。F组重链⑶R包括下列共有集合a.通式为 GFSLSNARMGVS(SEQ ID NO 279)的 CDRHlb.通式为 X1Ifsndeksystslks(seq id no :io63)的 cdrh2，其中父丨是！!或L。c.通式为 X1YssGWX2X3YGX4X5DX6(seq ID no 1070)的 CDRH3，其中X1 是 M 或 V，X2是S或无氨基酸，X3是F或无氨基酸，X4是V或无氨基酸，X5 是 F 或 M，X6是V或Y。G组重链⑶R包括下列共有集合a.通式为 GFSLXJGGVGVG(SEQ ID NO 1057)的 CDRH1，其中x1 是 s 或 n。b.通式为 LiywnxiX2KrySPSLX3S (SEQ id no :1064)的 cdrh2，其中父:是0或 V，父2是0或E，父3是1(或R。c.通式为 RX1X2X3PFX4Y(SEQ ID NO 1071)的 CDRH3，其中
X1 是G、H、L、N 或 R，X2 是 Ε、T 或 W，
父3是1^、111或￥，X4 是 D 或 Ε。 在另一个方法中，共有序列可通过在相应于U-Vl或U-Vh的相同序列内保持⑶R连 续来确定。简而言之，在该方法中，将相应于或U-Vh的完整可变结构域的氨基酸序列 转换成FASTA格式以方便处理比较比对和推断系统发生。然后，将这些序列的构架区用人 工接头序列替换，从而在不导入任何氨基酸位点权重偏向(weighting bias)(由于巧合的 事件(coincident event)(例如，偶然地共有共同的种系构架遗传物(heritage)的不相关 抗体)引起)，同时仍然在相应于U-Vl或U-Vh的相同序列内保持CDR连续的情况下进行单 独的CDR检查。然后使用应用标准ClutalW-Iike算法的程序(参见，Thompson等人，1994， Nucleic Acids Res. 22 :4673_4680)，将该格式的U-Vl或U-Vh序列经历序列相似性比对查 询。该程序同样地使用UPGMA (使用算术平均数的非加权成组配对法)或Neighbor-Joining 法(参见，Saitou 和 Nei，1987，Molecular Biology and Evolution 4:406-425)基于序列 相似性比对产生系统发育图(系统发生树图解)，从而通过分支长度比较和分组来构建和 图解说明序列组的相似性和差异。对于确定单独的组内的共有序列集合，两种方法产生相 似的结果。在一些情况下，抗原结合蛋白包含至少一个⑶RL1、⑶RL2或⑶RL3 (所述⑶RL具 有上述共有序列中的一个)。在一些情况下，抗原结合蛋白包含至少一个⑶RH1、⑶RH2或 CDRH3(所述CDRH具有上述共有序列中的一个)。在其他情况下，抗原结合蛋白包含至少两 个根据上述共有序列的CDRLJP /或至少两个根据上述共有序列的CDRH。在一个方面中， CDRL和/或CDRH来源于不同的组。在其他情况下，抗原结合蛋白包含至少两个来自相同 组A、B、C、D、E或F的CDRL和/或至少两个来自相同组A、B、C、D、E、F或G的CDRH。在其 他方面，抗原结合蛋白包含来自相同的上述组A、B、C、D、E或F的所有3个⑶RLl，⑶RL2 和CDRL 3序列，和/或来自相同的上述组A、B、C、D、E、F或G的所有3个CDRHl、CDRH2和 CDRH3序列。D.示例性抗原结合蛋白根据一个方面，提供了结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白，其包含(A)选自下列 的一个或多个轻链互补决定区(CDRL) :(i)选自SEQ IDNO =189-217的CDRLl ； (i i)选自 SEQ ID NO 218-233 的 CDRL2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :234_274 的 CDRL3 ；禾口 (iv)包含一个 或多个不超过5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的 CDRL ； (B)选自下列的一个或多个重链互补决定区(CDRH)⑴选自SEQ ID NO =275-299的 CDRHl ； (ii)选自 SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ； (iii)选自 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ； 和(iv)包含一个或多个不超过5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、 (ii)或(iii)的CDRH ；或(C) 一个或多个(A)的轻链CDRL ；和(D) 一个或多个(B)的重链 CDRH0在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白可包含㈧选自下列的CDRL :(i)选自 SEQ ID NO 189-217 的CDRLl ； (i )选自 SEQ ID NO :218_233 的CDRL2 ；和(iii)选自 SEQ ID NO 234-274 的 CDRL3 ； (B)选自下列的 CDRH (i)选自 SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ； (ii)选自 SEQ ID NO 300-331 的 CDRH2 ；禾口 (iii)选自 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ；或(C) 一 个或多个(A)的轻链CDRLjP (D) —个或多个(B)的重链CDRL。在一个实施方案中，分离 的抗原结合蛋白可包含(A)SEQ IDNO 189-217 的 CDRLl，SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2，禾口 SEQ ID NO 234-274 的 CDRL 3，和(B)SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl，SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2，和 SEQ ID NO 332-372 的 CDRH3。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO :94_141的氨基酸序列 具有至少80%、85%、90%或95%的序列同一性的可变轻链(Vj和/或与选自SEQ ID NO 142-186的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%的序列同一性的可变重链(Vh)。在 另外的实施方案中，八选自SEQ ID NO :94-141和/或乂11选自SEQ ID NO: 142-186。在另一方面，还提供了特异性结合含有至少一个包含IHGE的表位和/或HB-EGF 的EGF样表位的表位的分离的抗原结合蛋白。
在另外的方面，提供了结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包 含(A)选自下列的轻链互补决定区(CDRL) :(i)选自SEQ ID NO 234-274的CDRL3，(ii) 在氨基酸序列上与(i)的CDRL3相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的 CDRL3 ； (iii)选自下列的 CDRL3 氨基酸序列=X1QX2X3X4X5PX6X7 (SEQ ID NO 1046)，其中 X1 选 自I禾口 M，X2选自A、G禾口 S，X3选自I禾口 T，X4选自H禾口 Q、X5选自F、L禾口 W，X6选自C、I、H、 L 和 T，X7 选自 S 和 T !QQX1X2X3X4X5II^SEQ ID NO 1047)，其中 X1 选自 I 和 S，X2 选自 F 禾口 Y， X3 选自 F、I、S 和 Y，X4 选自 A、S 和 T，X5 选自 P 和 S ；X1X2X3X4X5X6X7X8T (SEQ ID NO 1048)，其 中X1选自L禾口 Q，X2选自K、N禾口 Q，X3选自A、H、S禾口 Y，X4选自H、N禾口 Y，X5选自N、S禾口 T， 乂6选自六、？、1、1\￥和丫，乂7选自 P 和无氨基酸，X8 选自 F、L 和 P ^X1X2DX3LPX4X5 (SEQ ID NO 1049)，其中X1选自H和Q，X2选自C和Y，X3选自D、I、N、S和Y，X4选自F、I和L，X5选自A、 S 和 T ；QQX1X2X3X4PX5X6X7 (SEQ ID NO 1050)，其中 X1 选自 H和 Y，X2 选自 G 和 N，X3 选自 N和 S， X4选自S和W，X5选自P和无氨基酸，X6选自R和W，X7选自S和T ；和X1QYX2X3X4X5X6X7F (SEQ IDNO 1051)，其中X1选自H禾口 Q，X2选自F禾口 Y，X3选自G、I禾口 S，X4选自F、I禾口 T，X5选 自M、P、S和T，X6选自F、L、R和W，X7选自S和T ；和/或⑶选自下列的重链互补决定区 (CDRH)⑴选自SEQ IDNO 332-372的CDRH3，(ii)在氨基酸序列上与⑴的CDRH3相异 在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH3;和(iii)选自下列的CDRH3氨 基酸序列=X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11DX12 (SEQ ID NO 1065)，其中 X1 选自 E 和 S，X2 选自 D、G 禾口 无氨基酸，X3选自D、N和无氨基酸，X4选自G和无氨基酸，X5选自G和无氨基酸，X6选自W、 Y和无氨基酸，X7选自I、N和Y，X8选自A和Y，X9选自G、V和Y，Xltl选自A、F和G，X11选 自 F、L 禾口 M，X12 选自 V 禾口 Y ；QX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11YX12X13X14DX15 (SEQ ID NO 1066)，其中 X1 选自G和无氨基酸，X2选自K、L和Y，X3选自A、G和S，X4选自S、V和Y，X5选自A和G，X6 选自G和无氨基酸，X7选自T和无氨基酸，X8选自S和无氨基酸，X9选自Y和无氨基酸，Xw 选自W和Y、X11选自G、S和Y、X12选自F和Y、X13选自G和无氨基酸，X14选自M和无氨基 酸，X15 选自 V 禾口 Y ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO 1067)，其中 X1 选自 D、G、L、S 和无氨基酸，X2选自G、H、W、Y和无氨基酸，X3选自A、F、W、Y和无氨基酸，X4选自D、G、Q、T 和无氨基酸，X5选自6、1、0、3和无氨基酸，&选自A、D，X8选自D、Y和无氨基酸，X9选自Y 和无氨基酸，X10选自A、E、N和Y，X11选自G、P、Τ、V和Y，X12是se，X14选自C、H、V和Y ；X1 X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14X15X16X17DX18 (SEQ IDNO 1068)，其中 X1 选自 E、D 和无氨基酸，X2选自G、R和无氨基酸，X3选自I、V、Y和无氨基酸，X4选自八、6、1^和队&选自六、6、￥和1， X6选自A、N、R和T，X7选自G、N、P和无氨基酸，X8选自G、T和无氨基酸，X9选自A和无氨 基酸，Xltl选自D、E和无氨基酸，X11选自S、Y和无氨基酸，X12选自G、Y和无氨基酸，X13选自 N、Y和无氨基酸，X14选自Y和无氨基酸，X15选自D、Y和无氨基酸，X16选自A、G和无氨基酸， X17 选自 F 禾口 M, X18 选自 I、V 禾口 Y ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X 20X21X22X23 (SEQ ID NO 1069)，其中X1选自A、D、G、S和T，X2选自A、E、G、L、N、R、Y和无氨基酸，X3选自A、 G、L、N、R、T、Y和无氨基酸，X4选自D、G、R、S、V、Y和无氨基酸，X5选自A、G、I、S、V、Y和无 氨基酸，X6选自F、G、L、R、V和无氨基酸，X7选自L、T、Y和无氨基酸，X8选自Y和无氨基酸， X9选自Y和无氨基酸，Xltl选自D和无氨基酸，X11选自S和无氨基酸，X12选自S和无氨基 酸，X13选自G和无氨基酸，X14选自D、L、M、S、Y和无氨基酸，X15选自H、I、P、V、W和无氨基 酸，X16选自F、G、L、R、S、Y和无氨基酸，X17选自D、F、V、W、Y和无氨基酸，X18选自C、F、L、 P、S和Y，X19选自D、F、G和Y，X20选自A、C、G、P、R、V和Y，X21选自F、L、M、S和无氨基酸， X22 选自 A、D 和无氨基酸，X23 选自 I、L、V、Y 和无氨基酸；X1YSSGffX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO 1070)，其中X1选自M和V，X2选自S和无氨基酸，X3选自F和无氨基酸，X4选自V和无氨基 酸，X5 选自 F禾口 M、X6 选自 V 禾口 Y ；禾口 RX1X2X3PFX4Y(SEQID NO 1071)，其中 X1 选自 G、H、L、N 禾口 R，X2选自Ε、T禾口 W，X3选自L、N、T禾口 V，X4选自D禾口 E。
在一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白还包含㈧选自下列的⑶RL:(i)选 自SEQ ID NO :189-217的⑶RLl ;(ii)在氨基酸序列上与(i)的⑶RLl相异在于不超 过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRLl ;(iii)选自下列的CDRLl氨基酸序列 X1Ssqslx2X3SDGX4TYLX5 (SEQ ID NO :1035)，其中 X1 选自 K 和 R，X2 选自 L 和 V，X3 选自 H 禾口 Y，X4 选自 K 禾口 N，X5 选自 N、S 和 Y ;RASQXJSX2YLN(SEQ ID NO 1036)，其中 X1 选自 R、S 禾口 T，X2 选自 R禾口 S ；RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID NO 1037)，其中 X1 选自 D、G、S 和 T，X2 选自 A、 R 禾口 S，X3 选自 H、I、N、R、S 和 T，X4 选自 D、W 禾口 Y，X5 选自 A、G 禾口 N ；QASQDIX1X2X3LN (SEQ ID NO 1038)，其中 X1 选自 S 和 T，X2 选自 D 和 N，X3 选自 S 和 Y ；RASQX1VX2X3X4X5LA (SEQ ID NO 1039)，其中X1选自S和T，X2选自I和S，X3选自R和S，X4选自S、N和无氨基酸，X5选自Y 和无氨基酸；和 Kssqx1X2Lx3X4SnnKnyLX5(seq id no 1040)，其中 X1 选自 ν和 s，X2 选自 ι 禾口 V,x3选自 D 和 Υ，Χ4 选自 N、R和 S，X5 选自 A和 V ；或(iv)选自 SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ； (ν)在氨基酸序列上与(iv)的CDRL2相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置 换的CDRH2 ；或(vi)选自下列的CDRL2氨基酸序列=X1X2SNX3X4S (SEQ ID NO 1041)，其中 X1 选自 E 禾口 K，X2 选自 I 禾口 V，X3 选自 R 禾口 W，X4 选自 D 禾口 F ；X1X2SX3LQS (SEQ ID NO 1042)， 其中 X1 选自 A 禾口 T，X2 选自 A、E 禾口 V，X3 选自 S 禾口 T ；X1ASX2LQS(SEQ ID NO 1043)，其中 X1 选自 A 禾口 V，X2 选自 S 禾口 T ；DASX1LET (SEQ ID NO 1044)，其中 X1 选自 I 和 N ；GASSRAT (SEQ IDNO 223)；和 WASX1RES(SEQ ID NO :1045)，其中 X1 选自 A 和 T ；或 B)选自下列的 CDRH ⑴选自SEQ ID NO =275-299的CDRHl ； (ii)在氨基酸序列上与⑴的CDRHl相异在于不 超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRHl ;(iii)选自下列的CDRHl氨基酸序列 GYTX1TX2X3X4X5X6 (SEQ ID NO 1052)，其中 X1 选自 F 和 L，X2 选自 E、G 和 S，X3 选自 H、L 禾口 Y， X4 选自 G、S 禾口 Y，X5 选自 I 禾口 M，X6 选自 H 禾口 S ；GYX1FTSYffIG(SEQ ID NO 1053)，其中 X1 选 自 R 禾口 S ；GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID NO 1054)，其中 X1 选自 R 和 S，X2 选自 H 和 Y，X3 选自 D 和 G ； GFX1FSX2YX3MX4 (SEQ ID NO 1055)，其中 X1 选自 P 和 T，X2 选自 A、R 禾口 S，X3 选自 A 禾口 S，X4选自 N 禾口 S ；GX1SX2SX3X4X5X6X7WX8(SEQ ID NO 1056)，其中 X1 选自 D 禾口 G，X2 选自 F、I 禾口 V， X3选自R、S和无氨基酸，X4选自G、Y和无氨基酸，X5选自D、G、S和无氨基酸，X6选自A、S 禾口 Y, X7 选自 A 禾口 Y，X8 选自 N 禾口 S ；GFSLSNARMGVS (SEQ ID NO 279)；禾口 GFSLXJGGVGVG (SEQ ID NO 1057)，其中 X1 选自 S 和 N ;(iv)选自 SEQ ID NO 300-331 的 CDRH2 ； (ν)在氨基酸序 列上与(iv)的CDRH2相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或置换的CDRH2 ；和 (vi)选自下列的 CDRH2 氨基酸序列=X1X2X3X4X5X6GX7TX8X9XltlQKX11X12 (SEQ ID NO: 1058)，其中 X1选自S禾口 W，X2选自F禾口 I，X3选自D、N禾口 S，X4选自A禾口 P，X5选自E、N禾口 S、X6选自D、 N和S，X7选自E、G和N，X8选自I和N，X9选自C、H和Y，Xltl选自A和T，X11选自F和L，X12 选自 D禾口 G ；Iiypx1Dsdx2Ryspsfqg(seq id no 1059)，其中 x1 选自 D和g，x2选自 a、i 和 τ ； X1IX2X3DGSX4X5X6YX7DSVX8G (SEQ ID NO 1060)，其中 X1 选自 F 和 V，X2 选自 S 和 W，X3 选自 D、 S禾口 Y，X4选自I、N禾口 T，X5选自K禾口 Q，X6选自N、R禾口 Y，X7选自A、T禾口 V，X8选自K禾口 R ； X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID NO 1061)，其中 X1 选自 Α、Η*Υ，Χ2 § G、R*S，X3itg G 和 S，X4 选自 G、R 禾口 S，X5 选自 S、T 和 Y，X6 选自 I 和 T ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13SX14KS (SEQ ID NO 1062)，其中 X1 选自 E、R 禾口 Y，X2 选自 I 禾口 T，X3 选自 H、N 禾口 Y，X4 选自 C、H、S、 T和Y，X5选自S和R，X6选自G和S，X7选自G、K、S和T，X8选自T和W，X9选自N和Y，X10 选自N和无氨基酸，X11选自D和无氨基酸，X12选自A和N，X13选自P和V，X14选自L和V ； X1Ifsndeksystslks(seq id no :io63)，其中X1 选自 η和li ；和Liywnx1X2KrySPSLX3S(seqid NO 1064)，其中X1选自D禾口 V，X2选自D禾口 E，X3选自K禾口 R。
在一些实施方案中，⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3序列中的至少2个或所有3个来源于共 有序列的相同的组A、B、C、D、E或F，和/或⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3序列中的至少2个或所 有3个来源于相同的组A、B、C、D、E、F或G。在其他情况下，将来自不同共有序列组的⑶R 混合和搭配。在另一个实施方案中，上文中描述的分离的抗原结合蛋白包含第一氨基酸序列和 第二氨基酸序列，两者的序列彼此共价连接。在另外的实施方案中，分离的抗原结合蛋白的 第一氨基酸序列包括 SEQ ID NO 234-274 的 CDRL3、SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 和 SEQ ID NO :189-217的⑶RL1。在另一方面，分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO 332-372 的 CDRH3, SEQ ID NO 300-331 的 CDRH2 和 SEQ IDNO 275-299 的 CDRHl。在一个方面，本文中提供的分离的抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、 重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在另一个实施方案中，本文中提供的分离的抗原结合蛋白的抗体片段可以是Fab 片段、Fab'片段、F(ab' )2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。在另外的实施方案中，本文中提供的分离的抗原结合蛋白是人抗体并且可以是 IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4 类型。在另一个方面，可将本文中提供的分离的抗原结合蛋白偶联至标记基团，例如放 射性同位素、放射性核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽 基团，或效应子基团例如放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗性基团或化学治疗基团。治 疗性基团或化学治疗基团的实例是卡奇霉素、auristatin-PE、格尔德霉素、美登纳新或其 衍生物。在另一个方面，本发明包括与任何上述抗原结合蛋白竞争的抗原结合蛋白。
如将由本领域技术人员认识到的，对于具有多于一个的来自所描述的序列的CDR 的任何抗原结合蛋白，可使用独立地选自所描述的序列的CDR的任何组合。因此，可产生具 有1、2、3、4、5或6个独立地选择的⑶R的抗原结合蛋白。然而，如将由本领域技术人员所 认识到的，特定实施方案通常使用非重复的CDR的组合，例如，抗原结合蛋白通常不由两个 ⑶RH2区域制备，等。在下文中更详细地论述提供的一些抗原结合蛋白。1.抗原结合蛋白和结合表位 当认为抗原结合蛋白结合多肽例如HB-EGF的特定残基中的表位时，例如，所指的 意思是抗原结合蛋白特异性结合由特定残基组成的多肽(例如，HB-EGF的特定区段)。这 样的抗原结合蛋白通常并非与HB-EGF中的每一个残基接触。HB-EGF的细胞外结构域或 HB-EGF内的每一个单个氨基酸置换或缺失并不一定显著影响结合亲和力。抗原结合蛋白 的表位特异性可以用多种方法来测定。例如，一个方法包括检测横跨抗原的序列的并且以 少量氨基酸(例如，3个氨基酸)增量相异的大约15个氨基酸的重叠肽的集合。将肽固定 在微量滴定板的孔内。可通过生物素化肽的一个末端来实现固定。任选地，为了比较目的， 可在氨基端和羧基端生物素化相同肽的不同样品，然后将其固定在分开的孔中。这用于鉴 定末端特异性抗原结合蛋白。任选地，可通过在特定的目的氨基酸上终止来包括另外的肽。 该方法可用于鉴定抗HB-EGF的内部片段的末端特异性抗原结合蛋白。就与每一个不同的 肽的特异性结合筛选抗原结合蛋白或免疫功能片段。表位定义为抗原结合蛋白对其显示特 异性结合的所有的肽共有的氨基酸的区段。关于界定表位的特定方法的详细内容示于实施 例23中。如实施例23中所显示的，本文中提供的抗原结合蛋白能够结合HB-EGF的至少一 个含有IHGE的表位和/或EGF样结构域。2.竞争性抗原结合蛋白在另一个方面，提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白与例举的抗体或功能性 片段中的一个竞争对上述表位的结合(以特异性结合HB-EGF)。这样的抗原结合蛋白还可 结合与本文中示例的抗原结合蛋白之一相同的表位或交叠表位。预期与示例的抗原结合蛋 白竞争或结合与其相同的表位的抗原结合蛋白和片段显示相似的功能特性。示例的抗原结 合蛋白和片段包括上文中描述的那些，包括具有图1、2、3、4、6和7中包括的重链和轻链、可 变区结构城和⑶R的那些。3.人抗体和抗体的人源化在一个实施方案中，HB-EGF抗原结合蛋白是人抗体或人源化的抗体。人抗体避免 了与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的许多问题。此类鼠或大鼠来源的蛋白 的存在可导致抗体的快速清除或可导致患者产生抗抗体的免疫应答。为了避免使用鼠或大 鼠来源的抗体，已通过将功能性人抗体基因座导入啮齿类动物、其他哺乳动物或动物(从 而使啮齿类动物、其他哺乳动物或动物产生完全人抗体)来产生完全人抗体。用于产生完全人抗体的一个方法是使用小鼠的XenoMouse 品系，其经工程改 造包含多达但小于IOOOkb大小的人重链基因座和K轻链基因座的种系配置的片段。参见， 例如 Mendez 等人，1997，NatureGenetics 15 146-156，以及 Green 和 Jakobovits，1998， J. Exp. Med. 188 :483_495。XenoMoU.Se 品系可从 Abgenix，Inc. (Fremont, CA)获得。
小鼠的XenoMoUSe ,品系的产生论述和详细描述于1990年I月12日提交的美国专利申请系列07/466，008、1990年11月8日提交的07/610，515、1992年7月24日提交 的 07/919，297、1992 年 7 月 30 日提交的 07/922，649、1993 年 3 月 15 日提交的 08/031，801、 1993年8月27日提交的08/112，848、1994年4月28日提交的08/234，145、1995年1月 20日提交的08/376,279、1995年4月27日提交的08/430，938、1995年6月5日提交的 08/464，584、1995 年 6 月 5 日提交的 08/464，582、1995 年 6 月 5 日提交的 08/463，191、1995 年6月5日提交的08/462，837、1995年6月5日提交的08/486，853、1995年6月5日提交 的 08/486，857、1995 年 6 月 5 日提交的 08/486，859、1995 年 6 月 5 日提交的 08/462，513、 1996 年 10 月 2 日提交的 08/724，752、1996 年 12 月 3 日提交的 08/759，620、2001 年 11 月30日提交的美国公开案2003/0093820和美国专利6，162，963,6, 150，584,6, 114，598、 6，075，181 和 5，939，598 以及日本专利 3068180Β2.3068506Β2 和 3068507Β2 中。也参见， 1996年6月12日公开的欧洲专利EP 0463151Β1、1994年2月3日公开的国际专利申请案 WO 94/02602、1996年10月31日公开的国际专利申请案W096/34096、1998年6月11日公 开的WO 98/24893、2000年12月21日公开的WO 00/76310。每一个上述专利、申请和参考 文献的公开内容以其全文通过引用合并入本文。在备选方法中，其他的包括GenPharm International, Inc.已利用“微小基因 座(minilocus)”方法。在微小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的片段(单独的基 因)来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个Vh基因，一个或多个Dh基因，一个或多个 Jh基因，μ恒定区以及通常第二恒定区(优选Y恒定区)构建入用于插入动物的构建体。 该方法描述于属于Surani等人的美国专利5，545，807和各自属于Lonberg和Kay的美 国专利 5，545，806,5, 625，825,5, 625，126,5, 633，425,5, 661，016,5, 770，429,5, 789，650、 5，814，318,5, 877，397,5, 874，299 和 6，255，458、属于 Krimpenfort 和 Berns 的美国专利 5，591，669 和 6，023，010、属于 Berns 等人的美国专利 5，612，205,5, 721，367 和 5，789，215 以及属于Choi和Dunn的美国专利5，643，763，以及1990年8月29日提交的GenPharm国 际美国专利申请系列案07/574，748、1990年8月31日提交的07/575，962、1991年12月 17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853，408、1992年6月23日提交的 07/904，068、1992 年 12 月 16 日提交的 07/990，860、1993 年 4 月 26 日提交的 08/053，131、 1993 年 7 月 22 日提交的 08/096，762,1993 年 11 月 18 日提交的 08/155，301,1993 年 12 月3日提交的08/161，739、1993年12月10日提交的08/165，699、1994年3月9日提交的 08/209, 741中，其公开内容通过引用合并入本文。也参见，欧洲专利0546073Β1、国际专利 申请 WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、W094/00569、 WO 94/25585,WO 96/14436,WO 97/13852 和 WO 98/24884 以及美国专利 5，981，175，其公开 内容以其全文通过引用合并入本文。Kirin也已显示从其中通过微细胞融合已导入了大的染色体片段或完整染色体的 小鼠产生人抗体。参见，欧洲专利申请773288和843961，其公开内容通过引用合并入本 文。此外，已产生KM 小鼠，其是Kirin' s Tc小鼠与Medarex' s微小基因座(Humab)小 鼠杂交育种的结果。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体(transchromosome)和 Genpharm 小鼠的 κ 链转基因(Ishida 等人，2002，Cloning StemCells 4:91-102)。还可通过体外方法产生人抗体。合适的实例包括但不限于噬菌体展示(CAT，Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion(之前为 Proliferon), Affimed)，核糖体展示(CAT)、酵母展示等。Ε.抗体的制备通过使用本文中描述的XenoMouse 技术制备本文中描述的抗体。此类小鼠能 够产生人免疫球蛋白分子和抗体并且基本上不产生鼠免疫球蛋白分子和抗体。用于产生人 抗体的技术公开于本文中公开的专利、申请和参考文献中。在一些实施方案中，如1996年 12月3日提交的美国专利申请系列08/759，620和1998年6月11日公开的国际专利申请 WO 98/24893和2000年12月21日公开的WO 00/76310 (其公开内容通过引用合并入本文) 中所公开的，进行小鼠和人抗体的转基因产生。也参见Mendez等人，1997，Nature Genetics 15 :146-156，其公开内容通过引用合并入本文。
通过使用此类技术，已产生了抗许多抗原的全长人单克隆抗体。通常，用目的抗原 (例如HB-EGF)免疫小鼠的XenoMouse ,品系，从高度免疫的小鼠回收淋巴细胞(例如B 细胞)，然后将回收的淋巴细胞与骨髓型细胞系融合以制备永生化的杂交瘤细胞系。筛选 和选择此类杂交瘤细胞系以鉴定产生特异于目的抗原的抗体的杂交瘤细胞系。还可就抗 HB-EGF片段的免疫反应性筛选上清液，以进一步绘制结合HB-EGF上的功能目的结构域的 不同抗体的图谱。还可筛选与EGFR或其家族成员的其他配体、其他相关人趋化因子结合的 和抗HB-EGF的大鼠、小鼠和非人灵长类动物例如食蟹猴直系同源物的抗体，最后以确定物 种交叉反应性。本文中提供了用于产生多种杂交瘤细胞系(其产生特异于HB-EGF的抗体) 的方法。此外，本文中提供了由此类细胞系产生的抗体的特征，包括此类抗体的重链和轻链 的核苷酸和氨基酸序列分析。备选地，可直接测定B细胞，而无需融合至骨髓瘤细胞以产生杂交瘤。例如，可从 高度免疫的XenoMouse 小鼠分离B细胞，让其增殖并且分化成抗体分泌型浆细胞。然 后通过ELISA就抗HB-EGF免疫原的反应性筛选来自细胞上清液的抗体。还可就抗HB-EGF 片段的免疫反应性筛选上清液以进一步绘制结合HB-EGF上的功能目的结构域的不同抗体 的图谱。还可筛选与EGF受体或其家族成员的其他配体、其他相关人趋化因子结合的和抗 HB-EGF的大鼠、小鼠和非人灵长类动物例如食蟹猴直系同源物的抗体，最后以确定物种交 叉反应性。可利用各种方法永生化来自包含目的抗体的孔的B细胞，所述方法包括融合以 从单独的孔或从混合的孔产生杂交瘤，或用EBV感染或用已知的永生化基因转染，然后涂 板在适当的培养基中。备选地，然后使用HB-EGF特异性溶血空斑测定(hemolytic plaque assay) (Babcook 等人，1996，Proc. Natl. Acad. Sci USA 93 :7843_48)分离分泌具有期望的 特异性的抗体的单个浆细胞。被靶向以裂解的细胞优选是包被有HB-EGF抗原的绵羊红细 胞(SRBC)。如上所述，存在许多抗体的同种型，包括但不限于下列人IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4。应理解，产生的抗体最初不需要具有这样的同种型，相反地，当产生时，抗体可具有任 何同种型，以及应理解可通过使用本领域内熟知的常规分子生物学技术，利用合适的表达 载体中的分子克隆的V区基因或克隆的恒定区基因或cDNA，然后使用本领城内已知的技术 在宿主细胞中表达抗体，来对抗体进行同种型转换。通常，由融合的杂交瘤产生的抗体是具有完全人κ链的人IgG2重链或人IgG4重链。抗体还可以是其他人同种型，包括IgGl或IgG3。抗体具有高亲和力，通常具有大约10_6 至大约10_12M或更低的KD，当通过固相和液相技术测量时。具有至少10_9M的Kd的抗体优 选用于抑制HB-EGF的活性。具有至少ΙΟ,Μ的Kd的抗体也优选用于抑制HB-EGF的活性。 具有至少IiT11M的Kd的抗体也优选用于抑制HB-EGF的活性。
如将意识到的，可在除了杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达抗HB-EGF抗体。可使 用编码特定抗体的序列转染合适的哺乳动物宿主细胞。在用于转染和随后表达抗体的合适 的载体的构建过程中，可将抗体从一种同种型类别转换成另一种同种型，例如可通过本领 域内已知的技术将IgG4抗体类别转换成IgG2。可通过用于将多核苷酸导入宿主细胞的任 何已知的方法(包括例如将多核苷酸包装入病毒中(或病毒载体中)，然后用病毒(或载 体)转导宿主细胞)或通过本领域内已知的转染方法(如美国专利4，399，216,4, 912，040、 4，740，461和4，959，455 (所述专利通过引用合并入本文)所例举的)进行转染。所使用 的转化方法取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法在本领域 内是熟知的，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿 孔、多核苷酸在脂质体中的封装和DNA至细胞核内的直接显微注射。可作为用于表达的宿主获得的哺乳动物细胞系在本领域内是熟知的并且包括许 多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵 巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如， Hep G2)、人上皮肾293细胞和许多其他细胞系。通过确定具有高表达水平且产生大量的抗 HB-EGF抗体的细胞系来选择特别优选的细胞系。备选地，可从经基因工程改造以产生完全人抗体的动物或从在噬菌体、酵母、核糖 体或大肠杆菌(E.coli)中制备的抗体展示文库制备此类抗体。参见，例如，Clackson等 人，1991，Nature 352 :624_628，Marks 等人，1991，J. Mol. Biol. 222 :581_597，Feldhaus 和 Siegel, 2004, J. Immunol. Methods. 290 :69_80，Groves禾口Osbourn，2005，Expert Opin Biol Ther. 5 125—135 以及 Jostock 禾口 Dubel，2005，Comb Chem High Throughput Screen. 8 127-133。另一方面涉及编码HB-EGF抗原结合蛋白例如抗体的分离的核酸分子。在本文的 上下文中，术语“分离的核酸分子”，如本文中所使用的，根据其来源，意指基因组、cDNA或合 成来源的多核苷酸或其一些组合，“分离的核酸分子”(1)不与在其中天然发现“分离的多 核苷酸”的所有或部分多核苷酸结合，(2)与其在天然状态下不与之连接的多核苷酸有效连 接，或(3)不作为更大的序列的部分天然发生。此外，术语“核酸分子”，如本文中所提及的， 意指长度为至少10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修 饰形式例如具有修饰的或取代的糖基的核苷酸等)的多聚体形式。术语还包括DNA的单链 和双链形式。在下文中更详细地描述编码抗原结合蛋白或其部分的示例性核酸。在一个实施方案中，将核酸分子有效连接至控制序列。术语“控制序列”，如本文中 使用的，是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。取决于宿 主生物，此类控制序列的性质不同。在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体 结合位点和转录终止序列。在真核生物中，一般地，此类控制序列包括启动子和转录终止序 列。术语“控制序列”意欲包括(在最低程度上)其存在是表达和加工所必需的所有组件， 并且还可包括其存在是有利的另外的组件，例如，前导序列和融合伴侣序列。此外，术语“有效连接的”，如本文中所使用的，是指处于允许它们以期望的方式发挥功能的关系中的所述 组件的位置。此外，如本文中所提供的，与编码序列有效连接的表达控制序列以在与表达控 制序列相容的条件下获得编码序列的表达的方式连接。另外的方面是包含编码本文中提供的HB-EGF抗原结合蛋白的核酸分子的载体。 可将核酸分子与控制序列有效连接。此外，载体可额外地包含复制起始区或选择标记基因。 可使用的载体的实例是例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。 F.基于基本抗体结构的抗原结合蛋白如上所述，已知基本抗体结构单位包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对 组成，各对具有一个“轻链”(大约25kDa)和一个“重链”(大约50-70kDa)。各链的氨基末 端部分包括大约100至110或更多个氨基酸的可变区(主要负责抗原识别)。各链的羧基 末端部分界定了负责二聚化效应子功能、循环半衰期和其他功能的恒定区。人轻链分类为 K和λ轻链。重链分类为μ、δ、Υ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、 IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连 接，对于重链还包括大约10或更多个氨基酸的“D”区。通常参见Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.编辑，第2版.Raven Press, N. Y. (1989))(以其全文通过引用合并入本文， 用于所有目的)。各轻链/重链对的可变区形成了抗体的抗原结合位点。因此，完整的IgG抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中外，两 个结合位点是相同的。链的可变区都展示相同的一般结构通过3个高变区(也称为互补决定区或CDR) 连接相对保守的构架区(FR)。来自各个对的两个可变区的CDR通过构架区联配，从而使 得能够与抗原上的特定表位结合。轻链和重链的可变区从N末端至C末端都包含结构域 FRU CDRU FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸至各结构域的分配遵从KabatSequences of Proteins of Immunological Interest(Nationallnstitutes of Health, Bethesda, Md. (1987 和 1991))，或 Chothia&Lesk，1897，J. Mol. Biol. 196 :901_917 ；Chothia 等人， 1989，Nature 342 :878_883 的定义。因此，本文中提供的抗体可包括至少一个具有式 FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3-⑶R3-FR4的可变区多肽链，其中FRl是第一人构架区，⑶Rl是第 一互补决定区，FR2是第二人构架区，⑶R2是第二互补决定区，FR3是第三人构架区，⑶R3 是第三互补决定区，以及FR4是第四人构架区。CDR3通常是抗体可变区的最多样的区域。在一些实施方案中，FRl区包括但不限于氨基酸序列SEQ IDNO :373_393和/或 453-469的任一个；CDRl区包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO 189-217和/或275-299 的任一个；FR2区包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO :394_414和/或470-481的任一个； CDR2区包括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO 218-233和/或300-331的任一个；FR3区包 括但不限于氨基酸序列SEQ ID NO =415-440和/或482-511的任一个；CDR3区包括但不限 于氨基酸序列SEQ ID NO 234-274和/或332-372的任一个；以及FR4区包括但不限于氨 基酸序列SEQ IDNO :441-452和/或512-517的任一个。因此，在一些实施方案中，本文中 提供的人抗体具有一个或多个本文中提供的氨基酸序列。应理解，本文中提供的抗体的氨基酸序列不限于20种常规氨基酸(参见， Immunology-Α Synthesis(第 2 片反，E.S. Golub 禾口 D. R. Gren, Eds.，Sinauer Associates，Sunderland,Mass. (1991))，其通过引用合并入本文)。例如，氨基酸可包括20种常规氨基 酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸例如α _，α - 二取代的氨基酸、N-烷 基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸。也可以是提供的抗体的合适的组分的非常规氨基酸 的实例包括4_羟脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、ε -N, N, N-三甲基赖氨酸、ε -N-乙酰赖氨酸、 O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ -N-甲基 精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸，例如4-羟脯氨酸。此外，预期包括SEQ ID NO :1_517和1035-1071中显示的氨基酸序列中的小变异， 只要氨基酸序列中的变异保持SEQ ID NO 1-517和1035-1071中所示的序列的至少75%， 更优选至少80%、90%、95%和最优选99%即可。SEQ ID NO :1_517和1035-1071中显示 的氨基酸序列中的优选变异，即，至少一个氨基酸的缺失、插入和/或置换，在功能结构域 的边界附近发生。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私人拥有的序列数据库 相比较来鉴定结构和功能结构域。可使用计算 机化的比较方法来鉴定在已知结构和/或功 能的其他抗体中发生的预测的蛋白质构象结构域或序列基序。鉴定折叠入已知的三维结构 的蛋白质序列的方法是已知的。参见，例如，Bowie等人，1991，Science253 164 ；Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed. ,W.H.Freeman and Company,New York(1984)) ；Introduction to Protein Structure(C. Branden禾口 J. Tooze,eds. ,Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))；和 Thornton 等人，1991，Nature 354 :105，其全都通 过引用合并入本文。因此，本领域技术人员可识别可用于界定结构和功能结构域的序列基 序和结构构象。SEQ ID NO 1-517和1035-1071中所示的氨基酸序列中的特别优选的变异是导致 减少的对蛋白质水解或氧化的易感性、改变糖基化模式或改变结合亲和力或赋予或改变抗 体的其他物理化学或功能特性的变异。特别地，涉及保守氨基酸置换。保守置换是在其侧 链相关的氨基酸的家族内发生的置换。优选的氨基酸家族如下酸性家族=天冬氨酸、谷氨 酸；碱性家族=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；非极性家族=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和不带电荷的极性家族=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族是脂肪族-羟基家族=丝氨酸和苏 氨酸；含有酰胺的家族=天冬酰胺和谷氨酸胺；脂肪族家族=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异 亮氨酸；和芳香族家族=苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。例如，可合理地预期，用异亮氨酸或缬 氨酸对亮氨酸的分离的置换、用谷氨酸对天冬氨酸的分离的置换、用丝氨酸对苏氨酸的分 离的置换或用结构上相关的氨基酸对氨基酸的相似置换将对所得抗体的结合或性质不具 有重大影响，特别是如果置换不涉及构架部位内的氨基酸。然而，还包括所有其他可能的氨 基酸置换。氨基酸变化是否导致功能性抗体，即，结合HB-EGF并且减小、中和或或显著抑制 HB-EGF的功能的抗体，可通过在ELISA或FACS中就与HB-EGF的结合测定所得抗体的特异 性活性或通过体外或体内功能测定来容易地进行确定。可通过影响，例如减少或抑制HB-EGF与其受体例如EGFR或HER4的结合来引起 HB-EGF介导的信号转导的减少、中和或显著抑制。术语“抗体”或“抗HB-EGF抗体”，如本文中所使用的，意指单克隆抗体、多克隆 抗体、重组抗体、人源化抗体(Jones等人，1986，Nature 321 :522_525 ；Riechmann等人， 1988，Nature 332 :323_329 ；禾口 Presta, 1992，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596)、嵌合抗体(Morrison 等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. Α. 81 :6851_6855)、从至少两个抗体形 成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或其抗体片段。术语“抗体片段”包括上述抗体的 任何部分，优选至少一个它们的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab' 片段、F(ab' )2 片段、Fv 片段、双价抗体(Hollinger 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90 :6444-6448)、单链抗体分子(Pluckthun in :The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113，Rosenburg 和 Moore，EDS，Springer Verlag, N. Y. (1994)，269-315)和其 他片段，只要它们展示期望的结合HB-EGF的能力。此外，术语“抗体”或“抗HB-EGF抗体”，如本文中所使用的，可包括包含抗体或 天然发生的抗体变体的经工程改造的亚结构域的抗体样分子。此类抗体样分子可以是 单链结构域抗体例如来源于天然来源例如骆驼(Muyldermans等人，2001，Reviews in MolecularBiotechnology 74，277-302)的或通过来自人、骆驼或其他物种的文库的体外展 示(Holt 等人·，2003，Trends Biotechnol. 21 484-90)产生的只有 VH 或只有 VL 的结构 域 。"Fv片段”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非 共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中各可变 结构域的3个⑶R相互作用以在二聚体的表面上界定抗原结合位点。6个⑶R共同赋 予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或只包含特异于抗原的3个CDR的一 半的Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常以比完整结合位点更低的亲和力。“Fab 片段”还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(C0I)。“Fab片段”与“Fab'片 段”相异在于在重链ChI结构域的羧基末端上添加少数几个残基，包括来自抗体铰链区的 一个或多个半胱氨酸。“F(ab' )2片段”最初产生为在它们之间具有铰链半胱氨酸的一对 "Fab'片段”。制备此类抗体片段的方法，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶降解，对于本领域技 术人员来说是已知的。本文中提供的抗体可引起(fix)补体依赖性细胞毒性(CDC)或激活抗体依赖性细 胞毒性(ADCC)，特别是IgGl抗体、通过分子生物学从人或哺乳动物来源的IgG2或IgG4或 另一个同种型类别转换的IgGl变体或从产生人IgGl的小鼠从新产生的IgGl变体。还可 使用其他方法。有时可将本文中提供的抗体偶联至标记基团或效应子基团，例如毒素、化学 治疗剂、报告分子或显象剂。G.其他类型的HB-EGF结合蛋白在另一个方面，本文中提供的HB-EGF抗原结合蛋白是具有抗体样结合活性(即结 合 HB-EGF)的支架蛋白(scaffold protein)。在本发明的背景中，术语“支架蛋白”，如本文中所使用的，意指其折叠对修饰例如 多个插入、缺失或置换具有高度耐受性的多肽构架。该固有的构象稳定性使得能够在蛋白 质的确定区域内进行定向随机化和剧烈变化。因此，其获得了某些新的特性，然而，其总体 结构完整性和原始物理化学行为仍然得到保持。该从新采用的特性主要但非唯一地包括对 预先确定的靶分子的结合特异性。目前，正在使用许多支架蛋白，其模拟常规抗体的结合原理至不同程度(Hey等 人，2005，Trends in Biotechnol. 23 :514_22)。可根据本发明使用的支架蛋白的实例可细 分为不同类型。抗体相关支架，其被定义为抗体的衍生物，所述抗体的衍生物在大小上天然更小并且在结构上更简单或已以这样的方式进行了工程改造。该类型包括例如所谓的 纳米抗体(Nanobody)(综述于 Hey 等人，Trends in Biotechnol. 2005 ；23 (10) ；514-522)、 结构域抗体(Holt等人，2003，Trends inBiotechnol. 21 :484_489)或鲨鱼抗原反应性 蛋白(shark antigenreactive proteins)(Holt 等人.Trends in Biotechnol. 2003 ； 21 ；484-489)。第二种类型的支架蛋白是耐受单个环肽的插入或随机化的刚性蛋白折叠 如 Kunitz-型结构域(Dennis 等人，1995 J. Biol. Cell. 270 :25411_25417)、人转铁蛋白 (Ali 等人，1999 J. Biol. Cell. 274 24066-24074)或半胱氨酸结(cystein-knot)结构基 序(Christmann等人，1999，Protein Eng. 12 797-806)。共有与抗体类似的在刚性保守构 架上具有多个高变环的原理的代表性蛋白是人CTLA-4 (Hufton等人，2000FEBS Lett. 475 225-231)、人纤连蛋白 III 型结构域(Koide 等人，1998 J. Mol. Biol. 284 :1141_1151)、C 型凝集素样结构域或脂质运载蛋白(Skerra，2001，J. Biotechnol. 74 :257-275)。具有通 过部分或完全位于蛋白质的刚性二级结构内的氨基酸残基产生的结合特异性的支架是例 如锚蛋白重复蛋白(Binz，2003，J. Mol. Biol. 332 :489_503)、蛋白A的Z结构域(Nord等 人，1995，Protein Eng. 8 601-608)或 Y-晶体蛋白(crystalline) (Fiedler 和 Rudolph， 2001，国际专利申请WO 01/04144)。支架蛋白和肽以及其应用综述于Hey等人，2005， Trends in Biotechnol. 23 514-522 ；Binz ^A, 2005, Nature Biotechnol. 23 1257-1268 和 Holliger 等人，2005，Nature Biotechnol. 23 :11261136。
支架蛋白工程改造可被当作是将亲和功能移植至或整合入多肽构架(其折叠对 修饰具有高度耐受性)的结构构架。亲和功能根据本发明意指蛋白质结合亲合力。支架在 结构上可与赋予结合特异性的氨基酸序列分离。通常，可通过合理的或最通常地，组合蛋 白质工程技术获得适合用于开发此类人工亲和试剂的蛋白质，例如，使用本领域内已知的 技术(Skerra, 2000，J. Mol. Recog. Jul—Aug ；13 (4) 167—87 ；Binz 禾口 Pliickthun，2005，Aug ； 16(4) 459-69)针对抗原例如HB-EGF(纯化的蛋白质或在细胞表面上展示的蛋白质)在体 外展示的人工支架文库中淘选结合剂。此外，具有抗体样结合活性的支架蛋白可来源于包 含支架结构域的受体多肽，例如前述蛋白之一，所述受体多肽可移植供体多肽的结合结构 域以将供体多肽的结合特异性赋予含有支架结构域的受体多肽。所述插入的结合结构域可 以是例如抗体特别地HB-EGF抗体的一个或多个互补决定区(⑶R)。优选⑶R是⑶R3。可 通过本领域技术人员已知的各种方法(包括例如，多肽合成、编码氨基酸的核酸合成)以及 通过本领域技术人员熟知的各种形式的重组方法进行插入。H. HB-EGF抗原结合蛋白缀合物在另一个实施方案中，将本文中提供的HB-EGF抗原结合蛋白例如抗体偶联至标 记基团。这样的标记的抗原结合蛋白特别适合用于诊断应用。如本文中所使用的，术语 “标记基团”是指可检测的标志物，例如放射性标记的氨基酸或可通过经标记的抗生物素蛋 白(例如，与可通过光学法或比色法检测的荧光标志物或酶促活性结合的链霉抗生物素蛋 白)检测的生物素基部分。用于标记多肽和糖蛋白例如抗体的各种方法在本领域内是已知 的并且可被使用。合适的标记基团的实例包括但不限于下列放射性同位素或放射性核素 (例如，礼吨？^？义^？^“化’严仏焚光基团(例如，FITC、罗丹明、稀土元素磷光 体)、酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β _半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基 团、生物素基团或由第二报告分子识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在某些方面，可能期望通过各种长度的间隔 臂连接标记基团以减小潜在的空间位阻。备选地，可将本文中提供的HB-EGF抗原结合蛋白，例如抗体偶联至效应子基团。 这样的效应子修饰的抗原结合蛋白特别适合于治疗性应用。如本文中使用的，术语“效应 子基团”是指细胞毒性基团例如放射性同位素或放射性核素、毒素、治疗性基团或本领域内 已知的其他效应子基团。合适的效应子基团的实例是放射性同位素或放射性核素(例如， 3H、14C、15N、35S、9°Y、99TC、mIn、125I、mI)、卡奇霉素、多拉司他汀类似物例如auristatin和化 学治疗剂例如格尔德霉素和美登纳新衍生物，包括DMl。在某些方面，可期望通过各种长度 的间隔臂连接效应子基团以减小潜在的空间位阻。同样如本文中所描述的，本文中提供的许多高度有用的HB-EGF抗原结合蛋白，例 如抗体制剂，识别HB-EGF的EGF样结构域内的表位，其包括蛋白质的残基106-149，例如具 有下列序列PCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGY HGERCHGLSLP(SEQ ID NO: 1076)。在 一些实施方案中，被本文中提供的抗原结合蛋白识别的表皮生长因子表位包括氨基酸 序列 IHGE。因此，提供了结合和识别HB-EGF的含有IHGE的表位和/或EGF样结构域(例如SEQ ID NO 1076)的抗体制剂。抗HB-EGF抗原结合蛋白可用于检测患者样品中的HB-EGF，从而可用作本文中描 述的疾病状态的诊断剂。此外，基于它们显著抑制HB-EGF和/或EGF受体活性的能力(如 在下文的实施例中所显示的)，HB-EGF抗原结合蛋白在治疗由HB-EGF表达和/或HB-EGF 活性引起的症状和病况中具有治疗效果。在特定的实施方案中，本文中的抗原结合蛋白和 方法涉及由HB-EGF相关疾病、HER4-相关疾病或EGF受体相关疾病状态例如癌症病况引起 的症状的治疗。另外的实施方案包括使用本文中描述的抗原结合蛋白和方法治疗不期望的 血管生成、肿瘤疾病例如黑素瘤、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺肿瘤、 胃(胃部)癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、 结肠癌和胰腺癌。I.编码HB-EGF抗原结合蛋白的核酸还提供了编码本文中描述的抗原结合蛋白或其部分的核酸，包括编码抗体的一条 或两条链或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的核酸、编码重链可变区或只编码CDR的多核 苷酸、足以用作杂交探针的多核苷酸、用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的 PCR引物或测序引物、用于抑制多核苷酸的表达的反义核酸和前述的互补序列。核酸可以 是任何长度。它们的长度可以是例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、 175、200、250、300、350、400、450、500、750、1，000,1, 500,3, 000,5, 000 或更多个核苷酸，和 /或它们可包含一个或多个额外的序列，例如，调控序列和/或可以作为更大的核酸例如 载体的一部分。核酸可以是单链的或双链的并且可包含RNA和/或DNA核苷酸，以及其人 工变体(例如，肽核酸)。图15A-15V描述了抗原结合蛋白的不同轻链的核苷酸序列。图 16A-16C描述了抗原结合蛋白的不同重链的核苷酸序列。图13A-13M描述了抗原结合蛋白 的不同轻链可变区的核苷酸序列。图14A-14L描述了抗原结合蛋白的不同重链可变区的核 苷酸序列。图18A-18F描述了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同CDR区的核苷酸序列。图 19A-19G描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同CDR区的核苷酸序列。图20A-20K描述 了抗原结合蛋白的轻链可变区的不同FR区的核苷酸序列。图21A-21K描述了抗原结合蛋白的重链可变区的不同FR区的核苷酸序列。图17A描述了抗原结合蛋白的轻链恒定区的 核苷酸序列。最后，图17B描述了抗原结合蛋白的重链恒定区的核苷酸序列。可从已用HB-EGF或其免疫原性片段免疫的小鼠的B细胞分离编码某些抗原结合 蛋白或其部分(例如，全长抗体、重链或轻链可变结构域或⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3、⑶RL1、 ⑶RL2或⑶RL3)的核酸。可通过常规方法例如聚合酶链式反应(PCR)分离核酸。噬菌体展 示是可籍以制备其他抗原结合蛋白和抗体的衍生物的已知技术的另一个实例。在一个方法 中，在任何合适的重组表达系统中表达作为目的抗原结合蛋白的组件的多肽，并允许所表 达的多肽组装以形成抗原结合蛋白分子。—个方面还提供了在特定的杂交条件下与其他核酸(例如，包含图13至21中 所述的核苷酸序列的核酸)杂交的核酸。用于杂交核酸的方法在本领域内是熟知的。参 见，例如，Current Protocols in Mo lecularBiology, John Wiley&Sons, N. Y. (1989), 6. 3. 1-6. 3. 6。如本文中所定义的，中度严格杂交条件使用含有5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、 0.5% SDSU.OmM EDTA(pH 8.0)的预清洗溶液，大约50%甲酰胺、6xSSC的杂交缓冲液和 550C的杂交温度(或其他相似杂交溶液，例如含有大约50%甲酰胺的溶液和42°C的杂交温 度)，和60°C下于0. 5x SSC、0. SDS中的清洗条件。严格杂交条件在45°C下于6x SSC中 杂交，然后在68°C下于0. Ix SSC，0.2% SDS中进行一次或多次清洗。此外，本领域技术人 员可操控杂交和/或清洗条件以提高或降低杂交的严格性，以使包含彼此至少65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。影响杂交条件的选择的基本参数和用于设计合适的条件的指导方针示于例如 Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis(2001，MolecularCloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N· Y·，同上禾口 Current Protocols inMolecular Biology, 1995，Ausubel 等人，eds.，John Wiley&Sons, Inc.，sections 2. 10 和6. 3-6. 4)中，并且它们可由本领域技术人员基于例如核酸的长度和/或碱基组成容易地 确定。可通过突变将变化导入核酸，从而导致其编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物) 的氨基酸序列发生变化。可使用本领域内已知的任何技术导入突变。在一个实施方案中， 使用例如定点诱变方案改变一个或多个特定的氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例 如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论如何进行突变，都可表达突变的多 肽，并且可就期望的性质筛选突变的多肽。可将突变导入核酸而不显著改变其编码的多肽的生物学活性。例如，可产生导致 非必需氨基酸残基上的氨基酸置换的核苷酸置换。备选地，可向核酸中导入一个或多个选 择性改变核酸编码的多肽的生物学活性的突变。例如，突变可定量或定性改变生物学活性。 定量改变的实例包括增加、减少或消除活性。定性改变的实例包括改变抗体的抗原特异性。另一个方面提供了适合用作检测核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。核酸分 子可只包含编码全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码多 肽的活性部分(例如，HB-EGF结合部分)的片段。基于核酸序列的探针可用于检测核酸或相似的核酸，例如编码多肽的转录物。探 针可包含标记基团，例如放射性核素、荧光化合物、酶或酶辅因子(co-factor)。此类探针可 用于鉴定表达多肽的细胞。
另一个方面提供了包含编码多肽或其部分(例如，包含一个或多个⑶R或一个或 多个可变区结构域的片段)的核酸的载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、非附 加型(non-印isomal)哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。重组表达载体可以以 适合于核酸在宿主细胞中表达的形式包含核酸。重组表达载体包含一个或多个与待表达的 核酸序列有效连接的调控序列(其基于用于表达的宿主细胞进行选择)。调控序列包括在 多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的调控序列(例如，SV40早期基因增 强子、Rous肉瘤病毒启动子和巨细胞病毒启动子)、只在某些宿主细胞中指导核苷酸序列 的表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列，参见，Voss等人，1986 Trends Biochem. Sci. 11 :287，Maniatis等人，1987，Science 236 1237，以其全文 通过引用合并入本文)，以 及响应特定处理或条件而指导核苷酸序列的诱导型表达的调控序列(例如，哺乳动物细胞 中的金属硫蛋白启动子以及原核和真核系统中的tet-响应和/或链霉素响应启动子(参 见，同前)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于这样的因素如待转化的宿主 细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。可将表达载体导入宿主细胞，从而产生蛋白质或 肽，包括由本文中所述的核酸编码的融合蛋白或肽。另一个方面提供了已向其中导入了重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任 何原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如，CHO 细胞))。可通过常规转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞。对于哺乳动物的 稳定转染，已知，取决于所使用的表达载体和转染技术，只有小部分细胞可将外源DNA整合 入它们的基因组。为了鉴定和选择此类整合体，通常将编码选择标记(例如，赋予对抗生素 的抗性)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物例如 G418、潮霉素和甲氨蝶呤的抗性的选择标记。特别地，可通过药物选择鉴定用导入的核酸稳 定转染的细胞(例如，已整合了选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞将死亡)。J. HB-EGF抗原结合蛋白用于诊断和治疗目的的用途1.适应症(Indication)本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可用于检测或治疗许多疾病和病症，包括牵 涉过度细胞增殖、不期望的细胞迁移和/或异常的血管生成的疾病。例如，此类HB-EGF抗原 结合蛋白可抑制癌细胞中HB-EGF诱导的EGFR和/或HER4的酪氨酸磷酸化(图22-29)。这 样的抑制可中断驱动细胞增殖和迁移以及血管生成的信号转导事件的级联。此外，HB-EGF 抗原结合蛋白可干扰EGFR的反式激活。此外，此类抗原结合蛋白抑制基础HUVEC细胞增殖 (图32B)、内皮细胞管形成(图33)和体内基质胶塞测定中HB-EGF诱导的血管形成(图 36)。这些结果表明本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白在体外和体内抑制血管生成。此外， 此类抗原结合蛋白还抑制不依赖于锚定的细胞生长(图34和图35)以及小鼠中异种移植 物肿瘤的生长(图37和图38)。HB-EGF抗原结合蛋白还显著抑制MCF-7和MDA-MB231癌 细胞的迁移(参见，图27和27)。因此，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白攻击肿瘤和其 他癌性病况的发展中的几个步骤，包括控制细胞增殖的信号转导事件、血管生成和与转移 癌的扩散和发展相关的细胞迁移。这样的多方面干预对于控制和抑制癌症籍以发展的过程 大有益处。此外，可治疗处于任何进展期的癌症(例如，早期癌症、转移癌和复发性癌症)。除了 HB-EGF抗原结合蛋白在检测和治疗处于不同进展期的癌症中的用途外，此 类抗原结合蛋白还可用于检测许多不同类型的癌症。例如，HB-EGF以非常低的水平在正常乳腺和胰腺组织中表达。然而，HB-EGF在大约55%的胰腺癌细胞和大约70%的乳腺癌细 胞中以高水平表达。此外，如实施例中所描述的，在不同的癌细胞系中检测到HB-EGF表达， 这表明本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可用于检测多种癌症类型。例如，可通过所请求保护的抗原结合蛋白检测或治疗的癌症包括实体哺乳动物肿 瘤以及血液恶性肿瘤。实体哺乳动物肿瘤包括儿童中的癌症，例如生殖细胞肿瘤、软组织肉 瘤、原发性脑肿瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤和癌、特别是鳞癌(squamous carcinoma)和 上皮癌。实体哺乳动物肿瘤还可包括成人癌症，例如未知来源的肿瘤，成人中的原发性脑 癌，脑下垂体、嘴唇、口腔、鼻咽、喉、上颂窦、筛窦、唾液腺、甲状腺(包括甲状旁腺和类癌)、 食道、胃、胰腺、小肠、结肠、直肠、肛管、肝脏、胆囊、肝外胆管(extra hepati c bile duct)、 Vater壶腹(ampulla of vater)的肿瘤，类癌，胃-肠-肝系统的内分泌肿瘤，嗜铬细胞瘤 和副神经节瘤，肾上腺、肺、胸膜、纵隔、胸腺，骨及软组织的肿瘤，嘴唇、眼险、外耳、脸的其 他未指明的部分、头皮和颈、躯干、上肢和肩、下肢和臀、阴户、阴茎、阴囊的皮肤肿瘤，乳腺 肿瘤，阴户、阴道、子宫颈、子宫体、卵巢、输卵管的妇科肿瘤，妊娠和滋养层肿瘤，阴茎、前列 腺、睾丸、肾、肾盂和输尿管、膀胱、尿道，眼睑、结膜、葡萄膜、视网膜、眼眶和泪腺的眼科肿 瘤。血液恶性肿瘤包括儿童的肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤、急性和慢性白血病(AML、ANLL、 ALL,CML,MDS)、何杰金氏病、B细胞、T细胞、大细胞、滤泡、淋巴细胞和皮肤来源的惰性/低 级、侵袭性/高级淋巴瘤、浆细胞肿瘤和与AIDS相关的癌症。此外，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白还可用于检测或治疗癌性病况或肿瘤 性病症，其包括例如腺瘤、管状绒毛状腺瘤、绒毛状腺瘤、血管纤维瘤、非典型增殖性粘液性 肿瘤(mucinous neoplasia)、勃勒纳肿瘤(Brenner tumor)、类癌、海绵状血管瘤、富细胞型 平滑肌瘤、绒毛膜血管瘤、先天性中胚层肾瘤、粘液性囊腺瘤、浆液性囊腺瘤、皮样瘤、硬纤 维瘤、纤维腺瘤、纤维瘤、纤维卵泡膜细胞瘤、滤泡腺瘤、神经节瘤、巨细胞瘤、颗粒细胞瘤、 粒层细胞瘤、血管瘤、导管内乳头状瘤、胰岛细胞瘤、平滑肌瘤、脂肪瘤、黄体瘤、脑膜瘤、胎 块(mole)、髓脂瘤、粘液瘤、神经纤维瘤、痣、骨软骨瘤、嗜铬细胞瘤、息肉、神经鞘瘤、浆液性 囊腺瘤、卵巢甲状腺肿、滑膜软骨瘤病(synovial chrondromatosis)、良性胸腺瘤。可用本文中描述的HB-EGF蛋白进行检测或治疗的癌症类型的另外的实例可见于 例如美国癌症学会(www. cancer, org)或 Wilson 等人(1991)Harrison' s Principles of Internal Medicine,第 12 版，McGraw-Hill, Inc0因此，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可用于治疗和/或预防癌症、癌性病况、 肿瘤生长、癌细胞的转移、血管生成过程和/或肿瘤性病症。因此，此类抗原结合蛋白提供 了治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括对受试者施用有效量的组合物，所述组 合物包含本文中描述的人和/或单克隆HB-EGF抗原结合蛋白制剂中的一种或其组合。高比例的实体瘤疾病通常表征为由生长因子(S卩，VEGF)和其他因子(S卩，HB-EGF) 介导的肿瘤血管生成、肿瘤组织中(异常)血管的过度生长。通过HB-EGF特异性抗原结合 蛋白靶向HB-EGF可阻止新血管的形成，从而限制现有肿瘤的扩展和新肿瘤的发生(即，转 移)。HB-EGF除了作为促有丝分裂和促侵入(pro-invasive)配体外，几个研究已证实 其可作为癌症中血管生成过程的重要调节剂。如实施例中所举例说明的，显示了 HB-EGF在 体内血管生成的调控中的功能。因此，本文中描述的抗原结合蛋白可用于治疗与血管生成相关或由其引起的疾病，例如癌性或非癌性疾病。例如本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可干扰平滑肌细胞(SMC)与内皮细胞之 间的通讯(血管生成例如肿瘤血管生成中血管的发育和功能性中的基本过程)。 此外，此类抗原结合蛋白可以至少部分地抑制HB-EGF诱导的VEGF的表达和从SMC 的释放(所述VEGF随后用作强效的内皮丝裂原)。类似地，VEGF增加内皮细胞中的HB-EGF 产量，这从而构成了由这两个重要配体组成的促血管生成反馈回路(该回路可通过施用本 文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白来中断)。最近，除了 VEGF外，还鉴定了另外的至关重要 的促血管生成组分例如促血管生成素(angiopoetin) 1和2(Ang_l&2)和它们的受体TIE-2 以及有效的平滑肌细胞GPCR刺激物血管紧张素II (ATII)。有趣地，HB-EGF是内皮细胞中 ATII诱导的EGFR反式激活以及VEGF和Ang_2的下游上调的至关重要的介体。在体内，ATII 以HB-EGF依赖性方式诱导血管生成并且增强VEGF的血管生成活性。这些发现支持，平行 于VEGF，HB-EGF能够通过Ang2激活另外的血管生成途径。因此，可通过施用有效量的本文 中描述的HB-EGF抗原结合蛋白来治疗哺乳动物中的异常血管生成或癌症。除了其作为癌症中血管生成过程的重要调节剂的作用外，具有激活的血管生成途 径和需要侧枝血流的各种非癌适应症是HB-EGF抗原结合蛋白治疗的推定疾病。慢性炎性疾病(例如，肾炎、C0PD、炎性肠病)，包括免疫系统介导的“炎性反 应”(例如，移植物抗宿主病、移植排斥、再狭窄)、代谢疾病(例如，糖尿病)或慢性缺氧性 病况，通常以过度血管形成和/或新血管形成(例如，慢性溃疡)为特征。所述HB-EGF抗 原结合蛋白可以至少部分地抑制血管生成的必需过程一由HB-EGF(由炎性细胞产生或被 缺氧上调)诱导的内皮细胞对血管平滑肌细胞的招募一从而代表用于过度/病理性血管 形成的介入治疗的吸引人的途径。在肥胖受试者中，来源于积累的脂肪的增加的水平的HB-EGF(其促成肥胖症中血 管疾病的更高发病率)可用本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白来中和。使用HB-EGF抗原 结合蛋白的治疗性干预从而可在中断脂肪血管轴(adipovascular axis)中直接用作抗脂 肪细胞因子。在成纤维细胞中，HB-EGF通过激活表皮生长因子受体而显著下调弹性蛋白mRNA。 该效应在肺纤维化的发展中提供了干预的途径。此外，HB-EGF是参与炎性疾病的发病机制的角质形成细胞的丝裂原。此外，HB-EGF 的表达和与EGFR的共定位可在银屑病的早期发病机制中起重要作用，这在皮肤炎性疾病 的治疗中和特别地在银屑病的早期治疗中(使用请求保护的抗原结合蛋白)打开了潜在的 治疗窗口。使用所述抗原结合蛋白靶向HB-EGF还可导致用于患增生性玻璃体视网膜病变 (PVR)的患者的治疗选择，因为PVR的发展伴随PVR视网膜中HB-EGF的显著上调。此外，纤 维增生组织中的HB-EGF表达和其对神经胶质细胞增殖、趋化性和VEGF分泌的刺激作用表 明HB-EGF可能是PVR期间介导神经胶质细胞应答的因子。这些原理还可用于其他血管生 成依赖性眼病例如年龄相关和非年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、rubeotic青光 目艮、间质性角膜炎、早产儿视网膜病变和角膜移植失败(corneal graft failure)。由于GPCR的血管收缩和生长促进能力，已将GPCR例如肾上腺受体和血管紧张素 受体与高血压的发病机制联系在一起。因为HB-EGF是此类途径的至关重要的介体，因此中和性抗原结合蛋白适用于高血压病症例如心肌肥厚和充血性心力衰竭、肾衰竭或中风中的 靶向干预。 在具有内膜增厚的冠状动脉的粥样硬化斑块中检测到HB-EGF(平滑肌细胞(SMC) 的强效丝裂原和化学引诱物)，其由SMC和巨噬细胞产生。进一步显示残粒脂蛋白(Remnant lipoprotein)(其为动脉粥样硬化的已知致病因子)通过HB-EGF介导的EGFR反式激活诱 导SMC增殖。因此，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白代表通过阻断至关重要的平滑肌细 胞功能靶向动脉粥样硬化的具有选择性且有效的试剂。此外，以平滑肌细胞的增殖为特征 的经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention)后的再狭窄可能也通 过HB-EGF功能的特异性中和而被阻止。因此，本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可用于治疗多种疾病，包括非恶性增殖 性疾病例如异常血管生成、平滑肌瘤(子宫纤维化)、良性平滑肌细胞肿瘤、肾小球硬化(系 膜细胞的过度增殖)、平滑肌细胞增生、动脉粥样硬化(血管平滑肌细胞的过度增殖)、红 变、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性失明、黄斑变性、风湿性关节炎、心 肌肥厚、银屑病等。在另外的方面，此类HB-EGF抗原结合蛋白可用于治疗与扰乱的例如，病理性增强 的生长因子受体激活相关的或与其相伴的病症。在另一个方面，该增强的生长因子受体激活可与G蛋白和/或G蛋白偶联受体的 活性的病理性增加相关或由其引起。应当指出，与扰乱的例如病理性增强的生长因子受体 激活相关或与其相伴的以及可能与G蛋白和/或G蛋白偶联受体的活性的病理性增加相关 或由其引起的病症可以与特征在于增强的生长因子受体激活活性的其他病症区分开，因为 发生了经由G蛋白偶联受体的生长因子受体的反式激活。2.诊断方法本文中描述的HB-EGF抗原结合分子可用于检测测试样品中的癌细胞的方法中， 其包括将测试样品与抗原结合分子接触和检测抗体是否结合样品中的表达pr oHB-EGF或 HB-EGF分子的细胞。结合发生的程度可通过使用对照样品来估量。测试和对照样品可以例 如是血液、血清、腹水、胸腔积液、脑脊髓液、组织、细胞、尿液、淋巴、唾液、乳汁或其他样品。 这样的对照样品可以是非癌性的体液或组织或细胞类型的样品。在一些实施方案中，对照 样品是获自与测试样品相同的受试者的非癌性样品。“受试者”或“患者”是指需要治疗或 检测病况、病症或疾病的哺乳动物，优选人。抗体与测试样品的组分的结合可通过检测结合至或可选择性结合至本文中描述 的抗原结合蛋白的报告分子、显象剂或标记来检测。此类HB-EGF抗原结合蛋白可具有一个 或多个报告分子、标记或显象剂。报告分子定义为可使用测定法检测的任何部分。已被缀 合至抗体的报告分子的非限定性实例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化 学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体例如生物素。报告分子可提供 可检测的信号。例如，可检测的信号可以是荧光、磷光、化学发光、电化学发光、电化学、颜色 变化或酶的信号。本文中提供的抗HB-EGF抗体可用作捕获抗体，其用于生长因子的基于 ELISA的检测或组织样品的免疫组织化学分析，如图39中所示。在一些实施方案中，将报告分子共价连接至本文中描述的抗原结合蛋白。在其他 实施方案中，可将报告分子选择性地结合至本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白。报告分子与所述抗原结合蛋白的此类选择性结合可通过具有共价连接的标记的二抗来进行，其中二 抗选择性结合本文中描述的HB-EGB抗原结合蛋白。3.治疗方法药物制剂、施用的途径癌症的治疗或治疗癌症意欲包括至少一种通常与疾病相关的症状的缓和或减轻。 治疗还包括一种以上的相关症状的缓和或减轻。治疗可治愈癌症，例如，其可基本上消除癌 细胞和/或停止癌性肿瘤的生长。备选地，治疗可减缓癌症的进展。 可使用本领域技术人员可获得的方法来评估抗多种癌症或癌细胞的抗癌活性。抗 癌活性，例如，可通过测定本文中描述的抗原结合蛋白的制剂的LDltltl或ED5tl来测定，所述抗 原结合蛋白的制剂阻止癌症的生长。在一个实施方案中，抗癌活性是当使用标准剂量应答 方法测量时杀死50%或100%的癌细胞的抗体的量。本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白可单独施用，或与抗体、化学治疗药物或放射 疗法联合施用。根据本发明的药物组合物可以作为单一疗法施用或与另一种药物组合物 (优选包含另一种抗肿瘤剂，特别是顺钼或阿瓦斯丁)联合施用。例如，可将所述HB-EGF抗 原结合蛋白与抗肿瘤抗体(例如，嵌合、人源化或人抗肿瘤抗体)，与特异性结合VEGF以进 一步抑制肿瘤血管生成的抗体或与特异性结合受体酪氨酸激酶例如HER2、HER4或EGFR并 从而进一步抑制肿瘤细胞增殖的抗体共施用。在图38中，对于测试的两个治疗性抗HB-EGF 抗体，可显示抗EGFR抗体和抗HB-EGF抗体的协同作用。此外，可将本文中描述的HB-EGF 抗原结合蛋白与其他抗肿瘤剂共施用。可与本文中提供的抗体共施用的抗肿瘤剂的特定 实例包括，例如，吉非替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、培美曲塞、贝伐单抗(bevacisumab)、西妥 昔单抗、伊马替尼、曲妥珠单抗、阿仑珠单抗、利妥昔单抗、厄洛替尼、硼替佐米等。可抑制癌 症或肿瘤细胞增殖的任何其他抗癌剂或药物也可用于本文描述和请求保护的组合物中。例 如，请求保护的组合物可包括化学治疗剂例如卡培他滨、柔红霉素、道诺霉素、放线菌素D、 多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、氯 乙亚硝脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素、泼尼 松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴胼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、 苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿 糖胞苷(CA)、5_氮杂胞苷、羟基脲、脱氧考福霉素、4-hydroxyperoxycyclophosphor-amide 、5_氟尿嘧啶(5-FU)、5_氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、泰素、长春新碱、 长春碱、依托泊苷、三甲曲沙、替尼泊苷、顺钼、阿瓦斯丁和己烯雌酚(DES)。通常参见，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, H 15 片反，1987， pp. 1206-1228, Berkow ^A, eds. , Rahway, N. J0当与所述HB-EGF抗原结合蛋白一起使用时，此类化学治疗剂可分别地 (例如，5-FU和抗体)、相继地(例如，5-FU和抗体，一段时间后，MTX和抗体)或与一种或 多种其他此类化学治疗剂联合(例如，5-FU、MTX和抗体，或5-FU、放射治疗和抗体)使用。还提供了评估使用具有本文中公开的氨基酸序列的抗体治疗癌症的治疗有效剂 量的方法，该方法包括测定HB-EGF抗原结合蛋白制剂在体内或体外的LDiqq或ED5Q。这样的 方法允许计算抑制癌细胞生长或转移大约10 %至100 %，或大约20 %至100 %，或大约25 % 至100 %，或大约30 %至100 %，或大约40 %至100 %，或大约50 %至100 %的每体积所需的 抗原结合蛋白的近似量。在一些实施方案中，观察到低于100%的癌细胞生长或转移的抑 制。例如，癌细胞生长和/或转移被抑制大约90%、80%、70%、60%或50%。可以例如通过对本领域可获得的SCID或nu/nu小鼠(其中已导入了肿瘤细胞)施用抗原结合蛋白制 剂和/或通过标准方法，使用培养的癌细胞(参见，图38B)来测定百分比抑制。在实施例 中描述了几种方法。还包括的是本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白的无菌药物制剂，其可用作用于 疾病包括例如癌症和/或异常血管生成的疗法。这样的制剂可抑制HB-EGF与其受体例如 EGFR或与HER4的结合，从而有效地治疗其中例如血清、细胞或组织HB-EGF异常升高或其中 其受体例如，EGFR或HER4，异常活跃的病理状况。如本文中所举例说明的，HB-EGF抗原结 合蛋白具有足够的亲和力来有效地中和HB-EGF以及调节与HB-EGF受体相关的信号转导事 件。本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白优选是人源化抗原结合蛋白。此类人源化抗 原结合蛋白的施用减小了负面作用的可能性。此外，此类抗原结合蛋白例如在体内是稳定 的，因为它们被识别为正常人产物，从而使免 疫系统应答的风险降至最低。此外，此类抗原 结合蛋白不易被蛋白水解破坏，从而提高了它们的循环半衰期。因此，本文中描述的HB-EGF 制剂具有优良的体内半衰期，从而使得人中的施用相对不频繁。这样的延长的作用持续时 间可允许进行较不频繁的和更方便的给药方案(通过可选的胃肠外途径例如皮下或肌内 注射)。可以例如通过在抗体的冷冻干燥和重构之前或之后通过无菌滤膜过滤来产生无 菌制剂。通常将本文中描述的抗原结合蛋白以冻干的形式贮存或贮存在溶液中。通常将治 疗性抗体组合物置于具有无菌存取口的容器(例如，静脉内注射溶液袋或具有允许抽取制 剂的适配器(adapter)例如可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)内。可按照已知的方法施用HB-EGF抗原结合蛋白，例如，通过静脉内、皮下、真皮内、 腹膜内、大脑内、肌内、眼内、动脉内、鞘内、膀胱内、海绵体内途径进行的注射或输注、吸入、 损伤内途径或通过持续释放系统(如下文中指出的)。在一些实施方案中，通过输注或通过 团注连续施用本文中描述的抗原结合蛋白。可将本文中描述的HB-EGF抗原结合蛋白与可药用载体一起制备于混合物中。可 以优选以液体或粉末气雾剂(冷冻干燥的)的形式静脉内或经鼻或肺施用该治疗性组合 物。还可如所期望地胃肠外或皮下施用组合物。当全身性施用时，治疗性组合物应当是无 菌的、无热源的并且在胃肠外可接受的溶液(对此要考虑的是生理上可接受的PH值、等渗 性和稳定性)中。这些条件对于本领域技术人员来说是已知的。简而言之，通过将具有期 望的纯度的化合物与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备用于贮存或施用的 本文中描述的化合物的剂量制剂。这样的材料在使用的剂量和浓度上对受者是无毒的，并 且其包括缓冲剂例如TRIS HC1、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、和其他有机酸盐；抗氧化剂例如 抗坏血酸；低分子量(少于大约10个残基)肽例如聚精氨酸、蛋白质例如血清白蛋白、明胶 或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidinone)；氨基酸例如 甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括纤维素或其衍生物、 葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA ；糖醇例如甘露醇或山梨醇；抗衡离子例如钠离子 和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。可按照 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (第 20 版， Lippincott Williams&ffilkens Publishers (2003))中所描述的常规药学实践配制用于注射的无菌组合物。例如，可期望将活性化合物溶解或悬浮于媒介物例如水或天然产生的植 物油如芝麻油、花生油或棉籽油或合成的脂肪媒介物如油酸乙酯等。可按照可接受的药学 实践包含缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。持续释放制剂的合适的实例包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质， 该基质以成形的制品、膜或微胶囊的形式存在。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶 (例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(如Langer等人，1981，J. Biomed Mater. Res. 15 167-277 和 Langer，1982，Chem. Tech. 12 :98_105 所描述的)，或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美 国专利3，773，919、EP 58，481)、L_谷氨酸与γ乙基_L_谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人， 1983，Biopolymers 22 :547_556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等人，同上)、可 降解的乳 酸_乙醇酸共聚物例如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林 组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133，988)。虽然聚合物例如乙烯_醋酸乙烯酯和乳酸_乙醇酸使分子能够释放100多天，但 某些水凝胶释放蛋白质较短的时间。当封装的蛋白质在体内长时间保持时，它们可变性或 聚集(由于在37°C下暴露于潮湿)，从而导致生物学活性的丧失和免疫原性的可能变化。取 决于牵涉的机制，设计用于蛋白质稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是经由二硫互 换的分子间S-S键形成，则可通过修饰巯基残基，从酸性溶液冷冻干燥，控制含湿量，使用 合适的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。持续释放组合物还包括悬浮于合适的制剂中的能够在悬浮液中保持结晶的抗原 结合蛋白的晶体制剂。此类制剂，当皮下或腹膜内注射时，可产生持续释放效果。其他组 合物还包括脂质体捕获的抗体。通过本身已知的方法制备含有此类抗体的脂质体美国专 利 DE3, 218，121 ；Epstein 等人，1985，Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 :3688_3692 ；Hwang 等 人，1980，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4030-4034 ；EP 52，322 ；EP 36，676 ；EP 88，046 ；EP 143，949 ；142，641 ；日本专利申请 83-118008 ；美国专利 4，485，045 和 4，544，545 ；以及 EP 102，324。用于给定的患者的抗原结合蛋白制剂的剂量可由主治医师通过考虑已知修饰药 物的作用的各种因素(包括疾病的严重度和类型、体重、性别、饮食、施用的时间和途径、其 他用药和其他相关临床因素)来确定。治疗有效剂量可通过体外或体内方法来确定。待治疗性使用的本文中描述的抗原结合蛋白的有效量将取决于例如治疗目的、施 用途径和患者的状况。因此，优选，治疗学家滴定剂量和根据需要改变施用途径以获得最佳 治疗效果。典型的日剂量可在大约0.001mg/kg至多达100mg/kg或更大的范围内，这取决 于上述因素。通常，临床医师将施用治疗性抗原结合蛋白直至达到获得期望的效果的剂量。 该治疗的进程可通过本文中描述的常规测定容易地监控。应理解，根据本文中的组合物和方法的治疗实体(therapeuticentity)可与合 适的载体、赋形剂和其他试剂(其掺入制剂中以提供提高的转移、递送、耐受性等)一起 施用。此类制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴 离子的)的载体(例如Lipofectin )、DNA缀合物、无水吸收糊剂(anhydrousabsorption paste)、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(emulsionscarbowax)(各种分子量的聚乙二 醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。上述混合物的任一种可适用于包括本文中 描述的HB-EGF抗原结合蛋白的治疗和疗法，只要制剂中的活性成分不被制剂灭活并且制剂对于施用途径在生理上是相容的和可耐受的。也参见BaldrickP. 〃 Pharmaceutical excipient development :the need forpreclinical guidance, " 2000, Regul. Toxicol. Pharmacol. 32 210~218 ；Wang, " Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals, " 2000, Int. J. Pharm. 203 1-60 ；Charman WN " Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emergingconcepts, " J. Pharm. Sci. 89 :967_978 ;Powell 等人，1998, " Compendium of excipients for parenteral formulations, “ PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52 :238_311 以及其中关于与药物化学家熟 知的制剂、赋形剂和载体相关的另外的信息的引文。下列实施例，包括进行的实验和获得的结果仅仅用于举例说明目的，而不被解释 为对本文中的教导的限定。
实施例 K.实施例1 免疫原的产生从pcDNA3-VSV-HB-EGF表达构建体(Prenzel等人，1999，同上)扩增含有EGF样 结构域(氨基酸1-149)的HB-EGF，然后将其克隆入在羧基末端提供符合读框的6His标 签的表达载体(pcDNA 3. lmyc-his, InVitrogen)。在HEK293细胞中表达该具有C末端 myc (HIS) 6标签的HB-EGF免疫原，在Ni-NTA琼脂糖凝胶(Amersham Pharmacia)和肝素琼 脂糖凝胶(Sigma)上通过两步纯化法对其进行纯化。免疫原的HB-EGF部分具有下列序列(SEQ ID N0:1077)。1MKLLPSVVLK LFLAAVLSAL VTGESLERLR RGLAAGTSNP41DPPTVSTDQL LPLGGGRDRK VRDLQEADLD LLRVTLSSKP81QALATPNKEE HGKRKKKGKG LGKKRDPCLR KYKDFCIHGE121CKYVKELRAP SCICHPGYHG ERCHGLSLPB.实施例2 Aenomouse小鼠的免疫和观察到的滴度通过连续地免疫XenoMoUSe 小鼠(XenoMouse品系XMG2(产生人IgG2)禾口 XM3C-1 (产生人 IgG4)，Abgenix, Inc. Fremont, CA)产生抗 HB-EGF 的单克隆抗体。1.免疫经足垫进行所有注射以免疫XenoMouse动物。各注射的总体积为50 μ 1/小鼠， 25 μ 1/足垫。对于组群1 (10只XMG2小鼠)和组群2 (10只XM3C-1)，初次免疫为每只小鼠使用与 TITERMAX GOLD (Sigma，Oakville，ON)以 1 1 (ν/ν)混合的 IOyg HB-EGF 蛋白。用与 无热原的 D-PBS 中的 100 μ g 铝胶(alumgel) (Sigma, Oakville, ON)以 1 1 (ν/ν)混合的 IOyg HB-EGF蛋白进行随后的4次增强。第5次增强由与TITERMAX GOLD 以1 1 (ν/ ν)混合的10 μ gHB-EGF蛋白组成。第6和第7次注射由与100 μ g铝胶以1 1 (ν/ν)混合 的10 μ g HB-EGF蛋白组成。最终的加强用无热原的DPBS中的10 μ gHB-EGF蛋白(不含佐 剂)来进行。对于该方案，在第0、4、8、14、18、21、25和28天免疫乂6110]\101186小鼠，在第32 天进行融合。在第4次增强后16天，第6次增强后23天通过眼眶后放血(Retro-Orbital Bleed)法进行两次放血。2.通过滴定选择用于收获的动物
通过ELISA测定来自免疫的XenoMouse小鼠的血清中抗HB-EGF抗体的滴度。简 而言之，在4°C下在抗原包被缓冲液(0. IM碳酸盐缓冲液，pH 9. 6NaHC03(MW 84)8. 4g/L)中
HB-EGF 蛋白(2 μ g/ml)过夜包被至 Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96孔板(Corning，Acton，MA)上。第二天，使用Biotek洗板机用清洗缓冲液(lx PBS中的 0. 05% Tween 20)清洗板一次。然后用200 μ 1/孔的封闭缓冲液(lx PBS中的0. 5% BSA, 0. 1% Tween 20,0. 01%的硫柳汞)封闭板，并且在室温下温育1小时。在1小时的封闭后， 使用Biotek洗板机用清洗缓冲液清洗板一次。在0. 5% BSA/PBS缓冲液中以1 3的稀释 度(从1 100的初始稀释度开始)以一式两份滴定来自HB-EGF蛋白免疫的XenoMouse小 鼠的或首次用于实验的XenoMouse小鼠动物的血清。最后的孔留作空白对照。将这些板在 室温下温育2小时，然后使用Biotek洗板机用清洗缓冲液清洗板3次。以1 2000的终浓 度将山羊抗人IgG Fc-特异性辣根过氧化物酶(CALTAG，产品编号，H10507)缀合的抗体加 入封闭缓冲液中，并在室温下温育1小时。使用Biotek洗板机用清洗缓冲液清洗板3次。在 清洗后，通过加入TMB显色底物(BioFx BSTP-0100-01)并进行10-20分钟或直至阴性对照 孔开始显色来对板进行显色。然后通过加入终止液(650nM用于TMB (BioFxBSTP-0100-01) 的终止试剂，用IOOml水/瓶进行重构)来终止ELISA。根据650nm处的光密度来测定各 XenoMouse动物的具体滴度，并将其示于下面的表1中。滴度值是具有2倍于背景的OD读 数的血清的最大稀释度的倒数。因此，数值越高，对HB-EGF的体液免疫应答越大。表 1
组 1，fp, XMG2, 10 只小鼠,_ 组 2，fp, XM3C-1, 10 只小鼠，_
4次注射后I 6次注射后4次注射后1 6次注射后
小鼠ID 对HB-EGF的反应性小鼠ID 对HB-EGF的M性_
P4721 3，800__59，000P2664 35_ 2’ 300_
P4722 6,500__68, 000P2666 20__750 _
P4723 2，500__43’ 000P2669 30__850_
P4724 2,400__22，000P26610 75__1,900_
P4725 2,400__71,000P2892 60550_
P4726 45058，000P2894 60__1,400_
P4727 1,600__20, 000P2895 95_ 2, 600_
P4728 2，700__61，000P2896 45__2,500_
P4729 80061,000P3672 50__2，000_
P4721Q 5,700__78, 000P3678 60__1,800
_NC__<100<100NC<100__<100_
PCI <100<100PC35丨 20C.实施例3 杂交瘤的产生和结合剂的初步筛选杀死免疫的小鼠，收集淋巴节，将来自各组群的淋巴节混合在一起。通过在DMEM 中研磨以从组织释放细胞来分离淋巴细胞，将细胞悬浮于DMEM中。计数细胞，将0. 9mlDMEM(每1亿个淋巴细胞)加入至细胞沉淀以轻轻但完全地重悬浮细胞。使用100 μ 1⑶90+ 磁珠(每1亿个细胞)，通过在4°C下将细胞与磁珠一起温育15分钟来标记细胞。将包含 多至IO8个阳性细胞(或多至2xl09个总细胞)的磁性标记的细胞悬浮液装载到LS+柱上， 然后用DMEM洗涤柱子。收集总流出物作为CD90-阴性级分(预期大多数此类细胞为B细 胞)。通过将来自上述方法的清洗的富集的B细胞与购自ATCC，cat. #CRL 1580的没有 分泌作用的骨髓瘤 P3X63Ag 8. 653 细胞(Kearney 等人，1979，J. Immunol. 123 1548-1550) 以1 1的比例混合来进行融合。以800g轻轻地离心细胞混合物。在完全除去上清液后， 用2-4ml的链霉蛋白酶溶液(CalBiochem，cat. #53702 ；0. 5mg/ml于PBS中)处理细胞沉淀 不超过2分钟。然后，加入3-5ml FBS来终止酶活性，使用电细胞融合液ECFS (0. 3M蔗糖， Sigma, Cat#S7903,0. ImM 醋酸镁，Sigma, Cat#M2545,0. ImM 醋酸钙，Sigma, Cat#C4705)将 悬浮液调整至40ml的总体积。在离心后除去上清液，将细胞重悬浮于40ml ECFS中。重复 该清洗步骤，再次将细胞重悬浮于ECFS至2xl06个细胞/ml的浓度。使用融合发生器(fusion generator) (ECM2001 型，Genetronic，Inc.，San Diego, CA)进行电细胞融合。使用的融合杯(fusionchamber)大小为2. 0ml，使用下列仪器设置 Alignment条件电压50V，时间50秒；膜破裂于电压3000V，时间30微秒；融合后保 持时间3秒。在电细胞融合后，在无菌条件下小心地从融合杯中取出细胞悬浮液，将其转移至 装有相同体积的杂交瘤培养基(DMEM(JRHBiosciences)、15% FBS(Hyclone)、补充有L-谷 氨酰胺、青霉素/链霉素、OPI (草酰乙酸盐、丙酮酸盐、牛胰岛素)(全都来自Sigma)和 IL-6 (Boehringer Mannheim))的无菌试管内。在37°C下将细胞温育15至30分钟，然后 以400g离心5分钟。轻轻地将细胞重悬浮于小体积的杂交瘤选择培养基(补充有0. 5x HA (Sigma, cat. #A9666)的杂交瘤培养基)，然后基于5xl06个B细胞(总共)/96孔板和 200 μ L/孔的终涂板，用更多的杂交瘤选择培养基适当的调整体积。将细胞轻轻地混合，然 后转移入96孔板中，让其生长。在第7或10天，除去一半的培养基，用杂交瘤选择培养基 再饲养细胞。在14天的培养后，通过ELISA就HB-EGF特异性单克隆抗体筛选来自组群#1和 组群#2的杂交瘤上清液。在初步筛选中，用50 μ 1/孔的包被缓冲液(0. IM碳酸盐缓冲 液，ρΗ 9.6，NaHCO3 8. 4g/L)中的 HB-EGF 蛋白(2 μ g/ml)包被 ELISA 板(Fi sher，产品编 号12-565-136)，然后在4°C下温育过夜。温育后，用清洗缓冲液(0. 05% Tween 20于PBS 中)清洗板一次。加入200 μ 1/孔的封闭缓冲液(lx PBS中的0. 5% BSA, 0. 1% Tween 20， 0.01%硫柳汞)，然后将板在室温下温育1小时。温育后，用清洗缓冲液清洗板1次。加入 杂交瘤上清液以及阳性和阴性对照的等分(50 μ 1/孔)，然后将板在室温下温育2小时。整 个过程中使用的阳性对照是相关HB-EGF蛋白免疫的XenoMouse小鼠的血清，阴性对照是 KLH免疫的相关品系的XenoMouse小鼠的血清。在温育后，用清洗缓冲液清洗板3次。加入 100 μ 1/孔的检测抗体山羊抗hulgGFc-HRP (Caltag Inc.，产品编号H10507，使用的浓度为 1 2000的稀释度)，然后将板在室温下温育1小时。温育后，用清洗缓冲液清洗板3次， 并加入100 μ 1/孔的TMB (BioFX Lab.产品编号TMSK-0100-01)。然后让板显色大约10分 钟(直至阴性对照孔刚开始显色)。然后加入50 μ 1/孔的终止液(TMB终止液(BioFX Lab.
69产品编号STPR-0100-01)，在ELISA板读数器上在450nm的波长处读取板。除去来自阳性杂交瘤细胞培养孔(基于初次筛选)的旧培养上清液，将HB-EGF阳 性杂交瘤细胞重悬浮于新鲜杂交瘤培养基中，然后转移至24孔板。培养2天后，这些上清液 准备用于二次确认筛选。在二次确认筛选中，通过ELISA(如上所述)，用两组检测抗体山 羊抗hulgGFc-HRP (Caltag Inc.，产品编号H10507，使用的浓度为1 2000的稀释度)(用 于人Y链检测)和山羊抗hlgK -HRP(SouthernBiotechnology，产品编号2060-05)(用于 人κ轻链检测)筛选第一次筛选中的阳性，以证明抗体制剂是HB-EGF特异性的并且在其 组成上是完全人的。两组ELISA方法与上文中描述的相同，除了分别使用两种不同的检测 抗体外。与二次确认筛选平行地，进行相反ELISA筛选(counter ELISAscreen)以排除与 myc (his) 6标签反应的抗体。ELISA方法与上文中描述的相同，除了用无关myc (his) 6标签 蛋白(ML-myc(his)6蛋白)包被而非用HB-EGF myc (his) 6蛋白包被外。在二次确认和相反ELISA筛选后，从组群1和2鉴定了 49个完全人IgG/ κ HB-EGF 特异性单克隆抗体。D.实施例4 功能测定中抗体的放大(Scale-Up)和检测本实施例描述了产生对于HB-EGF具有亲和力的抗HB-EGF抗体的杂交瘤细胞系的鉴定。1.结合至表达HB-EGF的细胞系的杂交瘤产生的抗HB-EGF抗体的FACS检测通过FACS分析确定细胞系上的HB-EGF表达。为了进行该分析，用PBS中的IOmM EDTA收获2xl05个选择的表达HB-EGF的细胞，将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS，3% FCS, 0.4%叠氮化物)中，然后接种至96孔圆底板上。在以IOOOrpm离心3分钟以除去上清液 后，将细胞重悬浮于杂交瘤来源的抗HB-EGF抗体稀释液(100 μ 1/孔)中，并在4°C下温 育45分钟。用FACS缓冲液清洗细胞2次，并用以1 100稀释于FACS缓冲液中的二抗 (ΙΟΟμΙ/孔)驴抗人PE(Jackson)重悬浮细胞。在4°C下将细胞悬浮液于黑暗中温育30 分钟，用FACS缓冲液清洗2次，然后进行分析(FACS，Beckman Coulter)。这些测定的结果提供于下面的表2和3中，其提供了各FACS测定的荧光平均值。 如表3和4中所举例说明的，在不表达HB-EGF的CHO对照细胞中基本上检测不到HB-EGF 的表达。然而，当HB-EGF在CHO细胞中重组过表达时，几种单克隆抗体制剂展示了显著的 对表达HB-EGF的细胞的结合。对MDA-MB231、SCC-9和C0S-7细胞的结合在一定程度上是 可变的，但结合一种表达HB-EGF的细胞类型的抗体制剂通常结合另一种细胞类型。如表2 中所示，几种抗体制剂，包括例如U2-24、U2-5、U2-19、U2-21、U2-15和U2-42抗体制剂展示 了对表达HB-EGF的CHO细胞的强结合。类似地，抗体制剂U2-39、U2-26、U2-44、U2-45和 U2-48也展示了良好的对表达HB-EGF的CHO细胞的结合。表2抗HB-EGF抗体上清液的FACS分析(组群1)CHO对照细胞对表达HB-EGF的 CHO细胞内源表达HB-EGF的细胞系抗体CHO-K1CHO-HB-EGFMDA-MB231SCC-9COS-7KLH0.20.30.40.20.4U2-180.31543.11.21.6U2-680.22381.70.61.1U2-240.236020.66.7U2-140.31322.80.81.1U2-10.2641.80.73.1U2-320.2761.71.21.8U2-400.21372.11.31.1U2-50.33716.91.72.2U2-80.31483.71.41.4U2-130.21360.4(2.6)0.50.8U2-170.21701.60.61-4U2-190.43475.51.86.1U2-380.3303.90.91.4U2-210.23443.93.42.1U2-150.237030.60.9U2-160.21971.50.40.9U2-300.32733,513.4U2440.35.60.80.25.2U2-421.22773.30.56.7U2-360.91121.60.34.9U2-220.32211J0.24.9U2-560.2380.50.21.8Neg0.20.20.3Pos (山羊 aHB)0.2803表3抗HB-EGF抗体上清液的FACS分析(组群2)
7权利要求
结合HB EGF的分离的抗原结合蛋白，其包含A)一个或多个选自下列的轻链互补决定区(CDRL)(i)选自SEQ ID NO189 217的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO218 233的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO234 274的CDRL3；和(iv)包含一个或多个不超过4个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRL；或B)一个或多个选自下列的重链互补决定区(CDRH)(i)选自SEQ ID NO275 299的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO300 331的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO332 372的CDRH 3；和(iv)包含一个或多个不超过4个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或(iii)的CDRH。
2.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，其包含一个或多个A)的轻链CDRL，和一个或多 个B)的重链CDRH。
3.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，其包含至少2个A)的CDRL和至少2个B)的 CDRH0
4.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，其包含所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2 和 CDRL3。
5.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，其中 所述A)的CDRL选自⑴选自 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl ；(ii)选自SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；(iii)选自SEQ ID NO :234_274 的 CDRL 3 ；禾口(iv)包含一个或多个不超过2个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或 (iii)的 CDRL ；所述B)的CDRH选自(i)选自SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ；(ii)选自SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ；(iii)选自SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ；和(iv)包含一个或多个不超过2个氨基酸的氨基酸置换、缺失或插入的(i)、(ii)或 (iii)的 CDRH ；或C)一个或多个A)的轻链⑶RL和一个或多个B)的重链⑶RH。
6.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含A)选自下列的CDRL⑴选自 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl ；(ii)选自SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；禾口(iii)选自SEQ ID NO :234_274 的 CDRL3 ；B)选自下列的CDRH:(i)选自SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ；(ii)选自SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2 ；禾口(iii)选自SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3 ； 或C) 一个或多个A)的轻链⑶RL和一个或多个B)的重链⑶RH。
7.权利要求6的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含A)SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl，SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2，和 SEQ ID NO :234_274 的CDRL3，和/或B)SEQ ID NO :275-299 的 CDRH1，SEQ ID NO :300_331 的 CDRH2，和 SEQ ID NO :332_372 的 CDRH3。
8.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含与选自SEQID NO 94-141的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的轻链可变区(VJ和/或与选自SEQ ID NO 142-186的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的重链可变区(Vh)。
9.权利要求8的分离的抗原结合蛋白，其中八与选自SEQID NO :94-141的氨基酸序 列具有至少90%的序列同一性，和/或Vh与选自SEQ IDNO 142-186的氨基酸序列具有至 少90%的序列同一性。
10.权利要求8的分离的抗原结合蛋白，其中Vl选自SEQID NO :94_141，和/或Vh选 自 SEQ ID NO 142-186。
11.特异性识别至少HB-EGF的含有IHGE的表位和/或EGF样结构域的分离的抗原结 合蛋白ο
12.与权利要求1的抗原结合蛋白竞争结合的分离的抗原结合蛋白。
13.结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含A)一个或多个选自下列的轻链CDR (CDRL)⑴与SEQ ID NO 189-217具有至少80%的序列同一性的CDRLl ；(ii)与SEQID NO :218_233具有至少80%的序列同一性的CDRL2 ；禾口(iii)与SEQID NO :234_274具有至少80%的序列同一性的CDRL3 ；B)一个或多个选自下列的重链⑶R (⑶RH)⑴与SEQ ID NO 275-299具有至少80%的序列同一性的CDRHl ；(ii)与SEQID NO 300-331具有至少80%的序列同一性的CDRH2 ；禾口(iii)与SEQID NO :332_372具有至少80%的序列同一性的CDRH 3 ；或C)一个或多个A)的轻链⑶RL和一个或多个B)的重链⑶RH。
14.权利要求13的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含A)一个或多个选自下列的⑶RL ⑴与SEQ ID NO 189-217具有至少90%的序列同一性的CDRLl ；(ii)与SEQID NO :218_233具有至少90%的序列同一性的CDRL2 ；禾口(iii)与SEQID NO :234_274具有至少90%的序列同一性的CDRL3 ；B)一个或多个选自下列的⑶RH ⑴与SEQ ID NO 275-299具有至少90%的序列同一性的CDRHl ； (ii)与SEQ ID NO 300-331具有至少90%的序列同一性的CDRH2 ；禾口(iii)与SEQ ID NO :332_372具有至少90%的序列同一性的CDRH3 ；或 C) 一个或多个A)的轻链⑶RL和一个或多个B)的重链⑶RH。
15.结合HB-EGF的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含 A)选自下列的轻链互补决定区(⑶RL) ⑴选自 SEQ ID NO 234-274 的 CDRL 3 ；( )在氨基酸序列上与(i)的⑶RL3相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置换的⑶RL3 ；和(iii)选自下列的⑶RL3氨基酸序列X1QX2X3X4X5PX6X7(SEQ ID NO: 1046)，其中X1选自I和M，X2选自A、G和S，X3选自I和T，X4选自H和Q、X5选自F、L和W，7X6 选自 C、I、H、L 和 T，X7选自S和T ；QQX1X2X3X4X5IT(SEQ ID N0:1047)，其中X1选自I和S，X2选自F和Y，X3选自F、I、S和Y，X4 选自 A、S*T，X5选自P和S ；X1X2X3X4X5X6X7X8T(SEQ ID NO: 1048)，其中X1选自L和Q，X2选自K、N和Q，X3选自A、H、S和Y，X4选自H、N和Y，X5 选自 N、S*T，X6 选自 A、F、I、Τ、V 和 Y，X7选自P和无氨基酸，X8选自F、L和P ；QX1X2DX3LPX4X5(SEQ ID Ν0:1049)，其中X1选自H和Q，X2选自C和Y，X3 选自 D、I、N、S 和 Y，X4选自F、I和L，X5选自A、S和T ；QQX1X2X3X4PX5X6X7(SEQ ID NO: 1050)，其中 X1选自H和Y，X2选自G和N， X3选自N和S， X4选自S和W， X5选自P和无氨基酸， X6选自R和W， X7选自S和T ；和X1QYX2X3X4X5X6X7F(SEQ ID NO: 1051)，其中X1选自H和Q，X2选自F和Y，X3选自G、I和S，X4选自F、I和T，X5选自M、P、S和T，X6选自F、L、R和W，X7选自S和T ；和/或B)选自下列的重链互补决定区(⑶RH)⑴选自 SEQ ID NO 332-372 的 CDRH3,( )在氨基酸序列上与(i)的⑶RH3相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置换的⑶RH3 ；和(ii i)选自下列的CDRH3氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11DX12 (SEQ ID NO: 1065)，其中X1选自E和S，X2选自D、G和无氨基酸，X3选自D、N和无氨基酸，X4选自G和无氨基酸，X5选自G和无氨基酸，X6选自W、Y和无氨基酸，X7选自I、N和Y，X8选自A和Y，X9选自G、V和Y，X10 it 自 A、F 禾口 G，X11 选自 F、L*M，X12选自V禾口 Y ；QX1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13X14DX15(SEQ ID NO: 1066)，其中X1选自G和无氨基酸，X2选自K、L和Y，X3选自A、G和S，X4选自S、V和Y，X5选自A和G，X6选自G和无氨基酸， X7选自T和无氨基酸， X8选自S和无氨基酸， X9选自Y和无氨基酸， X10 选 S W 和 Y， X11选自G、s和Y， X12选自F和Y， Xw选自G和无氨基酸， X14选自M和无氨基酸， X15选自V禾口 Y ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14(SEQ ID NO: 1067)，其中X1选自D、G、L、S和无氨基酸，X2选自G、H、W、Y和无氨基酸，X3选自A、F、W、Y和无氨基酸，X4选自D、G、Q、T和无氨基酸，X5选自G、I、Q、S和无氨基酸，X6选自A、D、N、Q、S和无氨基酸，X7选自G、Y和无氨基酸，X8选自D、Y和无氨基酸，X9选自Y和无氨基酸，X1。选自 A、E、N 和 Y，X11 选自 G、P、T、V 和 Y，X12选自F禾口 I，X13选自D和Q，X14 选自 C、H、V 禾口 Y;X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14X15X16X17DX18(SEQ ID NO 1068)，其中X1选自E、D和无氨基酸，X2选自G、R和无氨基酸，X3选自I、V、Y和无氨基酸，X4 选自 A、G、L 禾口 N，X5选自A、G、V和W，X6 选自 Α、Ν、《Τ，X7选自G、N、P和无氨基酸，X8选自G、T和无氨基酸，X9选自A和无氨基酸，Xltl选自D、E和无氨基酸，X11选自S、Y和无氨基酸，X12选自G、Y和无氨基酸，Xw选自N、Y和无氨基酸，X14选自Y和无氨基酸，X15选自D、Y和无氨基酸， X16选自A、G和无氨基酸， X17选自F禾口 M， X18选自I、V和Y;X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22X23 (SEC) ID NO 1069)，其中X1 选自 A、D、G、SiPT，X2选自A、Ε、G、L、N、R、Y和无氨基酸，X3选自A、G、L、N、R、T、Y和无氨基酸，X4选自D、G、R、S、V、Y和无氨基酸，X5选自A、G、I、S、V、Y和无氨基酸，X6选自F、G、L、R、V和无氨基酸，X7选自L、T、Y和无氨基酸，X8选自Y和无氨基酸，X9选自Y和无氨基酸，Xltl选自D和无氨基酸，X11选自S和无氨基酸，X12选自S和无氨基酸，X13选自G和无氨基酸，X14选自D、L、M、S、Y和无氨基酸，X15选自H、I、P、V、W和无氨基酸，X16选自F、G、L、R、S、Y和无氨基酸，X17选自D、F、V、W、Y和无氨基酸，X18 选自 C、F、L、P、S 和 Y，X19 选自 D、F、G 和 Y，乂2。选自六、(、6、卩、1 、￥和 Y，X21选自F、L、M、S和无氨基酸，X22选自A、D和无氨基酸，X23选自I、L、V、Y和无氨基酸；X1YSSGffX2X3YGX4X5DX6(SEQ ID NO: 1070)，其中X1选自M和V，X2选自S和无氨基酸，X3选自F和无氨基酸，X4选自V和无氨基酸，X5选自F和M，X6选自V和Y;和RX1X2X3PFX4Y(SEQ ID N0:1071)，其中 X1 选自 G、H、L、N 禾口 R， X2选自E、T和W， X3 选自 L、N、TiPV，X4选自D禾口 E。
16.权利要求15的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白还包含 A)选自下列的CDRL ⑴选自 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl ；( )在氨基酸序列上与(i)的CDRLl相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置换的⑶RLl ；(iii)选自下列的⑶RLl氨基酸序列 X1SSQSLX2X3SDGX4TYLX5(SEQ ID NO:IO35)，其中 X1选自K和R，X2选自L和V， X3选自H和Y， X4选自K和N， X5选自N、S和Y ；RASQX11SX2YLN(SEQ ID N0:1036)，其中 X1 选自 R、SiPT， X2选自R和S ；RASQX1IX2X3X4LX5(SEQ ID N0:1037)，其中X1 选自 D、G、SiPT，X2选自A、R禾口 S，X3 选自 H、I、N、R、S 禾口 T，X4选自D、W和Y，X5选自A、G和N ；QASQDIX1X2X3LN(SEQ ID N0:1038)，其中 X1选自S和T， X2选自D和N， X3选自S和Y ；RASQX1VX2X3X4X5LA(SEQ ID NO: 1039)，其中X1选自S和T，X2选自I和S，X3选自R和S，X4选自S、N和无氨基酸，X5选自Y和无氨基酸；和KSSQX1X2LX3X4SNNKNYLX5(SEQ ID NO:IO4O)，其中X1选自N和S，X2选自I和V，X3选自D和Y，X4选自N、R和S，X5选自A和V ；(iv)选自SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 ；8(ν)在氨基酸序列上与(iv)的CDRL2相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置换的⑶RL2 ；和(vi)选自下列的CDRL2氨基酸序列 X1X2SNX3X4S(SEQ ID N0:1041)，其中 X1选自E和K， X2选自I和V， X3选自R和W， X4选自D和F ；X1X2SX3LQS(SEQ ID N0:1042)，其中 X1选自A和T， X2选自A、E禾口 V， X3选自S和T ； X1ASX2LQS(SEQ ID NO: 1043)，其中 X1选自A和V， X2选自S和T ；DASX1LET(SEQ ID NO : 1044)，其中 X1选自I和N ；GASSRAT(SEQ ID NO 223)；禾口WASX1RES(SEQ ID N0:1045)，其中X1选自A和T ；或B)选自下列的CDRH :(i)选自 SEQ ID NO 275-299 的 CDRHl ；( )在氨基酸序列上与(i)的CDRHl相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置换的⑶RHl ；(iii)选自下列的⑶RHl氨基酸序列 GYTX1TX2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 1052)，其中 X1选自F和L， X2选自E、G禾口 S， X3选自H、L禾口 Y， X4选自G、S和Y， X5选自I和M， X6选自H和S ；GYX1FTSYffIG(SEQ ID NO: 1053)，其中 X1选自R和S ；GFTFX1SX2X3MH(SEQ ID N0:1054)，其中 X1选自R和S， X2选自H和Y， X3选自D和G ；GFX1FSX2YX3MX4(SEQ ID NO: 1055)，其中x1选自p和τ， x2选自a、r禾口 s， x3选自a和s， x4选自n和s ；gx1sx2sx3x4x5x6x7wx8(seq id no: 1056)，其中x1选自d和g， x2选自f、i和v，x3选自r、s和无氨基酸，X4选自G、Y和无氨基酸，x5选自d、g、s和无氨基酸，x6选自a、s和y，x7选自a和y，x8选自n和s ；gfslsnarmgvs(seq id no 279)；禾口 gfslxjggvgvg(seq id no: 1057)，其中 x1选自s和n ；(iv)选自 seq id no :300-331 的 cdrh2 ；(ν)在氨基酸序列上与(iv)的CDRH2相异在于不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失 或置换的⑶RH2 ；和(vi)选自下列的CDRH2氨基酸序列x1x2x3x4x5x6gx7tx8x9x10qkx11x12 (seq id n0:1058)，其中x1选自s和w，x2选自f和i，x3选自d、n禾口 s，x4选自a和p，x5选自e、n和s，x6选自d、n和s，x7选自e、g禾口 n，x8选自i和n，x9选自c、h和y，x10选自a和t，X11 选自 FfPL,x12选自d禾口 g ；Iiypx1Dsdx2Ryspsfqg(seq id no:io59)，其中 x1选自d和g， x2选自a、i和t ；x1ix2x3dgsx4x5x6yx7dsvx8g(seq id no: 1060)，其中 x1选自f和v， x2选自s和w，X3选自D、S禾口 Y， X4 选自 I、N*T， X5选自K和Q， X6选自N、R和Y， X7选自A、T禾口 V， X8选自K和R ；X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG(SEQ ID N0:1061)，其中X1选自A、H禾口 Y，X2选自G、R禾口 S，X3选自G和S，X4选自G、R和S，X5选自S、T和 Y，X6选自I和T ；X1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11YX12X13SX14KS(SEQ ID NO: 1062)，其中X1选自E、R禾口 Y，X2选自I和T，X3选自H、N禾口 Y，X4 选自 C、H、S、T 和 Y，X5选自S和R，X6选自G和S，X7 选自 G、K、SiPT，X8选自T和W，X9选自N和Y，Xltl选自N和无氨基酸，X11选自D和无氨基酸，X12选自A和N，X13选自P禾口 V，X14选自L禾口 V ；X1Ifsndeksystslks(seq id no:io63)，其中 X1选自H和LI ；和LIYffNX1X2KRYSPSLX3S(SEQ ID N0:1064)，其中 X1选自D和V， X2选自D和E， X3选自K禾口 R。
17.权利要求16的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含所述第一氨基酸 序列和所述第二氨基酸序列。
18.权利要求17的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一氨基酸序列共价连接至所述第二氨基酸序列。
19.权利要求17的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一氨基酸序列包含所述SEQIDNO 234-274 的 CDRL 3,SEQ ID NO :218_233 的 CDRL2 和 SEQ ID NO 189-217 的 CDRLl，以及 所述第二氨基酸序列包含所述SEQ ID NO 332-372的CDRH3，SEQ ID NO 300-331的CDRH2 和 SEQ IDNO 275-299 的 CDRHl。
20.权利要求1-19的任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克 隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体，或其抗体片 段。
21.权利要求20的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体片段是Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。
22.权利要求20的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人抗体。
23.权利要求20的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体。
24.权利要求1-19的任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是IgGl、 IgG2、IgG3 或 IgG4 类型。
25.权利要求24的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是IgG2或IgG4类型。
26.权利要求1-19的任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白偶联至标 记基团。
27.权利要求26的分离的抗原结合蛋白，其中所述标记基团是放射性同位素、放射性 核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽基团。
28.权利要求1-19的任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白偶联至效应子基团。
29.权利要求28的分离的抗原结合蛋白，其中所述效应子基团是放射性同位素、放射 性核素、毒素、治疗性基团或化学治疗基团。
30.权利要求29的分离的抗原结合蛋白，其中所述治疗性基团或化学治疗基团是卡奇 霉素、auristatin-PE、格尔德霉素、美登纳新或其衍生物。
31.与权利要求1-19的一项的抗原结合蛋白竞争对人HB-EGF的结合的分离的抗原结 合蛋白ο
32.权利要求31的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体、多克 隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体，或其抗体片段。
33.权利要求32的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体片段是Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2片段、Fv片段、双价抗体或单链抗体分子。
34.权利要求32的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人抗体。
35.权利要求32的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体。
36.权利要求31的任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是IgGI、 IgG2、IgG3 或 IgG4 类型。
37.权利要求36的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是IgG2或IgG4类型。
38.权利要求31的任一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白偶联至标记 基团。
39.权利要求38的分离的抗原结合蛋白，其中所述标记基团是放射性同位素、放射性 核素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素基团或预先确定的多肽基团。
40.权利要求31的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白偶联至效应子基团。
41.权利要求40的分离的抗原结合蛋白，其中所述效应子基团是放射性同位素、放射 性核素、毒素、治疗性基团或化学治疗基团。
42.权利要求41的分离的抗原结合蛋白，其中所述治疗性基团或化学治疗基团是卡奇 霉素、auristatin-PE、格尔德霉素、美登纳新或其衍生物。
43.权利要求1-19的一项的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白至少部分地 减少HB-EGF介导的信号转导。
44.编码权利要求1-19的任一项的抗原结合蛋白的核酸分子。
45.权利要求44的核酸分子，其中所述核酸分子与控制序列有效连接。
46.包含权利要求44的核酸分子的载体。
47.包含权利要求45的核酸分子的载体。
48.包含权利要求45的核酸分子的宿主细胞。
49.包含权利要求46或47的一项的载体的宿主细胞。
50.制备权利要求1-19的任一项的抗原结合蛋白的方法，其包括从分泌所述抗原结合 蛋白的宿主细胞制备所述抗原结合蛋白的步骤。
51.包含至少一种权利要求1-19的任一项的抗原结合蛋白以及可药用的载体、稀释剂 和/或佐剂的药物组合物。
52.权利要求51的药物组合物，其还包含另外的活性剂。
53.权利要求52的药物组合物，其中所述至少一种另外的活性剂是抗肿瘤剂。
54.权利要求53的药物组合物，其中所述抗肿瘤剂是抗肿瘤抗体。
55.权利要求54的药物组合物，其中所述抗肿瘤抗体是抗受体酪氨酸激酶的抗体。
56.权利要求53的药物组合物，其中所述抗肿瘤抗体抗EGFR。
57.权利要求51的药物组合物，其用于过度增殖性疾病的诊断、预防或治疗。
58.权利要求57的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病与HB-EGF表达相关。
59.权利要求57的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病与被扰乱的例如病理性增强 的生长因子受体激活相关或与其相伴。
60.权利要求59的药物组合物，其中所述病理性增强的生长因子受体激活与G蛋白和 /或G蛋白偶联受体的活性的病理性增加相关或由其引起。
61.权利要求51的药物组合物，其用于癌症的诊断、预防或治疗。
62.权利要求61的药物组合物，其中所述癌症选自乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、前列腺癌、 卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、膀胱癌、 神经胶质瘤、黑素瘤、癌，特别是上皮或鳞癌、其他表达或过表达HB-EGF的癌症以及肿瘤转 移的形成。
63.至少一种权利要求1-19的抗原结合蛋白用于制造药物组合物的用途，所述药物组 合物用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病。
64.权利要求63的用途，其中所述过度增殖性疾病是如权利要求58中所定义的过度增殖性疾病。
65.用于诊断与HB-EGF的表达相关的病况的方法，其包括将样品与权利要求1-19的抗 原结合蛋白接触，和确定HB-EGF在所述样品中的存在。
66.权利要求65的方法，其中所述病况是如权利要求58中所定义的过度增殖性疾病。
67.用于预防或治疗患者中的与HB-EGF的表达相关的病况的方法，其包括对有此需要 的患者施用有效量的至少一种权利要求1-19的抗原结合蛋白。
68.权利要求62的方法，其中所述病况是如权利要求57-60的任一项中所定义的过度 增殖性疾病。
69.权利要求57的方法，其中所述患者是哺乳动物患者。
70.包含权利要求1-19的抗原结合蛋白、权利要求44或45的核酸分子或权利要求46 或47的载体的试剂盒。
71.权利要求70的试剂盒，其包含至少一种另外的活性剂。
72.权利要求71的试剂盒，其中所述另外的活性剂是抗肿瘤剂。
73.权利要求53的药物组合物，其中所述抗肿瘤剂是顺钼或阿瓦斯丁。
74.权利要求51-62的任一项的药物组合物，其将作为单一疗法施用或与优选包含抗 肿瘤剂例如顺钼或阿瓦斯丁的另外的药物组合物联合施用。
全文摘要
本文中提供了抗原结合蛋白，例如人和/或单克隆抗体，其具有对肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的亲和力并且中和该生长因子的生物学功能。
文档编号A61K33/24GK101970485SQ200880117400
公开日2011年2月9日 申请日期2008年9月26日 优先权日2007年9月26日
发明者E·伯吉斯, E·茨维克-瓦拉施, M·罗特, N·普伦策尔, O·富尔德, T·海特曼 申请人:U3制药有限公司;安进公司