专利名称：Fc结合性蛋白质及其制造方法
技术领域：
本发明涉及对免疫球蛋白具有亲和性的Fe结合性蛋白质。更具体地，本发明涉及能够作为例如亲和色谱用免疫球蛋白亲和性配体使用的、与野生型相比显示高热稳定性等特性的Fe结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、和使用该蛋白质作为构成要素的、吸附例如免疫球蛋白的吸附材料。
背景技术：
来自免疫球蛋白G(以下也称为IgG)的免疫信号通过抗原捕捉后的IgG与存在于免疫细胞表面的Fe受体结合而被传导。Fe受体是与IgG的Fe区域结合的一组蛋白质分子，各个分子种类具有属于免疫球蛋白超家族的Fe识别结构域，识别单一种类、或属于同一亚型的免疫球蛋白。由此确定各个免疫应答中哪种辅助细胞被动员(非专利文献I)。Fe受体还可以再分成亚型，作为针对IgG的受体，已经报告存在Fe yR1、Fc YRIIa、Fc YRIIb、Fe Y RIII (非专利文献I)。这其中，FcyRI与IgG的结合亲和性高，其平衡解离常数(Kd)为10_8M以下(非专利文献2)。FcyRI大体分为信号肽区域、细胞外区域、跨细胞膜区域、和细胞质内区域，与IgG的结合发生在IgG的Fe区域和Fe Y RI的细胞外区域，然后两者结合的信号传导至细胞质内。FcyRI由与IgG的结合直接相关的α链、以及Υ链这2种亚基构成，Y链通过位于跨细胞膜区域与细胞外区域的交界处的半胱氨酸介导的共价键形成同型二聚体(非专利文献I)。FcyRI的α链的氨基酸序列和基因碱基序列已由非专利文献3阐明，其后报告了通过基因重组技术以大肠杆菌(专利文献I)或动物细胞作为宿主细胞进行表达的例子(非专利文献4)。如前述，构成Fe Y RI的细胞外区域的蛋白质(以下也称为Fe结合性蛋白质)基于高度的亲和性具有针对人抗体`的良好的识别功能。在该高度的亲和性的基础上，对于Fe结合性蛋白质，已经报告了作为诊断试剂、抗体医药品的研究用工具或IgG等抗体医药品的制造步骤中利用的亲和色谱的配体加以应用的方法(专利文献I)。Fe结合性蛋白质是以在人体内发挥功能的蛋白质作为起源的蛋白质，与细菌的细胞表层等生物体外存在的蛋白质相比，因热、极端PH变化等而引起蛋白质变性的倾向强。另一方面，在将Fe结合性蛋白质作为用于IgG制备的亲和色谱用配体使用的情况下，在使用固定化有该配体的凝胶对通过色谱操作吸附的IgG进行洗脱时，该配体有时会暴露于柠檬酸缓冲液等低PH的溶液，因而该Fe结合性蛋白质需要对酸的稳定性。此外，在对该凝胶进行洗涤或再生的情况下，该配体还有时会暴露于氢氧化钠溶液等高PH溶液，因而该Fe结合性蛋白质又需要对碱的稳定性。而且，考虑到该凝胶的长期保存，该Fe结合性蛋白质还需要对热的稳定性。为了对蛋白质这样的生物体物质进行工业利用，有些情况下也需要通过对该生物体物质具有的天然结构进行改良，来重新制作在一定条件下稳定的物质。对于酶蛋白质等，已经报告了许多向其编码多核苷酸中人工导入突变，进行筛选后，取得获得了需要的性状的突变体的例子。然而，对于作为受体蛋白质的Fe结合性蛋白质，没有对热、酸或碱的稳定性提高的改良体的报告，迄今为止没有工业利用的例子。现有技术文献专利文献专利文献1:特表2002-531086号公报非专利文献非专利文献1:J. V. Ravetch 等，Annu. Rev.1mmunol. , 9,457,1991非专利文献2 :Toshiyuki Takai, Jpn. J. Clin. Tmmunol. , 28, 318, 2005非专利文献3 J.M. Alien 等，Science，243，378，1989非专利文献4 :A. Paetz 等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，338,1811, 2005非专利文献5:夕 > 八夕質乃構造i機能，J 力卟 寸4工> 7 4 >夕一于'>彐于卟社，9，2005非专利文献6 :Molecular Cloning, Cold Spring Horbor Laboratory, 256,199
发明内容
发明所要解决的问题本发明提供与野生型的人Fe受体Fe YRI相比，对热、酸和/或碱的稳定性提高了的Fe结合性蛋白质及其 制造方法。此外，本发明还提供使用该蛋白质作为亲和色谱用配体，特异性地分离含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质的方法。解决问题的方法本发明人对上述课题进行了深入研究，结果发现确定Fe结合性蛋白质中涉及结构稳定性的氨基酸残基，将该氨基酸残基取代成其他氨基酸残基而得到的突变体具有对热、酸和/或碱的良好稳定性，且作为亲和色谱用配体是有用的，从而完成了本发明。SP，本申请包含以下的(A)IK)记载的方案⑷一种Fe结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中的第16位至第289位的氨基酸，且该第16位至第289位的氨基酸序列中发生了以下( Γ(168)中的至少I个氨基酸取代(I)SEQ ID NO 1的第20位的苏氨酸被取代成脯氨酸(2) SEQ ID NO 1的第25位的苏氨酸被取代成赖氨酸(3) SEQ ID NO 1的第38位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(4) SEQ ID NO 1的第46位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(5) SEQ ID NO 1的第62位的丙氨酸被取代成缬氨酸(6) SEQ ID NO 1的第63位的苏氨酸被取代成异亮氨酸(7) SEQ ID NO 1的第69位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸或苏氨酸(8) SEQ ID NO 1的第71位的精氨酸被取代成组氨酸(9) SEQ ID NO 1的第77位的缬氨酸被取代成丙氨酸或谷氨酸(IO)SEQ ID NO 1的第78位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(11) SEQ ID NO 1的第94位的天冬氨酸被取代成谷氨酸(12) SEQ ID NO 1的第100位的异亮氨酸被取代成缬氨酸
(13) SEQ ID NO 1的第110位的丝氨酸被取代成天冬酰胺(14) SEQ ID NO 1的第114位的苯丙氨酸被取代成亮氨酸(15) SEQ ID NO 1的第125位的组氨酸被取代成精氨酸(16) SEQ ID NO 1的第131位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(17) SEQ ID NO 1的第149位的色氨酸被取代成亮氨酸(18) SEQ ID NO 1的第156位的亮氨酸被取代成脯氨酸(19) SEQ ID NO 1的第160位的异亮氨酸被取代成甲硫氨酸(20) SEQ ID NO 1的第163位的天冬酰胺被取代成丝氨酸(21) SEQ ID NO 1的第195位的天冬酰胺被取代成苏氨酸(22) SEQ ID NO 1的第199位的苏氨酸被取代成丝氨酸(23) SEQ ID NO 1的第206位的天冬酰胺被取代成赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸(24) SEQ ID NO 1的第207位的亮氨酸被取代成脯氨酸(25) SEQ ID NO 1的第218位的亮氨酸被取代成缬氨酸(26) SEQ ID NO 1的第240位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸
(27) SEQ ID NO 1的第248位的亮氨酸被取代成丝氨酸(28) SEQ ID NO 1的第283位的亮氨酸被取代成组氨酸(29) SEQ ID NO 1的第285位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(30) SEQ ID NO 1的第17位的缬氨酸被取代成甘氨酸或谷氨酸(31) SEQ ID NO 1的第19位的苏氨酸被取代成异亮氨酸(32) SEQ ID NO 1的第20位的苏氨酸被取代成异亮氨酸(33) SEQ ID NO 1的第25位的苏氨酸被取代成甲硫氨酸或精氨酸(34) SEQ ID NO 1的第27位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或赖氨酸(35) SEQ ID NO 1的第35位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸、甲硫氨酸或精氨酸(36) SEQ ID NO 1的第36位的谷氨酸被取代成甘氨酸(37) SEQ ID NO 1的第41位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(38) SEQ ID NO 1的第42位的组氨酸被取代成亮氨酸(39) SEQ ID NO 1的第44位的谷氨酸被取代成天冬氨酸(40) SEQ ID NO 1的第45位的缬氨酸被取代成丙氨酸(41) SEQ ID NO 1的第46位的亮氨酸被取代成丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或色氨酸(42) SEQ ID NO 1的第47位的组氨酸被取代成谷氨酰胺、亮氨酸或天冬酰胺(43) SEQ ID NO 1的第49位的脯氨酸被取代成丝氨酸或丙氨酸(44) SEQ ID NO 1的第50位的甘氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(45) SEQ ID NO 1的第51位的丝氨酸被取代成丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸或
缬氨酸(46) SEQ ID NO 1的第52位的丝氨酸被取代成甘氨酸(47) SEQ ID NO 1的第53位的丝氨酸被取代成亮氨酸、苏氨酸或脯氨酸(48) SEQ ID NO 1的第55位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(49) SEQ ID NO 1的第57位的苯丙氨酸被取代成酪氨酸
(50) SEQID NO :1的第58位的亮氨酸被取代成精氨酸(51) SEQID NO 1的第60位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(52) SEQID NO 1的第61位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(53) SEQID NO 1的第62位的丙氨酸被取代成谷氨酸(54) SEQID NO 1的第63位的苏氨酸被取代成亮氨酸、苯丙氨酸(55) SEQID NO 1的第64位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸(56) SEQID NO 1的第65位的苏氨酸被取代成丙氨酸或缬氨酸(57) SEQID NO 1的第66位的丝氨酸被取代成苏氨酸(58) SEQID NO 1的第67位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(59) SEQID NO 1的第69位的丝氨酸被取代成丙氨酸(60) SEQID NO 1的第70位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸(61) SEQID NO 1的第71位的精氨酸被取代成酪氨酸 (62) SEQID NO 1的第73位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(63) SEQID NO 1的第74位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸(64) SEQID NO 1的第76位的丝氨酸被取代成天冬酰胺(65) SEQID NO 1的第77位的缬氨酸被取代成天冬氨酸或赖氨酸(66) SEQID NO 1的第78位的天冬酰胺被取代成丝氨酸或甘氨酸(67) SEQID NO 1的第80位的丝氨酸被取代成丙氨酸(68) SEQID NO 1的第84位的精氨酸被取代成丝氨酸(69) SEQID NO 1的第88位的甘氨酸被取代成丝氨酸(70) SEQID NO 1的第89位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺或脯氨酸(71) SEQID NO 1的第90位的丝氨酸被取代成甘氨酸(72) SEQID NO 1的第92位的精氨酸被取代成半胱氨酸或亮氨酸(73) SEQID NO 1的第96位的异亮氨酸被取代成缬氨酸或赖氨酸(74) SEQID NO 1的第97位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸或赖氨酸(75) SEQID NO 1的第101位的组氨酸被取代成亮氨酸(76) SEQID NO 1的第102位的精氨酸被取代成丝氨酸或亮氨酸(77) SEQID NO 1的第103位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或丝氨酸(78) SEQID NO 1的第111位的丝氨酸被取代成丙氨酸(79) SEQID NO :1的第114位的苯丙氨酸被取代成丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸(80) SEQID NO 1的第115位的苏氨酸被取代成异亮氨酸或苯丙氨酸(81) SEQID NO 1的第118位的谷氨酸被取代成天冬氨酸(82) SEQID NO 1的第121位的丙氨酸被取代成苏氨酸或缬氨酸(83) SEQID NO 1的第128位的赖氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸(84) SEQID NO 1的第129位的天冬氨酸被取代成甘氨酸(85) SEQID NO 1的第131位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(86) SEQID NO 1的第133位的酪氨酸被取代成组氨酸或精氨酸(87) SEQID NO 1的第134位的天冬酰胺被取代成丝氨酸
(88) SEQ ID NO 1的第137位的酪氨酸被取代成苯丙氨酸(89) SEQ ID NO 1的第138位的酪氨酸被取代成组氨酸(90) SEQ ID NO 1的第139位的精氨酸被取代成组氨酸(91) SEQ ID NO 1的第140位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(92) SEQ ID NO 1的第141位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或缬氨酸(93) SEQ ID NO 1的第142位的赖氨酸被取代成谷氨酸或精氨酸(94) SEQ ID NO 1的第144位的苯丙氨酸被取代成异亮氨酸(95) SEQ ID NO 1的第147位的苯丙氨酸被取代成丝氨酸(96) SEQ ID NO 1的第148位的组氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(97) SEQ ID NO 1的第149位的色氨酸被取代成精氨酸(98) SEQ ID NO 1的第151位的丝氨酸被取代成苏氨酸(99) SEQ ID NO 1的第152位的天冬酰胺被取代成苏氨酸、异亮氨酸或脯氨酸(IOO)SEQ ID NO 1的第154位的苏氨酸被取代成丝氨酸(IOl)SEQ ID NO 1的第156位的亮氨酸被取代成组氨酸(102) SEQ ID NO 1的第157位的赖氨酸被取代成精氨酸
(103) SEQ ID NO 1的第159位的天冬酰胺被取代成苏氨酸或天冬氨酸(104) SEQ ID NO 1的第160位的异亮氨酸被取代成苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸(105) SEQ ID NO 1的第161位的丝氨酸被取代成苏氨酸(106) SEQ ID NO 1的第165位的苏氨酸被取代成甲硫氨酸(107) SEQ ID NO 1的第171位的甲硫氨酸被取代成苏氨酸(108) SEQ ID NO 1的第173位的赖氨酸被取代成精氨酸(109) SEQ ID NO 1的第174位的组氨酸被取代成谷氨酰胺(IlO)SEQ ID NO 1的第177位的苏氨酸被取代成丝氨酸(Ill)SEQ ID NO 1的第181位的异亮氨酸被取代成苏氨酸(112) SEQ ID NO :1的第182位的丝氨酸被取代成苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸或谷氨酸(113) SEQ ID NO 1的第184位的苏氨酸被取代成丝氨酸(114) SEQ ID NO 1的第190位的脯氨酸被取代成丝氨酸(115) SEQ ID NO 1的第193位的缬氨酸被取代成亮氨酸(116) SEQ ID NO 1的第195位的天冬酰胺被取代成丙氨酸(117) SEQ ID NO 1的第196位的丙氨酸被取代成丝氨酸(118) SEQ ID NO 1的第198位的缬氨酸被取代成甘氨酸或甲硫氨酸(119) SEQ ID NO 1的第199位的苏氨酸被取代成丙氨酸(120) SEQ ID NO 1的第200位的丝氨酸被取代成甘氨酸或精氨酸(121) SEQ ID NO 1的第202位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(122) SEQ ID NO 1的第203位的亮氨酸被取代成组氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸(123) SEQ ID NO 1的第204位的谷氨酸被取代成缬氨酸(124) SEQ ID NO 1的第207位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺、组氨酸或精氨酸
(125) SEQ ID NO :1的第209位的苏氨酸被取代成丙氨酸(126) SEQ ID NO 1的第211位的丝氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸(127) SEQ ID NO :1的第213位的谷氨酸被取代成缬氨酸或异亮氨酸(128) SEQ ID NO :1的第215位的赖氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(129) SEQ ID NO :1的第217位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(130) SEQ ID NO 1的第218位的亮氨酸被取代成异亮氨酸、甲硫氨酸或赖氨酸(131) SEQ ID NO 1的第219位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或精氨酸(132) SEQ ID NO 1的第223位的亮氨酸被取代成精氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸(133) SEQ ID NO 1的第224位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(134) SEQ ID NO 1的第225位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(135) SEQ ID NO 1的第227位的苯丙氨酸被取代成异亮氨酸(136) SEQ ID NO 1的第230位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸(137) SEQ ID NO 1的第231位的甲硫氨酸被取代成赖氨酸或精氨酸(138) SEQ ID NO 1的第233位的丝氨酸被取代成甘氨酸或天冬酰胺(139) SEQ ID NO 1的第234位的赖氨酸被取代成谷氨酸(140)SEQ ID NO 1的第240位的天冬酰胺被取代成甘氨酸(141) SEQ ID NO 1的第244位的谷氨酸被取代成缬氨酸(142) SEQ ID NO 1的第245位的酪氨酸被取代成组氨酸或谷氨酸(143) SEQ ID NO 1的第246位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或赖氨酸(144) SEQ ID NO 1的第248位的亮氨酸被取代成异亮氨酸(145) SEQ ID NO 1的第249位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(146) SEQ ID NO 1的第250位的丙氨酸被取代成缬氨酸(147) SEQ ID NO 1的第251位的精氨酸被取代成丝氨酸(148) SEQ ID NO 1的第252位的精氨酸被取代成组氨酸(149) SEQ ID NO 1的第253位的谷氨酸被取代成甘氨酸(150) SEQ ID NO 1的第257位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(151) SEQ ID NO 1的第261位的谷氨酸被取代成缬氨酸或丙氨酸(152) SEQ ID NO 1的第262位的丙氨酸被取代成缬氨酸(153) SEQ ID NO 1的第263位的丙氨酸被取代成丝氨酸(154) SEQ ID NO 1的 第264位的苏氨酸被取代成丝氨酸(155) SEQ ID NO 1的第265位的谷氨酸被取代成丙氨酸或甘氨酸(156) SEQ ID NO 1的第268位的天冬酰胺被取代成丝氨酸、异亮氨酸或苏氨酸(157) SEQ ID NO 1的第270位的亮氨酸被取代成组氨酸、精氨酸或缬氨酸(158) SEQ ID NO 1的第271位的赖氨酸被取代成精氨酸(159) SEQ ID NO 1的第272位的精氨酸被取代成谷氨酰胺(160) SEQ ID NO 1的第277位的谷氨酸被取代成缬氨酸(161) SEQ ID NO 1的第279位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或组氨酸(162) SEQ ID NO 1的第282位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(163) SEQ ID NO 1的第283位的亮氨酸被取代成脯氨酸
(164) SEQ ID NO 1的第285位的亮氨酸被取代成精氨酸或组氨酸(165) SEQ ID NO 1的第286位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸(166) SEQ ID NO :1的第287位的苏氨酸被取代成异亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸或缬
氨酸(167) SEQ ID NO 1的第288位的脯氨酸被取代成丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸(168) SEQ ID NO 1的第289位的缬氨酸被取代成丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨
酸或异亮氨酸。(B)⑷所述的Fe结合性蛋白质，其中，所述第16位至第289位的氨基酸序列中至少发生了所述(4)、(14)、(41)和(79)中的任一个所述的氨基酸取代。(C) (B)所述的 Fe 结合性蛋白质，其包含 SEQ ID NO :2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列中的第34位至第307位的氨基酸。(D) (B)所述的 Fe 结合性蛋白质，其包含 SEQ ID NO :2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所不的氨基酸序列。(E)编码(A) (D)中的任一个所述的Fe结合性蛋白质的多核苷酸。(F)包含(E)所述的多核苷酸的表达载体。
(G)用(F)所述的表达载体转化宿主而得到的转化体。(H) (G)所述的转化体，其中，宿主是大肠杆菌。(I)Fc结合性蛋白质的制造方法，其中，培养(G)或⑶所述的转化体来生产Fe结合性蛋白质，并从其培养物回收所产生的Fe结合性蛋白质。(J)将(A) (D)中的任一个所述的Fe结合性蛋白质固定化于固相而得到的、包含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料。(K)抗体纯化方法，其包括(I)在将包含 SEQ ID NO : 114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列的Fe结合性蛋白质固定化于固相而得到的、包含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料中添加包含抗体的溶液，使该抗体吸附于该吸附材料的步骤；以及(2)使用ρΗ3. (Γ4. 5的缓冲液对吸附于所述吸附材料的所述抗体进行洗脱的步骤。发明的效果本发明的Fe结合性蛋白质是在野生型的人Fe受体Fe Y RI中将位于细胞外区域的I个以上特定氨基酸残基取代成其他氨基酸而成的蛋白质。与野生型的人Fe Y RI相比较，该蛋白质对热、酸和/或碱的稳定性提高。因而，通过将本发明的Fe结合性蛋白质用作亲和色谱用配体，能够稳定地对人IgG这样的抗体进行纯化。此外，在通过对用包含编码Fe结合性蛋白质的多核苷酸的表达载体转化宿主而得到的转化体进行培养，生产Fe结合性蛋白质，并从其培养物回收所产生的Fe结合性蛋白质的Fe结合性蛋白质的制造方法中，将本发明的Fe结合性蛋白质作为Fe结合性蛋白质使用，蛋白质生产性提高。因而，本发明在Fe结合性蛋白质在工业制造中也是有用的。而且，与野生型的人Fe YRI相比较，本发明的Fe结合性蛋白质对热、酸和/或碱的稳定性提高。因而，将本发明的Fe结合性蛋白质固定化于固相而得到的包含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质的吸附材料即使例如进行基于碱处理(例如IOOmM氢氧化钠水溶液)的再生处理，吸附性能也几乎不会劣化。因此，可以说本发明的吸附材料特别优选用于人IgG这样的抗体的大量纯化用途。
[图1]显示人Fe受体FeY RI的结构的概略的图。[图2]插入了编码人FeY RI的多核苷酸的质粒pUCFcR的结构概略图。[图3]插入了编码Fe结合性蛋白质的多核苷酸的质粒pETFcR的制作概略图。[图4]质粒pETMalE的结构概略图。[图5]质粒pETFcR的结构概略图。[图6]对用质粒pETFcR转化体表达的Fe结合性蛋白质的抗体结合活性进行评价的图。[图7]对Fe结合性蛋白质(FcRm4、FcRm6、FcRm8、FcRml9)的生产性进行评价的图。[图8]对Fe结合性蛋白质(FcRm32)的生产性进行评价的图。[图9]对Fe结合性蛋白质(FcRm32)的碱稳定性进行评价的图。[图10]对Fe结合性蛋白质(FcRm36b)的生产性进行评价的图。[图11]对Fe结合性蛋白质(FcRm36b)的碱稳定性进行评价的图。
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[图12]对Fe结合性蛋白质(FcRm44)的生产性进行评价的图。[图13]对Fe结合性蛋白质(FcRm44)的碱稳定性进行评价的图。[图14]对Fe结合性蛋白质(FcRm48)的生产性进行评价的图。[图15]对Fe结合性蛋白质(FcRm48)的碱稳定性进行评价的图。[图16]对Fe结合性蛋白质(FcRm54b)的生产性进行评价的图。[图17]对Fe结合性蛋白质(FcRm54b)的碱稳定性进行评价的图。[图18]对Fe结合性蛋白质(FcRm56b)的生产性进行评价的图。[图19]对Fe结合性蛋白质(FcRm56b)的碱稳定性进行评价的图。[图20]对Fe结合性蛋白质(FcRm57b)的生产性进行评价的图。[图21]对Fe结合性蛋白质(FcRm57b)的碱稳定性进行评价的图。[图22]对Fe结合性蛋白质(FcRm60c、FcRm61、FcRm62)的生产性进行评价的图。[图23]对Fe结合性蛋白质(FcRm60c、FcRm61、FcRm62)的碱稳定性进行评价的图。[图24]对Fe结合性蛋白质的酸稳定性进行评价的图。[图25]对Fe结合性蛋白质(FcRml9)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。[图26]对Fe结合性蛋白质(FcRm32)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。[图27]对Fe结合性蛋白质(FcRm36b)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。[图28]对Fe结合性蛋白质(FcRm48)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。[图29]对Fe结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。[图30]对Fe结合性蛋白质(FcRm57b)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。[图31]对Fe结合性蛋白质(FcRm32、FcRm36b、FcRm56b)固定化凝胶的碱稳定性进行评价的图。
[图32]对Fe结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶的重复稳定性进行评价的图。发明的
具体实施例方式以下，对本实施方式的Fe结合性蛋白质进行具体说明。人Fe受体Fe Y RI的α链的结构示于图1。人Fe受体Fe Y RI的α链由下述区域构成由N末端侧起15个氨基酸组成的信号肽区域(SS、SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中第I位至第15位的区域)、由277个氨基酸组成的细胞外区域(EC、SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中第16位至第292位的区域)、由21个氨基酸组成的跨细胞膜区域(TM、SEQID NO 1所示的氨基酸序列中第293位至第313位的区域)、以及由61个氨基酸组成的细胞内区域(C、SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中第314位至第374位的区域)。 本实施方式的Fe结合性蛋白质包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中自第16位的谷氨酰胺至第292位的组氨酸的细胞外区域(图1的EC区域)中的至少自第16位的谷氨酰胺至第289位的缬氨酸的区域。此外，本实施方式的Fe结合性蛋白质可以包含处于EC区域的N末端侧的信号肽区域(图1的SS区域)的全部或一部分，也可以包含处于EC区域的C末端侧的跨膜区域(图1的TM区域)或细胞内区域(图1的C区域)。而且，本实施方式的Fe结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧可以添加多组氨酸标签等用于进行纯化等的标签妝。本实施方式的Fe结合性蛋白质是SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列中的处于作为细胞外区域(图1的EC区域)的一部分的第16位的谷氨酰胺 第289位的缬氨酸的区域中的氨基酸残基中的至少I个被取代成其他氨基酸残基而得到的多肽。通过该取代，与由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列组成的野生型的人Fe y RI相比，本实施方式的Fe结合性蛋白质的热稳定性、酸稳定性和/或碱稳定性显著提高，且作为亲和色谱用配体是有用的。例如，实施例中示例的Fe结合性蛋白质在43°C进行10分钟加热处理，或在70°C进行20分钟加热处理，或在PH3. O的酸条件下进行24小时处理，或在pHIO的碱条件下53°C进行20分钟处理，仍保持着不低于未发生氨基酸取代的野生型的人Fe Y RI的抗体结合活性。具体地，本实施方式的Fe结合性蛋白质包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中、至少第16位的谷氨酰胺至第289位的缬氨酸的区域的氨基酸序列。而且，该氨基酸序列是发生了 Thr20Pro(该表示方式表示SEQ ID NO :1的第20位的苏氨酸被取代成月甫氨酸，以下相同)、Thr25Lys> Thr38Ala> Thr38Ser> Leu46Arg> Leu46Pro> Ala62Val、Thr63Ile、Ser69Phe、Ser69Thr、Arg71His、Val77Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Asp94Glu、IlelOOVaK SerlIOAsnΛPhell4Leu、Hisl25Arg、Leul31Arg、Leul31Pro、Trpl49Leu、Leul56Pro、Ilel60Met、Asnl63Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ser、Asn206Lys、Asn206Ser、Asn206Thr、Leu207Pro、Leu218Val、Asn240Asp、Leu248Ser、Leu283His、Leu285Gln、Vall7Gly、Vall7Glu、Thrl9Ile、Thr20Ile、Thr25Met、Thr25Arg、Gln27Pro、Gln27Lys、Gln35Leu、Gln35Met、Gln35Arg、Glu36Gly、Leu41Met、His42Leu、Glu44Asp、Val45Ala、Leu46Ala、Leu46Asn、Leu46Asp、Leu46Gln、Leu46Gly、Leu46His、Leu46Lys、Leu46Ser、Leu46Trp、His47Gln、His47Leu、His47Asn、Pro49Ser、Pro49Ala、Gly50Arg、Gly50Glu、Ser51Ala、 Ser51Thr、 Ser51Leu、 Ser51Pro、 Ser51VaU Ser52Gly、 Ser53Leu、 Ser53Thr、Ser53Pro、Gln55Arg、Phe57Tyr、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr61Ala、Thr61Ser、Ala62Glu、Thr63Leu、Thr63Phe、Gln64Pro、Gln64His、Gln64Leu、Gln64Lys、Thr65Ala、Thr65VaUSer66Thr、Thr67Ala、Thr67Ser、Ser69Ala、Tyr70His> Tyr70Phe> Arg71Tyr> Thr73Ala、Thr73Ser、Ser74Phe、Ser76Asn、Val77Asp、Val77Lys、Asn78Ser、Asn78Gly、Ser80Ala、Arg84Ser> Gly88Ser> Leu89Gln、Leu89Pro> Ser90Gly> Arg92Cys> Arg92Leu> Ile96Val、Ile96Lys、Gln97Leu、Gln97Lys、Hisl01Leu、Argl02Ser、Argl02Leu、Glyl03Asp、Glyl03Ser、SerlllAla、Phell4Ala、Phell4Ile、Phell4Met、Phell4Pro、Phell4Thr、Phell4Val、Thrll5Ile、Thrll5Phe、Glull8Asp、Alal21Thr、Alal21Val、Lysl28Arg、Lysl28Gly、Aspl29Gly、Leul31Gln、Tyrl33His、Tyrl33Arg, Asnl34Ser、Tyrl37Phe、Tyrl38His、Argl39His> Asnl40Asp、Glyl41Asp> Gly 141Val> Lysl42Glu> Lysl42Arg> Phel44Ile、Phel47Ser、Hisl48Arg、Hisl48Gln、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Asnl52Ile、Asnl52Pro、Thrl54Ser、Leul56His、Lysl57Arg> Asnl59Thr、Asnl59Asp、Ilel60Thr>Ilel60VaU Ilel60Leu, Serl61Thr、Thrl65Met、Metl71Thr、Lysl73Arg、Hisl74Gln、Thrl77Ser、 Ilel81Thr、 Serl82Thr、 Serl82Leu、 Serl82Val, Serl82Glu、 Thrl84Ser、Prol90Ser、Vall93Leu、Asnl95Ala、Alal96Ser、Vall98Gly、Vall98Met、Thrl99Ala、Ser200Gly> Ser200Arg> Leu202Met、Leu203His、Leu203Gln、Leu203Tyr> Leu203Arg>Leu203Pro、Glu204Val、Leu207Gln、Leu207His、Leu207Arg、Thr209Ala、Ser211Arg、Ser211Gly、Glu213Val、Glu213Ile、Lys215Arg、Lys215Glu、Leu217Arg、Leu217Gln、Leu218Ile、Leu218Met、Leu218Lys> Gln219Pro> Gln219Arg> Leu223Arg、Leu223Gln、Leu223Met、Gln224Arg> Leu225Gln、Phe227Ile、Tyr230His> Tyr230Phe> Met231Lys>Met231Arg、Ser233Gly、Ser233Asn、Lys234Glu、Asn240Gly、Glu244Val、Tyr245His、Tyr245Glu、Gln246Arg、Gln246Lys、Leu248Ile、Thr249Ala、Thr249Ser、Ala250Val、Arg251Ser、Arg252His、Gl u253Gly、Leu257Arg、Leu257Gln、Glu261Val、Glu261Ala、Ala262Val、Ala263Ser、Thr264Ser、Glu265Ala、Glu265Gly、Asn268Ser、Asn268Ile、Asn268Thr、Leu270His、Leu270Arg、Leu270Val、Lys271Arg、Arg272Gln、Glu277Val、Gln279Arg、Gln279His、Gly282Asp、Leu283Pro、Leu285Arg、Leu285His、Pro286Gln、Pro286Arg> Pro286Glu> Thr287Ile> Thr287Pro> Thr287Ala> Thr287Val> Pro288Ala>Pro288Ser、Pro288Thr、Val289Ala、Val289Asp、Val289Gly、Val289Leu 和 Val289Ile 中的 I个以上的任意取代的多肽。此外，在上述取代中，若发生Thr20Pro、Thr25Lys、Thr38Ser、Leu46Pro、Thr6311 e、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、IlelOOVal,Phell4Leu,Ilel60Met,Asnl63Ser,Asnl95Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Asn240Asp、Leu283His 和 Leu285Gln 中的 I 个以上的任意取代，则热稳定性进一步提闻，由此是优选的。此外，在上述取代中，若发生Leu46Arg、Leu46Pro、Leu46Ala、Leu46Asn、Leu46Asp、Leu46Gln、Leu46Gly> Leu46His、Leu46Lys> Leu46S er、Leu46Trp、Phell4Leu、Phell4Ala、Phell4Ile、Phell4Met、Phell4Pro、Phell4Thr 和 Phell4Val 中的 I 个以上的任意取代，贝丨JFe结合性蛋白质对热、酸和碱的稳定性进一步提高，因此是优选的。而且，在通过发生氨基酸取代来制作本实施方式的Fe结合性蛋白质时，对于特定的氨基酸位置，也可以取代成前述取代之外的氨基酸，只要具有抗体结合活性即可。作为其中的一例，可以列举出在两个氨基酸的物理性质和/或化学性质相似的氨基酸之间进行取代的保守取代。本领域技术人员知道，就保守取代而言，不仅仅限于Fe结合性蛋白质，蛋白质的功能在发生了取代者与未发生取代者之间普遍地能够得以维持。作为保守取代的一例，可以列举出甘氨酸和丙氨酸之间、天冬氨酸和谷氨酸之间、丝氨酸和脯氨酸之间、或谷氨酸和丙氨酸之间发生的取代(非专利文献5)。本实施方式的Fe结合性蛋白质中，对于取代的氨基酸的数目没有特殊限制。作为一例，可以列举出以下所示的(a广(η)的取代体。这些取代体中，(cr(η)所示的取代体对热、酸和喊的稳定性进一步提闻，因此是特别优选的。(a)发生了 Leu46Pro、Thr63Ile、Phe 114Leu 和 Asn240Asp 的取代的 4 重取代体(包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fe结合性蛋白质)、(b)发生了 Thr38Ser、Leu46Pro> Thr63Ile> IlelOOVal、Phell4Leu 和 Asn240Asp的取代的6重取代体(包含SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fe结合性蛋白质)、(c)发生了 Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、IlelOOVal、Phell4Leu、Ilel60Met、Asnl63Ser和Asn240Asp的取代的8重取代体(包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fe结合性蛋白质)、(d)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Thr38Ser> Leu46Pro> Thr63Ile> Ser69Thr>Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ilel00Val、Phell4Leu、Ilel60Met、Asnl63Ser、Asnl95Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Asn240Asp、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 19 重取代体(包含SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fe结合性蛋白质)、(e)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Glu36Gly> Thr38Ser> Val45Ala、Leu46Pro>Pro49Ser> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala> Ser69Thr> Arg71His> Val77Glu、Asn78Asp、IlelOOVal、Phel 14Leu> Tyrl33His> Argl39His> Trpl49Arg> Leul56Pro> Ilel60Thr>Asnl63Ser> Lysl73Arg> Ilel81Thr> Asnl95Thr> Leu203His、Asn206Thr> Leu207Gln、Met231Lys、Asn240Asp、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 32 重取代体(包含 SEQ ID NO 114所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(f)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser52Gly> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala> Ser69Thr>Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ilel00Val、Phell4Leu、Tyrl33His、Argl39His、Trpl49Arg、Asnl52Thr、 Leul56Pro、 Ilel60Thr、 Asnl63Ser、 Lysl73Arg> Ilel81Thr、 Asnl95Thr、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Met231Lys、Asn240Asp、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的36重取代体(包含SEQ ID NO : 118所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(g)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Gln35Leu、Glu36Gly> Thr38Ser> Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser52Gly> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala> Ser69Thr>Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、He IOOVaU Phe 114Leu、Lysl28Arg、Tyrl33His> Argl39His、Trpl49Arg、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg> Ilel60Thr、Asnl63Ser> Lysl73Arg> Ilel81Thr> Serl82Leu> Asnl95Thr> Leu203His、Asn206Thr >Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys、Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu283His和Leu285Gln的取代的44重取代体( 包含SEQ ID NO : 130所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(h)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Thr> Ser52Gly> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala>Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal, Phell4Leu, Lysl28Arg、Leul31Gln、Tyrl33His> Tyr 137Phe> Argl39His、Trpl49Arg、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg> Ilel60Thr、Asnl63Ser、Lysl73Arg> Ilel81Thr、Ser182Leu> Thr 184Ser>Asnl95Thr> Leu203His、Asn206Thr> Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys>Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 48 重取代体(包含SEQ ID NO 134所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(i)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Gln35Leu、Glu36Gly> Thr38Ser> Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Ala> Ser52Gly> Gly60Asp> Thr63Ile> Thr65Ala>Ser69Thr、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal, Phell4Leu、Alal21Val、Lysl28Arg、Leul31Gln、Tyrl33His、Tyrl37Phe、Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg> Ilel60Thr、Asnl63Ser、Lysl73Arg>Ilel81Thr、Serl82Leu、Thrl84Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ala、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile, Met231Lys、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu270Val、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 54 重取代体(包含 SEQ ID NO 148所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(j)发生了 Thr20Pro、 Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Ala> Ser52Gly> Leu58Arg> Gly60Asp> Thr63Ile>Thr65Ala、Ser69Thr、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal,SerlllAla、Phell4Leu、Thrll5Ile、Alal21Val、Lysl28Arg、Leul31Gln、Tyrl33His、Tyrl37Phe> Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg>Ilel60Thr>Asnl63Ser> Lysl73Arg> Ilel81Thr> Ser182Leu> Thrl84Ser>Asnl95Thr>Thrl99Ala、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys、Lys234Glu、Asn240A sp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的 56 重取代体(包含SEQ ID NO 154所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(k)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys> Gln35Leu、Glu36Gly> Thr38Ser> Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Ala> Ser52Gly> Leu58Arg> Gly60Asp> Thr63Ile>Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVaU SerlllAla、Phell4Leu、Thrll5Ile、Alal21Val、Lysl28Arg、Tyrl33His、Tyrl37Phe> Argl39His、Trpl49Arg、Ser 151Thr> Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg>Ilel60Thr> Asnl63Ser> Lysl73Arg> Ilel81Thr> Ser 182Leu> Thr 184Ser> Asnl95Thr>Thrl99Ala> Asn206Thr> Leu207Pro> Glu213Val、Leu218Ile、Tyr230Phe> Met231Lys>Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His 和 Leu285Gln 的取代的57重取代体(包含SEQ ID NO :164所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(I)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal、SerlllAla^ Phell4Leu、Thrll5Ile、Alal21Val、Lysl28Arg、Tyrl33His、Tyrl37Phe、Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg、Ilel60Thr、Asnl63Ser、Thrl65Met、Lysl73Arg、Ilel81Thr、Serl82Leu、Thrl84Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu217Gln、Leu218Ile、Tyr230Phe、Met231Lys、Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln和Val289Asp的取代的60重取代体(包含SEQ IDNO 174所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(m)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal、SerlllAla^ Phell4Leu、Thrll5Ile、Glull8Asp、Alal21Val、Lysl28Arg、Tyrl33His、Tyrl37Phe、Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg、Ilel60Thr、Asnl63Ser、Thrl65Met、Lysl73Arg、Ilel81Thr、Serl82Leu、Thrl84Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu218Ile、Tyr230Phe、Met231Lys、Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240A sp、Gln246Lys、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln 和 Val289Asp 的取代的 61 重取代体(包含 SEQ ID NO:170所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)、(η)发生了 Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro> Pro49Ser> Ser51Ala> Ser52Gly> Leu58Arg> Gly60Asp> Thr63Ile>Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、IlelOOVal, SerlllAla、Phell4Leu、Thrll5Ile、Glull8Asp、Alal21Val、Lysl28Arg、Tyrl33His> Tyrl37Phe> Argl39His、Trpl49Arg、Serl51Thr、Asnl52Thr、Leul56Pro、Lysl57Arg> Ilel60Thr> Asnl63Ser、Thrl65Met、Lysl73Arg> Ilel81Thr、Ser 182Leu>Thrl84Ser、Asnl95Thr、Thrl99Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu217Gln、Leu218Ile、Tyr230Phe> Met231Lys> Ser233Gly> Lys234Glu> Asn240Asp、Gln246Lys>Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln 和 Val289Asp 的取代的 62 重取代体(包含SEQ ID NO 176所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fe结合性蛋白质)。作为具有编码本实施方式的Fe结合性蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸(以下也简称为本实施方式的多核苷酸)的制作方法，可以列举出例如以下所示的(I)或(II)的方法。(I)从本实施方式的Fe结合性蛋白质的氨基酸序列转换成核苷酸序列，人工合成包含该核苷酸序列的多核苷酸的方法。(II)直接人工制备、或者从人Fe Y RI的cDNA等出发通过PCR法等DNA扩增方法制备包含人Fe y RI的全体或部分序列的多核苷酸，并采用适当方法将制备的该多核苷酸连接的方法。而且，从氨基酸序列到核苷酸序列的转换优选在考虑转化的宿主中的密码子的使用频率的基础上进行。作为一例，在宿主为大肠杆菌(Escherichiacoli)的情况下,精氨酸(Arg)的 AGA/AGG/CGG/CGA、异亮氨酸(Ile)的 ΑΤΑ、亮氨酸(Leu)的 CTA、甘氨酸(Gly)的GGA、脯氨酸(Pro)的CCC各自的使用频率低(所谓的稀有密码子)，因此转换时避免这些密码子即可。密码子的使用频率的解析也可以利用公共数据库(例如，KAZUSA DNA研究所的主页上的密码子用法数据库等)。在采用所述(II)的方法在本实施方式的多核苷酸中导入突变的情况下，作为DNA扩增方法，也可以采用所谓的易错PCR法。对易错PCR法中的反应条件没有特殊限制，只要是能够在编码人Fe Y RI的多核苷酸中导入希望的突变的条件即可。例如，通过使作为底物的4种脱氧核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度不均一，并在PCR反应液中添加O. 01至IOmM浓度(优选O.1至ImM)的MnC12来进行PCR，能够在多核苷酸中导入突变。而且，作为在本实施方式的多核苷酸中导入突变的方法，还可以列举出以下所示的(III)的方法。(III)使包含人Fe Y RI的全体或部分序列的多核苷酸与作为突变原的药物接触、作用，或者对其照射紫外线，在多核苷酸中导入突变来进行制作的方法。作为突变原的该药物，可以使用羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼等本领域技术人员通常使用的突变原药物。而且，在采用所述(I)、(II)或(III)的方法制作的本实施方式的多核苷酸的5’末端侧，可以添加编码信号肽的多核苷酸。在宿主为大肠杆菌的情况下，作为所述信号肽，可以列举出pelB、DsbA、MalE(SEQ ID NO :182)、TorT等使得蛋白质向周质中分泌的信号肽(日本特愿2009-256180号)。在使用本实施方式的多核苷酸转化宿主的情况下，可以使用本实施方式的多核苷酸本身，而使用在合适位置插入了本实施方式的多核苷酸的表达载体(例如原核细胞、真核细胞的转化中通常使用的噬菌体、粘粒、质粒等)则更为优选。而且，对该表达载体没有特殊限制，能够在转化 的宿主内稳定存在并复制即可。在以大肠杆菌作为宿主的情况下，可以示例出pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体、pCDF质粒载体、pBBR质粒载体等。此外，所述合适的位置，是指不破坏涉及表达载体的复制功能、希望的抗生物质标记和传导性的区域的位置。在所述表达载体中插入本实施方式的多核苷酸时，优选以与表达所必要的启动子等功能性多核苷酸连接的状态插入表达载体。作为该启动子的例子，在宿主为大肠杆菌的情况下，可以示例出trp启动子、tac启动子、trc启动子、Iac启动子、T7启动子、recA启动子、Ipp启动子、以及λ噬菌体的λ PL启动子、λ PR启动子等。为了用插入了采用所述方法制作的本实施方式的多核苷酸的表达载体转化宿主，可以采用本领域技术人员通常使用的方法进行。例如，在作为宿主选择属于埃希氏菌属的微生物(大肠杆菌JM109株、BL21(DE3)株等)的情况下，可以采用非专利文献6所述的方法等进行转化。通过采用合适的方法从采用这样的方法转化得到的转化体中进行筛选，可以获得表达对热、酸、碱的稳定性提高的本实施方式的Fe结合性蛋白质的转化体。为了从该转化体制备插入了本实施方式的多核苷酸的表达载体，可以使用碱抽提法、QIAprep SpinMiniprep kit (QIAGEN公司制造)等市售的抽提试剂盒来制备。为了筛选表达本实施方式的Fe结合性蛋白质的转化体，可以通过例如测定抗体对表达的Fe结合性蛋白质的结合活性来进行。抗体的结合活性可以采用ELISA法、表面等离子体共振法等测定例如对IgG的结合活性。结合活性的测定中使用的IgG优选人IgG，特别优选人IgGl。
作为本实施方式的Fe结合性蛋白质，可以通过对用含本实施方式的多核苷酸的表达载体转化得到的宿主(转化体)进行培养来制造。该Fe结合性蛋白质的制造方法具体包括培养该转化体、从其培养物回收本实施方式的Fe结合性蛋白质。而且，本说明书中，培养物所指的概念除了经培养的转化体的细胞自身，还包括培养中使用的培养基等。回收可以通过例如从培养物抽提Fe结合性蛋白质来进行。本实施方式的Fe结合性蛋白质的制造方法中使用的转化体可以使用适合于对象宿主的培养的培养基进行培养，在宿主是大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基的一例，可以列举出补加了必要营养源的LB (Luria-Bertani)培养基。而且,为了能够根据有无导入含本实施方式的多核苷酸的表达载体来选择性地进行转化体的增殖，优选在培养基中添加与该表达载体所含的药物抗性基因对应的药物来进行培养。例如，在该表达载体包含卡那霉素抗性基因的情况下，可以在培养基中添加卡那霉素。此外，培养基中除了碳、氮和无机盐供给源之外，还可以添加适当的营养源，视需要还可以包含选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代乙醇酸盐和二硫苏糖醇组成的组中的一种以上的还原剂。而且，还可以添加甘氨酸等促进从所述转化体向培养液的蛋白质分泌的试剂，具体地，在宿主是大肠杆菌的情况下，优选相对于培养基添加2%(w/v)以下的甘氨酸。培养温度可以根据表达的Fe结合性蛋白质的特性来选择，在宿主是大肠杆菌的情况下，一般为10°C至40°C、优选25°C至35°C、更优选30°C左右。培养基的pH在宿主是大肠杆菌的情况下，为pH6. 8至pH7. 4,优选pH7. O左右。在含本实施方式的多核苷酸的表达载体包含诱导性启动子的情况下，可以在能够良好表达含本实施方式的Fe结合性蛋白质的多肽的条件下进行诱导。作为诱导剂，可以示例出IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)。在宿主是大肠杆菌的情况下，通过测定培养液的浊度(600nm 的吸光度)，当其变成约O. 5至1. O时添加适当量的IPTG，然后继续进行培养，可以诱导本实施方式的Fe结合性蛋白质的表达。IPTG的添加浓度可以在O. 005至1. OmM的范围适宜选择，优选O. 01至O. 5mM的范围。IPTG诱导相关的各种条件可以采用该技术领域中公知的条件进行。为了从本实施方式的转化体的培养液抽提Fe结合性蛋白质，可以根据表达的形式适宜选择抽提方法。在表达于培养上清的情况下，可以通过离心分离操作分离菌体，并从所得培养上清抽提Fe结合性蛋白质。另一方面，在表达于细胞内(对于原核生物还包括周质)的情况下，可以通过在离心分离操作收集菌体后，添加酶处理剂、表面活性剂等破碎菌体，来抽提Fe结合性蛋白质。为了从抽提出的蛋白质中分离纯化Fe结合性蛋白质，可以使用该技术领域中公知的方法。作为一例，可以列举出使用液相色谱的分离纯化。作为液相色谱，可以列举出离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。通过组合这些色谱进行纯化操作，能够高纯度地制备本实施方式的Fe结合性蛋白质。本实施方式的Fe结合性蛋白质可以用作例如用于分离纯化包含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质的亲和色谱用配体。为了将本实施方式的Fe结合性蛋白质适用于所述色谱，可以以例如将本实施方式的Fe结合性蛋白质固定化于固相而成的、吸附包含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质的吸附材料(以下也简称为本实施方式的吸附材料)的方式使用。作为用于固定化本实施方式的Fe结合性蛋白质的固相，可以示例出包含亲水性乙烯基聚合物、二氧化硅、玻璃、Sepharose (注册商标)、琼脂糖、纤维素、羟基磷灰石、聚苯乙烯的物质等。而且，使固相的形态为空孔得到控制的形态、或膜的形态，则从分离能力变好的角度是优选的。为了将本实施方式的Fe结合性蛋白质固定化于固相，可以例如在固相表面导入环氧基、甲酰基、氨基、羧基等活性基团后，使本实施方式的Fe结合性蛋白质表面存在的氨基酸残基与导入该固相表面的活性基团共价结合。作为使用本实施方式的吸附材料分离纯化的、包含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质(以下也称为目的蛋白质)的一例，可以列举出包含IgG的恒定区域的蛋白质。作为其具体例，可以列举出IgG、IgG的Fe结合性蛋白质结合位点与其他蛋白质的融合蛋白质。而且，这里所说的IgG的恒定区域可以包含用例如木瓜蛋白酶等蛋白酶处理而从IgG产生的铰链、CH2和CH3结构域。作为使用本实施方式的吸附材料分离纯化的目的蛋白质的例子，可以列举出 人IgG、人源化IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、兔IgG、骆驼IgG等，特别优选人IgG或人源化IgG。使用本实施方式的吸附材料分离纯化的人IgG可以列举出人IgGl、人IgG2、人IgG3和人IgG4。作为使用本实施方式的吸附材料分离纯化的目的蛋白质的其他例子，可以列举出单克隆IgG抗体、多克隆IgG抗体、IgG片段等。使用本实施方式的吸附材料的、抗体等目的蛋白质的分离纯化方法具备例如以下所示的⑴和⑵的步骤。(I)在将本实施方式的Fe结合性蛋白质固定化于固相而得到的包含Fe结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料中添加含目的蛋白质的溶液，使该目的蛋白质吸附于该吸附材料的步骤。(2)使用合适的洗脱液洗脱吸附于吸附材料的目的蛋白质的步骤。使用本实施方式的吸附材料分离纯化的抗体等目的蛋白质可以例如通过采用基因重组技术，在CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)等动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌、芽孢杆菌属细菌等细菌、面包酵母、粟酒裂殖酵母等酵母、或米曲霉等丝状真菌等中表达来进行生产。而且，在希望将目的蛋白质以其表面必要存在糖链的形态进行生产的情况下，可以选择作为真核细胞的动物细胞、昆虫细胞、酵母或丝状真菌，更优选使用CHO细胞。作为包含使用本实施方式的吸附材料分离纯化的目的蛋白质的溶液的一例，可以列举出可表达目的蛋白质的宿主(动物细胞、昆虫细胞、细菌、酵母、丝状真菌等)的培养液、可表达目的蛋白质的植物的破碎液、牛等动物的乳。而且，上述例子中，对于培养液，可以包含可表达目的蛋白质的宿主，也可以通过合适的前处理除去该宿主。这里所说的合适的前处理，可以示例出离心分离操作、精密过滤膜、超滤膜，可以采用本领域技术人员公知的方法。作为在本实施方式的吸附材料上吸附目的蛋白质的步骤的一例，可以列举出在使用了本实施方式的吸附材料的分离纯化用柱上，使用合适的送液系统，直接或以PH调整后的状态添加含目的蛋白质的溶液，吸附目的蛋白质的步骤。该分离纯化用柱可以通过例如在合适容量的空柱中充填本实施方式的吸附剂来制作。此外，送液系统可以使用例如液相色谱中使用的高压泵、蠕动泵。在对含目的蛋白质的溶液进行PH调整的情况下，对调整的PH没有特殊限制，只要是目的蛋白质不变性的条件即可，可以是中性、酸性、碱性。但是，在通常的目的蛋白质的情况下，优选将PH调整至3至10的范围，特别优选调整至pH4至pH8的范围。在对本实施方式的吸附材料上吸附的目的蛋白质进行洗脱时，可以在所述吸附步骤后立即进行目的蛋白质的洗脱，优选经过在洗脱步骤前用合适的洗涤液除去杂蛋白质的洗涤步骤后再进行洗脱。作为该洗涤液，可以是调整至目的蛋白质不发生洗脱的条件的PH的缓冲液。作为用作洗涤液的缓冲液的构成要素的一例，可以列举出乙酸、柠檬酸、组氨酸、磷酸、硼酸、铵盐(例如乙酸铵、琥珀酸铵)、MES(2-吗啉乙磺酸一水合物)、MOPS(3-吗啉丙磺酸)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1_哌啶基]乙磺酸)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)和它们的组合。用作洗涤液的缓冲液的PH因目的蛋白质而异，一般优选pH为3至10的范围，特别优选PH4至pH8的范围。而且，用作洗涤液的缓冲液中视需要可以存在添加剂，可以列举出例如用于调整缓冲液离子强度的氯化钠、硫酸钠、氯化钾等盐、甘氨酸、组氨酸、精氨酸等氨基酸、尿素等离液剂、乙醇、甘露醇、甘油、苄醇等醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、果糖等糖等。在洗脱本实施方式的吸附材料上吸附的目的蛋白质的步骤中，使用合适的洗脱液使目的蛋白质从该吸附材料解离，回收到合适的容器中。作为该洗脱液，只要是是调整至目的蛋白质洗脱并且目的蛋白质不变性的条件的PH的缓冲液即可。用作洗脱液的缓冲液的pH因目的蛋白质而异，一般优选pH为2至11的范围，特别优选pH为2. 5至pH6的范围。而且，在本实施方式的吸附材料为将由SEQ ID NO :114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列组成的Fe结合性蛋白质固定化于固相而得到的吸附材料的情况下，用作洗脱液的缓冲液的pH为3. (Γ4. 5的范围。此外，用作洗脱液的缓冲液中视需要可以存在添加剂，可以列举出例如用于稳定化目的蛋白质的表面活性剂、盐、糖等。通过将使用本实施方式的吸附材料分离纯化出的目的蛋白质提供给柱色谱，还可以纯化至更高纯度。作为可使用的色谱，可以示例出离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、羟基磷灰石色谱等。 实施例以下列举出实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限定。实施例1编码人Fe受体Fe Y RI的多核苷酸的克隆(I)以SEQ ID NO 1所述的人Fe受体Fe Y RI的氨基酸序列为基础，对于细胞外区域、跨细胞膜区域和细胞内区域(第16位至第374位的区域)，使用大肠杆菌型的密码子进行了向核苷酸序列的转换。(2)以所述核苷酸序列为基础，合成了用于制作编码人Fe Y RI的多核苷酸的52种寡核苷酸。合成的寡核苷酸如SEQ ID NO 10至61所示。(3)为了从⑵合成的寡核苷酸制作编码人Fe Y RI的多核苷酸的全长，进行了下述所示的2阶段PCR。(3-1)第I阶段的PCR反应如下进行使用表I所示的反应液，94°C、5分钟热处理后，以第I步94°C 30秒、第2步62°C 30秒、第3步72°C I分钟作为I个循环，将反应进行25个循环，最后72°C进行7分钟热处理。[表 I]
权利要求
1. 一种Fe结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中的第16位至第289 位的氨基酸序列，且该第16位至第289位的氨基酸序列中发生了以下(1Γ(168)中的至少 I个氨基酸取代1)SEQID NO 1的第20位的苏氨酸被取代成脯氨酸2)SEQ ID NO 1的第25位的苏氨酸被取代成赖氨酸3)SEQ ID NO 1的第38位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸4)SEQ ID NO 1的第46位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸5)SEQ ID NO 1的第62位的丙氨酸被取代成缬氨酸6)SEQ ID NO 1的第63位的苏氨酸被取代成异亮氨酸7)SEQ ID NO 1的第69位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸或苏氨酸8)SEQ ID NO 1的第71位的精氨酸被取代成组氨酸9)SEQ ID NO 1的第77位的缬氨酸被取代成丙氨酸或谷氨酸(10SEQIDNO 的第78位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(11SEQIDNO 的第94位的天冬氨酸被取代成谷氨酸(12SEQIDNO 的第100位的异亮氨酸被取代成缬氨酸(13SEQIDNO 的第110位的丝氨酸被取代成天冬酰胺(14SEQIDNO 的第114位的苯丙氨酸被取代成亮氨酸(15SEQIDNO 的第125位的组氨酸被取代成精氨酸(16SEQIDNO 的第131位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸(17SEQIDNO 的第149位的色氨酸被取代成亮氨酸(18SEQIDNO 的第156位的亮氨酸被取代成脯氨酸(19SEQIDNO 的第160位的异亮氨酸被取代成甲硫氨酸(20SEQIDNO 的第163位的天冬酰胺被取代成丝氨酸(21SEQIDNO 的第195位的天冬酰胺被取代成苏氨酸(22SEQIDNO 的第199位的苏氨酸被取代成丝氨酸(23SEQIDNO 的第206位的天冬酰胺被取代成赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸(24SEQIDNO 的第207位的亮氨酸被取代成脯氨酸(25SEQIDNO 的第218位的亮氨酸被取代成缬氨酸(26SEQIDNO 的第240位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸(27SEQIDNO 的第248位的亮氨酸被取代成丝氨酸(28SEQIDNO 的第283位的亮氨酸被取代成组氨酸(29SEQIDNO 的第285位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(30SEQIDNO 的第17位的缬氨酸被取代成甘氨酸或谷氨酸(31SEQIDNO 的第19位的苏氨酸为异亮氨酸(32SEQIDNO 的第20位的苏氨酸为异亮氨酸(33SEQIDNO 的第25位的苏氨酸为甲硫氨酸或精氨酸(34SEQIDNO 的第27位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或赖氨酸(35SEQIDNO 的第35位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸、甲硫氨酸或精氨酸(36SEQIDNO 的第36位的谷氨酸被取代成甘氨酸(37SEQIDNO1的第41位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(38SEQID NO :1的第42位的组氨酸被取代成亮氨酸(39SEQIDNO1的第44位的谷氨酸被取代成天冬氨酸(40SEQID NO 1的第45位的缬氨酸被取代成丙氨酸(41SEQIDNO1的第46位的亮氨酸被取代成丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或色氨酸(42SEQIDNO1的第47位的组氨酸被取代成谷氨酰胺、亮氨酸或天冬酰胺(43SEQIDNO1的第49位的脯氨酸被取代成丝氨酸或丙氨酸(44SEQIDNO1的第50位的甘氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(45SEQIDNO1的第51位的丝氨酸被取代成丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸或缬氨me (46SEQIDNO1的第52位的丝氨酸被取代成甘氨酸(47SEQIDNO1的第53位的丝氨酸被取代成亮氨酸、苏氨酸或脯氨酸(48SEQIDNO1的第55位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(49SEQIDNO1的第57位的苯丙氨酸被取代成酪氨酸(50SEQIDNO1的第58位的亮氨酸被取代成精氨酸(51SEQIDNO1的第60位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(52SEQIDNO1的第61位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(53SEQIDNO1的第62位的丙氨酸被取代成谷氨酸(54SEQIDNO1的第63位的苏氨酸被取代成亮氨酸、苯丙氨酸(55SEQIDNO1的第64位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸(56SEQIDNO1的第65位的苏氨酸被取代成丙氨酸或缬氨酸(57SEQIDNO1的第66位的丝氨酸被取代成苏氨酸(58SEQIDNO1的第67位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(59SEQIDNO1的第69位的丝氨酸被取代成丙氨酸(60SEQIDNO1的第70位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸(61SEQIDNO:1的第71位的精氨酸被取代成酪氨酸(62SEQIDNO1的第73位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(63SEQIDNO1的第74位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸(64SEQIDNO1的第76位的丝氨酸被取代成天冬酰胺(65SEQIDNO1的第77位的缬氨酸被取代成天冬氨酸或赖氨酸(66SEQIDNO1的第78位的天冬酰胺被取代成丝氨酸或甘氨酸 (67SEQIDNO1的第80位的丝氨酸被取代成丙氨酸(68SEQIDNO1的第84位的精氨酸被取代成丝氨酸(69SEQIDNO1的第88位的甘氨酸被取代成丝氨酸(70SEQIDNO1的第89位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺或脯氨酸(71SEQIDNO1的第90位的丝氨酸被取代成甘氨酸(72SEQIDNO1的第92位的精氨酸被取代成半胱氨酸或亮氨酸(73SEQIDNO1的第96位的异亮氨酸被取代成缬氨酸或赖氨酸(74) SEQIDNOI的第(75) SEQIDNOI的第(76)SEQIDNOI的第(77) SEQIDNOI的第(78)SEQIDNOI的第(79)SEQIDNO1的第酸、苏氨酸或缬氨酸(80) SEQIDNOI的第(81) SEQIDNOI的第(82) SEQIDNOI的第(83) SEQIDNOI的第(84) SEQIDNOI的第(85) SEQIDNOI的第(86) SEQIDNOI的第(87) SEQIDNOI的第(88) SEQIDNOI的第(89) SEQIDNOI的第(90) SEQIDNOI的第(91) SEQIDNOI的第(92) SEQIDNOI的第(93) SEQIDNOI的第(94) SEQIDNOI的第(95) SEQIDNOI的第(96) SEQIDNOI的第(97) SEQIDNOI的第(98) SEQIDNOI的第(99) SEQIDNOI的第100)SEQIDNOI的第154101)SEQIDNOI的第156102)SEQIDNOI的第157103)SEQIDNOI的第159104)SEQIDNOI的第160105)SEQIDNOI的第161106)SEQIDNOI的第165107)SEQIDNOI的第171108)SEQIDNOI的第173109)SEQIDNOI的第174110)SEQIDNOI的第177IlDSEQIDNOI的第181137位的酪氨酸被取代成苯丙氨酸138位的酪氨酸被取代成组氨酸139位的精氨酸被取代成组氨酸140位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸141位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或缬氨酸142位的赖氨酸被取代成谷氨酸或精氨酸144位的苯丙氨酸被取代成异亮氨酸147位的苯丙氨酸被取代成丝氨酸148位的组氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺149位的色氨酸被取代成精氨酸151位的丝氨酸被取代成苏氨酸152位的天冬酰胺被取代成苏氨酸、异亮氨酸或脯氨酸`154位的苏氨酸被取代成丝氨酸位的亮氨酸被取代成组氨酸位的赖氨酸被取代成精氨酸位的天冬酰胺被取代成苏氨酸或天冬氨酸位的异亮氨酸被取代成苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸位的丝氨酸被取代成苏氨酸位的苏氨酸被取代成甲硫氨酸位的甲硫氨酸被取代成苏氨酸位的赖氨酸被取代成精氨酸位的组氨酸被取代成谷氨酰胺位的苏氨酸被取代成丝氨酸位的异亮氨酸被取代成苏氨酸(112SEQIDNOI的第182位的丝氨酸被取代成苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸或谷氨酸(113SEQIDNOI的第184位的苏氨酸被取代成丝氨酸(114SEQIDNOI的第190位的脯氨酸被取代成丝氨酸(115SEQIDNOI的第193位的缬氨酸被取代成亮氨酸(116SEQIDNOI的第195位的天冬酰胺被取代成丙氨酸(117SEQIDNOI的第196位的丙氨酸被取代成丝氨酸(118SEQIDNOI的第198位的缬氨酸被取代成甘氨酸或甲硫氨酸(119SEQIDNOI的第199位的苏氨酸被取代成丙氨酸(120SEQIDNOI的第200位的丝氨酸被取代成甘氨酸或精氨酸(121SEQIDNOI的第202位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸(122 脯氨酸SEQIDNO1的第203位的亮氨酸被取代成组氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、精氨酸、(123SEQIDNOI的第204位的谷氨酸被取代成缬氨酸(124SEQIDNOI的第207位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺、组氨酸或精氨酸(125SEQIDNOI的第209位的苏氨酸被取代成丙氨酸(126SEQIDNOI的第211位的丝氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸(127SEQIDNOI的第213位的谷氨酸被取代成缬氨酸或异亮氨酸(128SEQIDNOI的第215位的赖氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸(129SEQIDNOI的第217位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(130SEQIDNOI的第218位的亮氨酸被取代成异亮氨酸、甲硫氨酸或赖氨酸(131SEQIDNOI的第219位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或精氨酸(132SEQIDNOI的第223位的亮氨酸被取代成精氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸(133SEQIDNOI的第224位的谷氨酰胺被取代成精氨酸(134SEQIDNOI的第225位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺(135SEQIDNOI的第227位的苯丙氨酸被取代成异亮氨酸(136SEQIDNOI的第230位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸(137SEQIDNOI的第231位的甲硫氨酸被取代成赖氨酸或精氨酸(138SEQIDNOI的第233位的丝氨酸被取代成甘氨酸或天冬酰胺(139SEQIDNOI的第234位的赖氨酸被取代成谷氨酸(140SEQIDNOI的第240位的天冬酰胺被取代成甘氨酸(141SEQIDNOI的第244位的谷氨酸被取代成缬氨酸(142SEQIDNOI的第245位的酪氨酸被取代成组氨酸或谷氨酸(143SEQIDNOI的第246位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或赖氨 酸(144SEQIDNOI的第248位的亮氨酸被取代成异亮氨酸(145SEQIDNOI的第249位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸(146SEQIDNOI的第250位的丙氨酸被取代成缬氨酸(147SEQIDNOI的第251位的精氨酸被取代成丝氨酸(148SEQIDNOI的第252位的精氨酸被取代成组氨酸(149SEQIDNOI的第253位的谷氨酸被取代成甘氨酸(150)SEQ ID NO 1的第257位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺(151)SEQ ID NO 1的第261位的谷氨酸被取代成缬氨酸或丙氨酸(152)SEQ ID NO 1的第262位的丙氨酸被取代成缬氨酸(153)SEQ ID NO 1的第263位的丙氨酸被取代成丝氨酸(154)SEQ ID NO 1的第264位的苏氨酸被取代成丝氨酸(155)SEQ ID NO 1的第265位的谷氨酸被取代成丙氨酸或甘氨酸(156)SEQ ID NO 1的第268位的天冬酰胺被取代成丝氨酸、异亮氨酸或苏氨酸(157)SEQ ID NO 1的第270位的亮氨酸被取代成组氨酸、精氨酸或缬氨酸(158)SEQ ID NO 1的第271位的赖氨酸被取代成精氨酸(159)SEQ ID NO 1的第272位的精氨酸被取代成谷氨酰胺(160)SEQ ID NO 1的第277位的谷氨酸被取代成缬氨酸(161)SEQ ID NO 1的第279位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或组氨酸(162)SEQ ID NO 1的第282位的甘氨酸被取代成天冬氨酸(163)SEQ ID NO 1的第283位的亮氨酸被取代成脯氨酸(164)SEQ ID NO 1的第285位的亮氨酸被取代成精氨酸或组氨酸(165)SEQ ID NO 1的第286位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸(166)SEQ ID NO 1的第287位的苏氨酸被取代成异亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸或缬氨酸(167)SEQ ID NO 1的第288位的脯氨酸被取代成丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸(168)SEQ ID NO :1的第289位的缬氨酸被取代成丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸或 异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的Fc结合性蛋白质，其中，所述第16位至第289位的氨基酸序 列中至少发生了所述(4)、(14)、(41)和(79)中的任一个氨基酸取代。
3.根据权利要求2所述的Fc结合性蛋白质，其包含SEQID NO :2、3、4、5、114、118、130、 134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列中的第34位至第307位的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的Fc结合性蛋白质，其包含SEQID NO :2、3、4、5、114、118、130、 134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列。
5.编码权利要求r4中的任一项所述的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
6.包含权利要求5所述的多核苷酸的表达载体。
7.用权利要求6所述的表达载体转化宿主而得到的转化体。
8.根据权利要求7所述的转化体，其中，所述宿主为大肠杆菌。
9.一种Fc结合性蛋白质的制造方法，其包括通过培养权利要求7或8所述的转化体生产Fc结合性蛋白质，并从其培养物回收生产 的Fc结合性蛋白质。
10.包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料，其通过将权利要求广4中任一 项所述的Fc结合性蛋白质固定化于固相而得到。
11.一种抗体纯化方法,其包括(1)在包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料中添加包含抗体的溶液，使 该抗体吸附在该吸附材料上的步骤，其中，所述蛋白质吸附材料是将包含SEQ ID N0:114、`118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列的Fe结合性蛋白质固定化于固相而得到的；以及(2)使用ρΗ3. (Γ4. 5的缓冲液洗脱吸附于所述吸附材料的所述抗体的步骤。
全文摘要
本发明提供与野生型相比对热、酸和/或碱的稳定性提高的Fc结合性蛋白质及其制造方法，此外，还提供将该蛋白质用作亲和色谱用配体，特异性地分离包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质的方法。解决方法通过将野生型人Fc受体的处于细胞外区域的1个以上的特定氨基酸残基取代成其他氨基酸残基，能够得到与野生型人Fc受体相比、对热、酸和/或碱的稳定性提高的Fc结合性蛋白质。本发明的Fc结合性蛋白质通过例如固定化于固相，作为亲和色谱用配体是有用的。此外，使用用包含编码本发明的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的表达载体转化的宿主，表达该蛋白质，则与使用野生型人Fc受体的情况相比，蛋白质的生产量提高。
文档编号C12N15/09GK103038344SQ201180023599
公开日2013年4月10日 申请日期2011年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者畑山耕太, 朝冈义晴, 田中亨, 井出辉彦 申请人:公益财团法人相模中央化学研究所, 东曹株式会社