专利名称：由聚合物-蛋白质结合物形成的支架，产生该支架的方法及其用途的制作方法
技术领域：
在其一些实施方式中，本发明涉及聚合物-蛋白结合物(conjugate),并且更具体地，但是非排他地，涉及形成支架(scaffold)的聚合物-蛋白结合物,涉及产生支架的方法以及涉及其在例如组织工程学(tissue engineering)中的用途。
背景技术：
随着组织工程学领域的发展，对于新型生物材料支架存在需要，这些支架可以提供超过仅仅是构造和机械性的支持。新型“杂化(混合，hybrid)”材料被开发成复杂的支架，其中生物聚合物例如藻酸酯(藻酸盐)、胶原或纤维蛋白原与合成的聚合物相结合从而在材料/细胞界面处提供増加的多祥性和生物活性。从细胞相互作用的方面，杂化材料的生物域可以积极地參与朝向功能性组织的形成来刺激细胞。通过生物大分子例如蛋白区段[Cutler and Garcia, Biomaterials 2003，24:1759-1770]、生长因子[Seliktar et al. , J Biomed Mater Res A 2004，68:704-716;Zisch et al. , FASEBJ2003; 17:2260-2262; DeLong et al. , Biomaterials 2005，26:3227-3234]、或短的生物活性妝[Mann et al. , Biomaterials 2001, 22:3045-3051; Lutolf et al. , Proc Natl AcadSci U S A 2003，100:5413-5418;Stile and Healy, Biomacromolecules 2001, 2:185-194]来控制生物活性信号。这些元件能够影响细胞迁移、増殖、以及引导的分化(导向分化，guided differentiation) [Dikovsky et al. , Biomaterials 2006,27:1496-1506]。从生物材料特性的方面，还可以使用“灵巧型(smart) ”聚合物来提供响应于温度、pH、或光的改变对支架本体特征更好的控制[Furth et al. , Biomaterials 2007, 28:5068-5073; Galaevand Mattiasson, Trends Biotechnol 1999,17:335-340]。由灵巧型聚合物制造的杂化材料具有额外的自由度，包括对体积密度(松密度)、可降解性、孔隙率以及顺应性的控制，它们的全部可以通过合成的聚合物组分进行调节[Peppas et al. , Annu Rev Biomed Eng2000,2:9-29;Tsang and Bhatia, Adv Drug Deliv Rev 2004,56:1635-1647;3]BaierLeach et al. , Biotechnol Bioeng 2003,82:578-589]。已经基于内源性蛋白与多效合成聚合物相结合制备了这些杂化材料[Almanyand Seliktar, Biomaterials 2005,26:2467-2477;Gonen-ffadmany et al. , Biomaterials2007, 28:3876-3886;Peled et al. , Biomed Mater Res A 2007, 80:874-884;Seliktar, AnnN Y Acad Sci 2005，1047:386-394]。已经研究了由结合到纤维蛋白原上的聚こニ醇(PEG)制造的水凝胶的交替的结构特性对形态的影响以及胶囊化(encapsulated)平滑肌细胞的重塑[Dikovsky et al. , Biomaterials 2006, 27:1496-1506; Dikovsky et al. , Biophys J2008，94:2914-2925]。这些材料表现了通过多效合成组分通过改变多种因素例如密度、硬度、以及蛋白质分解的可降解性来控制细胞行为的能力。纤维蛋白原是用于组织重塑的天然基质，它包含数个细胞信号传导域，包括蛋白酶降解基质以及细胞粘附基序[Herrick etal.,Int J Biochem Cell Biol 1999, 31:741-746;fferb, Cell 1997,91:439-442]。
国际专利申请PCT/IL2004/001136 (公开为W02005/061018)和美国专利申请号11/472，437说明了由合成聚合物(例如聚乙二醇)交联的蛋白(例如纤维蛋白原)骨架组成的生物可降解的支架，以及从聚合物-蛋白结合物产生这类支架的方法。国际专利申请PCT/IL2008/000521 (公开为WO 2008/126092)说明了由白蛋白或合成聚合物例如聚乙二醇交联的巯基化 的胶原组成的支架。在室温下逆热响应聚合物能够产生低粘度水溶液，并且在较高温度下形成凝胶。可以使用这个特性来原位产生植入物[Cohn et al. , Biomacromolecules2005,6:1168-1175]oStile 和 Healy [Biomacromolecules 2001, 2:185-194]用包含 RGD (Arg-Gly-Asp)的肽修饰了灵巧型聚合物、N-异丙基丙烯酰胺，从而形成具有生物活性区段的可逆热敏性水凝胶用于细胞培养研究。他们报告了 RGD肽结合到该热响应灵巧型聚合物上不损害水凝胶的温度诱导的溶胶-凝胶转变。他们进一步报告了该结合的RGD肽增强了另外地惰性N-异丙基丙烯酰胺聚合物网络的生物相互作用。还报告了具有聚(环氧乙烷)(PEO)-聚(环氧丙烷)(PPO) -PEO三嵌段结构的逆热响应聚合物，称为“泊洛沙姆”。由于随着温度升高结合到PPO区段上的水分释放引起的熵增加，发生了吸热的溶胶 _ 凝胶转变[Alexandridis, Colloid Surface A 1995,96:1-46]。Plutonic F127泊洛沙姆是一种熟知的合成三嵌段共聚物(PE099-PP067-PE099)[Nagarajan and Ganesh,J Colloid Interface Sci 1996,184:489-499;Sharmaand Bhatia, Int J Pharm 2004，278:361-377;Cohn et al. , Biomaterials2003，24:3707-3714],在临界温度以上在水溶液中它表现了反向热胶凝(reverse thermalgelation, RTG)特性。Cohn 等人[PoIym Adv Tech2007; 18:731-736]报告了与 F127 相比较，聚合的F127在较低浓度下表现了反向热胶凝并且具有增强的机械特性。另外的背景技术包括Halstenberg 等人[Biomacromolecules 2002, 3:710-723] >Cohn 等人[Polym Adv Tech 2007; 18:731 - 736]、以及美国专利号 7，842，667。
发明内容
根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了包括多肽的一种结合物，该多肽具有附连(attach)到其上的至少两个聚合物部分(polymeric moieties),这些聚合物部分中至少一个表现反向热胶凝(reverse thermal gelation)。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了包括本文所述结合物交联形式的物质组合物(composition-of-matter,或物质组成),该交联形式包括彼此交联的该结合物的多个分子。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了生产本文所述物质组合物的一种方法，该方法包括将本文所述结合物多个分子的溶液从第一温度加热到第二温度，该第二温度是这样的使得在溶液中该结合物的反向热胶凝得以实现，由此生产该物质组合物。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了生产本文所述的物质组合物的一种方法，该方法包括使包括本文所述结合物的多个分子的溶液(该结合物包括至少一个交联部分)经受使交联部分实现共价交联的条件，由此产生该物质组合物。根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了体内生产本文所述物质组合物的一种方法，该方法包括(a)使包括本文所述结合物的多个分子的溶液(该结合物包括至少ー个交联部分)经受在体外实现共价交联的条件，由此生产共价交联的支架；以及(b)使该共价交联的支架在体内经受生理温度，从而在体内实现支架的反向热胶凝，由此生产该物质组合物。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了控制本文所述物质组合物的物理特性的ー种方法，该方法包括控制选自以下构成的组中的參数本文所述结合物在溶液中的 浓度、环境温度、存在或不存在引发剂、在共价交联过程中的辐射剂量、以及交联温度。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了生产本文所述结合物的ー种方法，该方法包括将ー种聚合物共价附连到一种多肽上，该聚合物和该多肽是这样的使得至少两个聚合物分子共价地附连到该多肽的分子上，其中这两个聚合物分子中至少ー个表现反向热胶凝，由此生产该结合物。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了本文所述结合物或本文所述物质组合物在制造用于修复组织损伤的药物中的用途。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了本文所述结合物或本文所述物质组合物在制备用于治疗患有特征为组织损伤或损失的失调(disorder，病症)的受试者(subject)的药物中的用途。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了在体内诱导组织形成的ー种方法，该方法包括将本文所述物质组合物植入到受试者体内，由此诱导组织形成。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了在体内诱导组织形成的ー种方法，该方法包括将本文所述结合物的多个分子植入到受试者体内，由此诱导组织形成。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了在体外(ex vivo)诱导组织形成的ー种方法，该方法包括使包括如本文所述细胞的物质组合物经受诱导(conductive)细胞生长的条件，由此诱导组织形成。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了治疗患有特征为组织损伤或损失的失调的受试者的ー种方法，该方法包括将本文所述物质组合物植入到受试者体内，由此诱导组织形成，由此治疗特征为组织损伤或损失的失调。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了治疗患有特征为组织损伤或损失的失调的受试者的ー种方法，该方法包括将本文所述结合物的多个分子植入到受试者体内，由此诱导组织形成，由此治疗特征为组织损伤或损失的失调。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了包括本文所述结合物的多个分子的ー种药物、化妆品或美容保健品(药用化妆品，cosmeceutical)组合物,该组合物被鉴定用于当与组织接触时并且进ー步当使该组合物经受生理温度时诱导组织形成。根据本发明一些实施方式的ー个方面，提供了用于诱导组织形成的ー种试剂盒，该试剂盒包括(a)本文所述的结合物；(b)水溶剂；以及(c)用于交联该结合物的水溶液从而形成用于诱导组织形成的支架的说明。根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分的每ー个表现了反向热胶凝。
根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分中至少一个进一步包括用于将该结合物的多个分子共价地彼此交联的至少一个交联部分。根据本发明的一个实施方式，该结合物具有通式X(-Y-Zm) n其中X是本文所述的多肽；Y是本文所述的聚合物部分；Z是本文所述的交联部分； n是大于I的整数；并且m是O、I或大于I的整数。根据本发明的一些实施方式，该多肽包括蛋白或其片段。根据本发明的一些实施方式，该蛋白是选自以下所组成的组细胞信号蛋白、细胞外基质蛋白、细胞粘附蛋白、生长因子、蛋白A、蛋白酶、以及蛋白酶底物。根据本发明的一些实施方式，该细胞外基质蛋白是选自以下所组成的组纤维蛋白原、胶原、纤连蛋白、弹性蛋白、原纤蛋白(fibril I in)、纤蛋白(fibulin)、波形蛋白、层粘连蛋白以及明胶蛋白(明胶，gelatin)。根据本发明的一些实施方式，该多肽包括纤维蛋白原或其片段。根据本发明的一些实施方式，该蛋白是变性的。根据本发明的一些实施方式，该多肽是一种变性的纤维蛋白原。根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分包括合成的聚合物。根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分中至少一个包括泊洛沙姆(聚(环氧乙烷-环氧丙烷)共聚物)。根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分的每一个包括泊洛沙姆。根据本发明的一些实施方式，该泊洛沙姆是F127泊洛沙姆。根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分中至少一个包括T1307聚合物。根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分是选自以下所组成的组PluronicCD聚合物和Tetron ic. 聚合物。根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分的每一个包括从I至10个交联部分。根据本发明的一些实施方式，该交联部分包括可聚合基团。根据本发明的一些实施方式，该可聚合基团是可通过自由基聚合反应来聚合的。根据本发明的一些实施方式，该可聚合基团是选自以下所组成的组丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、以及乙烯基砜。根据本发明的一些实施方式，该多肽是变性的纤维蛋白原并且这些聚合物部分包括F127泊洛沙姆。根据本发明的一些实施方式，该结合物包括F127泊洛沙姆二丙烯酸酯部分，其中这些F127泊洛沙姆二丙烯酸酯部分中每一个的丙烯酸酯基团附连到该纤维蛋白原的半胱
氨酸残基上。根据本发明的一些实施方式，该多肽是变性的纤维蛋白原并且这些聚合物部分包括T1307聚合物。根据本发明的一些实施方式，该结合物包括T1307四丙烯酸酯部分，其中这些T1307四丙烯酸酯部分中每ー个的丙烯酸酯基团附连到该纤维蛋白原的半胱氨酸残基上。根据本发明的一些实施方式，该结合物特征为在水溶液中经历反向热胶凝的能力。 根据本发明的一些实施方式，该反向热胶凝在水溶液中结合物的浓度小于10%(重量)下起作用。根据本发明的一些实施方式，该结合物的反向热胶凝将该水溶液的剪切储能模量增加了至少10倍。根据本发明的一些实施方式，该反向热胶凝将该水溶液的剪切储能模量増加到至少 20Pa。根据本发明的一些实施方式，该反向热胶凝将该水溶液的剪切储能模量从小于2Pa增加到至少20Pa。根据本发明的一些实施方式，当温度从10° C升高到55° C时发生了该反向热胶凝。根据本发明的一些实施方式，该反向热胶凝是可逆的。根据本发明的一些实施方式，该反向热胶凝形成了ー种生物可降解凝胶。根据本发明的一些实施方式，该结合物被鉴别用于产生ー种支架。根据本发明的一些实施方式，该结合物被鉴别用于可逆地产生ー种支架。根据本发明的一些实施方式，该支架是ー种水凝胶。根据本发明的一些实施方式，该水凝胶特征为在37° C温度下剪切储能模量为至少 15Pa。根据本发明的一些实施方式，该水凝胶能够经历反向热胶凝。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物是ー种水凝胶。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物是通过在水溶液中该结合物多个分子的反向热胶凝而产生的。根据本发明的一些实施方式，该结合物的多个分子非共价地彼此交联。根据本发明的一些实施方式，该结合物的交联形式是可逆的。根据本发明的一些实施方式，这些聚合物部分中至少ー个包括交联部分，并且该结合物的多个分子共价地彼此交联。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物是通过使该结合物的多个分子经受使这些交联部分交联的条件而产生的。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物特征为在37° C温度下剪切储能模量为至少20Pa。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物能够经历反向热胶凝。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物的反向热胶凝将该物质组合物的剪切储能模量増加了至少200%。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物的反向热胶凝将该物质组合物的剪切储能模量増加到至少15Pa。
根据本发明的一些实施方式，该物质组合物的反向热胶凝将该物质组合物的剪切储能模量从处于从0. 5Pa至200Pa范围中的第一值增加到高于该第一值至少20%的第二值。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物的反向热胶凝将该物质组合物的剪切储能模量从第一值增加到处于从20Pa至5000Pa范围内的第二值，该第二值比该第一值高至少20%。根据本发明的一些实施方式，当温度从10° C升高到55° C时发生了该物质组合物的反向热胶凝。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物的反向热胶凝是可逆的。
根据本发明的一些实施方式,该物质组合物特征为该物质组合物的一部分的剪切储能模量，它与该物质组合物的至少一个另外部分的剪切储能模量不同。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物是可生物降解的。 根据本发明的一些实施方式，该物质组合物进一步包括其中的细胞。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物被鉴别用于诱导组织形成。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物被鉴别用于修复组织损伤。根据本发明的一些实施方式，该物质组合物是在体内生产的。根据本发明的一些实施方式，上述第二温度是一种生理温度。根据本发明的一些实施方式，该结合物包括至少一个聚合物部分，该聚合物部分进一步包括至少一个交联部分，并且该方法进一步包括使该溶液经受使这些交联部分实现交联的条件。根据本发明的一些实施方式，在加热之前使该溶液经受实现交联的条件。根据本发明的一些实施方式，在加热之后使该溶液经受实现交联的条件。根据本发明的一些实施方式，该共价交联是在体内实现的。根据本发明的一些实施方式，在体外实现共价交联，由此生产一种共价交联的支架，并且该方法进一步包括使该共价交联的支架在体内经受一个生理温度，使得在体内实现支架的反向热胶凝，由此生产本文所述的一种物质组合物。 根据本发明的一些实施方式，这些条件包括辐射。根据本发明的一些实施方式，这些条件包括存在自由基引发剂。根据本发明的一些实施方式，该溶液进一步包括细胞，并且该方法是用于生产包括包埋在其中的细胞的物质组合物。根据本发明的一些实施方式，该结合物包括至少一个交联部分，并且该方法进一步包括共价交联该结合物的多个分子。根据本发明的一些实施方式，通过使该结合物的多个分子经受使交联部分进行共价交联的条件而实现交联。根据本发明的一些实施方式，该结合物包括至少一个交联部分，并且本文所述的组合物被鉴定以用于当进一步使该结合物的多个分子经受使该交联部分进行共价交联的条件时诱导组织形成。根据本发明的一些实施方式，本文所述的药物、化妆品或美容保健品组合物进一步包括用于诱导交联部分共价交联的引发剂。
根据本发明的一些实施方式，本文所述的药物、化妆品或美容保健品组合物被包装到ー种包装材料中并且在印刷物中、在包装材料中或其上进行标识(identify)，用于诱导组织形成。根据本发明的一些实施方式，该结合物包括至少ー个交联部分，并且该试剂盒进一歩包括用于诱导该交联部分共价交联的引发剂。根据本发明的一些实施方式，该试剂盒进ー步包括用于包埋在本文所述支架中的细胞。除非另外定义，在此使用的所有的技术的和/或科学的术语具有与本发明所属领域中ー个普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些类似的或等价的方法和材料可以用于实践或本发明实施方式的测试中，在下面说明示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，本专利说明书(包括定义)将具有支配力。此外，这些材料、方法、和实例仅是说明性的并且不g在必须进行限制。
在此參考附图仅通过举例说明本发明的一些实施方式。现在特别地详细參考附图，应当强调的是所显示的这些细节是作为举例的并且目的是本发明实施方式的说明性讨论。在此方面，參考附图的说明使本领域普通技术人员清楚如何可以实践本发明的实施方式。在这些附图中图IA和IB是显示根据本发明的一些实施方式，在室温下(R.T.)在具有三こ胺((ET)3N)的ニ氯甲烷(DCM)和甲苯的1:2的混合物中从F127泊洛沙姆和丙烯酰氯合成F127泊洛沙姆ニ丙烯酸酯(图1A)以及在具有SM脲的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中使用泊洛沙姆ニ丙烯酸酯合成F127泊洛沙姆-纤维蛋白原结合物(FF127)(图1B)的方案；图2显示了比较曲线图，这些图显示了在4、6和8mg/ml的纤维蛋白原浓度下FF127溶液的储能模量(G’)，为ー种温度函数；该插图显示了具有8mg/ml纤维蛋白原的FF127溶液的储能模量(G，)和损耗模量(G，，)；图3A和3B示出了曲线图，这些曲线图显示了具有(图3B)和不具有(图3A)FF127的化学(共价)交联的FF127溶液的储能模量，为在存在0. I或0. 01mg/ml胶原酶下，以及在缺少胶原酶下，循环温度在15° C与37° C之间改变的一种时间函数；图4是根据本发明的一些实施方式通过以温度依赖方式可逆地(非共价)交联聚合物或不可逆地UV诱导地(共价)交联而结合到聚合物(黒色)和水凝胶组件(hydrogelassembly)上的纤维蛋白原多肽的示意性说明(红色、绿色以及蓝色)；图5是ー个曲线图，该曲线图显示了通过增加环境温度(Tamb)可逆地増加了 FF127溶液的储能模量(G’)，并且随后不可逆地UV诱导地増加了该储能模量；图6示出了比较曲线图，这些图显示了在4、6和8mg/ml的纤维蛋白原浓度下化学(共价)交联的FF127的储能模量(G’)，为ー种温度函数；该插图显示了具有8mg/ml纤维蛋白原的化学(共价)交联的FF127的储能模量(G’ )和损耗模量(G”)；图7A和7B示出了曲线图，显示了振动应カ和温度改变对具有(黑色线)和不具有(虚线)化学(共价)交联(温度以1° C/秒的速率在37° C (红色线)至15° C (蓝色线)之间进行循环；振荡频率为IHz ;应变为2%)的8mg/ml FF12的水凝胶的储能模量(G’ ;图7A)和损耗模量(G” ;图7B)的影响；图8示出了ー个曲线图，该曲线图显示了通过在不同交联温度(TJ下应用UV光，随后暴露于环境温度(Tamb)(在Tamb=37° C之前，Tamb=Tcl)而交联的(共价地)FF127水凝胶(8mg/ml纤维蛋白原)的储能模量(G’ )；图9是ー个条形图，显示了使用21° C或37° C的交联温度(Td)形成的FF127水凝胶(6mg/ml纤维蛋白原)和在4° C和37° C的环境温度(Tamb)下从交联的12kDaPEG-纤维蛋白原结合物(PF12kDa)形成的水凝胶的溶胀比；图IOA和IOB是图像，显示了在21。C(图10A)或37。C(图10B)的温度下化学(共价)交联，并且然后经受37° C的环境温度的FF127(6mg/ml纤维蛋白原)水凝胶的直径(通过黑色圆圈标记);左侧图像显示立即地在化学交联之后在交联温度下的水凝胶，并且右侧图像显示了在37° C下在孵化之后化学(共价)交联的水凝胶；图11示出了比较曲线图，这些曲线图显示了在胰蛋白酶溶液中在21° C或37° C的交联温度(Tel)下通过交联FF127或12kDa PEG-纤维蛋白原结合物(PF12)而形成的水凝胶的降解(指示了这些水凝胶的储能模量(G’ )和降解半衰期(t50));图12是ー个条形图，显示了在37° C的环境温度(Tamb)下，通过交联FF127 (在21° C或37° C的交联温度(Tel)下)、12kDa PEG-纤维蛋白原结合物(PF12kDa)、或F127ニ丙烯酸酯(F127-DA)而形成的水凝胶的储能模量(G’ )；图13A和13B是说明根据本发明的一些实施方式，在室温(R.T.)下在具有SM脲的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中T1307-纤维蛋白肽结合物(FT-1307)(图13A)的合成以及该结合物的结构(图13B)的方案；图14A和14B示出了比较曲线图(图14A)和条形图(图14B)，显示了在4° C、21° C或37° C的温度下(Tel)交联的FT-1307(6mg/ml纤维蛋白原)水凝胶的储能模量(G’ )，为环境温度的函数(图14A)，以及是在37° C的环境温度下4个样品的平均值土SEM (图14B)；图15是ー个条形图，显示了在4° C和37° C的环境温度(Tamb)，在4° C、21° C或37° C的温度(Tel)下交联的FT1307水凝胶(6mg/ml纤维蛋白原)的溶胀比(Qm)；图16是ー个条形图，显示了在胰蛋白酶溶液中在4° C、21° C或37° C的温度(Tcl)下交联的FT1307水凝胶(6mg/ml纤维蛋白原)生物降解半衰期(T1/2)； 图17示出了多个图像，显示了在接种(seeding)之后3和6天接种在通过交联FF127(在21° C或37° C的交联温度下(Tel))、12kDa PEG-纤维蛋白原结合物(PEG-Fib12kDa)、或F127 ニ丙烯酸酯(F 127-DA)而形成的水凝胶中的人包皮成纤维细胞(比例尺=100um)；图18是ー个图像，显示了在接种之后3和6天接种在具有(物理的+化学的)或不具有(物理的)FF127的化学交联(在37° C的交联温度下)的FF127水凝胶中的人包皮成纤维细胞(比例尺=100 ii m)；图19是ー个曲线图，显示在21° C或37° C的交联温度(Tel)下在通过交联FF127形成的水凝胶中接种了 0或3天的人包皮成纤维细胞的活力(指示了这些水凝胶的储能模量(G，)和降解半衰期(t50))；
图20A和20B是一个图像(图20A)和一个曲线图(图20B)，显示了在将组织封装到水凝胶中之后第1、3、以及5天细胞从平滑肌组织侵入到通过交联FF127 (在21° C或37° C的交联温度(Tel)下)、或12kDa PEG-纤维蛋白原结合物(PF12kDa)形成的水凝胶中；图20B显示了侵入距离，为一个时间函数(比例尺=IOOiim)；图21是一个图像，显示了在接种到具有52、244或373Pa的储能模量的FT1307水凝胶中之后3小时、3天或6天的人包皮成纤维细胞(有活力的细胞用钙黄绿素(绿色)染色，并且无活力的细胞用胡米胺(ethidium)(橙色)染色；比例尺=IOOiim)；图22是一个图像，显示了在接种到具有52、244或373Pa的储能模量的FT1307水凝胶中之后3小时、3天或6天的HeLa细胞(有活力的细胞用钙黄绿素(绿色)染色，并且无活力的细胞用胡米胺(橙色)染色；比例尺=IOOiim)； 图23A和23B说明了根据本发明的一些实施方式，包埋在FT1307水凝胶中的接种细胞的FF127胶囊(capsule)的制备。图24A和24B是照片，显示了接种有在具有373Pa (图24A)或52Pa(图24B)的储能模量的FT1307水凝胶(6mg/ml纤维蛋白原)中包埋6天的人包皮成纤维细胞(绿色)的FF127胶囊(6mg/ml纤维蛋白原)(比例尺=200 u m)；图25A和25B是照片，显示了接种有在具有373Pa (图25A)或52Pa(图25B)的储能模量的FT1307水凝胶(6mg/ml纤维蛋白原)中包埋6天的Hela细胞(绿色)的FF127胶囊(6mg/ml纤维蛋白原)(比例尺=200ii m)；图26A和26B是照片，显示了在包埋在FT1307水凝胶(6mg/ml纤维蛋白原)中第0天(图26A)和第5天(图26B)接种有人包皮成纤维细胞(染成绿色)和Hela细胞(染成红色)的共培养物的FF127胶囊(6mg/ml纤维蛋白原)(在图26B中的虚线圆圈显示第0天细胞培养物的直径，比例尺=200 y m);以及图27A和27B是照片，显示了在包埋在FT1307水凝胶(6mg/ml纤维蛋白原)中第0天(图26A)和第5天(图26B)接种有人包皮成纤维细胞(染成绿色)和Hela细胞(染成红色)的共培养物的FF127胶囊(6mg/ml纤维蛋白原)(比例尺=200 iim)。
具体实施例方式在其一些实施方式中，本发明涉及聚合物-蛋白结合物，并且更具体地，但是非排他地，涉及形成支架的聚合物-蛋白结合物，涉及产生支架的方法以及涉及其在例如组织工程学中的用途。合成聚合物结合到天然蛋白(例如纤维蛋白原)上提供了产生生物相容性水凝胶的手段，同时控制它们的物理特性。该结合反应是旨在为该蛋白组分赋予额外的结构多样性，而不损害它的生物相容性。本发明诸位发明人以前已经披露了产生从合成聚合物(例如结合到纤维蛋白原上的聚乙二醇(PEG))制造的水凝胶的方法，它通过操纵多种因素(例如密度、硬度、以及通过多效合成组分的蛋白质分解的可降解性)能够控制形成的水凝胶的细胞行为。在寻找产生具有改进控制的水凝胶特征的水凝胶的方法中，本发明诸位发明人通过将合成的聚合物结合到蛋白上已经设计并且成功地实践了产生“灵巧(smart)”水凝胶的方法，该合成聚合物在水溶液中在临界温度以上表现了反向热胶凝(RTG)特性。
找到这种方法来生产对这些水凝胶的物理特征具有特殊控制的水凝胶，因为它允许通过选择例如导致凝胶形成的交联反应的程度和特性来操纵这些特征。因为已经掲示的是这些蛋白-聚合物结合物表现了ー种反向热胶凝特性，可以控制非共价(物理)交联的程度和发生，由此可以针对实现共价交联来选择化学条件(如果希望的话)。因此，使用光聚合交联和温度的组合，证明了对产生的水凝胶的物理特性的特殊控制。还证明了这些产生的水凝胶用作细胞和组织生长和存活的基质(例如支架)的能力。在详细说明本发明的至少ー个实施方式之前，应当理解的是本发明不必限于将它应用到在下面说明中列出的或通过实例举例说明的细节中。本发明能够具有其他实施方式并且能够以不同途径实践或执行。本发明诸位发明人已经证明了这种新型方法同时使用了Pkironic F127泊洛沙姆和Tctronic:めT1307共聚物(一种泊洛沙姆衍生物)，它们是用丙烯酰基(acryl group)进行末端官能化(end-functionalize),并且通过迈克尔型加成反应与变性的纤维蛋白原 进行反应从而形成ー种蛋白-共聚物结合物。这些示例性的聚合物结合物可以交联从而形成包括该结合物的多个单元(“单聚体”)的ー种结构。在功能化的单聚体以及从中产生的水凝胶上进行流变学测量从而表征这些结合物对环境刺激的物理反应(例如温度反应性)。因此本发明诸位发明人进ー步掲示的是这些产生的水凝胶保持它们纤维蛋白原组分的生物相容性，在使用合成的F127组分控制聚合物网络的物理特性方面具有增强的精确度的额外优点。已经显示的是该结合反应未消除F127的自组装特性，而是将它增強，因此为获得的蛋白-聚合物结合物赋予了反向热胶凝(RTG)特性。因此，已经掲示的是该泊洛沙姆-纤维蛋白原结合物在低浓度下(例如低于20mg/ml结合物)出人意料地经历了胶凝，该浓度显著地低于单独的泊洛沙姆的反向热胶凝所必需的浓度。这表明该蛋白作为扩链剂(chainextender)起作用，该扩链剂允许泊洛沙姆-蛋白结合物在这些特别低的浓度下经历胶凝。在低结合物浓度下获得水凝胶的能力对于多种应用(例如组织再生)是有利的，因为这类水凝胶更适合允许在水凝胶中进行细胞生长以及迁移。使用光聚合交联和温度的组合，证明了对产生的水凝胶的物理特性的特殊控制。还证明了这些产生的水凝胶用作细胞和组织生长以及存活的基质的能力。现在參考这些附图，图IA和IB表现了ー种示例性F127泊洛沙姆-纤维蛋白原结合物的合成。图2显示了在不同浓度下(包括在结合物浓度低于20mg/ml下)通过升高温度(SP反向热胶凝)该结合物的胶凝。这类浓度低于允许单独的F127泊洛沙姆的反向热胶凝的浓度，表明通过用作扩链剂，结合到纤维蛋白原上增强了泊洛沙姆的RTG特性。图3A和3B显示该结合物的反向热胶凝是可逆的，从而胶凝可以被反复诱导和逆转，甚至在该结合物已经被共价地结合之后(图3B)。图6显示了在不同浓度下共价交联的结合物的反向热胶凝。。图4表现了两种类型的交联，该结合物的分子可以经历这些交联从而形成ー种水凝胶；结合物分子的ー种可逆的温度依赖性交联(通过反向热胶凝)，通过UV光诱导的ー种不可逆交联。图5显示了因结合物分子的可逆和不可逆交联两者引起的剪切储能模量的增カロ。
图7A和7B显示了示例性共价交联的水凝胶和非共价交联的水凝胶对应力反应的不同行为。图7A和7B还显示在响应于应力塌缩之后，在降低和升高温度之后两种类型的水凝胶完全恢复从而取消或恢复该反向热胶凝。图8和12显示示例性共价交联的水凝胶的剪切储能模量强烈地依赖于该结合物共价交联的温度。图11显示交联温度对生物可降解性的影响是显著地更弱的，并且该生物可降解性更多地被结合到该蛋白上聚合物类型的影响。
图9-10B显示共价交联的泊洛沙姆-纤维蛋白原水凝胶的溶胀性是温度依赖性的(与交联的PEG-纤维蛋白原水凝胶相反)，并且显示该温度依赖性程度被交联温度影响。图13A和13B表现了示例性的T1307-纤维蛋白原结合物的合成，其中在该结合物中每个T1307部分包括三个丙烯酸酯交联部分。图14A和14B显示共价交联的T1307-纤维蛋白原水凝胶的剪切储能模量强烈地依赖于该结合物共价交联的温度。图15显示共价交联的T1307-纤维蛋白原水凝胶的溶胀性是温度依赖性的，并且显示该温度依赖性程度是被交联温度影响的。图16显示该生物可降解性不是清楚地与交联温度相关联。在图14A-16中提供的结果表明包含T1307的水凝胶的特性类似于包含F127泊洛沙姆的水凝胶的特性。图17-22和24A-27B显示这些示例性水凝胶可以用作细胞生长和侵入的基质，并且显示细胞生长和侵入的速率和类型依赖于这些水凝胶的共价交联温度。图26A-27B显示在不同细胞类型的共培养物中不同水凝胶特性对细胞生长的影响。图23A和23B表现了用于制备具有一组物理特性的水凝胶胶囊的一个示例性过程，其包埋在具有一个不同组的物理特性的水凝胶中。因此，已经证明的是根据本发明示例性实施方式的聚合物-纤维蛋白原结合物可以容易地交联从而形成水凝胶支架。此外，可以容易地结合非共价和共价交联。这些水凝胶表现高柔性、生物可降解性、良好的生物功能性并且支持细胞扩展和侵入，以及可以通过多种参数容易控制的剪切储能模量。进行共价交联的温度对于控制剪切储能模量是特别有用的，因为它对其他特性(例如生物可降解性)具有较小影响。根据本发明的一个方面，提供了包括多肽的一种结合物，该多肽具有附连到其上的至少两个聚合物部分，这些聚合物部分中至少一个表现反向热胶凝。在一些实施方式中，这些聚合物部分中每一个表现了反向热胶凝。如在此使用的,短语“反向热胶凝(逆热胶凝，reverse thermal gelation)”说明了一种特性，由此当温度升高时物质(例如一种化合物的水溶液)的粘度增加。粘度增加可以是例如从液态转化成半固态(例如凝胶)，从液态转化成更粘的液态，或从半固态转化成更硬的半固态。在此，通过术语“胶凝”包括所有这类转化。影响胶凝的温度升高可以是在任何两个温度之间。可选地，在0° C至55° C范围内的温度下实现胶凝。在此，如在此说明的，认为当相应于一个聚合物部分的聚合物(例如，未附连到上述多肽上的聚合物)的水溶液表现反向热胶凝时，该聚合物部分表现反向热胶凝。多种聚合物表现反向热胶凝。每个聚合物可以通过临界胶凝温度(criticalgelation temperature)来表征,其中在临界胶凝温度下或在高于临界胶凝温度的温度下实现胶凝。
在此，“临界胶凝温度”是指观察到材料的某些胶凝的最低温度(例如剪切储能模量的増加)。可以选择该聚合物部分从而给予包含它的结合物ー种反向热胶凝，该反向热胶凝的特征为在ー个温度范围内(例如在0° C至55° C的范围内)的临界胶凝温度，这允许通过暴露于高于和/或低于临界胶凝温度的环境温度而方便地操纵该结合物的特性。例如可以基于结合物的预期用途或预期特性来选择该聚合物的临界胶凝温度。例如，可以选择临界胶凝温度使得该结合物在生理温度下处于凝胶状态但是在室温下则不是这样，从而可以在体内实现胶凝。在另ー个实例中，可以选择临界胶凝温度使得该结合物在室温下处于凝胶状态但是在中等低温下则没有这样，从而可以实现胶凝(例如，通过从制冷装置中取出)。该聚合物部分可选地包括ー种合成的聚合物。泊洛沙姆(例如F127泊洛沙姆)是示例性聚合物，这些聚合物在适合本发明实施方式的温度下表现反向热胶凝。
如在此以及在本领域中使用的，“泊洛沙姆”是指具有PE0-PP0-PE0结构的聚(环氧こ烷)(PE0)_聚(环氧丙烷)(PPO)嵌段共聚物。适当的泊洛沙姆是可商购的，例如作为Pluron ic波聚合物。典型地，通过在分子之间形成非共价连接(例如，通过疏水性相互作用、离子相互作用、和/或氢键)来调节反向热胶凝，其中响应于温度的升高，非共价交联程度増加。在此，“非共价”交联(由于反向热胶凝而形成的)也称为“物理”交联或称为“非化学交联”。因此，该非共价交联可以理解为ー种温度依赖性交联。该聚合物部分可以包括实现非共价交联的ー个或多个部分(例如，疏水性部分)。胶凝程度和在其下实现胶凝的条件(例如温度)可以可选地由參与非共价交联的多个部分的特性和数量控制。该聚合物部分可以包括从I至高达100个以及甚至1000个參与非共价交联的部分。在多个实施方式中，这类部分的数量越多，并且这些部分越大(例如分子量越高)，在其下实现胶凝的温度越低。该聚合物部分可以包括一个或多个类型的实现交联的部分。这些部分可以通过相同的分子间相互作用(例如疏水性相互作用)或通过不同的分子间相互作用(例如疏水性和离子性相互作用)来实现非共价交联。表现反向热胶凝的聚合物(本领域中也称为RTG聚合物)包括但不限于聚(N-异丙基丙烯酰胺)，在温度高于约32-33° C下它经历反向热胶凝，及其共聚物(例如，聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-ニ甲基-Y-丁内酷)、聚(乙ニ酉事)-聚(氨基尿烧)(poly (ethylene glycol) -poly (amino urethane), PEG-PAU)嵌段共聚物、聚(e -己内酷)-聚(こニ醇)(PCL-PEG)嵌段共聚物(例如，PCL-PEG-PCL)、以及聚(甲基2-丙酰氨基丙烯酸酯)。此外，已经说明了具有PEG和疏水性寡肽侧基的聚有机磷腈类(它们提供了分子间疏水性相互作用)，它们在35-43° C的温度下形成凝胶[Seong etal. , Polymer 2005,46:5075-5081]。例如，泊洛沙姆部分包括调节胶凝的ー种疏水性PPO部分。聚合物部分可以可选地包括一个这样的PPO部分，或可替代地，多个这样的部分(例如，2、3、4、等，高达100以及甚至1000个这样的部分)。类似地，PCL-PEG共聚物包括亲水性PEG和一个相对疏水性的聚(e -己内酷)(PCL)部分，并且PEG-PAU共聚物包括亲水性PEG和一个疏水性聚(氨基尿烷)(PAU)部分(例如，双-1，4-(羟乙基)哌嗪-1，6- 二异氰酰六亚甲基缩聚物部分)。因此，总体上，可以从亲水性和疏水性构造单元的组合来制备表现反向热胶凝的许多嵌段共聚物。在一些实施方式中，每个聚合物部分包括泊洛沙姆(例如，F127泊洛沙姆)。可选地，聚合物部分包括一个泊洛沙姆。可替代地或另外地，至少一个聚合物部分包括多个泊洛沙姆部分。包括多个泊洛 沙姆部分的聚合物是可例如以Tetronic 聚合物形式来商购的。T1307(例如，Tetronic T1307)是包括四个泊洛沙姆部分的一种示例性聚合物。根据可选的实施方式，这些聚合物部分中至少一个进一步包括用于将该结合物的多个分子共价地交联到彼此上的至少一个交联部分。可选地，该聚合物部分包括从I至10，可选地从I至5，并且可选地从I至3个交联部分。应当注意的是在此使用表述“交联部分”用来说明附连到聚合物部分(例如，端基或侧基)上的多个部分，或它们形成该聚合物部分的整体部分，然而如上文中所述，它与实现非共价交联的聚合物部分中的那些部分不同。因此，如在此使用的“交联部分”说明了如在此定义的在该结合物的分子之间实现共价交联的聚合物部分上的多个部分。在此，“共价交联”(在此也称为“化学交联”)是指在两个或更多个分子之间(例如本文所述的两个结合物分子)形成一个共价键(“交联”)。一个分子可以附连到多个其他分子上，每个其他的分子通过一个不同的共价键进行附连。因此，可以将多个分子(例如，至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个)连接到一起。可选地所述的结合物可以通过下面通式来表示X(-Y-Zm) n其中X是如本文所述的多肽，Y是如本文所述的聚合物部分，Z是如本文所述的交联部分，n是大于I的整数(例如，2、3、4以及高达20)，并且m表示每个聚合物部分的交联部分的数量。因此，在缺少可选交联部分的实施方式中m是0，并且在包括该可选交联部分的实施方式中m是I或大于I的整数。应当理解的是因为上式包括多于一个-Y-Zm部分，在结合物中不同的-Y-Zm部分可以可选地具有针对m的不同数值。如在此使用的，短语“交联部分”是指通过实现与另一个分子(例如，另一个结合物)的官能团共价交联的能力表征的一个部分(例如，一个官能团)。根据可选的实施方式，该交联部分能够实现与本文所述的结合物类似和/或相同的结合物交联(例如，包括与本文所述的结合物的交联部分化学相关联和/或完全相同的交联部分的一种结合物)。因此，本文所述的交联部分提供了具有经历共价交联能力的一种结合物，相反地如本文所述表现反向热胶凝的聚合物部分提供了具有经历非共价结合(自组装)能力的结合物。因此，在不具有交联部分的实施方式中(例如，其中在通式中m是0)，可以通过非共价结合聚合物部分而单独地实现结合物的交联，相反地在具有交联部分的实施方式中(例如，其中在该通式中m是I或更大)，如在此更详细讨论的，可以通过非共价交联和/或通过共建交联来实现结合物的交联。适合用于本发明实施方式上下文中的示例性交联部分包括但不限于如在下面进一步详述的可聚合基团。因此，在一些实施方式中，该交联部分包括一种可聚合的基团，从而可以通过可聚合基团的聚合反应来实现交联。在本发明实施方式的上下文中，这些可聚合的基团可以用作単体，由此这些可聚合基团的聚合反应交联了包括这些可聚合基团的结合物。多个可聚合基团是本领域已知的，包括易于经历自由基聚合反应的基团(例如不饱和的基团)，以及易于通过开环作用经历聚合反应的环基(例如内酯类)。例如可以通过光引发(在适当光的存在下，例如365nm)，通过化学交联(在自由基供体的存在下)和/或加热(在适当的温度下)来实现聚合反应。在一些实施方式中，选择ー种可聚合基团使得其聚合反应可以在对活细胞无害的 相对温和的条件下来实现。例如，这些聚合反应条件可选地是充分地无毒的和无害的从而适合在体内实现聚合反应(如本文所述)。应当注意的是在交联剂的存在下还可以实现共价交联。这样的试剂典型地是ー种双官能的化学部分，该化学部分能够与该交联基团进行反应。这些实例包括但不限于在两端处用ー种反应基团进行封端的PEG，该反应基团能够容易地与该交联基团进行反应。在一些实施方式中，该可聚合基团可以通过自由基聚合反应进行聚合。这类基团的实例包括但不限于丙烯酸酷、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、以及こ烯基砜。根据可选的实施方式，该结合物包括聚合物部分，该聚合物部分包括可以附连到一个多肽上的多个交联部分。例如，丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、以及こ烯基砜，除了作为可聚合的基团之外，还适合于通过迈克尔型加成(Michael-typeaddition)附连到巯基基团上(例如,半胱氨酸残基)。因此，如在本文中实施例部分中举例说明的，聚合物部分可以包括多个这样的部分(例如，丙烯酸酷)，它们中的一个将聚合物部分附连到该多肽上，剩下的部分是如本文所述的交联部分。因此，在示例性实施方式中，该结合物包括泊洛沙姆ニ丙烯酸酯(例如，F127泊洛沙姆ニ丙烯酸酷)部分，其中在每个部分中ー个丙烯酸酯部分附连到一种多肽(例如，变性的纤维蛋白原)的半胱氨酸残基上，并且ー个丙烯酸酯基团用作一个交联部分。在另外的示例性实施方式中，该结合物包括一个聚合物四丙烯酸酯(例如，T1307四丙烯酸酷)部分，其中在每个部分中一个丙烯酸酯基团附连到一种多肽(例如变性的纤维蛋白原)的半胱氨酸残基上，并且三个丙烯酸酯基团用作结合部分。该结合物的多肽是至少10个氨基酸长度，可选地至少20个氨基酸长度，并且可选地至少50个氨基酸长度。如在此使用的术语“多肽”包括天然多肽(降解产物、合成方式合成的多肽亦或重组体多肽)和模拟肽(典型地，合成方式合成的多肽)，以及作为多肽类似物的类肽(peptoid)和半类肽(semipeptoid),它们可以具有例如在体内使这些多肽更稳定,或更加能够穿透进入细胞中的修饰。这类修饰包括但不限于N-端修饰、C-端修饰、肽键修饰,包括但不限于 CH2-NH、CH2-S、CH2-S=0、0=C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S=C-NHXH=CH 或 CF=CH、主链修饰、以及残基修饰。用于制备模拟肽化合物的方法是本领域熟知的并且例如在QuantitativeDrug Design, C. A. Ramsden Gd. , Chapter 17. 2, F. Choplin Pergamon Press (1992)中进行详细说明，通过引用将它结合在此如同在此完全列出。这个方面进一步详细情况在下面进行提供。该肽内的肽键(-C0-NH-)可以例如由以下所替代N_甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C (R) H-C-O-O-C (R) -N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、-氮杂键(-NH-N (R) -CO-)，其中R是任何烷基，例如，甲基、羰键(-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯属双键(-CH=CH-)、反酰胺键(-NH-C0-)、肽 衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中 R是自然地出现在碳原子上的"正常"侧链。这些修饰可以出现在沿着该多肽链的这些键的任何一个上或甚至同时在数个(2-3个)上。如遍及本文中使用的，术语“氨基酸”或“氨基酸类”应当理解包括20个天然发生的氨基酸；通常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸以及鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。根据可选的实施方式，该多肽包括蛋白或其片段。该蛋白可以是一种天然存在的蛋白(例如，在真核和/或原核生物、细胞、细胞材料、非细胞材料等中存在的蛋白)或与天然发生的蛋白相似的多肽(例如，至少90%相似性，可选地至少95%相似性、以及可选地至少99%相似性)。在一些实施方式中，该蛋白(或蛋白片段)是变性的。应当理解的是本文所述的蛋白可以可选地包括多于一个多肽链。在包括特征为多于一个多肽链的蛋白的实施方式中，本文所述的结合物可选地包括该蛋白的一个多肽。可替代地，本文所述的结合物包括该蛋白的多个多肽(例如，该蛋白的全部多肽)。可选地，多个多肽连接在一起(例如通过非共价和/或共价键)从而形成一种多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、六聚体等)，该多聚体具有附连到其上的至少两个聚合物部分(如本文所述)。可选地，本发明的多肽是分离的(例如通过将蛋白质变性而分离)，使得本文所述的结合物是不同结合物种类的混合物，其中这些结合物种类的每一个包括一种不同的多肽。可选地，对该多肽(例如，蛋白或蛋白片段)进行选择从而表现一种生物活性。可选地，该生物活性包括支持细胞生长和/或侵入。表现生物活性(该生物活性在本发明实施方式的上下文中是有利的)的蛋白实例包括但不限于细胞信号蛋白、细胞外基质蛋白、细胞粘附蛋白、生长因子、蛋白A、蛋白酶、以及蛋白酶底物。可选地，该蛋白是细胞外基质蛋白。根据可选的实施方式，该多肽包括一种纤维蛋白原多肽(纤维蛋白原的a、@和/或Y链)或其片段。可选地，本文所述的结合物包括纤维蛋白原的a、0和Y链。在示例性实施方式中，该多肽是一种变性的纤维蛋白原(例如，纤维蛋白原的变性和Y链的混合物)。细胞外基质蛋白的实例包括但不限于纤维蛋白原(例如，a -链-GenBank登录号 NP_068657 ; P -链-GenBank 登录号 P02675 ; Y -链-GenBank 登录号 P02679)、胶原(例如，GenBank登录号NP_000079)、纤连蛋白(例如，GenBank登录号NP_002017)、波形蛋白(例如，GenBank登录号NP_003371)、弹性蛋白、原纤蛋白、纤蛋白、层粘连蛋白(例如，GenBank登录号NP_000218)以及明胶。细胞信号传导蛋白的实例包括但不限于p38丝裂原(mitogen)活化蛋白激酶(例如GenBank登录号NP_002736)、细胞核因子k B(例如，GenBank登录号NP_003989)、Raf 激酶抑制剂蛋白(RKIP)(例如，GenBank 登录号 XP_497846)、Raf-I (例如，GenBank登录号NP_002871)、MEK (例如，GenBank登录号NP_002746)、蛋白激酶C (PKC)(例如，GenBank登录号NP_002728)、磷酸肌醇-3-激酶Y (例如，GenBank登录号NP_002640)、受体酪氨酸激酶例如胰岛素受体(例如，GenBank登录号NP_000199)、异构三聚体G-蛋白(例如，Galpha (i)-GenBank 登录号 NP_002060 ；Galpha (s)-GenBank 登录号 NP_000507 ；Galpha(q)-GenBank 登录号 NP_002063)、小窝蛋白 _3(例如，GenBank 登录号 NP_001225)、微管相关蛋白1B、以及14-3-3蛋白(例如，GenBank登录号NP_003397)。细胞粘附蛋白的实例包括但不限于整联蛋白(例如，GenBank登录号NP_002202)、胞间粘附分子(ICAM) I (例如，GenBank登录号NP_000192)、N-CAM(例如，GenBank登录号 NP_000606)、钙粘着蛋白(例如，GenBank登录号NP_004351)、生腱蛋白(tenascin)(例如，GenBank登录号NP_061978)、gicerin(例如,GenBank登录号NP_006491)、以及神经损伤诱导蛋白 2 (ninjurin2)(例如，GenBank 登录号 NP_067606)。生长因子的实例包括但不限于表皮生长因子(例如，GenBank登录号NP_001954)、转化生长因子(例如，GenBank登录号NP_000651)、成纤维细胞生长因子-酸性(例如，GenBank登录号NP_000791)、成纤维细胞生长因子-碱性(例如，GenBank登录号NP_001997)、促红细胞生成素(例如，GenBank登录号NP_000790)、血小板生成素(例如，GenBank登录号NP_000451)、神经突生长因子、肝细胞生长因子(例如，GenBank登录号NP_000592)、胰岛素样生长因子-I (例如，GenBank登录号NP_000609)、胰岛素样生长因子-II (例如，GenBank 登录号 NP_000603)、干扰素-Y (例如，GenBank 登录号 NP_000610)、以及血小板衍生生长因子(例如，GenBank登录号NP_079484)。蛋白酶的实例包括但不限于胃蛋白酶(例如，GenBank登录号NP_055039)、低特异性胰凝乳蛋白酶、高特异性胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶(例如，GenBank登录号NP_002760)、羧肽酶(例如，GenBank登录号NP_001859)、氨肽酶(例如，GenBank登录号NP_001141)、脯氨酸-肽链内切酶(例如，GenBank登录号NP_002717)、金黄色葡萄球菌V8蛋白酶(例如，GenBank登录号NP_374168)、蛋白酶K(PK)(例如，GenBank登录号P06873)、天冬氨酸蛋白酶(例如，GenBank登录号NP_004842)、丝氨酸蛋白酶类(例如，GenBank登录号NP_624302)、金属蛋白酶(例如，GenBank 登录号 NP_787047)、ADAMTS17 (例如，GenBank 登录号NP_620688)、类胰蛋白酶-Y (例如，GenBank登录号NP_036599)、蛋白裂解酶_2(例如，GenBank 登录号 NP_694564)。蛋白酶底物的实例包括作为蛋白酶蛋白靶的肽或肽序列。例如，赖氨酸和精氨酸是用于胰蛋白酶的靶；酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸是用于胰凝乳蛋白酶的靶。可以从分子生物试剂的任何已知供应商获得这类天然发生的蛋白。如在下面实例部分中举例说明的，已经出人意料地揭示的是包括如本文所述多肽和表现热胶凝的至少一个聚合物部分的结合物可以为该结合物提供经受反向热胶凝的能力。
因此，根据可选的实施方式，该结合物特征为如本文所述的，在水溶液中经受反向热胶凝的能力。可选地,在低于55° C的温度下,可选地低于50° C，，可选地低于40° C,并且可选地低于30° C，发生该结合物的反向热胶凝。可选地，在低于约37° C的温度下发生该反向热胶凝，使得在约37° C的生理温度下，该结合物处于凝胶状态。可选地，在高于0° C的温度下，可选地高于10° C，，可选地高于20° C，并且可选地高于30° C，发生该结合物的反向热胶凝。在一些实施方式中，当温度从0° C升高到55° C时，可选地从10° C至55° C，可选地从10° C至40° C，可选地从15° C至37° C，并且可选地从20° C至37° C，发生该结合物的反向热胶凝。当温度从室温(例如约20° C、约25° C)升高到生理温度(例如，约37° C)时发生的反向热胶凝对于一些应用(例如医学应用)是特别有用的，因为胶凝可以通过将该结合物从室温环境转移到生理温度来诱导(例如，通过将该结合物安置在体 内)。如在此举例说明的，结合物溶液发生胶凝的温度可以通过改变该结合物的浓度来控制。此外，该胶凝温度可以通过用适合包含在该聚合物部分中的胶凝温度选择聚合物，和/或通过改变表现反向热胶凝的聚合物部分的浓度(例如，通过改变附连到多肽上聚合物部分的数量和/或通过改变这些聚合物部分的尺寸)来进行控制。如在实施例部分中进一步举例说明的，包含本文所述结合物的水溶液能够以较低浓度经受反向热胶凝，例如小于20重量％ (重量百分比)的结合物，可选地小于10重量％，可选地小于5重量％，以及可选地小于2重量％。不受任何具体理论的限制，应当相信的是一种多肽结合到表现反向热胶凝的一种聚合物上作为聚合物的链延伸来起作用，它降低了胶凝所需要的最小浓度。应当注意的是至今从未报道过生物特性或起源(例如多肽)的扩链剂现象。可以通过测量包含如本文所述的结合物的水溶液的剪切储能模量来确定它的反向热胶凝。储能模量温度依赖性增加表明通过反向热胶凝凝胶的形成。如在此和本领域中使用的，“剪切模量”被定义为剪应力与剪应变的比率。剪切模量可以是一个复变量(complex variable),在这种情况下该“储能模量”是实分量并且该“损耗模量”是虚分量。粘弹性固体中的储能模量和损耗模量测量了储能，表示弹性部分，并且以热的形式耗散的能量，表示粘性部分。在一些实施方式中，本文所述的反向热胶凝将该结合物水溶液的剪切储能模量(在此也称作“储能模量”或称作“G’”)增加了至少十倍，可选地至少30倍，可选地至少100倍，以及可选地至少300倍。在一些实施方式中，本文所述的反向热胶凝将该水溶液的剪切储能模量增加到至少5Pa，可选地至少15Pa，可选地至少20Pa，可选地至少50Pa，可选地至少lOOPa，以及可选地至少200Pa。在一些实施方式中，在反向热胶凝之前(例如在温度低于胶凝发生的温度下)包含该结合物的水溶液的剪切储能模量是小于2Pa，可选地小于IPa，可选地小于0. 5Pa，以及可选地小于0. 2Pa。
根据可选的实施方式，该反向热胶凝是可逆的，即通过升高温度获得的凝胶状态可以通过降低温度回复到非凝胶状态，该非凝胶状态具有与在该反向热胶凝之前存在的基本上相同的特性。可逆胶凝是有利的，因为可以通过使该凝胶状态的至少一部分回复到非凝胶状态(通过降低温度)，紧接着以希望的形式形成凝胶状态(通过升高温度)来改变和/或重建凝胶状态。此外，在使用产物之前(例如存储的产物)可逆的胶凝不会由于胶凝而发生产物损坏，因为在施用产物之前任何这样的胶凝可以被消除(通过冷却)。可选地，在升温和降温的多个循环期间(例如至少10个循环，至少50个循环)该胶凝是可逆的。可选地，通过结合物水溶液的反向热胶凝形成的凝胶是一种生物可降解的凝胶，即在与组织和/或细胞接触时(例如通过蛋白水解作用和/或水解)该凝胶降解。生物可降解的材料可用于多种医学应用中，例如作为临时植入物。此外，生物可降解的材料高度适合作为支持细胞生长和/或迁移的基质，因为细胞生长和/或迁移是与周围基质的降解相关联的。
如在下面实施例部分中举例说明的，通过本文所述的结合物溶液的反向热胶凝形成的凝胶可以用作适合细胞生长、铺展、扩展、和/或侵入的基质。因此，本文所述的结合物可选地被鉴定用于产生支架(如在此定义的)。可以通过该结合物的反向热胶凝(例如通过结合物的非共价交联)和/或通过该结合物的共价交联来产生支架。因此本文所述的结合物也可以称作用于产生支架的前体分子。因此，通过将多个前体分子交联(共价地和/或非共价地)到彼此上来形成该支架。如在此使用的，术语“支架”说明了一个二维的或一个三维的支撑框架。根据本发明实施方式的支架由在其间交联的前体单元组成(包括如组成所述的结合物)。在一些实施方式中，支架可以用作细胞生长、附着和/或铺展(spreading)的支持物，并且因此有助于组织产生和/或组织修复。在一些实施方式中，支架保持由其支持的组织和/或细胞克隆希望的形状。在示例性实施方式中，该支架是一种水凝胶，即从该结合物形成的凝胶包括其中吸收的水，例如来自经历胶凝的结合物水溶液的水。如在此使用的并且是本领域熟知的，术语“水凝胶”是指一种材料，该材料包括由水溶性的天然的或合成的聚合物链形成的固体网络，典型地包含多于99%的水。可选地，该水凝胶特征为在37° C下至少15Pa (可选地至少50Pa，可选地至少IOOPa,以及可选地至少200Pa)的剪切储能模量。可选地，该支架的产生是可逆的。在其中通过反向热胶凝产生支架的实施方式中，可逆支架的产生是可选地获得的(如在上面讨论的)。可选地，通过与反向热胶凝不同的方法，例如通过共价交联来产生该支架。获得的支架(例如，水凝胶)可选地能够进一步经受反向热胶凝。进一步可选地，该支架是通过反向热胶凝而产生的，并且此后进一步经受共价交联(如在此讨论的)。如在此讨论的，本文所述的结合物可以通过非共价(物理)交联和/或通过共价(化学)交联来进行交联。因此，根据本发明实施方式的另一个方面，提供了包括本文所述的结合物的交联形式的一种物质组合物(例如，一种支架或一种水凝胶)。因此，该物质组合物包括交联到彼此上的结合物的多个分子。应当理解的是虽然为了简单性的目的该物质组合物在此描述为包括一种结合物，包括多个结合物种类的物质组合物(例如不同结合物的混合物)是被术语“物质组合物”包括的。在一些实施方式中，这些结合 物分子是非共价地交联的。可选地，这些分子是仅非共价地交联的(S卩，不存在实质性的共价交联)。可以通过在溶液(优选地水溶液)中非共价地和/或共价地交联这些结合物分子来可选地产生本文所述的物质组合物。可选地，该溶液保持吸收到该交联的结合物中，例如以凝胶形式(例如水凝胶)。可选择适合实现上述共价和/或非共价交联的溶液。在一些实施方式中，该溶液是一种水溶液。可以通过对水溶液中(例如，如在此说明的)结合物分子进行反向热胶凝来可选地产生仅包括非共价交联的物质组合物。可选地，如本文所述，该非共价交联形式是可逆的。在一些实施方式中，这些结合物分子是共价交联的。在这类实施方式中，该结合物包括一个交联部分(如本文所述)。通过使多个结合物分子经受用于实现这些结合物分子交联部分的共价交联的条件来可选地产生该物质组合物。可选地，该共价交联的物质组合物特征为在37° C下剪切储能模量为至少20Pa，以及可选地至少50Pa，可选地至少lOOPa，可选地至少200Pa，以及可选地至少300Pa。在一些实施方式中，除了共价交联之外，物质组合物包括非共价交联。例如，包括共价交联的物质组合物能够经受反向热胶凝(例如，一种可逆的反向热胶凝)。共价交联的物质组合物的这样的反向热胶凝可以将该物质组合物的剪切储能模量可选地增加至少20%，可选地至少50%，可选地至少200%，可选地至少400%，以及可选地至少 900%。在反向热胶凝之前该剪切储能模量可选地是在从0. 5Pa至200Pa的范围内，可选地在从0. 5Pa至IOOPa的范围内，以及可选地在从IOPa至IOOPa的范围内。在反向热胶凝之后该剪切储能模量是可选地至少15Pa，以及可选地在从20Pa至5000Pa的范围内，可选地从20Pa至lOOOPa，可选地从20Pa至500Pa，以及可选地从50Pa至500Pa。可选地，共价交联的物质组合物的反向热胶凝是在本文所述的用于结合物胶凝的温度下。如在下面实施例部分中举例说明的，物质组合物可以表征为该物质组合物一个部分的剪切储能模量与该物质组合物至少一个其他部分的剪切储能模量不同。每个部分可以独立地表征为非共价交联、共价交联或非共价和共价交联的组合(例如，如上文中说明的)。例如可以使用结合物的两种溶液(例如，不同结合物的溶液和/或具有不同浓度结合物的溶液)来制备这样的物质组合物。可选地，交联一种溶液用来获得第一物质组合物(例如，如在此说明的)，从而将该第一物质组合物加入到该第二溶液中。当交联该第二溶液时(例如，在不显著地影响该第一物质组合物的条件下)，可以获得具有不同特性部分的一种物质组合物。无论交联的类型(非共价和/或共价)如何，本文所述的物质组合物是可选地可生物降解的。在一些实施方式中，将交联结合物网络中的多肽结合到该物质组合物中使得当生物降解该多肽时该物质组合物生物降解。
根据可选的实施方式，该物质组合物进一步包括其中的细胞(优选地活细胞)。这些细胞可以包括一种细胞类型或两种或更多种细胞类型。本文所述的物质组合物可以例如通过用作支持细胞生长和/或侵入的基质，和/或通过提供诱导组织形成的细胞(例如包埋在物质组合物中)来诱导组织形成。这类特性可以用于修复组织损伤。因此，在一些实施方式中，该物质组合物被鉴定用于诱导组织形成(如在下面更详细地讨论的)。在一些实施方式中，该物质组合物被鉴定用于修复组织损伤(如在下面更详细地讨论的)。可以通过多种方法来制备本文所述的物质组合物，取决于物质组合物的类型，以及具体地，取决于该物质组合物中交联的类型(即非共价的和/或共价的)。因此，根据本发明实施方式的另一个方面，提供了生产包括非共价交联(例如，如本文所述)的物质组合物的方法。该方法包括将包括如本文所述结合物的多个分子的溶液(例如，水溶液)从第一温度加热到第二温度。该第二温度是这样的使得在溶液中该结合物的反向热胶凝得以实现，由此生产了具有非共价交联的物质组合物。该第二温度是处于或高于该前体结合物临界温度的一个温度(如在上文中详述的)。可选地，在体内，例如通过加热到生理温度(例如约37° C)来生产该物质组合物。可以简单地通过使该结合物的溶液与身体接触来实现这种加热。在一些实施方式中，该结合物是包括本文所述的至少一个交联部分的结合物，并且该方法进一步包括使该结合物溶液经受实现交联这些交联部分的条件(例如，在上述加热之前，在加热之后，或与加热相伴)。可以可选地实现这些交联部分的交联，从而获得包括非共价交联和共价交联两者的物质组合物。根据本发明实施方式的另一个方面，提供了生产包括共价交联(例如，如本文所述)的物质组合物的一种方法。该方法包括使包括本文所述的结合物的多个分子的溶液(其中该结合物包括至少一个交联部分(如本文所述))经受实现这些交联部分共价交联的条件，由此生产具有共价交联的物质组合物。可选地，该共价交联在体内实现。可替代地，该共价交联是在体外实现的。可选地，该方法进一步包括例如通过暴露于反向热胶凝发生的温度来形成非共价交联。在一些实施方式中，在体外实现共价交联，由此生产一种共价交联的支架，并且该方法进一步包括使该共价交联的支架在体内经受生理温度(例如，通过使该支架与身体接触)，使得该支架的反向热胶凝在体内得以实现，由此在体内生产包括非共价交联和共价交联的物质组合物。
在一些实施方式中，该结合物的溶液进一步包括细胞。因此，该方法生产了包括其中包埋的细胞的物质组合物(如本文所述)。实现交联这些交联部分的条件将取决于这些交联部分的化学特性。用于实现交联的多种条件是本领域已知的。例如，可以通过辐射(例如，通过UV光，通过可见光，通过电离辐射)，或通过引发剂(例如，自由基供体)和/或加热来实现交联。优选地，用于实现共价交联的条件是生物相容的，S卩，将认为无害的试剂或条件用于体内应用中。根据本发明一个可选的实施方式，该交联是通过用UV进行照射(例如在约365nm的波长下)。如在此使用的，术语“约”是指土 10%。当体内交联时，优选地避免有害的辐射剂量。无害的最大剂量将取决于例如辐射类型(例如，波长)，以及取决于暴露于辐射的身体部分。本领域技术人员将能够容易地确定一个剂量是否有害或无害。在一些实施方式中，这些条件包括存在被加入用来有助于交联的弓I发剂。可选地，该引发剂能够实现交联而无需辐射。可替代地，该引发剂是一种光引发剂，该光引发剂在辐照(例如UV光，可见光)存在下实现交联。添加光引发剂典型地将使人们能够使用较低剂量的UV光进行交联。如在此使用的，术语“光引发剂”说明了当暴露于UV或可见光照射时引发化学反应(例如，交联反应、链聚合反应)的一种化合物。许多适当的光引发剂对于本领域普通技术人员应当是已知的。示例性的光引发剂包括但不限于双(2，4，6-三甲基苯甲酰基)苯基膦氧化物(BAPO)、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、莰醌(CQ)、I-苯基-1，2-丙二酮(PPD)、有机金属络合物 Cp，Pt (CH (3)) (3) (Cp，=eta (5) -C (5) H (4) CH (3))、2-羟基-I-[4-(羟乙氧基)苯基]-2-甲基-I-丙酮(例如，Irgacure 2959)、甲基丙烯酸二甲胺乙酯(DMAEMA)、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯甲酮(BP)、和黄素类。如在下面实施例部分中举例说明的，物质组合物的物理特性(例如，剪切储存模 量)取决于可以容易地控制的某些参数。因此，可以通过选择这类参数一个或多个的适当数值来制备具有希望的物理特性的物质组合物。因此，根据本发明实施方式的另一个方面，提供了控制物质组合物的物理特性(例如，剪切储能模量)的一种方法(例如本文所述)。该方法包括控制表征该物质组合物的参数。这样的参数可以是例如在溶液中(水溶液)本文所述结合物的浓度、环境温度、交联温度。此外，该参数可以是存在或缺少共价交联，在共价交联期间弓I发剂浓度(例如，存在或缺少引发剂)，和/或用于共价交联的辐射剂量。如本文所述，可以通过在选择的浓度下制备结合物溶液，以及通过共价交联和/或非共价交联来交联该结合物从而容易地控制物质组合物中结合物的浓度，从而将该结合物的溶液转化成本文所述的物质组合物，具有选择的结合物浓度。在一些实施方式中，该结合物浓度是与该剪切储能模量正相关的(如在本文实施例中举例说明的)。在一些实施方式中，该结合物浓度与实现反向热胶凝的温度(例如，临界温度)是负相关的(如在本文实施例中举例说明的)。
在一些实施方式中，该环境温度通过影响物质组合物的反向热胶凝控制了物质组合物的物理特性(如本文所述)。例如，可以选择该环境温度，使得胶凝得以实现(例如，在较低温度下)并且该剪切储能模量是较低的，使得胶凝得以实现(例如在较高温度下)，并且该剪切储能模量是较高的。此外，可以选择环境温度(例如，在中间温度下)使得胶凝部分地实现至任何希望程度，使得该剪切储能可以是在所希望的任何中间水平。典型地，该物质组合物特征可以是较窄的温度范围(例如，5° C范围、10° C范围、15° C范围)，其中物理特性(例如剪切储能模量)表现了特别强的温度依赖性。可选地，从这个温度范围内选择环境温度，从而可以通过较小地改变环境温度来方便地控制物理特性。可以使用交联温度(S卩，该物质组合物中结合物共价交联的温度)来控制包括共价交联的物质组合物的物理特性(例如，如本文所述)。
在一些实施方式中，该交联温度与该物质组合物的剪切储能模量是负相关的(如在本文实施例中举例说明的)。在一些实施方式中，当交联温度是处于其中物理特性表现特别强地温度依赖性的温度范围内时，物理特性(例如，剪切储能模量)与交联温度之间的联系是特别强的(如在上文讨论的)。可选地，从这个温度范围内选择交联温度，从而可以通过较小地改变交联温度来方便地控制物理特性。在一些实施方式中，存在共价交联是与较高剪切储能模量相关联的(如在此举例说明的)。在一些实施方式中，通过调节实现共价交联的条件来改变共价交联的程度。因此，例如，可以通过不使用引发剂或使用少量的引发剂，和/或不使用辐射或使用少剂量的辐射(例如使用较短的辐射时间和/或低强度的辐射)进行共价交联来获得低程度的共价交联。在一些实施方式中，该参数(例如，环境温度、交联温度)是相对独立的一些物理特性(例如，生物降解速率)。这有利地允许控制感兴趣的两个或更多个物理特性(例如，降解速率和剪切储能模量)而不产生对于确定这类物理特性如何具有彼此依赖性的实验的需要。例如，可以通过选择适当的交联温度来可选地控制剪切储能模量，同时可以通过选择对于本文所述的聚合物部分适当的聚合物来控制降解速率。因此，在一些实施方式中，改变本文所述的参数(例如，环境温度，交联温度)可以将生物降解速率改变小于4的因子(因数，factor)，可选地小于3的因子，可选地小于2的因子，以及可选地小于I. 5的因子。可选地通过测量胰蛋白酶溶液中物质组合物的半衰期对生物降解速率进行定量(例如，使用本文所述的步骤)。能够以相对简单的并且廉价的方式生产根据本发明实施方式的结合物。因此，根据本发明实施方式的另一个方面，提供了生产如本文所述结合物的一种方法，该方法包括将一种聚合物共价地附连到一种多肽上，该聚合物和多肽是这样的使得至少两个聚合物分子附连到该多肽的一个分子上，其中这两个聚合物分子中至少一个表现反向热胶凝。该聚合物可以可选地包括至少一个交联部分(例如，如本文所述)，从而生产包括至少一个交联部分的结合物(如本文所述)。可选地，该聚合物包括能够反应从而将该聚合物附连到该多肽上的至少一个第一部分(可选地单个第一部分)，以及可选地至少一个第二部分，该第二部分是本文所述的一种交联部分。在一些实施方式中，该第一部分和第二部分是不同的，使得该第一部分可以进行反应从而将该聚合物附连到该多肽上，而不引起该第二部分(交联部分)过早地反应(例如在结合物分子的交联是希望的之前)。在一些实施方式中，该第一部分和第二部分是相同的，该部分适合于将该聚合物附连到该多肽上并且用于交联该结合物。可选地，这样的交联部分被选择为能够经受两个不同的反应，每一个在不同条件下，从而使得该部分可以在一组条件下进行反应从而将该聚合物附连到该多肽上，并且然后在不同条件下进行反应从而交联结合物分子。例如，如本文所述的，一些不饱和部分(例 如丙烯酸酯)可以经受通过巯基的迈克尔型加成(例如，在碱性条件下)从而使该聚合物附连到一组多肽上，并且还经历聚合反应(例如，在用于引发自由基聚合反应的条件下)从而交联这些结合物。在其中本文所述的第一和第二部分是相同的(或另外地在相同条件下能够经历类似反应)一些实施方式中，该多肽与摩尔过量的(例如，至少20:1，至少50:1，至少100:1，至少200:1)聚合物进行反应，从而防止每个聚合物分子附连到该多肽上多于一个位点。除了生产廉价之外，本发明实施方式的物质组合物具有高度重现性，柔性(可以容易地压缩或拉伸)，表现了可控的结构特性，并且适合可控地生物降解；使它高度适合体内或体外组织(例如，骨、软骨、心肌、皮肤组织、血管、以及体内其他组织(软组织和硬组织))再生的特征。例如，可以容易地将这样的支架水凝胶安置到组织或器官内的间隙中，此后它可以填充空隙并且在该支架降解掉时引发再生过程。因此，根据本发明实施方式的另一个方面，提供了本文所述的结合物或本文所述的物质组合物在制造修复组织损伤药物中的用途。该药物可选地用于诱导组织形成(体内和/或体外)。可选地，该药物是用于治疗特征为组织损伤或损失的失调(例如，如本文所述)。在此，短语“组织”是指由具有类似结构和功能的细胞聚集体组成的生物体的部分。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织脑组织、血管组织、肾脏组织、肺组织、性腺组织、造血组织、以及脂肪组织。优选地，如在此使用的短语“组织”还包括短语“器官”，器官是指针对某一具体功能特异化的动物体内完全分化的结构和功能单元。器官的非限制性实例包括头部、脑、眼、腿、手、心、肝、肾、肺、胰、卵巢、睾丸、和胃。根据本发明实施方式的另一个方面，提供了本文所述的结合物或本文所述的物质组合物在制造治疗患有特征为组织损伤或损失的失调的受试者的药物中的用途。如在此使用的，短语“特征为组织损伤或损失的失调”是指表现组织需要组织再生的损伤(例如，无功能的组织、癌或癌前期组织、破碎的组织、破裂的组织、纤维化的组织、或局部缺血的组织)或组织损失(例如，在创伤、传染病、遗传病等之后)的任何失调、疾病或病症。需要组织再生的失调或病症的实例包括但不限于肝硬化例如在丙型肝炎病人体内(肝组织)、I型糖尿病(胰腺组织)、囊性纤维化(肺、肝、胰腺组织)、骨癌(骨组织)、烧伤以及伤口修复(皮肤组织)、老年性黄斑退化症(视网膜组织)、心肌梗塞、心肌修复、CNS损害(骨髓)、关节软骨缺陷(软骨细胞)、膀胱退化、肠退化等。此外，术语“失调”包括美容组织(cosmetictissue)损伤或损失。如在此使用的，术语“美容(组织)”是指外观(例如，可见的)组织，包括但不限于皮肤组织。美容组织损伤或损失典型地在美学上是有害的，并且对于另外的原因(例如，心理因素)可能是有害的。在此，短语“治疗”是指在患有或诊断有疾病、失调或病症的个体中抑制或阻止该疾病、失调或病症的发展和/或使该疾病、失调或病症减少、缓解、或消退。本领域普通技术人员应当清楚可以用于评估疾病、失调或病症发展的多种方法和测定法，以及类似地，可以用于评估疾病、失调或疾病减少、缓解或消退的多种方法和测定法。
在一些实施方式中，如本文所述，包括如本文所述结合物的药物被鉴定用于交联该结合物(体内和/或体外)。在一些实施方式中，包括本文所述物质组合物的药物被鉴定用于植入受试者体内。如在此使用的，术语“受试者”是指一种脊椎动物，优选地一种哺乳动物，更优选地处于任何年龄的人类(男性或女性)。可选地使用手术工具例如解剖刀、匙、药刀、或其他手术设备来实现植入。可选地，通过注射来实现植入(例如，通过注射器、导管等)。在此，术语“植入物”和“植入”包括将一种物质(例如,本文所述的结合物或物质组合物)安置到体内或体表上(例如，在皮肤表面上)。根据本发明实施方式的另一个方面，提供了在体内诱导组织形成的一种方法，该方法包括将本文所述的物质组合物植入到受试者体内(例如，如本文所述)，由此诱导组织形成。在一些实施方式中，该物质组合物是包括如本文所述的共价交联的结合物的物质组合物，并且是在植入之后在体内非共价交联的(例如，用于为该物质组合物提供希望的刚性)。可选地,通过暴露于生理温度(例如，如本文所述)来实现非共价交联，暴露于生理温度是植入的直接结果。根据本发明实施方式的另一个方面，提供了在体内诱导组织形成的一种方法，该方法包括将本文所述结合物的多个分子植入到受试者体内，由此诱导组织形成。在一些实施方式中，在植入之后该结合物是在体内非共价交联的(例如用于形成支架)。可选地，通过暴露于生理温度(例如，如本文所述)来实现非共价交联，暴露于生理温度是植入的直接结果。在一些实施方式中，在植入之后该结合物是在体内共价交联的(例如，用于形成支架)。如本文所述可以使用无毒、无害试剂和/或条件(例如，施加UV辐射)来实现交联。根据本发明实施方式的另一个方面，提供了在体外诱导组织形成的一种方法，该方法包括使具有在其中的细胞的物质组合物(如本文所述)经受导致细胞生长的条件，由此诱导组织形成。如在此使用的，短语“体外”是指从生物体得到的并且在该活生物体外部生长(或培养)的活细胞，例如在脊椎动物、哺乳动物、或人类的身体外部。例如，从人类得到的(例如人肌细胞或人主动脉内皮细胞)并且在身体外部培养的细胞被称为体外培养的细胞。可选地选择处于本文所述物质组合物中的细胞从而能够形成组织。这类细胞可以是例如干细胞例如胚胎干细胞，骨髓干细胞、脐带血细胞、间质干细胞、成人组织干细胞、或分化的细胞例如神经细胞、视网膜细胞、表皮细胞、肝细胞、胰脏细胞、骨细胞、软骨细胞、弹性细胞、纤维状细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、以及造血细胞。包括细胞的物质组合物可以包括其中包埋的和/或该物质组合物表面上的细胞。可选地这些细胞可以通过在细胞的存在下(例如，如本文所述)交联本文所述的结合物而包埋在该物质组合物中。将细胞结合到该物质组合物的表面上可以可选地通过使制备的物质组合物与这些细胞接触来实现。该物质组合物之中和/或之上细胞的浓度取决于细胞类型以及支架特性。本领域 普通技术人员能够确定在每种情况下所使用的细胞浓度。该物质组合物可选地与组织培养基和生长因子相接触。可替代地或另外地，例如，该物质组合物在水凝胶的水相中包括组织培养基和生长因子。可选地，对这些细胞进行常规检查(例如，使用倒置显微镜)来评估细胞生长、铺展以及组织形成，用于有助于对组织形成进行控制，和/或用于确定组织形成过程何时完成。在体外组织形成之后，可选地将获得的组织和/或包括形成的组织的物质组合物植入受试者体内(例如，用于进一步诱导组织形成，用于修复组织损伤，和/或用于治疗如本文所述的失调)。本领域普通技术人员能够确定何时以及如何植入该组织和/或物质组合物由此诱导组织形成和/或修复，和/或用于治疗本文所述的疾病。应当理解的是如本文所述,有待植入受试者体内的细胞(例如,用于在体内诱导组织形成和/或在体外组织形成之后)可以可选地从治疗的受试者体内(自体来源)获得的，以及可选地来自异体来源例如不希望诱导免疫原性反应的胚胎干细胞。根据本发明实施方式的另一个方面，提供了治疗患有特征为组织损伤或损失的失调的受试者的一种方法(如本文所述)，该方法包括将本文所述的物质组合物植入到受试者体内(如本文所述)，由此诱导组织形成，由此治疗特征为组织损伤或损失的失调。根据本发明实施方式的另一个方面，提供了治疗患有特征为组织损伤或损失的失调的受试者的一种方法(例如，如本文所述)，该方法包括如本文所述的，将本文所述结合物的多个分子植入到受试者体内，由此诱导组织形成，由此治疗特征为组织损伤或损失的失调。在通过植入结合物来实现的本文所述方法的一些实施方式中，该结合物可选地包括至少一个交联部分(例如，如本文所述)。在一些实施方式中，该方法可选地进一步包括例如通过使多个分子经受实现这些分子交联部分共价交联的条件(例如如本文所述)来共价交联该结合物的多个分子。本文所述的结合物可以提供为一种组合物，例如用于实现本文所述的方法或用途的组合物。该组合物可以用于实现药物(例如药用)治疗和/或化妆品治疗(例如，如本文所述的)。因此，根据本发明实施方式的另一个方面，提供了包括本文所述结合物的多个分子的一种药物、化妆品或美容保健品组合物，该组合物被鉴定用于当与组织接触时，并且进一步地当使该组合物经受生理温度时诱导组织形成。在此，短语“美容保健品组合物(药妆组合物)”是指特征为药物和化妆品用途两者的一种组合物。可选地，该结合物包括至少一个交联部分(如本文所述)，并且该组合物被鉴定用于当进一步使该结合物的多个分子经受使这些分子的交联部分实现共价交联的条件(例如，如本文所述)时诱导组织形成。可选地，该组合物进一步包括用于诱导这些交联部分共价交联的一种引发剂(例如,如本文所述)。可选地，本文所述的组合物被包装到一种包装材料中并且在印刷物中，在该包装材料之中或之上进行标识，用于诱导组织形成和/或用于治疗失调(如本文所述)。该组合物可以进一步包括一种药学上可接受的载体，并且被配制以有助于它的施 用(例如，植入)。在此，术语“药学上可接受的载体”是指不会引起对生物体显著刺激并且不会终止所施用化合物的生物活性或特性的一种载体或稀释剂。载体的非限制性实例是丙二醇、盐水、乳液以及有机溶剂与水的混合物、以及固体(例如，粉末的)和气体载体。可选地，该载体是一种水性载体，例如一种水溶液(例如盐水)。该结合物还可以提供为试剂盒的一部分。因此，根据本发明实施方式的另一个方面，提供了用于诱导组织形成的试剂盒，该试剂盒包括本文所述的结合物、一种水溶剂(水性溶剂)、以及用于交联该结合物水溶液从而形成用于诱导组织形成的支架的说明。可选地，该结合物和溶剂是分开地存储在该试剂盒中的(例如，在分开包装的单元中)，使得该结合物以干燥状态进行存储直至与用于形成该结合物溶液的溶剂进行接触(例如，本文所述的溶液)。在使用之前结合物的这种存储可以增加该结合物(和试剂盒)的有效寿命。可选地，该结合物包括至少一个交联部分(例如，如本文所述)，并且该试剂盒进一步包括用于诱导这些交联部分共价交联的一种引发剂(例如如本文所述)。可选地，该试剂盒进一步包括用于包埋在该支架中的细胞(例如，如本文所述)。这些细胞可以形成该溶剂的一部分或可以分开地包装。在一些实施方式中，该试剂盒包括作为包装插入物(package insert)的说明。用于交联溶剂中结合物的说明可以是例如，将结合物与溶剂混合，并且使得到的溶液经受某一温度(例如，用于实现反向热胶凝)。例如，如果在环境温度下实现该结合物的胶凝作用，说明可以是在制冷装置下存储试剂盒(例如低于10° C或在4° C)，在室温下将这些组分混合，并且等待直至观察到凝胶形成。如果在较高温度下实现胶凝，说明可以是将这些组分混合并且然后将溶液加热持续指定的时间期间。如果共价交联是通过辐射实现的，说明可以是将这些组分混合(可选地包括如本文所述的光引发剂)，辐照该溶液，并且可选地将溶液加热至实现如前面所述的热胶凝。该辐射可以是在辐射之前，与辐射同时或在辐射之后。
如果共价交联是通过自由基聚合反应实现的，说明可以是将这些组分混合(包括如本文所述的聚合反应引发剂)，以及可选地将该溶液加热用于实现如前面所述的热胶凝，和/或用于实现聚合反应(如果加热是希望的话)。用于实现热胶凝以及用于实现聚合反应的加热可以是相同温度或不同温度。在一些实施方式中，该结合物和溶液以适合于获得具有希望特性的物质组合物的比率包装在试剂盒中。这样的比率可以是预先确定的(如上面详述)。
可选地，这些说明进一步包括根据上面提供的说明为了获得该物质组合物的适当特性用于选择适当比率的指导。这些说明可以进一步包括为了获得具有希望特性的物质组合物，关于选择交联条件(例如，使用或不使用辐射；使用或不使用加热；添加或不添加聚合反应引发剂)的指导。可以预期的是在从本申请直至专利(授权)的期间，可以开发出表现反向热胶凝的许多相关聚合物，并且短语“表现反向热胶凝的聚合物部分”的范围是旨在演绎地包括所有这类新型技术。术语“包含”，“包含了”，“包括”，“包括了”，“具有”以及它们的变型(conjugate)是指“包括但不限于”。术语“由…组成”是指“包括并且限于”。术语“基本上由…组成”是指该组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但是只要该另外的成分、步骤和/或部分不实质性地改变要求权利的组合物、方法或结构的基本的和新型特征即可。在此使用词语“示例性的”是指“用作一个实例、例证或说明”。以“示例性”形式说明的任何实施方式不必解释成优选的或比其他实施方式有利的和/或解释成排除与其他实施方式合并特征。在此使用词语“可选地”是指“在一些实施方式中提供并且在其他实施方式中未提供”。本发明任何具体的实施方式可以包括多个“可选的”特征除非这类特征发生冲突。如在此使用的，单数形式“一”、“一个”以及“该”包括复数引用，除非上下文另外清楚地说明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括它们的混合物。贯穿本申请，本发明的多个实施方式能够以范围形式提出。应当理解的是范围形式中的说明仅仅是为了方便和简单并且不应解释成对本发明范围的硬性限制。因此，范围的说明应当认为是具体地披露了所有可能的子范围以及该范围内的单独的数字值。例如，范围的说明例如从I至6应当认为是具体地披露了多个子范围例如从I至3，从I至4，从I至5，从2至4，从2至6，从3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、3、4、5、以及6。无论该范围的宽度如何，这都可以应用。每当在此指出数字范围时，它是指包括指定范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语一个第一指示数字和一个第二指示数字的“范围/之间的范围”以及“范围是/范围从”一个第一指示数字“至”一个第二指示数字在此可互换地使用并且是指包括该第一和第二指示数字以及其间所有分数和整数数字。如在此使用的，术语“方法”是指用于实现给定任务的方式、手段、技术以及步骤，包括但不限于化学、制药、生物、生物化学以及药物领域的从业人员已知的亦或从已知的方式、手段、技术以及步骤易于开发的那些方式、手段、技术以及步骤。应当理解的是本发明的某些特征(为了清楚的目的，这些特征在分离实施方式的上下文中进行说明)也能够以组合方式提供于一个单个实施方式中。相反地，本发明的多个特征(为了简单的目的这些特征在一个单个实施方式的上下文中进行说明)还可以分开地或以任何适当的亚组合方式或在本发明的任何其他说明的实施方式中以适当方式进行提供。在多个实施方式的上下文中说明的某些特征不应认为是这些实施方式的本质特征，除非不使用这些元件该实施方式是不可操作的。如上面说明的以及如在下面权利要求书部分中要求保护的本发明的多个实施方式和方面可在下面实施例中找到实验支持
具体实施例方式实施例
现在参考下面实施例，这些实施例与上面说明一起以非限制性方式解释本发明的一些实施方式。材料与方法材料丙丽是从Bio-Lab (以色列)获得的；丙烯酰氯是从Merck获得的；I丐黄绿素AM是从Sigma-Aldrich获得的；胶原I型是从BD Biosciences获得的；胶原酶IA是从Sigma-Aldrich获得的；二氯甲烷是从Aldrich获得的；二乙醚是从Frutarom(以色列)获得的；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基，DME培养基)是从Gibco获得的；胡米胺同源二聚体-I(ethidium homodimer-l)是从 Sigma-Aldrich 获得的；胎牛血清是从Biological Industries (以色列)获得的；福尔马林是从Sigma-Aldrich获得的；Hoechst 33342 是从 Sigma-Aldrich 获得的；Irgaciire^. 2959弓丨发剂是从Ciba获得的；疏基乙醇是从Gibco犾得的；N-轻基琥拍酰亚胺-突光素是从Thermo Scientific获得的；非必需氨基酸是从Biological industries (以色列)获得的；青霉素-链霉素是从Biological Industries (以色列)获得的；石油醚40-60是从Bio-Lab (以色列)获得的；Plutonic F127 (12. 6kDa)是从 Sigma 获得的；聚乙二醇(12kDa)是从Fluka获得的；叠氮化钠(sodiumazide)是从 Riedel-deHaen 获得的；TetaMiicK'四元醇 T1307 是从 BASF 获得的；
甲苯是从Bio-Lab (以色列)获得的；二乙胺是从Fluka获得的；三(2-羧乙基)膦盐酸盐是从Sigma获得的；胰蛋白酶是从MP Biomedicals获得的。F127泊洛沙姆-二丙烯酸酯，IetronicW T1307-四丙烯酸酯和PEG- 二丙烯酸酯的合成根据Halstenberg 等人[Biomacromolecules 2002, 3:710-723]所述步骤，对应地从PU丨ronic F127 (12. 6kDa)、Tetronic 四元酉享 T1307 (18kDa)和聚乙二醇(PEG) (12kDa)来制备F127泊洛沙姆-二丙烯酸酯(F127-DA)、Tetronic T1307-四丙烯酸酯(T1307-TA)和聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)。如图IA中说明的，在氩气下通过使处于二氯甲烷和具有丙烯酰氯(Merck, Darmstadt,德国)的甲苯和三乙胺(在相对于轻基基团I. 5:1的摩尔比率下)的溶液中的轻基封端聚合物进行反应来实现聚合物的丙烯酸酯化(acrylation)。在冰冷的二乙醚(用于PEG-DA)或石油醚40-60(用于F127-DA和T1307-TA)中使最终产物沉淀。在真空下将固体聚合物干燥48小时。使用质子NMR，确定每个F127-DA分子丙烯基(acryl groups)的平均数量为2. 15,确定每个T1307-TA分子丙烯基的平均数量为4. 38，并且确定每个PEG-DA的丙烯基的平均数量为1.74。流变学表征使用装备有帕尔帖极板温度控制基极(Peltier plate temperature-controlledbase)的AR-G2流变仪(TA Instruments)进行流变学测量。在所有实验中使用40mm石英板几何形状。用包含0. 1%(重量/体积)Irgaciire 2959引发剂的0. 4ml聚合物溶液进行每次测量。通过圆形多二极管阵列(Moritex，日本)来施加UV光(365nm)。对于所有测量测试条件是在IHz振荡频率下2%应变(strain)。水吸收测量这些水凝胶构建体是从在一个5mm直径娃管中具有0. 1% (重量/体积)irgaaire 2959引发剂的100 聚合物-纤维蛋白原结合物溶液的一个体积(volume)制造的。这些构建体是在UV光(365nm,4_5mW/cm2)下交联的从而形成一个5mm高圆柱体。FF127是在4° C、21° C或37° C温度下交联的。通过计算溶胀比(Qm)(即， 湿重(溶胀后质量)除以干重(冷冻干燥后的重量)的比率)对水吸收进行评估。生物降解的测量这些水凝胶的生物降解是通过用胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素(NHS-荧光素)对生物合成的水凝胶中生物组分进行荧光标记来表征的。通过测量在水凝胶的酶溶解过程中蛋白的释放对降解速率进行定量。在包含0. 05mg/ml NHS-荧光素的PBS溶液中将IOOiU水凝胶填料(plug)染色过夜，并且充分清洗用来去除未结合的荧光素。然后将这些填料转移到具有0. 01mg/ml胰蛋白酶和0. 1%叠氮化钠(Riedel-deHaen,印度)的3mlPBS中，并且在37° C下在连续搅拌下进行孵化。使用Sk-anU2.2 软件在Thermo Varioskan分光光度计(激发波长494nm，发射波长518nm)中进行荧光测量。在最后的时间点之后，通过添加0. IM NaOH将每个水凝胶水解地分离。在30分钟之后，记录100%降解的发射值。未用酶标记的水凝胶填料和未用酶溶液染色的填料被用作阴性对照。
制备接种细胞的构建体在分散的人包皮成纤维细胞或HeLa细胞存在下通过UV诱导交联溶液中FF127或FT1307结合物来制备接种细胞的水凝胶构建体。将传代的细胞进行胰蛋白酶消化并且悬浮于IOOiU在IO6细胞/ml浓度下的结合物溶液中(连同光引发剂(0. l%w/v) 一起)。在4° C、21° C或37° C下将圆盘形构建体暴露于UV光持续5分钟。从PEG (12kDa)-纤维蛋白原、F127泊洛沙姆二丙烯酸酯或T1307四丙烯酸酯(3%w/w在PBS中)来制备对照的接种细胞的构建体。在包含10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸、以及0. 2%2_巯基乙醇的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中将接种细胞的构建体培养长达6天。光学显微术和突光显微术
使用Eclipse TE2000-S 显微镜(Nikon)或 Eclipse TS100 显微镜(Nikon)，以及 数码相机实现光学显微术和荧光显微术。统计分析使用Microsoft Excel统计分析软件进行统计分析。针对每个变量对来自独立实验的数据进行定量和分析。使用学生T检验(student，s T-test)(双尾，等差)进行两个处理之间的比较并且用方差分析(ANOVA)进行多个处理之间的比较。〈0.05的p值被认为是统计显著的。实施例IF127泊洛沙姆-纤维蛋白原结合物如图IB中所示，通过迈克尔型加成反应将纤维蛋白原结合到F127泊洛沙姆-二丙烯酸酯上(如上面所述制备的，并且如图IA中所示)。为了将泊洛沙姆-蛋白结合物的特性与聚乙二醇(PEG)蛋白结合物的特性进行比较，使用相同的反应，使纤维蛋白原与12kDaPEG- 二丙烯酸酯(如上面所述制备的)相结合。将处于具有8M脲的150mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的3. 5mg/ml纤维蛋白原溶液补充有三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，TCEP :纤维蛋白原半胱氨酸残基摩尔比率为1.5:1。然后以4:1聚合物分子纤维蛋白原半胱氨酸残基摩尔比率添加具有SM脲的PBS和280mg/ml功能化的聚合物(F127-DA或PEG-DA)。允许混合物在室温下反应3小时。然后通过加入4体积丙酮将结合的蛋白沉淀。将沉淀再溶于处于10mg/ml蛋白浓度下包含8M脲的PBS中并且然后在4° C下对PBS透析(渗析，dialyze)持续2天，其中每天替换PBS两次。该透析管(dialysis tubing)具有12_14_kDa (光谱)截留值。为了建立F127纤维蛋白原与PEG纤维蛋白原结合物的总浓度，将0. 5ml结合物溶液冻干24小时并且称重。使用标准BCA 蛋白测定法(Pierce Biotechnology)确定净纤维蛋白原浓度并且将结合物(干重)和纤维蛋白原的浓度进行比较用来确定结合物中合成的聚合物的浓度。使用下式基于该合成聚合物和纤维蛋白原的浓度和分子量来计算结合反应的效率(e 假定理论最大值为每个纤维蛋白原分子29个合成的聚合物分子(因为纤维蛋白原包含29个巯基基团)
权利要求
1.ー种包括多肽的结合物，所述多肽具有附连到其上的至少两个聚合物部分，所述聚合物部分中至少ー个表现反向热胶凝。
2.根据权利要求I所述的结合物，其中，所述聚合物部分中的每ー个表现反向热胶凝。
3.根据权利要求I和2中任一项所述的结合物，其中，所述聚合物部分中至少ー个进ー步包括用于将所述结合物的多个分子共价交联到彼此上的至少ー个交联部分。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的结合物，具有通式X(-Y-Zm)n 其中 X是所述多肽； Y是所述聚合物部分； Z是所述交联部分； n是大于I的整数；并且 111是0、1或大于I的整数。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的结合物，其中，所述多肽包括蛋白或其片段。
6.根据权利要求5所述的结合物，其中，所述蛋白选自以下所组成的组细胞信号蛋白、细胞外基质蛋白、细胞粘附蛋白、生长因子、蛋白A、蛋白酶、以及蛋白酶底物。
7.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述细胞外基质蛋白选自以下所组成的组纤维蛋白原、胶原、纤连蛋白、弾性蛋白、原纤蛋白、纤蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白以及明胶蛋白。
8.根据权利要求5所述的结合物，其中，所述多肽包括纤维蛋白原或其片段。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的结合物，其中，所述蛋白是变性的。
10.根据权利要求I至9中任一项所述的结合物，其中，所述多肽是变性的纤维蛋白原。
11.根据权利要求I至10中任一项所述的结合物，其中，所述聚合物部分包括合成的聚合物。
12.根据权利要求11所述的结合物，其中，所述聚合物部分中至少ー个包括泊洛沙姆(聚(环氧こ烷-环氧丙烷)共聚物)。
13.根据权利要求12所述的结合物，其中，所述聚合物部分中的每ー个包括泊洛沙姆。
14.根据权利要求12和13中任一项所述的结合物，其中，所述泊洛沙姆是F127泊洛沙姆。
15.根据权利要求12和13中任一项所述的结合物，其中，所述聚合物部分中至少ー个包括T1307聚合物。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的结合物，其中，所述聚合物部分选自以下所组成的组Pluronic 聚合物和Tetronic 聚合物。
17.根据权利要求I至16中任一项所述的结合物，其中，所述聚合物部分中的每ー个包括I至10个所述交联部分。
18.根据权利要求I至17中任一项所述的结合物，其中，所述交联部分包括可聚合的基团。
19.根据权利要求18所述的结合物，其中，所述可聚合的基团是可通过自由基聚合反应来聚合的。
20.根据权利要求19所述的结合物，其中，所述可聚合的基团选自以下所组成的组丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、以及乙烯基砜。
21.根据权利要求I所述的结合物，其中，所述多肽是变性的纤维蛋白原并且所述聚合物部分包括F127泊洛沙姆。
22.根据权利要求21所述的结合物，包括F127泊洛沙姆二丙烯酸酯部分，其中，所述F127泊洛沙姆二丙烯酸酯部分中的每一个的丙烯酸酯基团附连到所述纤维蛋白原的半胱氨酸残基上。
23.根据权利要求I所述的结合物，其中，所述多肽是变性的纤维蛋白原并且所述聚合物部分包括T1307聚合物。
24.根据权利要求23所述的结合物，包括T1307四丙烯酸酯部分，其中，所述T1307四丙烯酸酯部分中的每一个的丙烯酸酯基团附连到所述纤维蛋白原的半胱氨酸残基上。
25.根据权利要求I至24中任一项所述的结合物，其特征为在水溶液中经历反向热胶凝的能力。
26.根据权利要求25所述的结合物，其中，所述反向热胶凝是在所述水溶液中所述结合物的浓度小于10重量％下实现的。
27.根据权利要求25至26中任一项所述的结合物，其中，所述结合物的所述反向热胶凝使所述水溶液的剪切储能模量增加至少10倍。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的结合物，其中，所述反向热胶凝使所述水溶液的剪切储能模量增加到至少20Pa。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的结合物，其中，所述反向热胶凝使所述水溶液的剪切储能模量从小于2Pa增加到至少20Pa。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的结合物，其中，当温度从10°C升高到55° C时发生所述反向热胶凝。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的结合物，其中，所述反向热胶凝是可逆的。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的结合物，其中，所述反向热胶凝形成生物可降解的凝胶。
33.根据权利要求I至32中任一项所述的结合物，被鉴定用于产生支架。
34.根据权利要求33所述的结合物，被鉴定用于可逆地产生支架。
35.根据权利要求33至34中任一项所述的结合物，其中，所述支架是水凝胶。
36.根据权利要求35所述的结合物，其中，所述水凝胶特征为在37°C的温度下剪切储能模量为至少15Pa。
37.根据权利要求35至36中任一项所述的结合物，其中，所述水凝胶能够经历反向热胶凝。
38.一种包括权利要求I至32中任一项所述的结合物的交联形式的物质组合物，所述交联形式包括交联到彼此上的所述结合物的多个分子。
39.根据权利要求38所述的物质组合物，为水凝胶。
40.根据权利要求38和39中任一项所述的物质组合物，通过在水溶液中所述结合物的所述多个分子的反向热胶凝来产生。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的物质组合物，其中，所述结合物的所述多个分子非共价地交联到彼此上。
42.根据权利要求40所述的物质组合物，其中，所述结合物的所述交联形式是可逆的。
43.根据权利要求38至39中任一项所述的物质组合物，其中，所述聚合物部分中至少ー个进一歩包括交联部分，并且所述结合物的所述多个分子共价地交联到彼此上。
44.根据权利要求43所述的物质组合物，通过使所述结合物的多个分子经受使所述交联部分实现交联的条件来产生。
45.根据权利要求43所述的物质组合物，其特征为在37°C的温度下剪切储能模量为至少20Pa。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的物质组合物，能够经历反向热胶凝。
47.根据权利要求46所述的物质组合物，其中，所述物质组合物的所述反向热胶凝使所述物质组合物的剪切储能模量増加至少200%。
48.根据权利要求46至47中任一项所述的物质组合物，其中，所述物质组合物的所述反向热胶凝使所述物质组合物的剪切储能模量増加到至少15Pa。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的物质组合物，其中，所述物质组合物的所述反向热胶凝使所述物质组合物的剪切储能模量从处于0. 5Pa至200Pa范围中的第一值增加到高于所述第一值至少20%的第二值。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的物质组合物，其中，所述物质组合物的所述反向热胶凝使所述物质组合物的剪切储能模量从第一值增加到处于20Pa至5000Pa范围内的第二值，所述第二值高于所述第一值至少20%。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的物质组合物，其中，当温度从10°C升高到55° C时发生所述物质组合物的所述反向热胶凝。
52.根据权利要求46至51中任一项所述的物质组合物，其中，所述物质组合物的所述反向热胶凝是可逆的。
53.根据权利要求38至52中任一项所述的物质组合物，特征为所述物质组合物的一部分的剪切储能模量与所述物质组合物的至少ー个另外部分的剪切储能模量不同。
54.根据权利要求38至53中任一项所述的物质组合物，是可生物降解的。
55.根据权利要求38至54中任一项所述的物质组合物，进ー步包括其中的细胞。
56.根据权利要求38-55中任一项所述的物质组合物，被鉴定用于诱导组织的形成。
57.根据权利要求38-55中任一项所述的物质组合物，被鉴定用于修复组织损伤。
58.—种生产权利要求38-42中任一项所述的物质组合物的方法，所述方法包括将如在权利要求I至32中任一项中所述的结合物的多个分子的溶液从第一温度加热到第二温度，所述第二温度使得在所述溶液中所述结合物的反向热胶凝得以实现，由此生产所述物质组合物。
59.根据权利要求58所述的方法，其中，所述物质组合物是在体内生产的。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，所述第二温度是生理温度。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中，所述结合物包括至少ー个聚合物部分，所述聚合物部分进ー步包括至少ー个交联部分，所述方法进ー步包括使所述溶液经受使所述交联部分实现交联的条件。
62.根据权利要求61所述的方法，其中，在所述加热之前使所述溶液经受使交联得以实现的所述条件。
63.根据权利要求61所述的方法，其中，在所述加热之后使所述溶液经受使交联得以实现的所述条件。
64.—种生产权利要求43-52中任一项所述的物质组合物的方法，所述方法包括使包括如在权利要求3至20、22、以及24至32中任一项中所述的结合物的多个分子的溶液，经受使所述交联部分实现共价交联的条件，由此生产所述物质组合物，所述结合物包括至少一个交联部分。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中，所述共价交联是在体内实现的。
66.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中，所述共价交联是在体外实现的，由此生产共价交联的支架，所述方法进一步包括使所述共价交联的支架在体内经受生理温度，使得在体内实现所述支架的反向热胶凝，由此生产所述物质组合物。
67.—种在体内生成权利要求43-52中任一项所述的物质组合物的方法，所述方法包括 (a)使包括如在权利要求3至20、22、以及24至32中任一项中所述的结合物的多个分子的溶液，经受在体外实现共价交联的条件，由此生产共价交联的支架，所述结合物包括至少一个交联部分；以及 (b)使所述共价交联的支架在体内经受生理温度，使得在体内实现所述支架的反向热胶凝，由此生产所述物质组合物。
68.根据权利要求61至67中任一项所述的方法，其中，所述条件包括辐射。
69.根据权利要求61至68中任一项所述的方法，其中，所述条件包括存在自由基引发剂。
70.根据权利要求58至69中任一项所述的方法，其中，所述溶液进一步包括细胞，所述方法是用于生产包括包埋在其中的细胞的物质组合物。
71.—种控制权利要求38至57中任一项所述的物质组合物的物理特性的方法，所述方法包括控制选自以下所组成的组的参数在所述溶液中如在权利要求I至32中任一项中所述的结合物的浓度、环境温度、存在或不存在引发剂、在共价交联过程中的辐射剂量、以及交联温度。
72.—种生产权利要求I至37中任一项所述的结合物的方法，所述方法包括将聚合物共价附连到多肽上，所述聚合物和所述多肽使得至少两个聚合物分子共价地附连到所述多肽的一个分子上，其中，所述两个聚合物分子中至少一个表现反向热胶凝，由此生产所述结合物。
73.权利要求I至37中任一项所述的结合物或权利要求38至57中任一项所述的物质组合物在制备用于修复组织损伤的药物中的用途。
74.权利要求I至37中任一项所述的结合物或权利要求38至57中任一项所述的物质组合物在制备用于治疗患有特征为组织损伤或损失的失调的受试者的药物中的用途。
75.一种在体内诱导组织形成的方法，所述方法包括将权利要求38至57中任一项所述的物质组合物植入到受试者体内，由此诱导组织形成。
76.一种在体内诱导组织形成的方法，所述方法包括将权利要求I至37中任一项所述的结合物的多个分子植入到受试者体内，由此诱导组织形成。
77.一种在体外诱导组织形成的方法，所述方法包括使权利要求55所述的物质组合物经受诱导所述细胞生长的条件，由此诱导组织形成。
78.一种治疗患有特征为组织损伤或损失的失调的受试者的方法，所述方法包括将权利要求38至57中任一项所述的物质组合物植入到受试者体内，由此诱导所述组织的形成，从而治疗特征为组织损伤或损失的失调。
79.一种治疗患有特征为组织损伤或损失的失调的受试者的方法，所述方法包括将权利要求I至37中任一项所述的结合物的多个分子植入到受试者体内，由此诱导所述组织的形成，从而治疗特征为组织损伤或损失的失调。
80.根据权利要求76和79中任一项所述的方法，其中，所述结合物包括至少一个交联部分，所述方法进一步包括共价交联所述结合物的所述多个分子。
81.根据权利要求80所述的方法，其中，所述交联是通过使所述结合物的所述多个分子经受使所述交联部分实现共价交联的条件来实现的。
82.—种包括权利要求1-37中任一项所述的结合物的多个分子的药物、化妆品或美容保健品组合物，所述组合物被鉴定用于当与组织接触时并且进一步地当使所述组合物经受生理温度时诱导组织形成。
83.根据权利要求82所述的药物、化妆品或美容保健品组合物，其中，所述结合物包括至少一个交联部分，所述组合物被鉴定用于当进一步使所述结合物的所述多个分子经受使所述交联部分实现共价交联的条件时诱导组织形成。
84.根据权利要求83所述的药物、化妆品或美容保健品组合物，进一步包括用于诱导所述交联部分的所述共价交联的引发剂。
85.根据权利要求82至84中任一项所述的药物、化妆品或美容保健品组合物，包装在包装材料中并且在印刷物中、在所述包装材料之中或之上进行标识，用于诱导所述组织的形成。
86.一种用于诱导组织形成的试剂盒，所述试剂盒包括 (a)权利要求1-37中任一项所述的结合物； (b)水溶剂；以及 (c)用于交联所述结合物的水溶液从而形成用于诱导所述组织形成的支架的说明。
87.根据权利要求86所述的试剂盒，其中，所述结合物包括至少一个交联部分，所述试剂盒进一步包括用于诱导所述交联部分共价交联的引发剂。
88.根据权利要求86至87中任一项所述的试剂盒，进一步包括用于包埋在所述支架中的细胞。
全文摘要
本文提供了多种结合物，它们包括附连到至少两个聚合物部分上的蛋白，这些部分中至少一个显示反向热胶凝。这些结合物适合通过非共价和/或共价交联进行交联。本文提供了包含交联结合物的物质组合物以及用于生产它们的方法。本文还提供了控制物质组合物物理特性的方法。如本文所描述的，这些结合物和物质组合物可以用于多种应用，例如细胞生长、组织形成、以及治疗特征为组织损伤或损失的多种失调。
文档编号C12N5/00GK102762715SQ201080057801
公开日2012年10月31日 申请日期2010年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者德罗尔·塞里克塔尔, 莎恰夫·约纳坦 申请人:瑞吉恩提斯生物材料有限公司