集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，具体涉及一种具有主动靶向功能的，同时装载疏水性抗肿瘤药物和磁共振分子影像探针的双功能纳米聚合物胶束体系的制备。这种纳米聚合物胶束体系在药物释放、肿瘤早期诊断、靶向分子探针、磁共振影像示踪、疗效评估等生物医学工程领域具有广阔的应用前景。
【背景技术】
[0002]全世界每年约有600万人死于恶性肿瘤，中国现有癌症患者约450万人，死亡率约30%，且呈逐年递增的趋势。肿瘤的非手术治疗包括放疗和化疗，均以杀死肿瘤细胞为目的，但它们最大的弊端由于缺乏对肿瘤细胞的特异性识别，所以治疗时将肿瘤细胞和正常细胞一并杀死，为了克服肿瘤治疗中的瓶颈问题，目前国内外众多学者致力于研宄“肿瘤靶向传递系统”。
[0003]在“肿瘤靶向传递系统”的研宄中，由于纳米粒子的微小体积和特殊结构，可以对药物在体内的分布、吸收、排除等行为达成控制，其作为药物载体具有特殊的优势。由于肿瘤组织自身的特征:如血管网丰富、血管内皮疏松、淋巴管缺乏等，使纳米粒子容易从血管中进入肿瘤组织局部而不易被淋巴管吸收返回到血液循环系统，通过这种增强的渗透及滞留作用(enhanced permeability and retent1n，EPR)，纳米粒子可以在肿瘤局部聚集从而获得被动靶向功能。同时，对纳米粒子可以进行表面化学修饰后易偶联或吸附适当的配体(包括抗体、半抗原、糖、叶酸等)，利用配体与细胞表面受体特异性结合的原理，以提高纳米载体对靶目标的特异性及敏感性，从而实现靶向诊断或治疗。2005年美国政府拨款10亿元用于纳米技术的研宄，这比用于人类基因组测序的昂贵费用多2倍多。在我国纳米技术的发展也是方兴未艾，日新月异。
[0004]在众多的研宄中利用聚合物纳米胶束进行抗癌药物及影像对比剂的靶向传输已经成为一个热门的研宄领域。在纳米胶束外壳的构造方面，聚乙二醇(PEG)是迄今所发现的生理性能较好的一种聚合物，它具有高度的亲水性、良好的生物相容性、并可显著减少蛋白黏附、网状内皮系统的吸收和吞噬细胞的吞噬，从而延长纳米胶束在体内的循环时间。在聚合物胶束结构的设计中，常采用聚己内醋(poly-ε-caprolactone，PCL)来构筑胶束的内核，因为PCL的药物通透性好，兼具可生物降解性，所以主要用作控释载体，用于药物的控制释放。叶酸(Folic acid，FA)受体是一种与糖基化磷脂酰肌醇(glycosylp-hosphatidylinositol, GPI)连接的膜糖蛋白，对叶酸有高度亲合性。叶酸通过γ-羧基偶联其它小分子化合物如抗肿瘤药物后，仍能保持与叶酸受体的高亲合性。此夕卜，叶酸分子具有分子量小、无免疫源性、无毒、生物相容性好等特点。自从发现叶酸受体在绝大多数恶性肿瘤细胞表面有大量表达以来，基于叶酸受体表达的组织分布特点、叶酸受体与叶酸的高度亲和性以及叶酸受体介导的细胞内吞转运机制，叶酸靶向的肿瘤显像技术和药物控释日渐成为关注的焦点。叶酸-药物偶联物与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合后，通过内吞作用(endocytosis)进入肿瘤细胞。在细胞内的弱酸性环境(pH 5)中，叶酸受体构型发生改变，释出叶酸-药物偶联物，而受体又可回到细胞膜表面，再转运其它的叶酸分子或叶酸-药物偶联物。
[0005]紫杉醇是广谱抗癌药物，对卵巢癌、乳腺癌、食管癌等上皮组织肿瘤疗效甚佳，但紫杉醇在水中的溶解性很差。为了改善紫杉醇的水溶性，临床应用的紫杉醇注射液中加入的成分容易导致过敏反应和毒性反应，严重限制了紫杉醇的临床使用。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，克服现有技术中疏水性抗肿瘤药物使用过程中容易导致过敏反应和毒性反应，严重限制了临床使用的缺陷。
[0007]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，包括以下步骤:
[0008]步骤⑴将0.1?I重量份疏水性抗肿瘤药物、I?10重量份的磁共振敏感分子探针、4?40重量份甲氧基封端的聚乙二醇-聚己内酯、0.8?8重量份的带有主动靶向集团的聚合物胶束及0.8?8重量份FITC-PEG-PCL溶解在I?100重量份四氢呋喃中制成混合物；
[0009]步骤(2)将步骤(I)制备的混合物加入到5?800重量份去离子水中，经过透析挥发以去除有机溶剂，得到靶向FA-NP/SP10/PTX纳米聚合物胶束；
[0010]步骤(3)将步骤(2)制备的靶向FA-NP/SP10/PTX纳米聚合物胶束经过滤膜过滤，以除去未装载包裹的抗肿瘤药物，再经过离心去除未装载包裹和游离状态的抗肿瘤药物，制得内核装载疏水性药物和磁共振敏感分子探针，外壳带有主动靶向集团的集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体。
[0011]本发明的有益效果是:添加有一定量的带有主动靶向集团的聚合物胶束，提高了胶束体系与肿瘤细胞的特异性结合能力，从而提高了抗肿瘤药物的局部浓度和抗肿瘤效应，并减少抗肿瘤药物的毒副作用，为克服诸如卵巢肿瘤细胞多药耐药提供理论依据。
[0012]本发明方法利用胶束的自组装特性，在纳米聚合物胶束壳内同时装载抗肿瘤药物和磁共振敏感分子探针，在达到将抗肿瘤药物特异性运输到肿瘤局部的同时，可用MRI敏感分子探针进行动态观察肿瘤细胞的生长情况、药物在肿瘤内的分布情况、显示治疗过程中靶点的分子改变，为了解抗肿瘤药物的药代动力学提供了机会和途径；同时也为临床治疗卵巢肿瘤实现“个体化”提供了机会和可能。
[0013]在同一纳米聚合物胶束体系中，同时实现诊断和治卵巢肿瘤的目的，既有利于临床肿瘤的诊断和治疗，同时有利于推动磁共振特异性探针和开发新的肿瘤靶点提供了坚实的理论依据，从而推动我国无创体外诊断方法的发展和进步。
[0014]本发明一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法其具有制备条件温和，操作简单，易于实施的特点。
[0015]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0016]本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述疏水性抗肿瘤药物为PTX ;所述磁共振敏感分子为超顺磁性氧化铁纳米颗粒。
[0017]本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述超顺磁性氧化铁纳米颗粒为Fe304、CoFe3O4或MnFe 204。
[0018]本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，步骤(3)所述滤膜为0.45 μ m的滤膜；所述经过离心去除未装载包裹和游离的抗肿瘤药物是经超滤离心管离心，离心速度为1000-500()rpm。离心速度过小不能有效分离目标产物或分离不彻底，离心速度过大纳米粒子可能会发生聚集。
[0019]本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述带有主动革E向集团的纳米聚合物胶束为球形无聚集，粒径为50?lOOnm。该纳米聚合物胶束在水溶液中分散均一稳定，粒径可控，适合于进一步的生物学应用。
[0020]本发明如上所述一种集诊断和治疗于一体的纳米聚合物胶束载体的制备方法，进一步，所述带有主动靶向集团的聚合物胶束通过以下方法制备得到:将叶酸溶解在无水的四氢呋喃中，加入l，r -羰基二咪唑，在室温下搅拌后，加入氨基封端聚乙二醇-聚己内酯，室温下继续搅拌，反应结束后，用去离子水透析，以除去游离的叶酸和其他副产品，冷冻干燥后，得到白色的粉末状的负载叶酸靶向集团的FA-PEG-PCL。
[0021]采用上述进一步的有益效果是:在纳米聚合物胶束表面负载叶酸分子，赋予纳米聚合物胶束肿瘤主动靶向功能，提高