用于预防和治疗高表达wt1肿瘤的黑猩猩腺病毒疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明创造属于疫苗技术领域，具体涉及一种用于预防和治疗高表达WTl肿瘤的黑猩猩腺病毒疫苗。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是常见乳腺肿瘤之一，其发病率位居女性癌症首位。目前以放疗、化疗及手术为主的传统治疗方法的疗效不甚理想，尤其是高转移型乳腺癌，因此迫切需要开发新的治疗手段。
[0003]WTl基因定位于11ρ13，由10个外显子组成，编码一种锌指结构的转录因子，是最早发现与Wilm肿瘤发生、发展有关的抑癌基因。WTl在多种肿瘤中表达异常，但因细胞特征不同，其可发挥癌基因或抑癌基因作用。WTl在乳腺癌中高表达，其在乳腺癌发生发展及预后中的作用并不明确，是治疗乳腺癌的一个潜在靶点。
[0004]目前有多种美国FDA批准的单克隆抗体(如trastuzumab、cetuximab和rituximab)应用于临床肿瘤的治疗(被动免疫治疗)。但由于单克隆抗体的半衰期短，需反复注射而价格高昂；单克隆抗体治疗时常可在患者体内达到很高浓度，即使为人源化抗体，亦常诱发严重的自身免疫反应。所以单克隆抗体的临床应用有很多局限性。疫苗(主动免疫治疗)是预防和控制传染病的最有效的措施之一；现代分子生物学，免疫学和肿瘤学的迅速发展也极大地推动了针对肿瘤的疫苗的研宄。疫苗可诱导记忆免疫细胞的产生，一次使用就可获得较持久的效果，故治疗费用相对便宜；疫苗可通过多种机制诱导抗肿瘤反应，其诱导的抗体浓度较低，发生副反应可能性降低。美国国立卫生研宄所(NIH)批准的针对WTl的多肽疫苗的多项临床试验中，有些能产生中等程度的抗原特异性的免疫反应和一定的保护作用，但其临床效果均不能令人满意。现代免疫学的发展认识到，免疫激活是多种免疫细胞相互协作的过程:主要包括抗原呈细胞提呈抗原、辅助性CD4+T细胞的帮助和杀伤性T细胞的活化。故真正有效的乳腺癌疫苗，不仅依赖于鉴定出具备诱导免疫保护作用的乳腺癌相关抗原，还有赖于构建优良的免疫激活系统，以增强机体对乳腺癌的免疫反应。
[0005]相比肿瘤细胞、肽段或蛋白疫苗，病毒疫苗能高水平持续表答肿瘤相关抗原、有效感染抗原提呈细胞，同时诱导T和B细胞免疫反应，并强烈激活固有免疫的多类细胞。腺病毒是目前最有应用前景的病毒疫苗载体，被广泛应用于各种预防性或治疗性疫苗的研宄，包括HIV、HPV、流感、乙肝、前列腺癌、黑色素瘤等疾病的疫苗。腺病毒是一种无包膜、线性的双链DNA病毒。与其它载体(如细菌或其它病毒)相比，腺病毒低毒性，感染腺病毒只引起轻微症状；经过基因改装后的腺病毒无安全性问题；腺病毒载体表达水平高且表达时间长久；腺病毒疫苗无需添加佐剂。因此，腺病毒成为新型疫苗的理想载体。由于人群中40-60%的个体含有抗AdHu5的中和抗体，以AdHu5为载体的疫苗，其免疫效果将受人体中已有中和抗体的影响。为避免这一问题，研宄者选择稀有血清型或其他种属来源的腺病毒作为疫苗载体，如黑猩猩型腺病毒。黑猩猩型腺病毒(Chimpanzee adenovirus，AdC)只流行于非洲的黑猩猩中，人群中一般不含抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，故以黑猩猩型腺病毒为疫苗载体，其免疫效果显著优于以AdHu5为载体诱导的免疫效果。
[0006]因此，WTl基因及黑猩猩型腺病毒可能对肿瘤，尤其是乳腺癌的治疗起到有利作用。
【发明内容】
[0007]本专利的目的是提供一种预防和治疗乳腺癌的基因疫苗，选择Wilm’ s瘤基因I (WTl)作为靶点，黑猩猩腺病毒作为载体，应用重组表达WTl和(GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WTl)的黑猩猩腺病毒疫苗成功的预防和延长了乳腺癌小鼠的生存期，为该疫苗的临床应用提供了实验基础，对其他肿瘤的治疗具有提示作用。
[0008]本发明首次应用黑猩猩腺病毒作为WTl的载体。
[0009]本发明还首次证实，表达WTl的黑猩猩腺病毒疫苗能够显著延长乳腺癌小鼠的生存期，而且表达(GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WTl)的黑猩猩腺病毒疫苗对生存期延长的效果更为显著。
[0010]所述的WTl基因核苷酸序列如SEQ N0.1所示。
[0011]所述的GM-CSF基因核苷酸序列如SEQ N0.2所示，IL-4基因核苷酸序列如SEQN0.3所示。
[0012]所述的(GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WTl)核苷酸序列如SEQ N0.4 所示。
[0013]所述腺病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤:(I)质粒合成；(2)重组腺病毒载体构建；(3)重组腺病毒的制备和鉴定。
[0014]其中质粒合成步骤中，合成tWTl in pUC57_Amp质粒或(GM-CSF) -P2A- (IL-4) -F2A- (WTl) in pUC57_Amp 质粒，其核苷酸序列分别如 SEQ N0.5、SEQN0.6 所示。
[0015]其中重组腺病毒载体构建步骤中，采用限制性内切酶酶切pUC57_Amp质粒或(GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WTl) in pUC57_Amp 质粒，将目的基因克隆入 pAdC68 载体内，构建病毒载体。优选的，所述的限制性内切酶为Xba I和Kpn I酶。
[0016]其中重组腺病毒的制备和鉴定步骤中，将所述病毒载体转入HEK293细胞中，并酶切鉴定。
[0017]本发明创造具有的优点和积极效果是:
[0018]本发明能够显著延长乳腺癌模型小鼠的生存期，研宄结果为表达WTl的黑猩猩腺病毒疫苗的临床应用提供了实验基础。
【附图说明】
[0019]图1 tWTl in pUC57_Amp的图谱及插入基因序列
[0020]图2 (GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(WTl) in pUC57_Amp 的图谱及插入基因序列
[0021]图3重组腺病毒载体pAdC68_WTl构建策略
[0022]图4 重组腺病毒载体 pAdC68- (GM-CSF) -P2A- (IL-4) -F2A- (WTl)构建策略
[0023]图5重组腺病毒质粒酶切鉴定A:重组腺病毒质粒pAdC68_WTl经Bgl I1、Xho 1、Mfe I酶切鉴定；B:重组腺病毒质粒pAdC68-GIW经Bgl IKXho 1、Mfe I酶切鉴定；1:1KbDNA ladder marker ;2、3、4 分别为 Bgl I1、Xho 1、Mfe I
[0024]图6表达WTl的重组黑猩猩腺病毒疫苗的制备
[0025]图7重组腺病毒基因组酶切鉴定A:重组腺病毒AdC68_WTl基因组经Bgl I1、Xho
1、Mfe I酶切鉴定；B:重组腺病毒AdC68-GIW基因组经Bgl IKXho 1、Mfe I酶切鉴定；1:1Kb DNA Iaddermarker ;2、3、4 分别为 Bgl 11 > Xho 1、Mfe I
[0026]图8重组腺病毒遗传稳定性检测A:第五代病毒AdC68_WTl和AdC68_GIW基因组酶切鉴定:第十五代病毒AdC68-WTl和AdC68-GIW基因组酶切鉴定；1:1Kb DNA laddermarker ;2、3、4 分别为 Bgl I1、Xho 1、Mfe I
[0027]图9重组腺病毒感染滴度检测
[0028]图10病毒疫苗对乳腺癌的预防性研宄技术路线
[0029]图11腺病毒疫苗对乳腺癌的预防性研宄的各组体重监测
[0030]图12腺病毒疫苗对乳腺癌的预防性研宄的各组肿瘤体积监测
[0031]图13腺病毒疫苗对乳腺癌的预防性研宄的生存期监测
[0032]图14病毒疫苗对乳腺癌的治疗性研宄技术路线
[0033]图15腺病毒疫苗对乳腺癌的治疗性研宄的各组体重监测
[0034]图16腺病毒疫苗对乳腺癌的治疗性研宄的各组肿瘤体积监测
[0035]图17腺病毒疫苗对乳腺癌的治疗性研宄的生存期监测
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图通过具体实施例对本发明创造进行进一步说明。
[0037]1.病毒合成和扩增
[0038]1.1 tffTl in pUC57_Amp 质粒合成
[0039]tffTl inpUC57-Amp质粒由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。质粒图谱和序列见图1。酶切位点为Xba I和Kpn I。
[0040]1.2 (GM-CSF) -P2A- (IL-4) -F2A- (WTl) in pUC57_Amp 质粒合成
[0041](GM-CSF)-P2A-(IL-4)-F2A-(W