一种用于真菌Oidiodendron truncatum生产新型抗肿瘤活性化合物chetracin B的新型 ...的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及发酵培养基技术领域，更为具体的，涉及到用于培养真菌Oid1dendron truncatum的培养基技术领域，尤其是指一种用于真菌Oid1dendrontruncatum生产新型抗肿瘤活性化合物chetracin B的新型培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002]天然产物不仅是创新药物的直接来源，而且可以为化学合成提供重要的活性骨架模板和结构信息，大大提高新药发现的几率，因而寻找和发现具有高活性、新靶点的骨架新颖的天然产物在现代药物研宄中发挥着不可替代的作用。真菌天然产物是结构多样性和活性多样性的重要来源。近年来，研宄者开始将目光转移到一些特殊生境来源的真菌，如极地、深海、盐湖、海洋动植物共附生等。
[0003]chetracin B 是本研宄室从南极来源真菌 Oid1dendron truncatum GW3-13 中分离出来的一种高活性新型的含多硫键的哌嗪类化合物(朱天骄，顾谦群第，一种含多硫键的哌嗪类化合物及其制备方法和用途，ZL201010119068.3)。细胞活性测试表明，其对BGC-823人胃癌细胞、BEL-7402人肝癌细胞、HCT-8人结直肠癌细胞、A549人非小细胞肺癌细胞、A2780人卵巢癌细胞的IC5tl分别为0.011,0.003,0.013,0.022,0.028 μ Mo在分子水平上该化合物具有 HIF-1 α 抑制活性(Liyuan Li，Dehai Li，Yepeng Luan, Qianqun Gu,and Tianjiao Zhu.Cytotoxic Metabolites from the Antarctic Psychrophilic FungusOid1dendron truncatum, J.Nat.Prod.，2012，75:920-927.)，具有很好的医药开发价值。
[0004]然而该化合物在初始发酵条件下产量较低(< 6mg.Γ1)，制约了对其进一步的体内外活性测试及动物、临床研宄，因此该化合物的产量成为了首要解决的问题，所以需开发一种促进真菌Oid1dendron truncatum GW3-13生产chetracin B的培养基，为后期研宄提供一个必要的基础条件。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的是针对上述存在的问题与缺陷，提供一种用于真菌Oid1dendron truncatum GW3-13生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基及其制备方法，该新型原料易得，成本较低，制备方法简单，能显著促进Oid1dendron truncatumGW3-13发酵生产chetracin B的产量，有利于大规模工业化生产，对Oid1dendrontruncatum GW3-13发酵研宄及chetracin B医药学研宄具有重大意义。
[0006]为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0007]一种用于Oid1dendron truncatum GW3-13生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基，其特点是，每升所述新型培养基包括:麦芽糖2?10g，蛋白胨0.5?5g，玉米粉I?1g,谷氨酸钠0.5?10g，葡萄糖10?100g，酵母膏0.2?4g，七水硫酸镁0.1?lg，磷酸二氢钾0.1?3g，其余为去离子水。
[0008]较佳地，所述麦芽糖5g，蛋白胨1.5g，玉米粉3g，谷氨酸钠4g，葡萄糖23.7g，酵母膏1.78g，七水硫酸镁0.45g，磷酸二氢钾0.5go
[0009]一种用于制备上述的新型培养基的方法，其特点是，所述麦芽糖，所述蛋白胨，所述玉米粉，所述谷氨酸钠，所述葡萄糖，所述酵母膏，所述七水硫酸镁，所述磷酸二氢钾溶于去离子水，定容。
[0010]较佳地，上述步骤进一步包括:在121°C，灭菌20?30min。
[0011]—种使用上述新型培养基培养南极来源真菌GW3-13生产chetracin B的发酵方法，其特点是，包括以下:取南极来源真菌GW3-13孢子接种所述新型培养基进行培养，进行发酵培养10?12天，获得发酵液。
[0012]较佳地，按终浓度3-5*106个所述南极来源真菌GW3-13孢子/ml进行接种；所述培养是在25°C，180r/min摇床培养。
[0013]—种上述发酵方法生产的chetracin B的检测方法，其特点事，包括步骤:待所述发酵液变深灰黑色后约12h，停止培养；取适量所述发酵液，加入乙酸乙酯和玻璃珠萃取离心，取适量有机相进行减压旋转蒸馏，馏干物用乙酸乙酯溶解，离心；取适量上层液，用HPLC测定chetracin B含量，然后换算所述发酵液中chetracin B含量。
[0014]较佳地，所述发酵液取20ml，所述乙酸乙酯40ml，所述玻璃珠5粒；所述萃取在25°C和150r/min条件下进行。
[0015]本发明的优良效果具体如下:
[0016]1、由于本发明的新型培养基成分主要是麦芽糖、蛋白胨、玉米粉、谷氨酸钠、葡萄糖、酵母膏、七水硫酸镁、磷酸二氢钾等常见物质，易得，成分低；
[0017]2、制备本发明的新型培养基时，只需将各成分混合溶于去离子水即可，制备简单；
[0018]3、使用本发明的新型培养基培养该目的菌株时，该菌株在该新型培养基中可生长良好，最终产量达到54.7mg/L，是原始水平的9.6倍，显著的促进了该菌株生产chetracinB的产量，有利于大规模工业化生产，对真菌Oid1dendron truncatum GW3-13发酵研宄及chetracin B医药学研宄具有重大意义。
【具体实施方式】
[0019]为了更好的理解本发明的内容，一下结合实例作进一步说明。
[0020]实施例1
[0021]1.1培养基配制
[0022]称取麦芽糖5g，蛋白胨1.5g，玉米粉3g，谷氨酸钠4g，葡萄糖23.7g，酵母膏1.78g，七水硫酸镁0.45g，磷酸二氢钾0.5g，倒入煮沸的去离子水中充分溶解，最后用去离子水定容至1000ml。
[0023]1.2 发酵生产 chetracin B:
[0024]南极来源真菌GW3-13(中国典型培养物保藏中心保藏编号是CCTCC M2010043)，用无菌水从斜面冲洗下新鲜GW3-13孢子，按终浓度3-5*106个/ml接入发酵培养基，于25oC,180r/min摇床培养10-12天，待发酵液变为深灰黑色后约12h后，停止培养。
[0025]1.3chetracin B 产量的测定
[0026]取上一步骤制备的发酵液20ml，加入40ml乙酸乙酯和5粒玻璃珠，于25°C，150r/min萃取24h。10000r/min离心lOmin，取上层有机相，减压旋转蒸馆?，饱干物用Iml乙酸乙醋溶解，用HPLC测定chetracin