技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及鸡血藤黄酮作为抗真菌药物的增效剂。
背景技术：
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鸡血藤原植物为密花豆(spatholobussuberectusdunn)，是一种沿用千年的活血化瘀中药,其性温,味苦、甘,归肝、肾经。有补血、活血、通络的功效,用于治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等。现代药理研究表明鸡血藤具有降血压、抗癌、抑菌、抗放射线的功效。目前对鸡血藤中有效成分的药理作用和应用主要集中在黄酮类，称之为鸡血藤黄酮类，由于已经分离得到的单体有16种，包括没食子儿茶素、表没食子儿茶素、鹰嘴豆芽素a、原花青素b2、染料木素、柚皮素、甘草素、异甘草素、樱黄素、儿茶素、表儿茶素、芒柄花甙、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素、大豆苷元、黄衫素。具有抗病毒，抗肿瘤，免疫调节等多种作用。
其中没食子儿茶素(gallocatechin，gct)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，egct)、鹰嘴豆芽素a(biochanina,bcn)，甘草素(liquiritigenin，lqt)，柚皮素(naringenin，nrg)，染料木素(genistein，gst)是从植物密花豆(spatholobussuberectusdunn)干燥的茎中提取而来。化学名称分别是：(士)-trans-3，5，7，3′，4′，5′-六羟基黄烷；(-)-cis-2-(3,4,5-三羟基苯基)-3,4-二氢-1(2h)-苯并吡喃-3,5,7-三醇；5,7-二羟基-4'-甲氧基异黄酮；4',7-二羟基黄烷酮；4',5,7-三羟基黄酮；5,7-二羟基-3-(4-羟苯基)-4h-1-苯并吡喃-4-酮。分子量分别为：290.27、306.27、284.26、256.08、272.07、270.05。分子式分别为：c15h14o6、c15h14o7、c16h12o5、c15h12o4、c15h12o5、c15h10o5。
随着目前临床上免疫抑制剂、化疗药物、以及导管类植入剂的大量使用，深部真菌感染的患者越来越多，其中以白念珠菌感染最为广泛。临床常用的抗真菌药物主要包括唑类抗真菌药物(如氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑等)、两性霉素b、棘白菌素类抗真菌药物(如卡泊芬净、米卡芬净等)。随着这些药物的广泛使用，临床耐药真菌的出现越来越普遍，尤其对唑类药物耐药的真菌在临床上开始大量出现。因此临床迫切需要寻找到能够提高抗真菌药物抗菌效果的有效途径。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，通过实验发现鸡血藤黄酮能够有效增强抗真菌药物效果，因而完成本发明。而现有技术中还没有鸡血藤黄酮与其他药物合用以协同抗真菌的报道。本发明为鸡血藤黄酮开辟了新的用途，将其用于抗真菌药物的增效剂，不仅能提高药物的抗真菌作用，而且还能减少抗真菌药物的用量，减少不良反应，并且鸡血藤黄酮来源于植物鸡血藤，资源丰富，可显著减轻患者的经济负担。因此鸡血藤黄酮可用于制备抗真菌药物增效剂，可用于不同深部和浅部真菌感染的治疗。具有十分广泛的应用前景。
对此，本发明提供一种增效的抗真菌药物组合物，所述组合物中包括抗真菌药物和作为增效剂的鸡血藤黄酮。
优选地，所述的鸡血藤黄酮选自：没食子儿茶素、表没食子儿茶素、鹰嘴豆芽素a、原花青素b2、染料木黄酮、柚皮素、甘草素、异甘草素、樱黄素、儿茶素、表儿茶素、芒柄花甙、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素、大豆苷元、或黄衫素。更优选地，所述的鸡血藤黄酮选自：鹰嘴豆芽素a、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、甘草素、柚皮素、染料木素。
其中，所述的抗真菌中的真菌是耐药性真菌。优选白念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、新生隐球菌、光滑念珠菌、申克氏孢子丝菌、红色毛癣菌、须毛癣菌、石膏样小包子菌、或羊毛状小孢子菌。
更优选地，所述的耐药性真菌选自对氟康唑、咪康唑、酮康唑、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶、卡泊芬净、两性霉素b、或甲帕霉素有耐性的真菌。
其中，所述的抗真菌药物选自：1)抗生素类抗真菌药物；2)唑类抗真菌药物；3)烯丙胺类抗真菌药物；4)苄胺类抗真菌药物；5)脂肽类抗真菌药物；6)5-氟胞嘧啶；或7)阿莫罗芬抗真菌药物。
进一步优选地：1)所述的抗生素类抗真菌药物为：两性霉素b、制霉菌素、或甲帕霉素；2)所述的唑类抗真菌药物为：氟康唑、咪康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑、或泊沙康唑；3)所述的烯丙胺类抗真菌药物为：特比萘芬；4)所述的苄胺类抗真菌药物为：布替奈芬；5)所述的脂肽类抗真菌药物为：卡泊芬净、米卡芬净、或阿尼芬净。
更进一步优选地，所述的抗真菌药物选自氟康唑、或酮康唑。
本发明具有以下有益效果：
本发明能够增加现有抗真菌药物的抗真菌效果，尤其增加对耐药菌的抗菌效果。同时本发明能够使临床上抗真菌药物的用量大大下降，减少药物所引起不良反应发生的可能性，具有非常重要的临床使用价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：鸡血藤黄酮与氟康唑协同对不同临床耐药和实验室诱导耐药白念珠菌的作用。
材料和方法
1、试药
鸡血藤黄酮：购自中国成都瑞芬思生物科技有限公司。
氟康唑(fluconazole,fcz)：购自sigma公司，货号为f8929。
二甲亚砜：购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
鸡血藤黄酮分别用二甲亚砜配成19.2μg/ml，氟康唑用水配成2mg/ml，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
2、菌株
临床株：耐药白念珠菌(103，100，102，311，0710922，19)均由上海长海医院真菌室提供，分别采自上海长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
3、培养液
rpmi1640培养液：rpmi1640(gibcobrl)10g，nahco32.0g，吗啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonicacid,mops)(sigma)34.5g(0.165m)，加三蒸水900ml溶解，1molnaoh调ph至7.0(25℃)，定容至1000ml，滤过消毒，4℃保存。
沙堡葡萄糖琼脂培养基(sda)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整ph至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
yepd培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
4、仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；
thz-82a台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)；
sw-ct-if型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。
5、菌液的准备
实验前，用接种圈从4℃保存的sda培养基上挑取白念珠菌球状菌少量，接种至1mlyepd培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlyepd培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以rpmi1640培养液调整菌液浓度至1×103～5×103cfu/ml。
6、药敏反应板的制备：
取无菌96孔板，合用的两种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(a至h)横(2至11)两方向分别进行二倍的倍比稀释。例如bcn与另一种抗真菌药物氟康唑合用后，使得氟康唑的终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg/ml，bcn的终浓度为128、64、32、16、8、4、2和1mg/ml。其余操作同上单用药物。各孔中dmso含量均低于1％。每次配制药敏板的同时均制备一质控菌药敏板，各药敏板于30℃恒温箱培养。
7.最低抑菌浓度(mic值)的判定：
在30℃恒温箱中，菌株培养24h，用酶标分析仪于630nm测各孔od值。阳性对照孔的od值控制在0.2左右，与阳性对照孔比，以od值下降50％以上的最低浓度孔中的药物浓度为mic50(真菌生长50％被抑制时的药物浓度)。当药物的mic50值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：mic50值高于最高浓度128μg/ml时，计为“>128μg/ml”；mic50值为最低浓度或在最低浓度以下时，计为“≤0.25μg/ml”或“≤1μg/ml”。上述实验均平行操作2到3次，当mic50值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为mic50值；当mic50值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
8.联合用药的效果评价：
部分抑菌浓度指数(fractionalinhibitoryconcentrationindex，fici)是评价联合用药的两药相互作用方式的主要参数。抑菌浓度分数(fic)，分别为每一种药物联合抑菌时所需最低抑菌浓度(mic)与单用时mic的比值.而fic指数(fici)则等于两种药物fic之和。当mic值高于检测最高限时以最高限浓度的两倍值用以计算fici。很多文献报道当fici≤0.5时两药的相互作用确定为协同作用，且fic指数越小，协同作用越强；0.5<fici≤1时两药的相互作用确定为相加作用；1<fici≤4时为无关作用；当fici>4时两药产生拮抗作用[91]。本课题选用目前国外期刊采用的最新标准：当fici≤0.5时，两药的相互作用确定为协同作用；0.5<fici≤4时为无关作用；当fici>4时两药产生拮抗作用。
本实施例的实验结果见表1，表2，表3。
表1bcn与fcz合用对耐药白色念珠菌的药物敏感性实验
bcn表示鹰嘴豆芽素a，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
表2gct与fcz合用对耐药白色念珠菌的药物敏感性实验
gct表示没食子儿茶素，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
表3egct与fcz合用对耐药白色念珠菌的药物敏感性实验
egct表示表没食子儿茶素，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
由表1，表2，表3可见，在6株耐药白念珠菌中，氟康唑和鹰嘴豆芽素a，没食子儿茶素或表没食子儿茶素联用均表现出显著的协同作用，所有fici<0.5；氟康唑单用时对其耐药(mic50>128μg/ml)的菌株，在氟康唑和鸡血藤黄酮联用时变得对氟康唑敏感：氟康唑mic50数值降低了8至512倍，降至0.5μg/ml至16μg/ml之间，和鸡血藤黄酮mic50数值也显著降低。
实施例2：鸡血藤黄酮与氟康唑协同对临床常见的其他真菌的作用。
材料和方法
1、试药
鸡血藤黄酮：购自中国成都瑞芬思生物科技有限公司。
氟康唑(fluconazole,fcz)：购自sigma公司，货号为f8929。
二甲亚砜：购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
鸡血藤黄酮分别用二甲亚砜配成19.2μg/ml，氟康唑用水配成2mg/ml，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
2、菌株
临床株：新生隐球菌(kn99，h99)、热带念珠菌(2718，8915)、光滑念珠菌(8535，ch1)均由上海长海医院真菌室提供，分别采自上海长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
其他实验步骤和方法同实施例1。
本实施例的实验结果见表4至表9。
表4bcn与fcz合用对临床常见其他真菌的药物敏感性实验
bcn表示鹰嘴豆芽素a，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
表5gct与fcz合用对临床常见其他真菌的药物敏感性实验
gct表示没食子儿茶素，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
表6egct与fcz合用对临床常见其他真菌的药物敏感性实验
egct表示表没食子儿茶素，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
表7lqt与fcz合用对临床常见其他真菌的药物敏感性实验
lqt表示甘草素，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
表8nrg与fcz合用对临床常见其他真菌的药物敏感性实验
nrg表示柚皮素，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
表9gst与fcz合用对临床常见其他真菌的药物敏感性实验
gst表示染料木素，fcz表示氟康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
由表4至表9可见，在临床常见其他真菌中，氟康唑和鹰嘴豆芽素a，没食子儿茶素，表没食子儿茶素，甘草素，柚皮素，染料木素等联用均表现出显著的协同作用，所有fici均≤0.5；氟康唑与鸡血藤黄酮联用时，氟康唑mic50数值降低了4至256倍，降至1μg/ml至64μg/ml之间，和鸡血藤黄酮mic50数值也显著降低。
实施例3：鸡血藤黄酮与其他抗真菌药物协同抗真菌的作用。
材料和方法
1、试药
鸡血藤黄酮：购自中国成都瑞芬思生物科技有限公司。
酮康唑(ketoconazole，kcz)：购自sigma公司，货号为k1003。
二甲亚砜：购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
鸡血藤黄酮、酮康唑分别用二甲亚砜配成19.2μg/ml，受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
2、菌株
临床株：耐药白念珠菌103，100由上海长海医院真菌室提供。
其他实验步骤和方法同实施例1。
本实施例的实验结果见表10。
表10bcn与kcz合用对临床常见其他真菌的药物敏感性实验
bcn表示鹰嘴豆芽素a，kcz表示酮康唑，fici表示部分抑菌浓度指数
由表10可见，其他抗真菌药物如酮康唑，也可以与鸡血藤黄酮合用发挥协同抗真菌作用，所有fici均≤0.5。
以上实验均证明鸡血藤黄酮具有显著协同现有抗真菌药物发挥抗真菌作用，降低抗真菌药物的给药剂量，因此可用于抗真菌药物的增效剂。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。